KR101477928B1

KR101477928B1 - 암 치료를 위한 pH 민감성 나노운반체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR101477928B1
Application number: KR20130137705A
Authority: KR
Inventors: 이은성; 이정옥
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2014-12-30

Abstract

본 발명은 pH 민감성 나노운반체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 포접 가능한 물질, pH 민감성 물질, 약물전달체 및 폴리펩티드를 이용하여 형성된 고분자를 포함하는 pH 민감성 나노운반체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 pH 민감성 나노운반체는 포접작용이 가능한 물질인 베타사이클로덱스트린으로 인해 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산을 표적 세포내로 쉽고 빠르게 침투하게 하는 효과가 있을 뿐만 아니라 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 병변 부위에 대해 선택적 및 효율적으로 약물을 전달하여 치료 효과를 높일 수 있는 있으므로 의료용 약물 전달체로서 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

암 치료를 위한 pH 민감성 나노운반체 및 그의 제조방법{Nano vehicle sensitive to tumor extracellular pH and preparing method thereof}

본 발명은 암 치료를 위한 pH 민감성 나노운반체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

최근 산업화에 따른 기술의 발전은 생명공학 분야에서 임상적용을 위한 치료 물질로서 펩타이드나 단백질의 사용 가능성을 실용화 할 수 있을 정도로 확장시켰다. 그러나 이러한 펩타이드 또는 단백질을 이용한 약물들의 경우 어떻게 생체 내로 전달시키느냐는 수년 동안 제약 연구 분야에서 계속 진행되고 있는 부분이다. 특히, 약물 전달을 위한 방법 중에서 경구 전달은 약물 전달을 위한 가장 전통적이며 바람직한 방법이라고 할 수 있는데, 반복적 또는 정기적 투여가 필요한 경우에는 더욱 그러하며(B.Y. Kim, 등., J. Control. Release 102, 525-38. 2005),주사와 같은 다른 투여 방법들에 비해 환자의 고통이 적으며, 주사에 동반되는 불쾌감을 덜어준다는 장점들이 있기 때문이다(A. des Rieux 등., J. Control. Release 116, 1-27, 2006). 그러나 약물을 경구 투여할 경우, 정제(tablet) 또는 캡슐(capsule) 형태 제제로부터 약물이 방출된 직후 소화강(digestive lumen)과 혈액 사이의 농도구배(concentration gradient)는 증가하지만, 제제가 소화관의 하부로 이동함에 따라 농도구배가 급격히 감소하게 되어 약물 흡수에 좋지 않은 여건이 형성되는 문제점이 있고, 특히, 단백질 또는 펩타이드 제제의 약물은 소화관으로 분비되는 소화효소에 의해 상당 부분 가수분해 되기 때문에 생체내의 이용도가 감소되는 문제점이 있다.

또한, 경구 투여용 제제 이외에도 지금까지 사용되고 있는 각종 형태의 제약들은 질환 부위에 적절한 약효를 나타내기 위해 필요로 하는 양보다 많은 양을 투약하여야만 약효를 나타내므로 적절치 않은 약물의 양으로 인해 그 이외의 부분에서는 부작용이 발생하여, 많은 제약회사들은 이러한 부작용을 줄일 수 있으면서 동시에 약효를 극대화할 수 있는 제형의 개발에 대한 필요성을 갖게 되었다.

이에 상기 기술된 문제점을 해결하기 위해 약물전달시스템에 대한 활용도가 높아지고 있는데, 약물전달시스템이란 기존 의약품을 전달하는데 있어서 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시키는 방법으로서, 이전보다 낮은 농도 또는 투약하기 곤란한 약물의 선택성을 개선하는데 유용하게 사용되고 있다. 투여되는 약물이 물리화학적으로나 약동학적으로 특별한 특성, 예컨대, 높은 수용성, 높은 지용성 및 불용성과 같은 특징이 있다면 특별한 전달체계의 사용이 요구되기 때문이다.

또한, 최근에는 이러한 약물전달시스템에 나노 기술이 도입되어 약물 전달 효과를 더욱 증진시키기 위한 노력들이 진행되고 있는데, 일반적으로 나노는 수십에서 수백 나노미터를 가리키는 것으로서, 화학적 요소, 올리고 핵산, DNA, RNA 및 단백질 등과 같은 치료학적으로 유효한 성분들을 나노 크기의 전달체를 사용하여 세포내로 전달시키는 기술들이 개발되고 있다. 그러나 이들을 이용한 효과가 분명하게 나타나기 위해서는 세포막 사이에 특이적인 경로 또는 비특이적인 경로를 거쳐 세포막의 지질 이중층을 통과하여 세포질 내에 약물의 방출이 이루어져야 한다. 따라서 이러한 점을 고려하여 효과적인 약물전달 체계로서 친수성과 소수성을 동시에 가지며, 내부 중심에 소수성 코어가 형성되어 약물을 봉입할 수 있도록 설계된 에멀젼(emulsion), 나노(nano) 입자, 리포좀(liposome) 등을 사용한 약물 전달체가 개발되어 있다.

한편, 인체 내에서 pH의 변화는 세 곳에서 관찰되고 있다. 첫째는 위장관에서의 변화로서, 위의 낮은 pH와 장의 높은 pH 사이의 차이가 있는데 이러한 pH의 차이는 약물전달 등에 이용되고 있다. 둘째로는 혈액내의 pH 변화인데 인체의 혈중 pH는 7.4를 유지하고 있으며, 그 변화의 폭은 일반적으로 ± 0.04를 넘지 않는다. 그러나 혈중의 pH 변화가 0.04보다 높으면 알카데미아(alkademia)가 유발되며, 0.04보다 낮으면 엑시데미아(acidemia)가 유발된다. 셋째로 인체 내에서 관찰되는 pH의 변화는 국부적인 세포내에서 관찰되는데, 이는 암이나 저산소증과 같은 질환이 유발되었을 경우, 정상 세포에 비해 pH가 낮아진다.

또한, 각 질병의 종류 및 발생 부위에 따라 병변 세포는 특정 약산성의 pH를 나타내는 것으로 알려져 있는데, 예컨대, 암세포의 경우에는 암주위의 pH가 암세포의 왕성한 대사에 의해 발생되는 유기산 때문에 정상조직보다 평균 0.6 낮은 약 6.8의 pH를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

이와 같이 암을 비롯한 각종 질병이 발생한 부위에서는 정상에 비해 pH가 다소 낮아지는 차이점이 있으므로 이러한 pH 변화를 이용한 약물 전달체를 사용할 경우, 종래의 약물 전달체에 비해 질병 부위 특이적으로 약물을 효율적으로 전달할 수 있어 치료 효과를 증진시킬 수 있을 것으로 기대할 수 있으나, 아직까지 이러한 pH 차이를 인식할 수 있는 약물 전달체가 개발되지 못하고 있다.

한국공개특허 10-2008-0006847

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 미세한 pH 변화에서도 반응하여 약산성에서부터 약리 효과를 가지며, 질병 부위로 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 포접가능한 물질, pH 민감성 물질, 약물전달체 및 폴리펩티드를 이용하여 형성된 고분자를 포함하는 pH 민감성 나노운반체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 pH 민감성 나노운반체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리라이신(poly-Lys)에 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)이 접합되고, 올레익산(Oleic acid; OA)과 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)이 결합된 하기 구조식을 갖는 pH 민감성 약물 나노운반체를 제공한다.

<구조식>

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노운반체는 올레익산(Oleic acid)의 소수성 결합 및 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)의 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)에 대한 포접작용으로 나노운반체 간의 자기집합체를 형성할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 캄토테신으로 구성된 항암제 중에서 선택된 1종 이상의 약물로서 상기 나노운반체 안에 봉입되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노운반체는 pH 7.0 미만의 조건에서 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)에 포접된 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)의 분리로 인해 나노운반체의 구조가 붕괴되어 나노운반체 안에 함유된 약물이 외부로 방출되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노운반체는 pH 7.0 이상의 조건에서는 나노운반체 간의 자기집합체 구조를 형성하여 내부에 봉입된 약물이 방출되지 않는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 pH 민감성 약물 나노운반체를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 pH가 7.0 미만의 병변 부위로 이동 및 축적되고, 나노운반체의 구조가 붕괴되어 나노운반체 안에 함유된 약물이 외부로 방출되어 암 세포의 사멸을 유도할 수 있다.

나아가 본 발명은,

a) 폴리라이신(poly-Lys)에 올레산(Oleic acid; OA)을 접합시키는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 형성된 접합체에 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)을 접합시키는 단계;

c) 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 1,3-디시클로헥실카르보이미드(1,3-dicyclohexylcarbodiimide(DCC)) 및 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide(NHS))의 존재 하에서 상기 b)단계에서 형성된 접합체에 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 결합시키는 단계를 포함하는, pH 민감성 약물 나노운반체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 pH 민감성 나노운반체는 포접작용이 가능한 물질인 베타사이클로덱스트린으로 인해 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산을 표적 세포내로 쉽고 빠르게 침투하게 하는 효과가 있을 뿐만 아니라 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 병변 부위에 대해 선택적 및 효율적으로 약물을 전달하여 치료 효과를 높일 수 있는 있으므로 의료용 약물 전달체로서 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1a는 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD를 접합시키는 화학반응 개념도를 나타낸 그림이다.
도 1b는 본 발명의 연구 개념도를 나타낸 그림이다.
도 2a는 본 발명의 나노운반체와 염화나튜름의 산-염기 적정 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 나노운반체(1mg/㎖, pH 7.4-5.0, PBS 150mM)의 시간에 따른 제타전위 변화를 나타낸 것이다.
도 2c는 pH에 따른 OA-b-poly(Lys-g-DMA)-CD 나노입자(0.1 mg/ml)의 FE-SEM이미지와 입자사이즈 분포를 나타낸 것이다.
도 2d는 pH에 따른 OA-b-poly(Lys-g-DMA) 나노입자(0.1 mg/ml)의 FE-SEM 사진과 입자사이즈 분포를 나타낸 것이다.
도 2e는 pH에 따른 OA-b-poly(Lys-g-DMA)-CD 나노입자(0.1 mg/ml)의 원평광 이색성 분석을 나타낸 것이다.
도 2f는 DOX가 봉입된 OA-b-poly(Lys- g-DMA)-CD 나노입자의 pH에 따른 약물방출 결과(0-48시간)를 나타낸 것이다.
도 3a는 pH 7.4와 pH 6.8에서 KB 암세포에 DOX가 봉입된 OA-b-poly(Lys-g-DMA)-CD 나노입자(질량대비 DOX 농도 10 ㎍/ml)를 처리한 형광사진이다.
도 3b는 유세포분석기를 이용한 pH 7.4-6.0에서 KB 암세포에 DOX가 봉입된 OA-b-poly(Lys-g-DMA)-CD 나노입자(질량대비 DOX 농도 1 ㎍/ml)의 흡수정도를 나타낸 결과이다.
도 3c는 DOX가 봉입된 OA-b-poly(Lys-g-DMA)-CD 나노입자와 OA-b-poly(Lys-g-DMA) 나노입자 및 DOX를 pH 7.4에서 처리한 후 KB 암세포 생존율(n=7)을 나타낸 결과이다.
도 3d는 DOX가 봉입된 OA-b-poly(Lys-g-DMA)-CD 나노입자와 OA-b-poly(Lys-g-DMA) 나노입자 및 DOX를 pH 6.8에서 처리한 후 KB 암세포 생존율(n=7)을 나타낸 결과이다.
도 4a는 Cy5.5 가 표지된 OA-b-poly(L-Lys-g-DMA)-CD 나노입자(복용량: 50 mg/kg)를 KB 종양 세포를 가지고 있는 누드 마우스에 종양 내 주사 후 촬영한 in vivo 비침습 형광 사진이다.
도 4b는 Cy5.5 가 표지된 OA-b-poly(L-Lys-g-DMA)-CD 나노입자(복용량: 50 mg/kg)를 KB 종양 세포를 가지고 있는 누드 마우스에 정맥주사 후 촬영한 in vivo 비침습 형광 사진이다.
도 4c는 KB 종양 세포를 가지고 있는 누드 마우스에 나노입자 또는 DOX(복용량: DOX 기준 10 mg/kg) 주입 후 종양 부피 퇴행 결과(n=5)이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

“약물”은 생활성을 가지며 치료용으로 사용 또는 개조되는 유기 또는 무기 화합물이나 물질을 의미한다. 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 및 유전자 치료제가 광의의 약물 정의에 포함된다.

“치료제”란 유기체(사람 또는 사람이 아닌 동물)에 투여될 때 국소적 및/ 또는 전신적 작용에 의해 욤아되는 약리학적, 면역원성 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 임의의 화합물 또는 조성물을 언급한다. 따라서 상기 용어는 전통적으로 약물, 백신, 및 단백질, 펩티드, 호르몬, 핵산, 유전자 구성물 등과 같은 분자를 포함하는 생체약제로서 간주되는 화합물 또는 화학물질을 포함한다. “치료제”는 하기를 포함하나 이로 제한되지 않는 모든 주요 치료 분야에 사용되는 화합물 또는 조성물을 포함한다; 항생제 및 항바이러스제와 같은 항-간염제; 진통제 및 진통 조합물; 국소 및 일반적인 마취제; 식욕감퇴제; 항관절염제; 항천식제; 항경련제; 항우울제; 항히스타민제; 항염증제; 항구토제; 항편두통제; 항신생물제; 항가려움제; 항정신병제; 해열제; 항연축제; 심혈관 제조물 (칼슘 채널 차단제, β-차단제, β-효능제 및 항부정맥제 포함); 항고혈압제; 화학요법제; 이뇨제; 혈관확장제; 중추 신경계 자극제; 기침 및 감기 제조물; 충혈제거제; 진단제; 호르몬; 골형성 자극제 및 골 재흡수 억제제; 면역억제제; 근육 이완제; 정신자극제; 진정제; 신경안정제; 단백질, 펩티드 및 이의 단편(천연 발생, 화학적으로 합성 또는 재조합에 의해 생성); 및 핵산 분자(둘 이상의 뉴클레오티드의 고분자 형태, 이중- 및 단일-가닥 분자 및 슈퍼코일되거나 축합된 분자를 포함하는 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA), 유전자 구성물, 발현 벡터, 플라스미드, 안티센스 분자 등).

“펩티드” “폴리펩티드”“올리고펩티드” 및 “단백질”은 펩티드 또는 단백질 약물을 말할 때 동일하게 사용될 수 있으며 특정 분자량, 펩티드 서열 또는 길이, 생활성 또는 치료분야에 국한되지 않는다.

“치료적 효과”란 당해 방법에 따라 치료된 피검체, 사람 또는 동물의 병에서의 임의의 개선을 의미하며, 예방 또는 방지 효과, 또는 물리적 조사, 실험실용 또는 기계적 방법에 의해 탐지될 수 있는 질병, 질환 또는 병의 징후 및 증상의 중증도에 있어서의 임의의 경감을 수득하는 것을 포함한다.

특정 질병 또는 질환과 관련하여 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 “치료”또는 “치료하는”이란 (i) 질병, 질환 및/또는 병에 걸리기 쉬우나 아직 병에 걸린 것으로 진단되지 않은 동물 또는 사람에서 질병, 질환 또는 병이 발생하는 것을 예방하고; (ii) 질병, 질환 또는 병을 억제하고, 즉 이의 진행을 억제하고; 및/또는 (iii) 질병, 질환 또는 병을 경감시키고, 즉 질병, 질환 및/또는 병의 퇴화를 야기하는 것을 언급한다.

“대상” 또는 “환자”는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.

“조직 또는 세포 샘플”은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 조직 샘플의 “절편”은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.

“암”, “종양” 또는 “악성”은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

“유효량”은 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수해동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 “약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함”을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 “치료학적으로 유효량”으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수해 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로”등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이요하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 폴리라이신[poly(L-Lysine); poly(L-Lys)]이 접합된 pH 민감성 나노운반체 제조에 대한 것으로 종양 세포의 산성 조건에서 내부에 봉입된 약물을 효과적으로 방출할 수 있고 종양 세포의 유도할 수 있는 나노운반체를 개발하였다.

상기 나노운반체는 폴리라이신(poly-Lys)에 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)이 접합되고, 올레익산(Oleic acid; OA)과 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)이 결합된 형태로 포접 상호작용을 통해 CD 내부에 물질을 포접 또는 방출 시킬 수 있는 특징을 가지며, 하기 구조식을 갖는다.

<구조식>

결과적으로 나노운반체는 올레익산(Oleic acid)의 소수성 결합 및 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)의 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)에 대한 포접작용으로 나노운반체 간의 자기집합체를 형성한다.

또한, CD와 DMA가 접합된 폴리펩티드 나노운반체는 DMA가 CD 내부에 포접되면서 나노입자가 형성되고, 종양세포의 약산성 (~pH 6.8) 조건에서 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)에 포접된 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)의 분리로 인해 나노운반체의 구조가 붕괴되어 나노운반체 안에 함유된 약물이 외부로 방출을 유도할 수 있다.

나노입자는 낮은 pH 조건에서 self pulling/pushing 작용을 일으킴으로써 내부에 봉입된 약물의 방출을 증진시킬 수 있다. DMA가 접합된 폴리펩티드의 1차 아민은 종양세포의 약 산성 조건에서 가수분해 작용으로 자유 1차 아민으로 변하게 되어 종양세포막의 음이온성과의 정전기적 인력에 의해 세포 내부로 상당 양이 침투 될 수 있고 그 결과 내부에 봉입된 약물의 방출 속도의 증가와 종양 세포 치료의 뛰어난 효과를 가진다(도 1b참조).

또한, 본 발명의 나노운반체는 pH 7.0 이상의 조건에서는 나노운반체 간의 자기집합체 구조를 형성하여 내부에 봉입된 약물이 방출되지 않는 것을 특징한다.

따라서 pH 7.0이하의 약산성을 보이는 질병부위에 특이적으로 반응할 수 있는 특징이 있으며, 바람직하게는 pH 5.0내지 7.0의 약산성을 보이는 부위에 특이적으로 반응할 수 있다. 가장 바람직하게는 pH 6.0 내지 7.0의 약산성 환경에서 반응할 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 pH 민감성 약물 나노운반체를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물로 이용 될 수 있다.

상기 조성물은 pH가 7.0 미만의 병변 부위로 이동 및 축적되고, 나노운반체의 구조가 붕괴되어 나노운반체 안에 함유된 약물이 외부로 방출되어 암 세포의 사멸을 유도한다..

본 발명의 나노 운반체는 올레산의 소수성 특성 때문에 소수성을 가지는 여러 항암제를 효율적으로 전달하는 체계로 널리 이용될 수 있으며, 중성 pH에서 올레산은 소수성 약물을 위한 창고(저장소)로서 제공될 수 있다.

따라서 본 발명의 pH 민감성 나노 운반체는 일반 저분자량의 항암제보다 투과 보유성 효과(enhanced permeability and retention, 이하 ERP)에 의하여 암조직에 대한 선택성이 높아, 더 많은 양이 암조직에 축적되어 효과적으로 항암 작용을 발휘할 수 있는 장점이 있고, 항암제의 전달체로서 표적 지향적이며, 지속적 약물 방출이 가능한, 높은 항암 효과를 발휘할 수 있는 약제로서 암 등의 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 pH 민감성 나노 운반체의 다른 pH의 조건에서의 제타 전위(zeta potential) 변위 또한 약산성 조건에서 나노 운반체의 분해로 인해 양이온의 노출이 늘어났다는 사실을 보여준다.

일반적으로 제타 전위는 입자 사이의 반발력이나 인력의 크기에 대한 단위로서 정전기 분산을 제어하는데 중요한 요소로 사용되고 있는데, 상기 본 발명의 pH 민감성 나노 운반체의 제타 전위는 pH 7.4에서 -5mV 정도로 측정되었고, pH가 점점 낮아질수록 제타 전위는 증가하여 pH 5.0에서는 +13mV로 측정되었다. 이러한 결과를 통해 약산성 조건에서 본 발명의 pH 민감성 나노 운반체의 내부에 양이온이 증가하면서 양이온의 노출이 증가함을 알 수 있다(도 2b참조).

또한, 본 발명의 pH 민감성 나노 운반체인 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD에 대해, FE-SEM으로부터 수득한 형태학적 이미지 역시 pH 7.4에서 거의 구형의 형태를 지니는 나노 운반체가 pH 6.8에서 불안정하게 되고 부분적으로 사라진다는 것을 보여준다(도 2c참조).

즉, 본 발명의 일 구체예인 pH 민감성 나노 운반체인 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD를 이용한 약물전달 방법은 표적세포에 대한 선택성을 충분히 나타내면서 정상세포에의 독성을 현저히 줄이고, 장기간 약물이 지속적으로 방출되도록 하는 약물 전달체계로서 암과 같은 심각한 질환을 치료하는 새로운 개념의 치료법의 연구에 사용될 수 있다.

나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 pH 민감성 나노 운반체의 제조방법을 제공한다.

c) 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 1,3-디시클로헥실카르보이미드(1,3-dicyclohexylcarbodiimide(DCC)) 및 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide(NHS))의 존재 하에서 상기 b)단계에서 형성된 접합체에 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 결합시키는 단계를 포함한다.

상기 합성된 pH 민감성 나노 운반체는 투석 및 동결 건조를 통해 파우더 상태로 수득할 수 있으며, 수상에 녹일 경우 음전하(-)를 띈다.

따라서 본 발명의 방법으로 합성된 고분자가 용해된 수용액에 양전하(+)를 띄는 약리 활성을 갖는 약물을 첨가할 경우, 정전기적 인력, 즉, 이온결합에 의해 상기 고분자의 내부에 상기 약물을 봉입시킬 수 있다. 이때, 상기 합성된 고분자 및 약리 활성을 갖는 약물은 합성된 고분자 대 약리 활성을 갖는 약물을 1:1 내지 10:1의 혼합비(중량%)로 혼합할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 pH 민감성 나노 운반체는 앞서 기술된 바와 같이 표적 부위, 특히 표적 세포 내로 쉽고 빠르면서도 깊숙히 들어갈 수 있는 장점이 있다.

나아가, 본 발명의 약물 전달체는 미세한 pH의 변화에도 반응하여 약산성에서부터 작용 범위를 가질 수 있는 특징이 있으며, 구체적으로 본 발명의 약물 전달체는 약산성인 pH 7.0 이하에서 나노 운반체 내부에 봉입되어 있는 약리 활성을 갖는 약물이 방출될 수 있는 특징이 있다.

일반적으로 체내의 신진과정은 정상의 수소이온 농도를 유지하기 위해 체내에서 생성된 상당량의 산(acid)의 제거가 신속하게 이루어져야 한다. 그러나 이러한 유지 기능에 장애가 발생하여 수소이온 농도가 7.35 아래로 내려갈 경우에는 산증(acidosis)이 유발되고, 7.45 이상으로 올라갈 경우에는 알칼리성증(Alkalosis)이 유발된다. 또한, 상기 산증(acidosis)은 질환이 발생할 경우 보이는 현상 중 하나로서, 근무력증, 루게릭병 및 근위축증과 같은 근신경계(neuromuscular) 질환, 만성 폐쇄성 질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스 관절염 및 고형암과 같은 질병부위는 약산성을 띄는 특징이 있으며, 특히 고형암의 세포외(extracellular) pH는 7.2내지 6.0이다.

따라서 질병 발생 시 유발되는 pH의 변화를 이용하여 pH에 민감한 특성을 갖는 약물 전달체를 이용할 경우, 질병 특이적으로 약물 전달체가 작용할 수 있으므로 보다 정확하고 효과적으로 질병을 진단 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 약물전달체는 단기 치료적 효과 또는 치료를 위한 하나 이상의 약물 또는 치료제를 포함할 수 있는데, 약물 또는 치료제는 천연고분자 및 합성고분자 중합체를 용액에 용해시키기 전, 용해시키는 동안 또는 용해시킨 후에 겔을 제조하는데 사용된 중합체에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 약물 또는 치료제를 용해시키기 전에 첨가시켜 약물 또는 치료제의 보다 균일한 분산 또는 용해를 촉진시킨다.

약물 또는 치료제를 겔(중합체)에 혼입시킬 수 있는 다양한 기술이 공지되어 있으며, 분무 건조, 용매 증발, 상분리, 급속 냉동 및 용매 추출을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.

약물 또는 치료제는 상기 겔에 약 0.1 내지 약 100 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 약 50 중량%, 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 30 중량%로 포함된다. 그러나 약물 또는 치료제가 겔의 0.01 내지 95 중량%로 포함될 수도 있다. 겔에 포함된 약물 또는 치료제의 양 또는 농도는 약물 또는 치료제의 흡수비활성화 및 배출 속도 뿐만 아니라 겔 중 중합체의 전달 속도에 따라 달라질 것이다.

본 발명에서 상기 합성된 나노 운반체 내부에 봉입할 수 있는 약물로는 양전하를 띄는 약리 활성을 갖는 성분이라면 모두 사용할 수 있다.

바람직하게는 단백질, 펩타이드 및 합성화합물을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 양전하를 띄는 단백질을 사용할 수 있으며, 양전하를 띄는 상기 단백질로는 이에 제한되지는 않으나, 리소자임(lysozyme), TRAIL(tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), 판크레아토펩티다제 E(pancreatopeptidase E), 칼시토닌(calcitonin), HIV Tat 단백질(human immunodeficiency virus Tat protein), Antp 호메오 박스 단백질(Antennapedia homeobox protein), HSV VP22 단백질(herpes simplex virus VP22 protein), 트라스투주맙(trastuzumab), 아다리뮤맙(adalimumab), 세투시맙(cetuximab), 알렙투주맙(alemtuzumab). 리투시맙(rituximab), 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 알레파셉트(alefacept), 바실릭시맙(basiliximab), 다실리주맙(daclizumab), 에리트로포이에틴(erythropoietin; epoetin-α), 다베포에틴알파(darbepoetin-α), 오프렐베킨(oprelvekin; interleukin 11), 루트로핀알파(lutropin-α), 인터페론-베타1a(interferon-β 1a), 인터페론-베타 1b(interferon-β 1b), 인터페론-감마 1b(interferon-γ 1b), 글루카곤(glucagon), 세크레틴(secretin),아르시투모맙(arcitumomab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 토시투모맙(tositumomab), 알테프라제(alteplase; tissue plasminogen activatoerl), 테넥테플라제(tenecteplase), 유로키나아제(urokinase), 살몰 칼시토닌(salmon calcitonin), 팔리퍼민(palifermin;keratinicyte growth factor) 및 베카플러민(becaplermin; platelet-derived growth factor)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다. 이는 앞서 기술한 바와 같이, 본 발명에서 합성된 고분자의 경우, 수상에 용해 시키면 음전하(-)를 띄게 되므로 양전하를 띄는 약물을 사용할 경우, 보다 용이하게 이온결합을 형성할 수 있기 때문이다.

예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항신생물제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항바이러스제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 조직 또는 세포 응집물, 및 이들의 조합물이 있다.

뿐만 아니라, 암 화학요법제, 예컨대 시토킨, 케모킨, 림포킨 및 실제로 정제된 핵산, 및 백신, 예컨대 약독화된 인플루엔자 바이러스가 있다. 혼입될 수 있는 실제로 정제된 헥산은 게놈 핵산 서열, cDNA 엔코딩 단백질, 발현 벡터, 상보적인 핵산 서열과 결합하여 번역 또는 전사를 억제하는 안티센스 분자 및 리보자임을 포함한다. 또한, 국소 마취제, 예컨대 아메토카인, 아르티카인, 벤조카인, 부피바카인, 클로로프로카인, 디부카인, 디클로닌, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 옥세타자인, 프라목신, 프릴로카인, 프로카인, 프로파라카인 및 로피바카인; 마약성 진통제, 예컨대 알펜타닐, 알파프로딘, 부프레노르핀, 부토르파놀, 코데인, 코데인 포스페이트, 시클라조신, 덱스토모라미드, 데조신, 디아모르핀, 디히드로코데인, 디피아논, 페도토진, 펜타닐, 히드로코돈, 히드로모르폰, 케토베미돈, 레보르파놀, 메프타지놀, 메타돈, 메타딜 아세테이트, 모르핀, 날부핀, 노르프로폭시펜, 노스카핀, 옥시코돈, 옥시모르폰, 파레고릭, 펜타조신, 페티딘, 페나조신, 피리트라미드, 프로폭시펜, 레미펜타닐, 수펜타닐, 틸리딘 및 트라마돌; 및 비마약성 진통제, 예컨대 살리실레이트 또는 페닐프로피온산 유도체가 있다. 적합한 살리실레이트의 예로는 아미노살리실릭 나트륨, 발살라지드,콜린 살리실레이트, 메살라진, 올살라진, 파라-아미노 살리실산, 살리실산, 살리실살리실산, 및 설파살라진 등이 있다. 적합한 페닐프로피온산 유도체의 예로는 이부프로펜, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜 및 나프록센 등이 있다.

특히, 본 발명의 pH 민감성 나노 운반체는 암 질환부위 등의 약산성 환경에서 약물방출효능을 가지므로, 상기 약물은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 캄토테신으로 구성된 항암제 중 선택되는 1종 이상의 약물인 것이 바람직하다.

본 발명의 치료제 약물 전달 시스템은 당해 약물 시스템에 포함된 약물이 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달(예: 이식, 체강 또는 가능한 공간에 넣는 것, 신체의 조직 표면을 코팅 또는 이식가능한 장치의 표면을 코팅함으로써)될 수 있지만, 특히, 상기 조성물은 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. '비경구'란 근육내, 복막내, 복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 대표적으로 주사 제형으로 제제될 수 있다.

본 발명의 주사가능한 조성물은 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유 동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다.

예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체내 임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.

또한, 본 발명의 약물 전달 시스템에 따라, 약물 또는 치료제가 피검체의 표적 부위에 제어된 식으로 방출될 수 있다.

일 구체예에서, 나노 운반체를 사용하여 약물 또는 치료제의 피검체로의 부위-특이적 방출을 제공한다. 또 다른 일 구체예에, pH 민감성 나노 운반체는 피검체에 투여될 수 있는 하나 이상의 약물 또는 치료제를 포함하여, 약물 또는 치료제가 나노운반체로부터의 확산 및/또는 나노운반체의 분해에 의해 방출된다.

이 때, 조성물의 투여 값은 치료되는 질병, 질환 또는 병의 유형 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 임의의 특정 피검체에 대하여, 특정 용량 섭생이 개개인의 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 지시하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 함을 추가로 이해해야 한다. 생체내 투여는 세포 배양에서의 시험관내 방출 연구 또는 생체내 동물 모델에 기초할 수 있다.

약물 또는 치료제의 방출 속도는 많은 인자에 의존적인데, 특히, 겔을 구성하는 생체분해가능한 중합체의 분해 속도에 의존적이다. 또한, 약물 또는 치료제의 입경에 의존적이다. 따라서, 상기 논의된 인자들을 조정함으로써, 분해, 확산 및 제어된 방출을 매우 다양한 범위로 달리할 수 있다. 예를 들어, 방출이 시간, 일, 개월에 따라 일어나도록 고안될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명할 것이나, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

pH 민감성 나노운반체 제조

<1-1> 올레산과 폴리라이신의 합성

pH 민감성 나노 운반체를 제조하기 위해 라이신 단량체로부터 개환중합을 이용하여 폴리라이신(poly(L-Lysine); poly(L-Lys))을 합성한 후 1몰의 폴리라이신을 디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF) 30mL에 녹이고, N,N'-디시클로헥실카르보디미드(N,N'-dicyclohexylcarbodimide; DCC) 3mM과 N-히드록시숙신아마이드(N-hydroxysuccinimide; NHS) 3mM를 올레산(Oleic acid; OA) 3mM과 1일간 반응시킨 후 TFA/33%HBr을 이용하여 폴리라이신의 벤질기를 제거하여 OA-β-poly(Lys)를 합성하였다.

<1-2> 베타사이클로덱스트린과 디메틸말레익산 전구체 제조

1몰의 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO) 30mL에 녹이고, N,N'-디시클로헥실카르보디미드(N,N'-dicyclohexylcarbodimide; DCC) 3mM과 N-히드록시숙신아마이드(N-hydroxysuccinimide; NHS) 3mM과 4시간 반응시킨 후, 상기 용액을 투석막(Spectra/Por: 1000MW)으로 옮겨 펜타붕사(sodium tetraborate)용액 상(pH 8.0, 5mM)에서 합성되지 않은 물질을 제거 시킨 후 2일 동안 동결 건조하여 파우더 형태인 CD-DMA-NHS ester를 얻었다.

<1-3> pH 민감성 나노운반체 제조

상기 실시예 1-1에서 합성한 OA-β-poly(Lys) 1mM을 디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF) 30mL에 용해시킨 후 트리에틸렌아민 1mM과 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA) 16mM을 5일간 반응시킨 후 과량의 디에틸에테르(diethyl ether)에 재침전 한 뒤, 재침전 된 물질을 건조시킨 후 하루 정도 진공 건조 시킨다.

상기 진공 건조 시킨 후 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO) 용액 20mL에 용해시킨 후 상기 실시예 1-2에서 제조한 전구체 6mM과 트리에틸렌아민 1㎖를 첨가하여 3일간 반응시킨 후, 상기 용액을 투석막(Spectra/Por: 5000MW)으로 옮겨 펜타붕사(sodium tetraborate)용액 상(pH 8.0, 5mM)에서 합성되지 않은 물질을 제거 시킨 후 2일 동안 동결 건조하여 파우더 형태인 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD를 얻었다(도 1a 참조).

<실험예 1>

나노입자의 물리 화학적 특성

상기 실시예　1을 통해 제조된 pH 민감성 나노운반체(OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD)의 물리화학적 특성을 확인하는 실험을 하였다.

<1-1> 산· 염기적정

탈이온수(30mM)에 용해된 상기 실시예 1을 통해 제조한 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD, OA-β-poly(Lys-g-DMA) 및 NaCl(eowhrns)를 1M NaOH로 pH10까지 조정하였다. 상기 용액을, 0.1 M HCl 용액의 다단계 첨가법(stepwise addition)에 의해 적정하여 pH 프로파일을 얻었다. 3회의 평균값을 표시하였다.

그 결과 도 2a에서와 같은 그래프 양상을 보여준다. 이는 산성 pH에서 2,3-디메틸말레익산의 탈락 때문에 프로톤화된 자유 1차 아민그룹의 생성으로 인해 나노 입자의 완충범위가 pH 6.7 내지 7.2로 나타나는 것을 알 수 있었다.

<1-2> 제타전위측정

상기 실시예 1-3의 투석막을 통한 투석 과정 동안 pH 민감성 나노운반체의 제타전위를 zetasizer 3000을 이용하여 측정하였다. 테스트 전에, 상기 pH 민감성 나노 운반체 용액을 4시간 도안 실온에서 안정화 시켰다.그 결과 도 2b에서처럼 2-4시간 교반하였을 때 pH 민감성 나노운반체로부터 2,3-디메틸말레익산의 탈락에 따라 pH 민감성 나노운반체 표면의 전위의 변화가 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 24시간 교반 후 용액의 pH가 7.4에서 5.0으로 감소하며 pH 민감성 나노운반체(OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD)의 제타전위는 -5mV에서 +13mV로 증가하였다.

<1-3> pH 변화에 따른 입자의 특성

pH 변화에 따른 pH 민감성 나노운반체에서의 베타사이클로덱스트린의 영향을 알아보는 실험을 하였다. 상기 나노운반체의 형태는 주사전자현미경(FE-SEM)을 이용하여 확인하였다. 그 결과 pH 6.8-7.4 사이에서 입자 사이즈 변화가 가장 극대화되어 나타났다.

본 발명에 따른 pH 민감성 나노운반체(OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD)는 pH7.4에서 거의 구형의 입자모양을 나타내었으나 pH 6.8에서는 사라지는 것을 알 수 있었다(도 2c참조). 또한, 베타사이클로덱스트린이 없는 OA-β-poly(Lys-g-DMA)의 경우 pH 변화에 따라 입자 형태의 변화가 나타나지 않았다(도 2d참조). OA-β-poly(Lys-g-DMA)의 경우 나노입자 형태를 형성하지 않는 것을 확인하였다.

즉, 올레산의 소수성 상호작용과 베타사이클로덱스트린 내부로 포접된 2,3-디메틸말레익산 사이의 포접작용을 통해 나노입자가 형성되며, 산성 환경에서의 2,3-디메틸말레익산의 탈락은 나노입자의 불안정성과 입자 내부로의 물 확산에 의해 물질의 붕괴를 일으키는 것을 알 수 있다.

또한, pH가 7.4에서 6.0의 변화에 따른 pH 민감성 나노운반체(OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD)의 특성을 원평광 이색성 측정장치(Circular dichroism; CD)를 통해 분석하였다. 근자외선 범위(250nm-350nm)내에서 pH 7.4 수용액 상의 나노운반체의 CD 시그널은 내부에 존재하는 2,3-디메틸말레익산에 의해 높게 나타난다. 반면, pH6.8에서는 2,3-디메틸말레익산의 탈락에 의해 CD 시그널이 낮게 나타났으며, 이는 나노입자의 구조적 붕괴를 나타내는 결과이다(도 2e참조).

<1-4> pH 변화에 따른 항암제의 방출경향

pH변화에 따른 항암제(Doxorubicin; DOX)의 방출경향을 살펴본 결과, pH 7.4에서는 DOX의 방출양이 낮았으나 pH 6.87에서는 방출양이 증가되는 것을 알 수 있다(도 2f참조).

< 실험예 2>

나노입자의 In vivo 항종향 효과 1

항암제(Doxorubicin; DOX)가 봉입된 pH 민감성 나노운반체(OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD)의 종양세포(KB)에 대한 흡수는 서로 다른 pH에 따라 형광 현미경(도3a 참조)과 유세포분석기(도 3b 참조)를 이용하여 관찰하였다. 상기 형광 현미경 측정은 DOX가 봉입된 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD의 질량대비 DOX 10㎍/㎖를 처리하였으며 유세포분석기는 DOX가 봉입된 (OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD)의 질량대비 DOX 1㎍/㎖을 처리하여 관찰하였다.

pH 6.8에서는 2,3-디메틸말레익산이 탈락된 후 프로톤화된 아민그룹에 의해 pH 7.4보다 더 높은 세포 흡수를 나타낸다(도 3a참조). 이러한 결과는 상기 유세포분석기를 통해 얻은 분석 결과와 일치하는 것을 알 수 있다(도 3b참조).

또한, DOX가 봉입된 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD와 OA-β-poly(Lys-g-DMA) 및 DOX를 각각 pH 7.4(도 3c참조)와 pH 6.8(도 3d참조)에서 처리한 후 KB 암세포 생존율(n=7)을 측정하였다.

그 결과, pH 7.4보다 pH 6.8에서 비교적 높은 종양 세포의 사멸을 유도하는 것을 알 수 있다(도 3c-d참조).

< 실험예 3>

나노입자의 In vivo 항종향 효과 2

Cy5.5가 표지된 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD(복용량 50mg/kg)를 KB 종양세포를 가지고 있는 누드마우스의 종양 내 및 정맥주사 후 in vivo 비침습 형광 사진을 촬영하였다. 그 결과, 도 4a에서와 같이 시간이 경과함에 따라 종양의 크기가 줄어드는 것을 알 수가 있었다.

또한, OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD를 정맥주사한 경우 종양 부위에서 높은 형광이 나타났으며, 특히, OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD를 정맥주사한 경우 종양 성장 억제에 효과적임을 알 수 있었다(도 4b참조).

또한, KB 종양 세포를 가지고 있는 누드 마우스에 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD와 OA-β-poly(Lys-g-DMA) 및 DOX 주입(복욕량: DOX 기준 10mg/kg) 후 종양 부피

퇴행 결과(n=5) 시간이 지남에 따라 OA-β-poly(Lys-g-DMA)-CD를 누드 마우스에 처리한 경우 종양 부피 퇴행 결과가 가장 뚜렷하게 나타냄을 알 수가 있다.(도 4c참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

폴리라이신(poly-Lys)에 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)이 접합되고, 올레익산(Oleic acid; OA)과 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)이 결합된 하기 구조식을 갖는 pH 민감성 약물 나노운반체;
<구조식>
제1항에 있어서,
상기 나노운반체는 올레익산(Oleic acid)의 소수성 결합 및 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)의 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)에 대한 포접작용으로 나노운반체 간의 자기집합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 나노운반체.
제1항에 있어서,
상기 약물은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 캄토테신으로 구성된 항암제 중에서 선택된 1종 이상의 약물로서 상기 나노운반체 안에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 나노운반체.
제1항에 있어서,
상기 나노운반체는 pH 7.0 미만의 조건에서 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)에 포접된 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; CD)의 분리로 인해 나노운반체의 구조가 붕괴되어 나노운반체 안에 함유된 약물이 외부로 방출되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 나노운반체.
제1항에 있어서,
상기 나노운반체는 pH 7.0 이상의 조건에서는 나노운반체 간의 자기집합체 구조를 형성하여 내부에 봉입된 약물이 방출되지 않는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 나노운반체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 pH 민감성 약물 나노운반체을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 pH가 7.0 미만의 병변 부위로 이동 및 축적되고, 나노운반체의 구조가 붕괴되어 나노운반체 안에 함유된 약물이 외부로 방출되어 암 세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
a) 폴리라이신(poly-Lys)에 올레산(Oleic acid; OA)을 접합시키는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 형성된 접합체에 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)을 접합시키는 단계;
c) 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 1,3-디시클로헥실카르보이미드(1,3-dicyclohexylcarbodiimide(DCC)) 및 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide(NHS))의 존재 하에서 상기 b)단계에서 형성된 접합체에 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 결합시키는 단계를 포함하는, 하기 구조식을 갖는 pH 민감성 약물 나노운반체의 제조방법;
<구조식>