KR20140118458A - Ｓｄａ／ｐｅｉ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체 - Google Patents

Ｓｄａ／ｐｅｉ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체 Download PDF

Info

Publication number
KR20140118458A
KR20140118458A KR1020130034414A KR20130034414A KR20140118458A KR 20140118458 A KR20140118458 A KR 20140118458A KR 1020130034414 A KR1020130034414 A KR 1020130034414A KR 20130034414 A KR20130034414 A KR 20130034414A KR 20140118458 A KR20140118458 A KR 20140118458A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
gene
psmt
pei
sda
Prior art date
Application number
KR1020130034414A
Other languages
English (en)
Inventor
조종수
조명행
신지영
박영찬
Original Assignee
서울대학교산학협력단
(주)크로엔리서치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단, (주)크로엔리서치 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020130034414A priority Critical patent/KR20140118458A/ko
Publication of KR20140118458A publication Critical patent/KR20140118458A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/68—Polyesters containing atoms other than carbon, hydrogen and oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 PEI (polyethyleneimine) 및 SDA (sorbitol diacrylate)가 결합된 SDA/PEI (PSMT) 공중합체, 상기 SDA/PEI (PSMT) 공중합체에 유전자가 결합된 유전자 전달체, 및 상기 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SDA/PEI (PSMT) 공중합체는 유전자 (DNA, RNA 등)에 높은 결합능을 나타내어 PSMT/유전자 복합체를 형성하며, 상기 PSMT/유전자 복합체는 200 nm이하의 작은 크기로 세포 내 유입이 가능하고, 세포 독성이 없으면서, 우수한 암 세포 표적능을 가지고 있어, 유전자 전달체 및 암의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＳＤＡ／ＰＥＩ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체 {SDA/PEI copolymer and gene delivery carrier comprising the same}
본 발명은 PEI (polyethyleneimine) 및 SDA (sorbitol diacrylate)가 결합된 SDA/PEI (PSMT) 공중합체, 상기 SDA/PEI (PSMT) 공중합체에 유전자가 결합된 유전자 전달체, 및 상기 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
유전자 치료(gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 치료하여 제거하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 다만, DNA 등 치료 핵산은 생체 내 효소에 의한 가수분해에 취약하고 세포 내로 유입되는 효율이 낮기 때문에, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 핵산을 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현효율의 달성을 가능케 하는 핵산 전달체(gene carrier)를 개발하는 것이 필수적이다.
유전자 전달체는 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다. 최근까지 임상 실험에는 유전자 전달체로 형질도입 효율이 높은 바이러스성 벡터(viral vector)가 사용되었다. 그러나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 핵산의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 벡터(non-viral vector)가 바이러스성 벡터의 대용으로 각광을 받고 있다.
비바이러스성 벡터는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 안전성 및 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터의 예로는 양이온성 리포좀(liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 알킬암모늄(alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있다. 그러나, 종래의 리포좀 계열 핵산 전달체는 혈액 안정성이 낮고, 가격 경쟁력이 낮은 단점이 있다.
최근 비바이러스성 벡터 중 양이온성 고분자가 음전하를 띠는 DNA또는 RNA 등과 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있기 때문에 많은 관심을 불러일으키고 있다. 이러한 양이온성 고분자에는 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N'-(디메틸아미노)에틸]메타크릴레이트(PDMAEMA) 등이 포함되며, 이들은 DNA 등 치료 핵산을 압축하여 나노 입자를 형성함으로써 효소 분해로부터 DNA를 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 상대적으로 낮은 형질도입 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다. 비바이러스성 벡터로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 역시 생체 내 형질도입 효율이 현저히 떨어지며, 높은 세포독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인한 핵산의 낮은 발현 효과 등의 문제점이 있다. 따라서, 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질도입 효율을 증강시킨 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 신규한 유전자 전달체를 개발하기 위해 노력한 결과, PEI (polyethyleneimine) 및 SDA (sorbitol diacrylate)가 결합된 SDA/PEI (PSMT) 공중합체가 유전자 (DNA, RNA 등)에 높은 결합능을 나타내어 PSMT/유전자 복합체를 형성하며, 상기 PSMT/유전자 복합체는 세포 독성이 없으면서, 우수한 암 세포 표적능을 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PEI (polyethyleneimine) 및 SDA (sorbitol diacrylate)가 결합된 SDA/PEI (PSMT) 공중합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SDA/PEI (PSMT) 공중합체에 유전자가 결합된 유전자 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PEI (polyethyleneimine) 및 SDA (sorbitol diacrylate)가 결합된 SDA/PEI (PSMT) 공중합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SDA/PEI (PSMT) 공중합체에 유전자가 결합된 유전자 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 SDA/PEI (PSMT) 공중합체는 유전자 (DNA, RNA 등)에 높은 결합능을 나타내어 PSMT/유전자 복합체를 형성하며, 상기 PSMT/유전자 복합체는 200 nm 이하의 작은 크기로 세포 내 유입이 가능하고, 세포 독성이 없으면서, 우수한 암 세포 표적능을 가지고 있어, 유전자 전달체 및 암의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1 은 SDA/PEI (PSMT) 공중합체의 제조 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 SDA/PEI (PSMT) 공중합체의 NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 SDA/PEI (PSMT) 공중합체의 DNA 응축 능력을 전기영동을 이용하여 확인한 도이다 (1 레인: DNA, 2 내지 7 레인: PSMT/DNA 복합체의 N/P 비가 각각 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10임).
도 4는 SDA/PEI (PSMT) 공중합체의 siRNA 응축 능력을 전기영동을 이용하여 확인한 도이다 (1 레인: 마커, 2 레인: siRNA, 3 내지 7 레인: PSMT/siRNA 복합체의 N/P 비가 각각 0.1, 0.5, 1, 5, 10임).
도 5는 PSMT/DNA 복합체의 DNA 보호 효과를 확인한 도이다 (마커 제외 1 레인: DNA, 2 레인: DNA+DNase Ⅰ, 3 레인: PSMT/DNA 복합체, 4 레인: PSMT/DNA 복합체+DNase Ⅰ).
도 6은 PSMT/siRNA 복합체의 siRNA 보호 효과를 확인한 도이다 (마커 제외 1 레인: siRNA, 2 레인: siRNA+RNase A, 3 레인: PSMT/siRNA 복합체, 4 레인: PSMT/siRNA 복합체+ RNase A).
도 7은 N/P 비에 따른 PSMT/DNA 복합체의 입자 크기 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 EF-TEM을 통해 PSMT/DNA 복합체의 형태를 관찰한 도이다.
도 9는 EF-TEM을 통해 PSMT/siRNA 복합체의 형태를 관찰한 도이다.
도 10은 SDA/PEI (PSMT) 공중합체의 세포 독성을 확인하기 위한 MTT 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 A549 세포에서 PSMT/siRNA 복합체의 트랜스펙션 효율을 확인하기 위한 루시퍼라제 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 HeLa 세포에서 PSMT/siRNA 복합체의 트랜스펙션 효율을 확인하기 위한 루시퍼라제 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 293T 세포에서 PSMT/siRNA 복합체의 트랜스펙션 효율을 확인하기 위한 루시퍼라제 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 폐암 동물 모델을 이용한 실험기간 동안 각 실험군 별 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 15는 폐암 동물 모델을 이용한 실험기간 동안 각 실험군 별 종양 부피의 크기 변화를 나타낸 도이다.
도 16은 폐암 동물 모델에 PSMT/siRNA 복합체의 투여 시 최종 종양 무게를 나타낸 도이다.
도 17은 폐암 동물 모델에 PSMT/siRNA 복합체의 투여 시 최종 종양 조직의 크기를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는, PEI (polyethyleneimine) 및 SDA (sorbitol diacrylate)가 결합된 SDA/PEI (PSMT) 공중합체를 제공한다.
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, m는 1 내지 500의 정수이다.
상기 PEI는 바람직하게는 가지형 PEI (branched PEI)이며, 상기 가지형 PEI (branched PEI, bPEI)는 분자량이 바람직하게는 400 Da 내지 15,000 Da이다.
상기 SDA/PEI (PSMT) 공중합체의 제조 시, 공중합 반응은 유기용매 하에서 진행되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는, 하기와 같은 과정을 통해 SDA/PEI (PSMT) 공중합체를 제조한다. 먼저 PEI (polyethyleneimine) 및 SDA (sorbitol diacrylate)를 각각 유기용매에 녹인다. PEI 용액에 SDA를 천천히 떨어뜨려 섞어준다. 이 때 바람직하게는 SDA:PEI의 몰비가 1:1이 되게 한다 (예: SDA 1M=290.27g/L, bPEI600 1M=600g/L). 약 80 °C에서 약 24시간 동안 충분히 혼합시켜 마이클 부가 반응(michael addition)을 수행한 후, 증류수를 이용하여 투석하고, 감압 하에 동결 건조한다. 상기 유기용매는 DMSO, 디옥산, THF, 디클로로메탄, DMF 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 SDA/PEI (PSMT) 공중합체는 유전자 (DNA, RNA 등)에 높은 결합능을 나타내어 PSMT/유전자 복합체를 형성하며, 상기 PSMT/유전자 복합체는 200 nm이하의 작은 크기로 세포 내 유입이 가능하고, 세포 독성이 없으면서, 우수한 암 세포 표적능을 가지고 있어, 유전자 전달체 및 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 SDA/PEI (PSMT) 공중합체에 유전자가 결합된 유전자 전달체를 제공한다.
상기 유전자 전달체에 결합될 수 있는 치료 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 형태의 유전자도 본 발명의 범위에 포함되며, 예를 들어 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA, DNA-RNA 혼성체 (hybrid), 리보자임 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자 전달체의 크기는 10 내지 200 nm, 바람직하게는 50 내지 200 nm이다.
상기 유전자 전달체의 N/P 비는 바람직하게는 1 내지 40이며, 보다 바람직하게는 15 내지 25이다.
본 발명의 유전자 전달체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 적절한 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 전달체는 통상의 방법에 따라 경구형 제형 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 다양하게 제형화할 수 있으며, 고체의 나노입자 및 미립구 분말로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 SDA/PEI (PSMT) 공중합체에 유전자가 결합된 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 혈액암, 대장암, 뇌암, 신경교종, 신경교육종, 역형성성상세포종, 수모세포종, 위암, 폐암, 소세포 폐 암종, 자궁경부암종, 결장암, 직장암, 척삭종, 인후암, 카포시 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 결직장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포암종, 간암종, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 고환 종양, 윌름 종양, 유잉 종양, 방광 암종, 혈관육종, 내피육종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두선 육종, 낭선육종, 기관지 암종, 수질 암종, 비만 세포종, 중피종, 활막종, 흑색종, 평활근종, 횡문근종, 신경모세포종, 망막모세포종, 핍지교종, 청신경종, 혈관모세포종, 수막종, 송과체종, 상의세포종, 두개인두종, 상피 암종, 배아 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포암종, 섬유육종, 점액종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종 및 백혈병 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하, 흡입 또는 국소 투여가 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.1 mg 내지 100 mg의 양으로 투여할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 항암 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SDA / PEI 공중합체 ( PSMT )의 제조
bPEI (branched PEI 600; Wako chemical) 및 SDA (sorbitol diacrylate, MW, 290.27 Da; purity, 98%)를 무수 DMSO에 각각 녹였다(SDA 1M=290.27g/L, bPEI600 1M=600g/L). 그리고 나서, 질소 퍼지하에서 SDA를 PEI 용액에 천천히 떨어뜨려 PEI 대 SDA의 화학량론적 비율이 1:1이 되게 하였다. 반응은 80 °C에서 24시간 동안 마그네틱바를 이용해서 저으며 수행하였다. 상기 반응 혼합액을 4 °C에서 48 시간 동안 증류수 (MWCO: 3500 Da)에 투석하고, 감압 하에 동결 건조하였다. 최종 산물은 －70 °C에서 보관하였다. 이상의 제조 과정을 도 1에 나타내었다. 대조군으로는 PEI 25K (MW, 25000 Da; purity, 97%)를 이용하였다.
실시예 2. PSMT /유전자 복합체의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 PSMT 용액 및 유전자 (DNA 또는 siRNA)를 멸균수에 다양한 N/P비로 섞어 준비하였다 (예: N/P 비 = 1인 경우, 1mg siRNA = 0.49 mg SDA/bPEI600). 이때 이용된 DNA는 pGL3였으며, siRNA의 서열은 5’-CGA GGU GAU AGC UUG GCU UAU-3’이다. siRNA를 유전자로 이용할 경우, RNase free water (DEPC treated water)에서 반응을 수행하였다.
실험예 1. SDA / PEI 공중합체 ( PSMT )의 확인
상기 실시예 1에서 제조한 SDA/PEI 공중합체가 제대로 제조되었는지를 확인하기 위하여, NMR (Avance TM 600, Bruker, Germany)을 통해 구조를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 2.2~2.5ppm에서 PEI 유닛의 메틸렌 양성자 (methylene proton)를 나타내는 피크가 확인되었으며, 3.5~4.3 및 5.8~6.8에서 각각 PSMT의 메틸렌 그룹과 SDA의 바이닐 그룹을 나타내는 피크가 확인되었다.
구체적인 SDA/PEI 공중합체 (PSMT)의 특징을 표 1에 나타내었다.
Figure pat00002
실험예 2. PSMT /유전자 복합체의 특성 분석
상기 실시예 2에서 수득한 PSMT/유전자 (DNA 또는 siRNA) 복합체의 물리 화학적 특성을 분석하였다.
2-1. DNA 또는 RNA 응축능 확인
유전자 전달체는 DNA 등의 유전자와 상호작용하여 이를 응축시킬 수 있는 능력을 가지고 있어야 한다. 이에 N/P 비의 변화에 따른 PSMT/유전자 (DNA 또는 siRNA) 복합체의 DNA 또는 RNA 응축 (condensation) 능력을 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, N/P 비의 증가에 따라 PSMT/유전자 (DNA 또는 siRNA) 복합체가 효과적으로 형성되어 지연 현상이 야기됨을 확인하였다.
2-2. DNA 또는 RNA 보호 효과 확인
유전자 전달체로서 효과적인 유전자 발현을 위해서는 핵산 분해 효소와 같은 효소로부터 유전자 전달체 내의 유전자가 보호될 수 있어야 한다. 이를 확인하기 위해, PSMT/유전자 (DNA 또는 siRNA) 복합체(N/P 비 =20)에 DNase Ⅰ 또는 RNase A를 처리한 후, 전기영동을 수행하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, PSMT/유전자 (DNA 또는 siRNA) 복합체는 DNase Ⅰ 또는 RNase A와 같은 핵산 분해 효소로부터 효과적으로 보호할 수 있음을 확인하였다.
2-3. 입자 크기 측정
유전자 전달체의 입자 크기는 복합체가 표적 부위에 접근하고 이를 통과하는데 중요한 요소로, 대부분의 유전자 복합체는 세포 내 이입(endocytosis) 또는 포액작용 (pinocytosis)에 의해 세포 내로 유입되기 때문에, 최적의 세포 내 유입을 위해서는 복합체의 크기가 일정 수준 이하인 것이 요구된다. 이에 DLS (Dynamic light scattering, ELS 8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 N/P 비의 변화에 따른 PSMT/DNA 복합체의 입자 크기를 측정하였다. 이때, 산란각도(scattering angle)는 90° 및 20°로 설정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, PSMT/DNA 복합체의 입자 크기는 N/P 비의 증가에 따라 점진적으로 증가하였으며, N/P 비가 40일 때 PSMT/siRNA 복합체의 크기는 140 nm 정도로 유전자 전달체로 사용되기에 적합한 입자 크기를 가지고 있음을 확인하였다.
2-4. 형태학적 분석
PSMT/DNA 또는 PSMT/siRNA 복합체의 형태를 EF-TEM (JEM 1010, JEOL, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, PSMT/유전자 복합체(N/P 비 = 20)는 구형이고, 응축된 형태임을 확인하였다.
실험예 3. SDA / PEI 공중합체 ( PSMT )의 세포 독성 분석
상기 실시예 1에서 수득한 PSMT의 세포 독성을 확인하기 위하여, 공지된 방법에 따라 A549 세포에서 MTT 어세이를 수행하였다. 보다 구체적으로, 각 세포를 24웰 플레이트에 10 × 104 cells/well의 농도로 심고, 약 80% 컨플루언시를 이룰 수 있도록 18 내지 20시간 동안 성장 배지에서 배양하였다. 성장 배지를 제거한 후, 다양한 농도를 가진 PSMT를 포함하는 배지 (혈청 포함 안됨) 500 μL 를 처리하고 24시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 배양하였다. 배양 후 50 μL의 MTT 용액을 처리하고 37°C에서 4시간 동안 더 배양한 후, DMSO로 녹이고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 (GLR 1000, Genelabs Diagnostics, Singapore). 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 PSMT는 PEI25K가 고 농도에서 세포 독성을 나타내는 것과는 달리, 농도의 증가나 시간의 흐름에도 불구하고 세포 독성이 거의 없음을 확인하였다.
실험예 4. PSMT / DNA 복합체의 트랜스펙션 효율 분석
상기 실시예 2에서 수득한 PSMT/DNA 복합체의 트렌스펙션 효율을 분석하기 위하여, 루시퍼라제 어세이를 수행하였다. 보다 구체적으로, A549 (Human lung adenocarcinoma epithelial cells), HeLa (human cervix epithelial carcinoma) 및 293T (human kidney transformed cells) 세포를 이용하였으며, 각 세포에 다양한 N/P 비를 가진 PSMT/DNA 복합체(1 μg of pGL3)를 혈청이 포함되지 않은 배지와 함께 처리하고, 37 °C에서 4시간 동안 배양하였다. 이 후, 10% 혈청이 포함된 배지로 교체하고 24시간 동안 더 배양한 후, 루시퍼라제 활성을 chemiluminometer (Autolumat, LB953; EG&G Berthold, Germany)를 이용하여 측정하였다. RLUs (relative light units)값은 BCA 단백질 어세이 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정한 세포 내의 단백질 농도를 통해 표준화하여 구하였다. 양성대조군으로는 리포펙타민 2000을 이용하였으며, 비교군으로 기존의 PEI25K/DNA 복합체를 이용하였다. 그 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다.
도 11 내지 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 PSMT/ DNA (pGL3) 복합체는 세 가지 종류의 세포에서 모두 N/P비의 증가에 따라 점진적으로 트렌스펙션 효율이 증가함을 확인하였다. 반면, PEI25K/DNA (pGL3) 복합체는 N/P비의 증가에 따라 급격하게 트렌스펙션 효율이 감소하였다.
실험예 4. PSMT / siRNA 복합체의 폐암 치료 효과 검증
상기 실시예 2에서 수득한 PSMT/siRNA 복합체가 유전자 치료제로 작용하여 암 세포에서 항암 효과를 나타낼 수 있는지 검증하기 위하여, 폐암 세포 in vivo 이종이식 (xenograft) 모델을 이용하여 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, 4주령의 수컷 Balb/c-nu 마우스를 이용하였으며, H460(Lung Cancer)을 마우스 당 5x106 세포로 피하에 주입하였다. 종양이 생긴 마우스를 무작위로 총 6개의 실험군으로 나누었으며, 각 시험 물질을 4주에 걸쳐 총 8회 투여하였다. 양성 대조군에 이용된 시스플라틴은 항암제의 일종으로 방광암, 난소암, 전립선암 등에 이용되고, 폐암 치료 시 생존률이 우수하나, 신장 독성, 골수 억제, 청력 장애 등의 부작용을 가지고 있는 물질이다. 구체적인 실험군은 하기와 같다.
1. 대조군 (Control) : 아무 물질도 투여하지 않음
2. 벡터 대조군 (Vector Control) : SDA/bPEI600 + siRNA Scramble
3. 실험군 (1) : SDA/bPEI600 + siRNA OPN (0.1mg/kg, i.v.)
4. 실험군 (2) : SDA/bPEI600 + siRNA OPN (0.5mg/kg, i.v.)
5. 실험군 (3) : SDA/bPEI600 + siRNA OPN (1.0mg/kg, i.v.)
6. 양성 대조군 (Positive Control) : Cisplatin (5mg/kg, i.p.)
실험기간 동안 마우스의 체중 및 종양의 크기를 주기적으로 측정하였으며, 마지막 시험 물질 투여 48시간 후 부검하였다. 그 결과를 도 14 내지 도 17에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 실험기간 동안 각 군간에 유의적인 체중 변화는 나타나지 않았다.
도 15 내지 도 17에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 PSMT/siRNA 복합체 투여군은 종양 크기의 증가가 현저하게 억제됨을 확인하였으며, 이러한 항암 효과는 siRNA OPN의 농도에 의존적으로 나타났고, siRNA OPN의 농도가 1.0 mg/kg일 때 알려진 항암제인 시스플라틴에 비해 통계적으로 유의한 항암 효과가 나타남을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 SDA/PEI (PSMT) 공중합체는 유전자 (DNA, RNA 등)에 높은 결합능을 나타내어 PSMT/유전자 복합체를 형성하며, 상기 PSMT/유전자 복합체는 200 nm 이하의 작은 크기로 세포 내 유입이 가능하고, 세포 독성이 없으면서, 우수한 암 세포 표적능을 가지고 있어, 유전자 전달체 및 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1-1. 산제의 제조
PSMT/유전자 복합체 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 주사제의 제조
PSMT/유전자 복합체 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-3. 액제의 제조
PSMT/유전자 복합체 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는, PEI (polyethyleneimine) 및 SDA (sorbitol diacrylate)가 결합된 SDA/PEI (PSMT) 공중합체.
    [화학식 1]
    Figure pat00003

    상기 화학식 1에서, m는 1 내지 500의 정수이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 PEI는 가지형 PEI (branched PEI)인 것을 특징으로 하는, SDA/PEI (PSMT) 공중합체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 가지형 PEI (branched PEI, bPEI)는 분자량이 400 Da 내지 15,000 Da인 것을 특징으로 하는, SDA/PEI (PSMT) 공중합체.
  4. 제 1항의 SDA/PEI (PSMT) 공중합체에 유전자가 결합된 유전자 전달체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 유전자는 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 유전자 전달체의 크기는 10 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 N/P비가 1 내지 40인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 암세포 특이적으로 치료 유전자를 전달하는 암세포 표적능을 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  9. 제 4항의 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 암은 혈액암, 대장암, 뇌암, 신경교종, 신경교육종, 역형성성상세포종, 수모세포종, 위암, 폐암, 소세포 폐 암종, 자궁경부암종, 결장암, 직장암, 척삭종, 인후암, 카포시 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 결직장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포암종, 간암종, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 고환 종양, 윌름 종양, 유잉 종양, 방광 암종, 혈관육종, 내피육종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두선 육종, 낭선육종, 기관지 암종, 수질 암종, 비만 세포종, 중피종, 활막종, 흑색종, 평활근종, 횡문근종, 신경모세포종, 망막모세포종, 핍지교종, 청신경종, 혈관모세포종, 수막종, 송과체종, 상의세포종, 두개인두종, 상피 암종, 배아 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포암종, 섬유육종, 점액종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020130034414A 2013-03-29 2013-03-29 Ｓｄａ／ｐｅｉ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체 KR20140118458A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130034414A KR20140118458A (ko) 2013-03-29 2013-03-29 Ｓｄａ／ｐｅｉ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130034414A KR20140118458A (ko) 2013-03-29 2013-03-29 Ｓｄａ／ｐｅｉ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140118458A true KR20140118458A (ko) 2014-10-08

Family

ID=51991308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130034414A KR20140118458A (ko) 2013-03-29 2013-03-29 Ｓｄａ／ｐｅｉ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20140118458A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Receptor and microenvironment dual-recognizable nanogel for targeted chemotherapy of highly metastatic malignancy
Bao et al. A chitosan-graft-PEI-candesartan conjugate for targeted co-delivery of drug and gene in anti-angiogenesis cancer therapy
Qian et al. Star-branched amphiphilic PLA-b-PDMAEMA copolymers for co-delivery of miR-21 inhibitor and doxorubicin to treat glioma
Li et al. Dual sensitive and temporally controlled camptothecin prodrug liposomes codelivery of siRNA for high efficiency tumor therapy
US20240131170A1 (en) Cationic amphiphilic polymers for codelivery of hydrophobic agents and nucleic acids
Ye et al. An integrated therapeutic delivery system for enhanced treatment of hepatocellular carcinoma
Jiang et al. Chitosan-graft-spermine as a gene carrier in vitro and in vivo
Gao et al. Reversal of multidrug resistance by reduction-sensitive linear cationic click polymer/iMDR1-pDNA complex nanoparticles
US20190292549A1 (en) Poly(ethylene glycol) brushes for efficient rna delivery
US20220054633A1 (en) Nanoparticles, controlled-release dosage forms, and methods for delivering an immunotherapeutic agent
Tam et al. Therapeutic potentials of short interfering RNAs
Butowska et al. Doxorubicin-conjugated siRNA lipid nanoparticles for combination cancer therapy
Liu et al. Metformin-conjugated micellar system with intratumoral pH responsive de-shielding for co-delivery of doxorubicin and nucleic acid
KR101734018B1 (ko) 비타민 b6 결합 핵산 전달체 및 이를 이용한 유전자 암치료
KR102003239B1 (ko) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법
EP3214178B1 (en) Polyol-based osmotic polydixylitol polymer based gene transporter and use thereof
CA3008095C (en) A pharmaceutical composition comprising apatite-based matrix and surface modifying agent
KR101560339B1 (ko) 의약 조성물 또는 조합제
KR20140118458A (ko) Ｓｄａ／ｐｅｉ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체
Zhu et al. The Synthesis of Glutamine‐Functionalized Block Polymer and Its Application in Triple‐Negative Breast Cancer Treatment
US9138488B2 (en) Polysorbitol-based osmotically active transporter and gene therapy using same
Liu et al. Integrating disulfides into a polyethylenimine gene carrier selectively boosts significant transfection activity in lung tissue enabling robust IL-12 gene therapy against metastatic lung cancers
KR101459185B1 (ko) 스페르민 공중합체 및 이를 핵산 전달체로 이용하는 유전자 치료
KR101450096B1 (ko) Ｐａｓｐｇ 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체
KR101555145B1 (ko) 암세포 외부 pH 감응성 벌레 모양의 미셀 및 이의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application