KR20150111080A - 자기공명영상을 위한 표면 전하 스위칭 나노복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

자기공명영상을 위한 표면 전하 스위칭 나노복합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양과 같은 질병 부위의 약산성 pH에 반응하여 선택적으로 질병 부위에 축적될 수 있어 자기공명영상의 조영효과를 증진시키는 표면 전하 스위칭 나노복합체의 제조 방법에 관한 것으로, 라이신 단량체를 기반으로 하여 폴리라이신을 합성한 후, 소수성 물질과 pH 민감성 물질을 화학적으로 접합시키고 내부에 자성 산화철 입자를 봉입하여 새로운 형태의 나노입자를 제조하였다. 제조된 나노입자는 생체 내 pH 보다 낮은 산성 환경에서 pH 민감성 물질이 제거되어 표면 전하가 스위칭 되어 산성 환경에서만 작용할 수 있다. 이를 통해 질병 부위로 조영제를 효과적으로 전달하고 조영효과를 극대화 시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

자기공명영상을 위한 표면 전하 스위칭 나노복합체 및 이의 제조방법{Surface charge switching nanoparticles for magnetic resonance imaging and preparing method thereof}
본 발명은 종양과 같은 질병 부위의 약산성 pH에 반응하여 선택적으로 질병 부위에 축적될 수 있어 자기공명영상의 조영효과를 증진시키는 표면 전하 스위칭 나노복합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
대표적인 단층 촬영 영상 기술인 자기공명영상은 비침습적으로 3차원 영상을 얻을 수 있는 방법으로, 대조도(contrast)와 공간 해상도(spatial resolution)가 뛰어나 질병의 진단을 위해 널리 사용되고 있다.
MRI 조영제는 생체 내 주입(injection) 후 강력한 외부 자기장과 고주파 에너지에 의해 발생하는 T1, T2 완화시간(relaxation time)의 변화에서 오는 차이를 감지하여 정상 조직과 비정상 조직의 대조도를 증강시킴으로써 국소부위의 해부학적 혹은 기능적 영역에 대한 영상화를 가능케 하는 화학 물질로, 일반적으로 MRI 조영제는 상자성(paramagnetic) 조영제와 초상자성 조영제로 구분된다(Eur. Radiol. 11: 2319, 2001).
상자성 조영제는 생체 독성이 심하며 mM 수준만의 영상이 가능하기 때문에 μM수준의 고감도 영상이 가능한 초상자성 조영제에 대한 관심이 보다 높다(Nano Lett. 6: 2427, 2006; Nat. Med. 13 : 95, 2007).
임상에 널리 사용되는 초상자성 조영제는 마그네타이트(magnetite, Fe3O4) 또는 마그헤마이트(maghemite, Fe2O3)와 같은 산화철(superparamagnetic iron oxide, SPIO)로 대표되는 초상자성 나노입자(nanoparticle)를 기반으로 제조된다. 이들은 수십 나노미터 이하의 크기를 갖는 균일한 입자의 안정한 콜로이드 형태인 산화철 용액(ferrofluid)으로 제조되어 체내로 투입된다.
상기 자성 나노입자는 나노 입자 주변 물 분자의 물 분자의 수소원자의 스핀-스핀 이완시간을 단축시켜 자기공명영상 신호를 증폭시키는 효과를 나타내 지금까지 공명 영상 진단에 사용되고 있다.
조영제는 신체 내 혈관과 주요기관에 투여되는 약물이므로, 미세한 부위까지 선명한 영상을 제공해야 하며 체내에서 독성과 자극이 거의 없어야 한다. 그러나 현재 상용화 되어 있는 조영제는 수동형 표적화에 머무르고 있고 낮은 자기 민감도로 인해 얻어낸 영상의 해상도가 낮아 질병 판단을 하는데 어려움이 있으며, 능동형 표적화의 경우에는 아직 연구 단계에 머무르고 있다.
최근 고효율, 고해상도의 자기공명 영상을 위해 많은 나노입자 시스템 정밀 제어 시도가 진행되고 있다. 그러나 복잡한 임상조건으로 인해 그 중에 오직 몇 몇의 나노 입자만이 임상적으로 쓰여지고 있다. 예를 들어, 종양 위치로의 나노입자들의 침투성과 표적화는 다양한 종양 조직에 있어서 일관된 결과를 보여주지 못한다. 종양 미세환경 및 세포내 세포간 변수 그리고 종양 세포들의 이질성은 나노입자를 이용한 MR 이미징 결과에 많은 영향을 끼치며 이러한 요소는 결국 조영제의 개발을 복잡하게 한다.
한국공개특허 10-2011-0059369
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결 하기 위해 종양과 같은 약산성 환경에 의해 질병 부위의 세포막과 상호작용하여 선택적으로 종양부위에 축적되는 효과를 가지며, 생체적합성이 뛰어난 폴리펩티드, 소수성 물질 , pH 민감성 물질 및 자성나노입자를 이용하여 형성된 고분자를 포함하는 표면 전하 스위칭 나노복합체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 표면 전하 스위칭 나노입자를 함유하는 자기공명영상을 위한 조영제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 표면 전하 스위칭 나노복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체적합성을 갖는 폴리펩티드를 백본으로 하여 소수성 물질과 pH 민감성 물질을 상기 폴리펩티드에 접합시키고 내부에 자성 나노입자를 봉입한 나노복합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드 고분자는, 폴리라이신, 폴리아스파르트산, 폴리히스티딘 및 폴리글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소수성 물질은 디옥시콜린산, 올레산 및 리놀레산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 pH 민감성 물질은 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자성 나노입자는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MpOq (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 “0 < p ≤3” 및 “0 < q ≤5”을 만족한다.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 표면 전하 스위칭 나노입자를 유효성분으로 포함하는 자기공명 영상용 조영제를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 생체적합성 폴리펩티드에 소수성 물질을 접합하는 단계; (b) 상기 소수성 물질이 접합된 폴리펩티드에 pH 민감성 물질을 접합하여 고분자를 합성하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 고분자 내부에 자성 나노입자를 봉입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 전하 스위칭 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드 고분자는, 폴리라이신, 폴리아스파르트산, 폴리히스티딘 및 폴리글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소수성 물질은 디옥시콜린산, 올레산 및 리놀레산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 pH 민감성 물질은 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자성 나노입자를 봉입한 나노복합체는 나노복합체 1g당 30 ~ 50mg의 함량으로 자성 나노입자가 봉입되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자성 나노입자는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MpOq (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 “0 < p ≤3” 및 “0 < q ≤5”을 만족한다.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자기공명영상을 위한 표면 전하 스위칭 나노입자는 종양과 같은 질병 부위의 약산성 pH에서 pH 민감성 물질이 제거되어 표면 전하가 스위칭 되고, 상기와 같은 전하의 스위칭을 통해 질병 부위로 조영제를 효과적으로 전달하여 자기공명영상의 조영효과를 극대화 시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 DOCA-b-poly(Lys-DMA)의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 폴리라이신 고분자에 소수성 물질인 디옥시콜린산과 pH 민감성 물질인 2,3-다이메틸말레산을 접합하고 내부에 자성 산화철 입자를 봉입하여 나노입자를 제조하고 이 물질을 자기공명영상을 위한 조영제로 활용하는 것을 그림으로 나타낸 것이다.
도 2a는 DOCA-b-poly(Lys-DMA)의 1H-NMR 피크이다.
도 2b는 DOCA-b-poly(Lys-SA)의 1H-NMR 피크이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 제조된 나노입자의 TEM 이미지(scale bar=200nm)이다.
도 4a는 본 발명의 방법에 따라 제조된 나노입자의 입자크기 분포를 측정한 결과이다.
도 4b는 HyperVisual Software 및 확대된 이미지(zoomed 10×)를 사용(scale bar = 1 μm) 하여 본 발명의 나노입자의 초분광 영상을 나타낸 것이다(red core: Fe3O4, yellow shell: DOCA-b-poly(Lys-DMA)).
도 4c는 DOCA-b-poly(Lys-DMA)와 DOCA-b-poly(Lys-SA)의 제타전위를 측정한 결과이다.
도 5a는 pH 7.4와 6.8의 값 (4 h incubation) 에서 형광 Ce6 염료(equivalent Ce6 10 μg/mL) 를 포함하는 DOCA-b-poly(Lys-DMA)와 DOCA-b-poly(Lys-SA)로 처리(1 mg/mL)된 KB종양 세포의 형광 이미지를 나타낸 것이다(red fluorescence: Ce6).
도 5b는 flow cytometry를 사용하여 pH 7.4와 6.8에서 KB 종양세포에 대한 형광 Ce6 염료(equivalent Ce6 10 μg/mL) 를 포함하는 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자(1 mg/mL)와 DOCA-b-poly(Lys-SA)나노입자(1 mg/mL)의 세포 흡수 결과이다.
도 5c는 pH6.8에서 형광 Ce6염료(equivalent Ce6 10 μg/mL)를 포함하는 DOCA-b-poly(Lys-DMA)나노입자로 처리된 KB세포의 공촛점 이미지(scale bar = 10 μm)이며, 세포는 세포막을 시각화 하는 염료인 WGA-Alexa Fluor488 를 사용하여 염색하였다.
도 6a는 KB 종양(tumor size: ~ 150 mm3)-이식한 누드 마우스의 꼬리 정맥을 통해 형광 Ce6 염료(equivalent Ce6 0.1 mg/kg)를 함유하는 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자(10 mg/mL)와 DOCA-b-poly(Lys-SA)나노입자(10 mg/mL)를 투여하여 얻은 in vivo 비침투성 형광이미지이다.
도 6b는 주입 후 12시간 후 적출된 각 기관에서 나노입자의 흡수를 나타내는 이미지이다.
도 6c는 본 발명의 산화철 입자가 내부 봉입된 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자(dose: equivalent Fe3O4 1 mg/kg) 또는 Feridex(dose: equivalent Fe 5 mg/kg)가 주입된 KB 종양(tumor size: ~ 400 mm3) 베어링 누드 마우스의 MR 이미지이다.
본 발명은 생체적합성 폴리펩티드 고분자에 소수성 물질과 pH 민감성 물질을 접합시키고, 내부에 자성 나노입자를 봉입하여 표면 전하 스위칭 나노입자를 제조하였으며, 본 발명의 표면 전하 스위칭 나노입자를 생체 내로 주입하면, 종양과 같은 약산성 환경에서 나노입자 표면의 pH 민감성 물질이 제거되어 표면 전하의 스위칭이 일어나게 되고, 생체적합성 폴리펩티드에 의해 양전하를 띄는 나노입자는 음전하를 띄는 질병 부위의 세포막과 상호작용하여 선택적으로 종양 부위에 축적되게 되며, 이로 인해 종양 부위에서 높은 자기공명영상 조영 효과를 나타내는 특징을 가지고 있다.
본 발명의 표면 전하 스위칭 나노입자의 제조방법은, (a) 생체적합성 폴리펩티드에 소수성 물질을 접합하는 단계; (b) 상기 소수성 물질이 접합된 폴리펩티드에 pH 민감성 물질을 접합하여 고분자를 합성하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 고분자 내부에 자성 나노입자를 봉입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드 고분자는, 폴리라이신, 폴리아스파르트산, 폴리히스티딘 및 폴리글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 폴리라이신을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소수성 물질은 디옥시콜린산, 올레산 및 리놀레산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 디옥시콜린산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 pH 민감성 물질은 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자성 나노입자는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금이며, 상기 금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고, 상기 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MpOq (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 “0 < p ≤3” 및 “0 < q ≤5”을 만족한다.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, 상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, 바람직하게는 자성물질을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 산화철(Fe3O4)을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 표면 전하 스위칭 나노입자를 유효성분으로 포함하는 자기공명 영상용 조영제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조영제에 사용되는 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조영제 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조영제는 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조영제의 다른 바람직한 양태는 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조영제를 생체 또는 시료에 투여하는 단계; 및 상기 생체 또는 시료로부터 표면 전하 스위칭 나노입자에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 단계를 포함하는 조영제의 이용방법에 관한 것이다.
상기에서 사용된 용어 “시료”는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 상기 조영제를 생체 또는 시료에 주입하는 단계는 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.
상기 이용방법에 있어서, 표면 전하 스위칭 나노입자에 의해 발산되는 신호는 자기장을 이용하는 각종 장비들에 의해서 감지될 수 있으며, 특히 자기공명영상 장치(MRI)가 바람직하다.
자기공명영상 장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵이 에너지를 흡수하여 에너지가 높은 상태로 만든 후 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명할 것이나, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
표면전하 스위칭 나노입자 제조
<1-1> 카복시벤질옥시카보닐라이신 무수물의 합성
카복시벤질옥시카보닐라이신 무수물((N-carboxy-(Nε-benzyloxycarbonyl)-L-lysine anhydride)은 벤질옥시카보닐라이신 9mM과 트리포스진 30mM을 무수 다이옥산 30mL에 녹여 50℃에서 2시간 동안 반응한 후 과량의 헥산으로 침전시켜 합성하였다.
<1-2> 폴리벤질옥시카보닐라이신( poly ( Lys - cbz ))의 합성
표면전하 스위칭 나노입자를 제조하기 위해 디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF) 30mL상에 헥실아민(Hexylamine) 0.3 mmol 을 개시제로 사용하여 카복시벤질옥시카보닐라이신 무수물 9 mmol을 상온에서 3일 동안 개환중합을 시켜서 합성하고 과량의 디에틸에테르를 이용해 재결정 시켜서 폴리벤질옥시카보닐라이신(Poly(Nε-benzyloxycarbonyl-L-lysine): poly(Lys-cbz))을 얻었다.
<1-3> DOCA -b- poly ( Lys - cbz )의 합성
DOCA-b-poly(Lys-cbz)을 제조하기 위해 먼저, N,N'-디시클로헥실카르보디미드(N,N'-dicyclohexylcarbodimide; DCC) 4.5mM와 N-히드록시숙신아마이드(N-hydroxysuccinimide; NHS) 6mM를 이용해 디옥시콜린산(Deoxycholic acid; DOCA)의 카르복시기를 미리 활성화 시켜 석시닐화한 디옥시콜린산(DOCA-NHS)을 합성하였고, 상기 실시예 1-2에서 제조한 Poly(Lys-cbz) 1mmol의 말단 아민 그룹은 석시닐화한 디옥시콜린산(DOCA-NHS) 3mmol과 트리에틸아민(Triethylamine)(1mL)을 포함한 디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF)(30mL)에 녹여 상온에서 하루 동안 반응시킨다.
상기 반응이 끝난 용액은 필터하고 과량의 다이에틸 에테르로 침전시켜 DOCA-b-poly(Lys-cbz)을 얻었다.
<1-4> DOCA -b- poly ( Lys )의 합성
상기 실시예 1-3에서 제조한 DOCA-b-poly(Lys-cbz)의 cbz그룹(benzyloxycarbonyl)은 TFA(5mL)/33%HBr in acetic acid(5mL) 에 녹여 상온에서 30분 동안 반응시켜 제거하고, 상기 반응이 끝난 용액은 과량의 에탄올(ethanol)/디에틸에티르(diethyl ether)(50:50 부피비)을 이용해 침전시킨 다음 필터 후 건조시켜 DOCA-b-poly(Lys)을 얻었다.
<1-5> DOCA -b- poly ( Lys -2,3- dimethylmaleic acid ) ; DOCA -b- poly ( Lys - DMA )의 합성
DOCA-b-poly(Lys)은 다시 트리에틸아민(Triethylamine) 1mL과 피리딘(pyridine) 1mL을 포함한 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO) 30mL에 녹여 2,3-다이메틸말레 무수물과 상온에서 5일 동안 반응시킨다. 반응이 끝난 용액은 필터 후 투석막(Spectra/PorMWCO 5K)에 옮겨 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO) 에서 2일 동안 그리고 Na2B4O7 버퍼(pH 8.0, 5 mM)에서 2일 동안 투석시킨 후 동결건조 하여 DOCA-b-poly(Lys-2,3-dimethylmaleic acid)[DOCA-b-poly(Lys-DMA)]을 얻는다.
또한, 상기 DOCA-b-poly(Lys-DMA)를 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)분석을 통해 화학적 결합 여부를 재확인하였다(도 2a참조).
또한, δ 1.85 (-CH3, DMA block) 과 δ 4.15 [-CH-, repeating unit of poly(Lys)]의 적분 비를 사용하여 1H-NMR 피크로 부터 계산된 poly(Lys)의 반복단위당 DMA 블록의 수로 정의된 DMA의 치환 정도는 0.65였으며, δ 0.60 (-CH3, DOCA block)과 δ 4.15 [-CH-, repeating unit of poly(Lys)]poly(Lys)의 적분비를 사용하여 1H-NMR 피크로부터 계산된 1몰에 접합된 DOCA의 몰비는 0.95였다(도 2a참조).
<1-6> 표면전하 스위칭 나노입자 합성
상기 실시예 1-5에서 얻은 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 10mg과 산화철 입자2mg을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO) 2mL에 분산시킨 뒤 투석막(Spectra/PorMWCO 15K)에 옮겨 PBS 버퍼(150 mM, pH 7.4)에서 24시간 동안 투석시킨다. 투석막 외부상은 신선한 PBS 버퍼로 3번 갈아주고. 투석이 끝난 용액은 이틀동안 동결건조 시켜 최종 나노입자를 얻었다.
또한, In vitro 세포 흡수 실험 과 In vivo 형광 이미지 실험에 산화철 입자 대신 형광 Ce6 염료를 함유하는 나노 입자를 동일한 방법으로 제조하였다.
<1-7> 대조군 나노입자 합성
상기 실시예 1-5에서 2,3-다이메틸말레 무수물 대신 숙신산 무수물을 사용하여 DOCA-b-poly(Lys-succinic acid) [DOCA-b-poly(Lys-SA)]를 대조군으로 제조하였고, 이를 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)분석을 통해 화학적 결합 여부를 재확인하였다(도 2b참조).
또힌, δ 2.40 (-CH2, SA block)과 δ 4.15 [-CH-, repeating unit of poly(Lys)]의 적분비를 사용하여 1H-NMR 피크로 부터 계산된 나노입자에서 poly(Lys)의 반복단위당 SA 블록의 수로 정의된 SA의 치환 정도는 0.59였다(도 2b참조).
< 실험예 1>
입자 크기 분포 측정
상기 실시예 1-6의 나노입자의 입자 사이즈 분포는 He-Ne 레이저빔을 구비한 Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, USA)로 633nm 파장에서 90°의 고정된 산란각으로 측정하였다.
산화철이 내부에 봉입된 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자(10㎍/mL)의 형상(morphology)을 투과 전자 현미경(Transmission electron microscope; TEM)(JEM 1010, Japan)으로 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 나노입자의 평균 크기는 대략 175nm인 것을 알 수 있었다(도 3 및 도 4a참조).
< 실험예 2>
초분광이미지 분석
VNIR 분광 카메라 시스템, CytoViva 듀얼 모드 형광(DMF) 모듈 및 CytoViva 고해상도 어댑터(CytoViva, Auburn, AL, USA)를 탑재한 니콘 현미경 초 분광 시스템(HSI)를 나노입자의 코어 및 쉘을 시각화하는데 사용하였다. 샘플을 유리 슬라이드에 나노 입자 용액(PBS pH7.4) 1-2방울을 건조 건조 후 제조하였다. 시료 분석을 위한 광 조명은 DC-안정화 150W 할로겐 광원을 사용하여 조작하였으며 램프 전압은 11V로 일정하였다.
내부 감광 필터는 빛의 세기를 감소시키는데 사용하였고, 나노 입자의 코어와 쉘은 스캔 영역의 각 필셀 내의 모든 가시 근적외선(VNIR) 스펙트럼 데이터를 수집하고 HyperVisual 소프트웨어에 저장된 라이브러리 데이터 베이스에 새로 스캔한 샘플의 스펙트럼 신호를 매핑한 후 시각화되었다.
그 결과, 도 4b에서와 같이 산화철이 봉입된 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자(노란색으로 매핑)는 거의 구형의 모양을 띄며, 나노입자 내부에 산화철(빨간색으로 매핑)이 봉입되어 있는 것을 알 수 있었다.
또한, 나노입자 내부에 봉입된 산화철의 양을 측정하기 위해 Jobin-Yvon Ultima-C와 plasma-atomic emission spectrometer를 사용한 결과 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 1g 속에 산화철이 30 내지 40mg이 봉입되어 있다는 것을 알 수 있었다(결과 미도시).
< 실험예 3>
제타전위 분석
제타전위를 분석하기 전에 각각의 샘플을 실온에서 4시간 동안 안정화 시킨 뒤, 다른 pH값(pH 7.4-5.0)에서 상기 실시예 1-5과 1-7의 나노 입자 샘플(0.1mg/㎖의 PBS 150mM)의 제타 전위 변화는 제타 3000(Malvern Instruments, USA)로 측정하였다.
제타전위 측정 결과 용액의 pH가 7.4로 감소됨에 따라 나노입자의 제타전위가 -10.5mV에서 +0.3mV로 증가하였다. 특히, 상기 실시예 1-5의 나노입자의 제타전위는 pH6.8에서 5.0으로 감소함에 따라 +3.0mV에서 +13.0mV로 증가하였다. 상기의 결과는 pH6.8 내지 5.0의 범위에서 2,3-다이메틸말레익산(DMA)의 분해에 의해 상쇄됨을 알 수 있었다.
하지만, 상기 실시예 1-7의 나노입자의 경우 제타전위의 변화가 나타나지 않았다(도 4c참조).
< 실험예 4>
In vitro 종양 세포 흡수 시험
Human nasopharyngeal epidermal carcinoma KB 세포를 2mM L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지에 humidified standard 배양기 내에서 5% CO2 분위기로 37℃로 유지하였다. 실험에 앞서, 단일층으로 성장한 세포 (1× 105 cells/ml)를 0.25%(w/v) 트립신/0.03%(w/v) EDTA 용액을 이용한 트립신 처리를 통해 수득하였다. RPMI-1640 배지에 부유하는 KB 세포를 웰 플레이트에 이식하고 in vitro 세포 테스트 전에 24시간 동안 배양하였다.
형광 Ce6 염료(equivalent Ce6 10 μg/mL)를 포함한 상기 실시예 1-6과 1-7의 나노입자의 종양 세포 흡수(pH가 7.4 또는 6.8에서 4 시간 배양 한 후 신선한 세포 배양 배지로 3 회 세척)는 Axio Imager D2 형광 현미경(Carl Zeiss, USA)과 FACSCalibur™ Flow Cytometer (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 모니터링 하였다.
또한, 나노입자(pH가 6.8에서 4 시간 배양 한 후 신선한 세포 배양 배지로 3 회 세척)는 상기 공초점 레이저 주사 현미경(CarlZeiss Meta LSM510, Germany)을 사용하여 조사하였다. 세포막을 시각화 하기 위해 WGA-Alexa Fluor488 로 세포를 염색하였다.
pH7.4(생리적 산도)와 6.8(종양의 pHe)의 값에서 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자로 처리된 KB 세포의 형광 이미지를 살펴보면, pH 7.4에서와 달리 pH6.8에서 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자가 높은 흡수율로 KB 세포에 흡수되었음을 보여준다(도 5a 참조). 그러나 DOCA-b-poly(Lys-SA) 나노입자의 경우 pH 7.4와 pH6.8에서 유의적인 차이를 보이지 않았다.
상기의 결과는 나노입자의 세포흡수 거동을 유동 세포 계측법을 통해 측정한 결과(pH7.4 평균 형광 8.2, pH6.8 평균 형관 296)와 일치한다(도 5b참조).
또한, 도 5c의 merged confocal 이미지(공촛점 이미지)를 살펴보면, pH6.8에서 2,3-디메틸말레익산(DMA)의 분해 후 양전하를 띄는 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자와 음전하를 띄는 세포막 사이의 정전기적 상호작용을 통해 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자가 효과적으로 KB 종양 세포로 흡수된 것을 보여준다.
< 실험예 5>
동물모델
In vivo 연구는 7~8 주령의 암컷 BALB/c 누드마우스(BALB/c, nu/nu mice, Institute of Medical Science, Tokyo, Japan)로 수행하였다. 마우스는 가톨릭대의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인된 프로토콜의 가이드라인에 따라 처치하였다.
< 실험예 6>
In vivo 형광 이미지
In vivo 동물실험을 위해, 암컷 누드마우스에 PBS pH 7.4 (ion strength: 0.15) 매질에 현탁된 1× 106 세포를 피하주사하여 KB 종양 세포를 유도하였다. 종양 체적이 약 150mm3에 도달했을 때, 형광 Ce6 염료(equivalent Ce6 0.1 mg/kg)를 포함하는 상기 실시예 1-6과 1-7의 나노입자(10mg/kg)을 종양-이식한 누드마우스에 꼬리 관을 통해 정맥 주사하고, 형광 이미지는 주사 후 1 내지 12시간에서 얻었다.
special C-mount 렌즈 및 장파장 방출 필터(600~700nm; Omega Optical, Brattleboro, VT, USA)가 구비된 12-bit CCD 카메라(Image Station 4000 MM; Kodak, Rochester, NY, USA)를 이용하여 누드마우스의 라이브 형광 이미지를 캡춰하였다(Park et al., 2011, 164 2012; Oh et al., 2012; Lee et al., 2011a, 2011b).
포스트 주입 12시간 후에 누드 마우스를 희생시키고, 장기(종양, 간, 비장, 폐, 신장, 심장)를 적출하여 분석하였다.
도 6a는 in vivo에서 각각의 나노입자를 처리한 누드마우스의 형광 강도를 보여준다. 상기 실시예 1-5의 나노입자(DOCA-b-poly(Lys-DMA) ;equivalent Ce6 0.1 mg/kg)를 KB 종양-이식한 누드마우스에 정맥주사로 투여한 결과 종양 부위에서 강한 형과 Ce6 신호가 나타났으며, 종양의 선명한 이미지를 제공한다. 이러한 결과는 상기 실시예 1-7의 나노입자(DOCA-b-poly(Lys-SA))를 투여하여 나타난 결과와 비교된다. 특히, DOCA-b-poly(Lys-SA) 나노입자의 높은 복욕량에서 불구하고 형광 Ce6 신호가 종양 부위에서 매우 약하게 나타나며, 이로부터 종양 타겟팅에 효과적이지 않다는 것을 알 수 있다. EPR(enhanced permeability and retention) 효과는 종양 맥관구조(vasculature)로부터 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자의 혈관 외 유출(extravasation)을 야기하며, in vivo 종양 조직에서 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자의 우선적인 축적을 이끈다.
또한, 종양 위치의 형광 강도는 주입 후 4시간 째 최고 레벨에 도달하였으며, 이러한 결과는 DOCA-b-poly(Lys-SA) 나노입자를 주입한 결과와 비교할 수 있다.
또한, 각각의 나노입자의 in vivo 종양 축적을 측정하기 위해 절제된 기관(종양, 간, 비장, 폐, 신장, 심장)의 형광 강도를 측정한 결과, DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자의 in vivo 축적 결과값은 매우 유의한 것을 알 수 있으며(도 6b참조), 이러한 결과는 자기 공명 영상 기기를 사용하여 얻은 결과값과 일치하였다.
< 실험예 7>
In vivo Magnetic resonance imaging ( MRI )
PBS(150mM, pH 7.4) 중의 상기 실시예 1-6 나노입자(dose: equivalent Fe3O4 1 mg/kg) 또는 Feridex(dose: equivalent Fe 5 mg/kg)을 KB 종양-이식한 누드마우스에 꼬리 관을 통해 정맥 주사(n=3)하였다(종양의 부피 400mm3). MR 이미지는 포스트 주사 4시간 후 얻었다.
살아있는 누드 마우스의 MR 이미징은 4채널 위상 배열 마우스 코일(Shanghai Chenguang Medical Technology, China)이 있는 임상 주입 3.0 T MRI 시스템(Achieva, Philips healthcare, The Netherlands)을 사용하였다.
살아있는 누드마우스의 T2*-가중된 MR 이미징을 위해, 다음의 파라미터를 적용하였다.
field of view of 800 mm
acquisition matrix of 80×80
section thickness of 1.0 mm
TR = 900 ms
TE = 80 ms
number of acquisitions = 2
T2 이완 시간 매핑(T2 maps)은 다음과 같은 매개변수를 사용하는 multi-slice multi-echo 구배 시퀀스를 사용하여 얻었다.
field of view of 80 mm
acquisition matrix of 80×80
section thickness of 1.0 mm
TR = 900 ms
TE = 2.8 ms
delta TE = 5.9 ms with 13 echoes.
T2 맵의 사후 처리는 Relaxation Maps Tool V2.1.1 in PRIDE software package (Philips Healthcare, The Netherlands)를 사용하여 수행하였다.
T2의 값이 자동으로 종양에 대한 관심 영역(region of interest; ROI)을 그림으로 계산되었다.
색의 강도와 관련된 모든 결과는 p< 0.01의 유의 수준에서 학생의 t-test 또는 ANOVA를 통해 분석하였다. MINITABrelease14 통계 소프트웨어를 사용했다.
산화철(Fe3O4)이 봉입된 DOCA-b-poly(Lys-DMA)나노입자로 처리한 KB 종양 베어링 누드 마우스의 T2*-가중된 MR 이미징(T2*-가중된 MR 이미지는 어두운 색으로 매핑됨)는 Feridex로 처리한 KB 종양 베어링 누드 마우스의 T2*-가중된 MR 이미징(color intensity: 16.2±3.4)에 비하여 강화된 T2* 음성 MR 이미지(낮은 색 농도에 해당color intensity: 5.25±1.6, p<0.01 compared to Feridex)를 나타내는 것을 알 수 있다(도 6c 참조).
종양 부위에 축적된 Fe3O4가 봉입된 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자는 이웃 물 양성자의 dephasing된 spin에 의해 spin-spin relaxation time(T2*)을 약화시키고, 종양 부위에서 T2*-가중된 MR 이미지를 어두워지도록 한다. Fe3O4가 봉입된 DOCA-b-poly(Lys-DMA) 나노입자의 증가된 T2* 음성 이미지는 NP1 나노입자가 광 발광 활성을 갖으며 신규한 MR 이미징 시약으로 활용될 수 있음을 의미한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (18)

  1. 생체적합성을 갖는 폴리펩티드를 백본으로 하여 소수성 물질과 pH 민감성 물질을 상기 폴리펩티드에 접합시키고 내부에 자성 나노입자를 봉입한 나노복합체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 폴리라이신, 폴리아스파르트산, 폴리히스티딘 및 폴리글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 디옥시콜린산, 올레산 및 리놀레산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 pH 민감성 물질은 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 자성 나노입자를 봉입한 나노복합체는 나노복합체 1g당 30 ~ 50mg의 함량으로 자성 나노입자가 봉입되는 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 자성 나노입자는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MpOq (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 “0 < p ≤3” 및 “0 < q ≤5”을 만족한다.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  10. 제 1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 나노복합체를 유효성분으로 포함하는 자기공명 영상용 조영제.
  11. (a) 생체적합성 폴리펩티드에 소수성 물질을 접합하는 단계;
    (b) 상기 소수성 물질이 접합된 폴리펩티드에 pH 민감성 물질을 접합하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계의 소수성 물질과 pH 민감성 물질이 폴리펩티드에 접합한 접합체 내부에 자성 나노입자를 봉입하는 단계를 포함하는, 제1항의 나노복합체 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 고분자는, 폴리라이신, 폴리아스파르트산, 폴리히스티딘 및 폴리글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 디옥시콜린산, 올레산 및 리놀레산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서,
    상기 pH 민감성 물질은 2,3-디메틸말레익산(2,3-dimethylmaleic acid; DMA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 자성 나노입자는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MpOq (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 “0 < p ≤3” 및 “0 < q ≤5”을 만족한다.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
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