KR20110068663A - ｐＨ 민감성 약물 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

ｐＨ 민감성 약물 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 다당류의 아민기에 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)이 도입되어 형성된 고분자를 포함하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체는 생분해성 및 생체적합성이 우수한 다당류를 기반으로 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산과 유기적인 결합에 의해 제조된 나노 크기의 약물 전달체로서 표적 세포 내로 쉽고 빠르게 침투할 수 있는 효과가 있으며, 약리 활성을 가지는 약물을 나노 복합체 내부에 봉입한 형태로 약물의 변성 및 면역반응에 의한 손상을 회피하면서 안정하게 표적 부위로 전달할 수 있는 효과가 있을 뿐만 아니라 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 특정 질병 부위에 대해 선택적 및 효율적으로 약물을 전달하여 치료 효과를 높일 수 있으므로 의료용 약물 전달체로서 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
다당류, 2,3-디메틸말레산, 나노 복합체, 약물 전달체, 약산성

Description

ｐＨ 민감성 약물 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법{PH sensitive nano complex for drug delivery and preparation method thereof}
본 발명은 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 다당류 및 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)을 이용하여 형성된 고분자를 포함하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 산업화에 따른 기술의 발전은 생명공학 분야에서 임상적용을 위한 치료 물질로서 펩타이드나 단백질의 사용 가능성을 실용화 할 수 있을 정도로 확장시켰다. 그러나 이러한 펩타이드 또는 단백질을 이용한 약물들의 경우 어떻게 생체 내로 전달시키느냐는 수년 동안 제약 연구 분야에서 계속 진행되고 있는 부분이다. 특히, 약물 전달을 위한 방법 중에서 경구 전달은 약물 전달을 위한 가장 전통적이며 바람직한 방법이라고 할 수 있는데, 반복적 또는 정기적 투여가 필요한 경우에는 더욱 그러하며(B.Y. Kim, 등., J. Control. Release 102, 525-38. 2005), 주사와 같은 다른 투여 방법들에 비해 환자의 고통이 적으며, 주사에 동반되는 불쾌감을 덜어준다는 장점들이 있기 때문이다(A. des Rieux 등., J. Control. Release 116, 1-27, 2006). 그러나 약물을 경구 투여할 경우, 정제(tablet) 또는 캡슐(capsule) 형태 제제로부터 약물이 방출된 직후 소화강(digestive lumen)과 혈액 사이의 농도구배(concentration gradient)는 증가하지만, 제제가 소화관의 하부로 이동함에 따라 농도구배가 급격히 감소하게 되어 약물 흡수에 좋지 않은 여건이 형성되는 문제점이 있고, 특히, 단백질 또는 펩타이드 제제의 약물은 소화관으로 분비되는 소화효소에 의해 상당 부분 가수분해 되기 때문에 생체내의 이용도가 감소되는 문제점이 있다.
또한, 경구 투여용 제제 이외에도 지금까지 사용되고 있는 각종 형태의 제약들은 질환 부위에 적절한 약효를 나타내기 위해 필요로 하는 양보다 많은 양을 투약하여야만 약효를 나타내므로 적절치 않은 약물의 양으로 인해 그 이외의 부분에서는 부작용이 발생하여, 많은 제약회사들은 이러한 부작용을 줄일 수 있으면서 동시에 약효를 극대화할 수 있는 제형의 개발에 대한 필요성을 갖게 되었다.
이에 상기 기술된 문제점을 해결하기 위해 약물전달시스템에 대한 활용도가 높아지고 있는데, 약물전달시스템이란 기존 의약품을 전달하는데 있어서 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시키는 방법으로서, 이전보다 낮은 농도 또는 투약하기 곤란한 약물의 선택성을 개선하는데 유용하게 사용되고 있다. 투여되는 약물이 물리화학적으로나 약동학적으로 특별한 특성, 예컨대, 높은 수용성, 높은 지용성 및 불용성과 같은 특징이 있다면 특별한 전달체계의 사용이 요구되기 때문이 다.
또한, 최근에는 이러한 약물전달시스템에 나노 기술이 도입되어 약물 전달 효과를 더욱 증진시키기 위한 노력들이 진행되고 있는데, 일반적으로 나노는 수십에서 수백 나노미터를 가리키는 것으로서, 화학적 요소, 올리고 핵산, DNA, RNA 및 단백질 등과 같은 치료학적으로 유효한 성분들을 나노 크기의 전달체를 사용하여 세포내로 전달시키는 기술들이 개발되고 있다. 그러나 이들을 이용한 효과가 분명하게 나타나기 위해서는 세포막 사이에 특이적인 경로 또는 비특이적인 경로를 거쳐 세포막의 지질 이중층을 통과하여 세포질 내에 약물의 방출이 이루어져야 한다. 따라서 이러한 점을 고려하여 효과적인 약물전달 체계로서 친수성과 소수성을 동시에 가지며, 내부 중심에 소수성 코어가 형성되어 약물을 봉입할 수 있도록 설계된 에멀젼(emulsion), 나노(nano) 입자, 리포좀(liposome) 등을 사용한 약물 전달체가 개발되어 있다.
한편, 인체 내에서 pH의 변화는 세 곳에서 관찰되고 있다. 첫째는 위장관에서의 변화로서, 위의 낮은 pH와 장의 높은 pH 사이의 차이가 있는데 이러한 pH의 차이는 약물전달 등에 이용되고 있다. 둘째로는 혈액내의 pH 변화인데 인체의 혈중 pH는 7.4를 유지하고 있으며, 그 변화의 폭은 일반적으로 ± 0.04를 넘지 않는다. 그러나 혈중의 pH 변화가 0.04보다 높으면 알카데미아(alkademia)가 유발되며, 0.04보다 낮으면 엑시데미아(acidemia)가 유발된다. 셋째로 인체 내에서 관찰되는 pH의 변화는 국부적인 세포내에서 관찰되는데, 이는 암이나 저산소증과 같은 질환이 유발되었을 경우, 정상 세포에 비해 pH가 낮아진다.
또한, 각 질병의 종류 및 발생 부위에 따라 병변 세포는 특정 약산성의 pH를 나타내는 것으로 알려져 있는데, 예컨대, 암세포의 경우에는 암주위의 pH가 암세포의 왕성한 대사에 의해 발생되는 유기산 때문에 정상조직보다 평균 0.6 낮은 약 6.8의 pH를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
이와 같이 암을 비롯한 각종 질병이 발생한 부위에서는 정상에 비해 pH가 다소 낮아지는 차이점이 있으므로 이러한 pH 변화를 이용한 약물 전달체를 사용할 경우, 종래의 약물 전달체에 비해 질병 부위 특이적으로 약물을 효율적으로 전달할 수 있어 치료 효과를 증진시킬 수 있을 것으로 기대할 수 있으나, 아직까지 이러한 pH 차이를 인식할 수 있는 약물 전달체가 개발되지 못하고 있다.
한편, 다당류는 독성이 거의 없는 것으로 입증된 천연 고분자로서 최근에는 이러한 다당류를 약물 전달체로 사용하려는 연구들이 시도되고 있다. 특히 다당류 중에서 키토산은 자연계에서 셀룰로오스 다음으로 풍분한 천연 고분자 재료인 키틴(chitin)을 탈아세틸화하여 얻어진 화합물을 총칭하는 것으로서, 2-아미노-2-디옥시-베타-d-글루코피라노오스로 구성된 다당류이다. 키토산은 자연계에 존재하는 다른 다당류와는 달리 주쇄에 1차 아민을 함유하고 있으며, 이로 인해 매우 독특한 성질을 나타내어 환경, 농업, 의약 등 여러 분야에서 응용되고 있으며, 특히 생체적합성 및 생분해성이 우수하여 유전자 및 약물 전달체, 조직공학을 위한 스케폴드, 주입형 하이드로젤 등의 구성요소로서 널리 사용되고 있다.
따라서 이러한 키토산과 같은 다당류들을 약물 전달체로 이용할 경우, 생체 내에서 생분해성 및 생체적합성을 확보할 수 있으므로 보다 안전한 약물전달체로 사용할 수 있는 잇점이 있다. 그러나 지금까지 이러한 다당류들을 이용하여 미세한 pH의 변화에도 반응함으로써 약산성을 띄는 질병 부위 안으로 약물을 효과적으로 전달하는 기술은 개발된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은 미세한 pH의 변화에서도 반응하여 약산성에서부터 약리 효과를 가지며, 질병 특이적으로 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 다당류의 아민기에 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)이 도입되어 형성된 고분자를 포함하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 다당류의 아민기에 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)이 도입되어 형성된 고분자를 포함하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 풀루란(pullulan), 커드란(cudlan), 히아루론산( hyaluronic acid), 펙틴(pectin), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 헤파린(Heparin) 및 전분(starch)으로 이루어진 군 중에서 선택 되는 생체고분자 다당류일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 복합체의 입자 크기는 150~450nm일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 복합체는 구형의 나노 복합체 내부에 약리 활성을 갖는 약물이 봉입될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약물은 단백질, 펩타이드 및 합성화합물로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 상기 단백질은 양전하를 띄는 단백질로서 리소자임(lysozyme), TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), 판크레아토펩티다제 E(pancreatopeptidase E), 칼시토닌(calcitonin), HIV Tat 단백질(human immunodeficiency virus Tat protein), Antp 호메오 박스 단백질(Antennapedia homeobox protein), HSV VP22 단백질(herpes simplex virus VP22 protein), 트라스투주맙(trastuzumab), 아다리뮤맙(adalimumab), 세투시맙(cetuximab), 알렙투주맙(alemtuzumab). 리투시맙(rituximab), 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 알레파셉트(alefacept), 바실릭시맙(basiliximab), 다실리주맙(daclizumab), 에리트로포이에틴(erythropoietin; epoetin-α), 다베포에틴알파(darbepoetin-α), 오프렐베킨(oprelvekin; interleukin 11), 루트로핀알파(lutropin-α), 인터페론-베타 1a(interferon-β 1a), 인터페론-베타 1b(interferon-β 1b), 인터페론-감마 1b(interferon-γ 1b), 글루카곤(glucagon), 세크레틴(secretin),아르시투모맙(arcitumomab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 토시투모맙(tositumomab), 알테프라 제(alteplase; tissue plasminogen activatoerl), 테넥테플라제(tenecteplase), 유로키나아제(urokinase), 살몰 칼시토닌(salmon calcitonin), 팔리퍼민(palifermin; keratinicyte growth factor) 및 베카플러민(becaplermin; platelet-derived growth factor)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 복합체는 pH 7.0 이하에서 나노 복합체 내부에 봉입되어 있는 약리 활성을 갖는 약물을 방출할 수 있다.
또한, 본 발명은, 다당류를 용매에 용해시키는 단계; 상기 다당류가 용해된 용액에 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)을 첨가하여 상기 다당류의 아민기와 상기 2,3-디메틸말레산의 카르복실기가 결합된 고분자를 합성하는 단계; 및 상기 합성된 고분자를 투석 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 풀루란(pullulan), 커드란(cudlan), 히아루론산( hyaluronic acid), 펙틴(pectin), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 헤파린(Heparin) 및 전분(starch)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 생체고분자 다당류일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고분자를 합성하는 단계는 트리에틸아민(triethylamine:TEA) 및 피리딘(pyridine)을 첨가한 다음, 상온에서 6~8일간 반응시켜 합성할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 투석 및 동결 건조한 합성된 고분자의 수용액에 약리 활성을 갖는 약물을 첨가하여 상기 고분자의 내부에 상기 약물을 봉 입시키는 단계를 더 추가할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약물은 단백질, 펩타이드 및 합성화합물로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 상기 단백질은 양전하를 띄는 단백질로서 리소자임(lysozyme), TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), 판크레아토펩티다제 E(pancreatopeptidase E), 칼시토닌(calcitonin), HIV Tat 단백질(human immunodeficiency virus Tat protein), Antp 호메오 박스 단백질(Antennapedia homeobox protein), HSV VP22 단백질(herpes simplex virus VP22 protein), 트라스투주맙(trastuzumab), 아다리뮤맙(adalimumab), 세투시맙(cetuximab), 알렙투주맙(alemtuzumab). 리투시맙(rituximab), 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 알레파셉트(alefacept), 바실릭시맙(basiliximab), 다실리주맙(daclizumab), 에리트로포이에틴(erythropoietin; epoetin-α), 다베포에틴알파(darbepoetin-α), 오프렐베킨(oprelvekin; interleukin 11), 루트로핀알파(lutropin-α), 인터페론-베타 1a(interferon-β 1a), 인터페론-베타 1b(interferon-β 1b), 인터페론-감마 1b(interferon-γ 1b), 글루카곤(glucagon), 세크레틴(secretin),아르시투모맙(arcitumomab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 토시투모맙(tositumomab), 알테프라제(alteplase; tissue plasminogen activatoerl), 테넥테플라제(tenecteplase), 유로키나아제(urokinase), 살몰 칼시토닌(salmon calcitonin), 팔리퍼민(palifermin; keratinicyte growth factor) 및 베카플러민(becaplermin; platelet-derived growth factor)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약물의 봉입은 수용액 상에서 상기 고분자와 약물 간의 이온결합에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고분자 및 약리 활성을 갖는 약물의 혼합비는 상기 고분자 대 약물의 비가 1:1 내지 10:1일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 복합체는 pH 7.0 이하에서 나노 복합체 내부에 봉입되어 있는 약리 활성을 갖는 약물이 방출될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 복합체의 입자 크기는 150~450nm일 수 있다.
본 발명에 따른 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체 생분해성 및 생체적합성이 우수한 다당류를 기반으로 하고 있으며 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산을 사용하여 제조된 나노 크기의 약물 전달체로서 표적 세포 내로 쉽고 빠르게 침투할 수 있는 효과가 있으며, 약리 활성을 가지는 약물을 나노 복합체 내부에 봉입한 형태로 약물의 변성 및 면역반응에 의한 손상을 회피하면서 안정하게 표적 부위로 전달할 수 있는 효과가 있을 뿐만 아니라 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 특정 질병 부위에 대해 선택적 및 효율적으로 약물을 전달하여 치료 효과를 높일 수 있으므로 의료용 약물 전달체로서 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 미세한 pH의 변화에 반응하여 약산성에서부터 약리 효과를 가지는 약물 전달체에 관한 것으로서, 다당류의 아민기에 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)이 도입되어 형성된 고분자를 포함하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체를 제공하는데 그 특징이 있다.
본 발명에 따른 상기 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체는 생분해성 및 생체적합성이 우수한 다당류와 pH 민감성 물질의 유기적인 결합에 의해 합성될 수 있는데, 상기 다당류로는 이에 제한되지는 않으나, 풀루란(pullulan), 커드란(cudlan), 히아루론산( hyaluronic acid), 펙틴(pectin), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 헤파린(Heparin) 및 전분(starch)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 생체고분자 다당류 및 이들의 유도체들을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 키토산을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 키토산 유도체인 글리콜 키토산을 사용할 수 있다.
또한, 상기 pH 민감성 물질로는 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)을 사용할 수 있다.
또한, 상기 다당류와 pH 민감성 물질의 유기적인 결합은 반응성이 뛰어난 다당류의 자유 아민기가 2,3-디메틸말레산의 카르복실기와 반응함으로써 생체고분자를 합성할 수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 상기 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법은, 다당류를 용매에 용해시키는 단계; 상기 다당류가 용해된 용액에 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)을 첨가하여 상기 다당류의 아민기와 상기 2,3- 디메틸말레산의 카르복실기를 결합시켜 고분자를 합성하는 단계; 및 상기 합성된 고분자를 투석 및 동결 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 다당류를 용해할 수 있는 용매로는 상기 다당류를 용해시킬 수 있는 용매라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용할 수 있다. 또한, 상기 다당류가 용해된 용액에 첨가되는 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)의 양은 상기 첨가된 다당류의 몰비와 동일한 양으로 첨가할 수 있으며, 반응 용액에 트리에틸아민과 피리딘을 첨가하여 반응시킴으로써 본 발명에 따른 상기 고분자를 합성할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 다당류로서 글리콜 키토산을 사용하였는데, 글리콜 키토산과 2,3-디메틸말레산(DMA)을 이용하여 글리콜 키토산 유도체의 고분자(GCD)를 합성하였는데, 상기 고분자의 합성과정은 하기에 나타낸 바와 같이, 글리콜 키토산(GSC)의 자유 아민기가 2,3-디메틸말레산(DMA)의 카르복실기와 반응하여 상기 아민기에 2,3-디메틸말레산(DMA)이 도입됨으로써 합성할 수 있는데, 이때 상기 반응은 상온에서 6~8일간 반응시킬 수 있다.
Figure 112009077941461-PAT00001
또한, 상기 합성된 고분자는 투석 및 동결 건조를 통해 파우더 상태로 수득할 수 있으며, 이때, 상기 합성된 고분자를 수상에 녹일 경우 음전하(-)를 띈다.
따라서 본 발명의 방법으로 합성된 고분자가 용해된 수용액에 양전하(+)를 띄는 약리 활성을 갖는 약물을 첨가할 경우, 정전기적 인력, 즉, 이온결합에 의해 상기 고분자의 내부에 상기 약물을 봉입시킬 수 있다. 이때, 상기 합성된 고분자 및 약리 활성을 갖는 약물은 합성된 고분자 대 약리 활성을 갖는 약물을 1:1 내지 10:1의 혼합비(중량%)로 혼합할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)와 리소자임 단백질을 각각 1:1, 2.5:1, 5:1 및 10:1의 중량%의 비로 혼합하여 상기 리소자임 단백질이 봉입된 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체를 제조하였다.
또한, 본 발명에서 상기 합성된 고분자의 내부에 봉입할 수 있는 약물로는 양전하를 띄는 약리 활성을 갖는 성분이라면 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 단백질, 펩타이드 및 합성화합물을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 양전하를 띄는 단백질을 사용할 수 있으며, 양전하를 띄는 상기 단백질로는 이에 제한되지는 않으나, 리소자임(lysozyme), TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), 판크레아토펩티다제 E(pancreatopeptidase E), 칼시토닌(calcitonin), HIV Tat 단백질(human immunodeficiency virus Tat protein), Antp 호메오 박스 단백질(Antennapedia homeobox protein), HSV VP22 단백질(herpes simplex virus VP22 protein), 트라스투주맙(trastuzumab), 아다리뮤맙(adalimumab), 세투시맙(cetuximab), 알렙투주맙(alemtuzumab). 리투시맙(rituximab), 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 알레파셉트(alefacept), 바실릭시맙(basiliximab), 다실리주맙(daclizumab), 에리트로포이에틴(erythropoietin; epoetin-α), 다베포에틴알파(darbepoetin-α), 오프렐베킨(oprelvekin; interleukin 11), 루트로핀알파(lutropin-α), 인터페론-베타 1a(interferon-β 1a), 인터페론-베타 1b(interferon-β 1b), 인터페론-감마 1b(interferon-γ 1b), 글루카곤(glucagon), 세크레틴(secretin),아르시투모맙(arcitumomab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 토시투모맙(tositumomab), 알테프라제(alteplase; tissue plasminogen activatoerl), 테넥테플라제(tenecteplase), 유로키나아제(urokinase), 살몰 칼시토닌(salmon calcitonin), 팔리퍼민(palifermin; keratinicyte growth factor) 및 베카플러민(becaplermin; platelet-derived growth factor)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다. 이는 앞서 기술한 바와 같이, 본 발명에서 합성된 고분자의 경우, 수상에 용해 시키면 음전하(-)를 띄게 되므로 양전하를 띄는 약물을 사용할 경우, 보다 용이하게 이온결합을 형성할 수 있기 때문이다.
그러므로 본 발명은 상기 본 발명에서 합성된 고분자 내부에 약리 활성을 갖는 약물이 봉입된 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체를 제공할 수 있다.
한편, 상기 기술된 방법으로 제조된 본 발명의 약물 전달용 나노 복합체는 나노입자 크기를 갖는다는 특징이 있다.
약물전달시스템은 체내로 도입된 약물의 체내 농도와 위치를 제어하여 부작용을 최소화하고 치료부위에 질병 치료용 약물을 효율적으로 전달하는 기술로서 기존 약물의 약물 동력학(pharmacokinetics)을 변화시켜 효능 및 효과를 극대화하고자 하는 약물 제형 기술을 말한다. 이러한 약물전달시스템은 최근 마이크로기술 또는 나노기술의 급속한 발전에 따라 약제 성분 또는 제형들을 나노크기의 전달체를 사용하여 세포내로 전달시키는 방법들이 속속들이 개발되고 있다.
또한, 나노입자는 입자의 크기가 수 나노미터에서 수백 나노미터 크기의 넓은 표면적을 가지는 콜로이드 상의 불균인 분산 입자로서, 나노입자가 인체에 투입될 때에는 주사, 경구, 피부 등 다양한 방법을 통해 전달되며 이때의 약물의 분포는 나노입자의 특성에 따라 조금씩 다르게 나타나며, 현재 가장 많이 사용되고 있는 나노 약물 전달체로는 리포좀과 폴리머솜이 있다.
일반적으로 리포좀은 양친매성 지질이 수상에 분산될 때 지질과 물의 비율에 따라 물속에서 다양한 구조의 이중막을 형성시키는 소포체를 말하며, 이러한 리포좀은 생체 내에서 제거될 수 있고 수용성 및 지용성 약물을 운반할 수 있다. 또한, 폴리머솜은 생체막과 유사한 고분자 이중층을 가지는 폴리머 베히클로서, 친수성과 소수성 블록이 특정 비율로 결합된 양친성 고분자를 합성하여 수용액에서 적절한 조건하에서 자가 조립하여 마이셀을 형성한다. 이러한 마이셀을 이룬 블록 공중합체들의 내부는 소수성의 성질을 가지고 있어 특히 난용성 약물을 손쉽게 포획할 수 있고 표면은 친수성의 성질을 가지므로 난용성 제제의 가용화에 특히 유용하다.
한편, 본 발명에 따른 약물 전달용 나노 복합체는 본 발명에서 합성된 고분자가 수용액 상에서 음전하(-)를 띄고 있으며, 양전하를 띄는 약물과 함께 이온결합에 의해 구형의 약물 전달용 나노 복합체의 형태를 이루게 되며, 이때, 상기 본 발명의 나노 복합체의 입자 크기는 150~450nm일 수 있으며, 바람직하게는 180~300nm일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 나노 복합체의 입자 크기는 합성된 고분자와 약리 활성을 갖는 약물의 혼합비에 따라 다소 차이가 있을 수 있다. 예컨대, 본 발명의 일실시예에 따르면, 합성된 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)와 리소자임 단백질의 혼합비가 1:1일 경우, 제조된 나노 복합체의 입자 크기는 약 280nm 정도의 크기였으며, 상기 혼합비가 2.5:1, 5:1 및 10:1일 경우에는 입자 크기가 약 200nm, 180nm 및 220nm인 것으로 나타났다(도 2a 참조).
따라서 본 발명에 따른 나노 복합체는 앞서 기술된 바와 같이 나노크기의 형태를 가지기 때문에 표적 부위, 특히 표적 세포 내로 쉽고 빠르면서도 깊숙히 들어갈 수 있는 장점이 있다.
나아가, 본 발명의 약물 전달용 나노 복합체는 미세한 pH의 변화에도 반응하여 약산성에서부터 작용 범위를 가질 수 있는 특징이 있으며, 구체적으로 본 발명의 나노 복합체는 약산성인 pH 7.0 이하에서 나노복합체 내부에 봉입되어 있는 약 리 활성을 갖는 약물이 방출될 수 있는 특징이 있다.
일반적으로 체내의 신진과정은 정상의 수소이온 농도를 유지하기 위해 체내에서 생성된 상당량의 산(acid)의 제거가 신속하게 이루어져야 한다. 그러나 이러한 유지 기능에 장애가 발생하여 수소이온 농도가 7.35 아래로 내려갈 경우에는 산증(acidosis)이 유발되고, 7.45 이상으로 올라갈 경우에는 알칼리성증(Alkalosis)이 유발된다. 또한, 상기 산증(acidosis)은 질환이 발생할 경우 보이는 현상 중 하나로서, 근무력증, 루게릭병 및 근위축증과 같은 근신경계(neuromuscular) 질환, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스 관절염 및 고형암과 같은 질병부위는 약산성을 띄는 특징이 있으며, 특히 고형암의 세포외(extracellular) pH는 7.2 내지 6.0이며, 류마티스 관절염의 경우는 pH가 약 6.0인 것으로 알려져 있다(E. Cesaroni, et. al., Pediatr.Neurol. 2009, 41, 131-134; F. Chabot, et. al., Presse Med. 2009, 38, 485-495; E. M. et. al., SpringerSemin.Immunopathol. 1998, 20, 73-94; K. Engin, et. al., Int. J. Hyperthermia, 1995, 11, 211-216).
따라서 질병 발생 시 유발되는 pH의 변화를 이용하여 pH에 민감한 특성을 갖는 약물 전달체를 이용할 경우, 질병 특이적으로 약물 전달체가 작용할 수 있으므로 보다 정확하고 효과적으로 질병을 진단 또는 치료할 수 있다. 따라서 최근에는 pH에 민감한 특성을 갖는 약물 전달체가 개발되고 있으며 단백질 약물을 함유한 고분자를 세포질 내로 도입할 수 있는 나노 전달체가 개발된 바 있다(Y. Lee, et. al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 5362-5363). 그러나 상기 개발된 pH 민감성 약물 전달체는 pH가 5.5인 낮은 산성 영역에서만 작용하는 문제점이 있다.
한편, 본 발명에 따른 약물 전달용 나노 복합체는 pH가 7.0 이하의 약산성을 보이는 질병부위에 특이적으로 반응할 수 있는 특징이 있으며, 바람직하게는 pH 5.0 내지 7.0의 약산성을 보이는 부위에 특이적으로 반응할 수 있다.
본 발명의 약물 전달용 나노 복합체의 약물 방출 원리는 하기에 나타낸 바와 같이 중성의 pH, 즉, pH 7.4에서는 본 발명에서 합성된 고분자의 내부에 약리 활성 물질이 이온결합에 의해 구형의 나노입자들을 형성하고 있다가 pH가 낮아져서 약산성의 조건이 되면, 양이온의 증가로 이온 결합이 균형을 이루지 못하고 상기 이온결합이 해리되면서 내부에 존재하던 약물이 외부로 방출하게 된다.
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그러므로 본 발명에서는 질환 부위에 형성되는 약산성 조건인 pH 7.0에서도 약물을 방출할 수 있는 약물 전달용 나노 복합체를 최초로 규명하였다는 특징이 있 다.
본 발명의 일실시예에서는 pH 변화에 민감한 본 발명의 나노 복합체에 대해 각기 다른 pH 조건하에서 나노 복합체 입자의 형태 및 안정성을 조사하였는데, 즉, 중성 조건인 pH 7.4와 약산성 조건인 pH 6.8에서 글리콜 키토산(GSC)의 자유 아민기와 2,3-디메틸말레산(DMA)의 카르복실기가 반응하여 합성된 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)로부터 노출된 1차 아민의 양을 측정하였다. 그 결과, pH 7.4에서는 1차 아민의 노출이 약 20% 정도에 불과했지만 약산성 조건인 pH 6.8에서는 약 70%로 급격히 증가하는 것으로 나타났으며, 이러한 증가는 4시간 이내로 발생하는 것으로 나타났다(도 1a 참조).
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 각기 다른 pH 조건 하에서 본 발명의 나노 복합체의 평균 입자 크기를 측정한 결과, 약산성 조건인 pH 5.0, 6.0, 6.4 및 6.8의 경우에는 평균 입자 크기가 10nm 이내인 것으로 나타났고, 특히 pH 6.8의 경우에는 6nm로 매우 작은 크기로 관찰된 반면, pH 7.4의 중성 조건에서는 평균 입자 크기가 약 180nm인 것으로 나타났다(도 1 b 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 제조된 약물 전달용 나노 복합체는 pH 7.4의 중성 조건에서는 그 구조가 안정하게 유지되지만 pH가 낮아져서 약산성 조건에서는 복합체의 구조가 분해된다는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 나노 복합체에 대한 제타 전위도 각기 다른 pH의 조건에서 측정하였는데, 일반적으로 제타 전위는 입자 사이의 반발력이나 인력의 크기에 대한 단위로서 정전기 분산을 제어하는데 중요한 요소로 사용되고 있다. 상기 본 발 명의 나노 복합체에 대한 제타 전위 측정 결과를 살펴보면, pH 7.4의 경우에는 -0.4mV 정도로 측정되었고, pH가 점점 낮아질수록 제타 전위는 증가하여 pH 5.0에서는 +4.6mV로 측정되었다(도 1c 참조). 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 약산성 조건에서 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)의 내부에 양이온이 증가하면서 양이온의 노출이 늘어났다는 사실을 알 수 있었다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 나노 복합체의 구성 중, pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산(DMA)의 농도가 증가할 경우, 나노 복합체 내부에 봉입된 양전하를 띄는 약물과의 정전기적 인력이 더욱 증가하여 혈액 중에 존재하는 상기 나노 복합체는 안정성이 더욱 증가할 것으로 예측하였는데, 이러한 예측은 본 발명의 일실시예에서 나노 복합체가 용해된 인산완충용액(PBS)의 농도를 10mM에서 300mM로 증가시켰을 경우, 정상적인 혈액의 pH인 7.4에서는 나노 복합체가 그 크기를 그대로 유지하면서 안정한 형태로 존재한다는 것을 확인한 반면, pH인 6.8에서는 나노 복합체가 붕괴되어 입자 크기가 급격히 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 2b 참조).
나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 나노 복합체에 함유된 약리 활성 물질이 약산성 조건에서 방출되는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 약리 활성 물질로서 리소자임이 봉입된 나노 복합체를 각기 다른 pH의 조건으로 투석을 실시하여 pH의 변화에 따라 나노 복합체로부터 방출되는 리소자임의 양을 측정하였다. 그 결과, pH 7.4의 조건으로 투석하였을 경우에는 방출되는 리소자임의 양은 불과 약 30% 미만인 것으로 나타났으며, 리소자임의 봉입 효과가 약 80% 정도임 을 감안할 때(도 1a 참조), 실질적으로 방출되는 리소자임은 단지 약 10% 정도인 반면, pH 6.8 및 6.0의 조건으로 투석하였을 경우에는 8시간 이내로 약 60 및 90%의 리소자임이 빠르게 방출되는 것으로 나타났다(도 3a 참조). 또한, 방출된 약리 성분의 구조가 그대로 유지되는지를 확인하기 위해, 방출된 리소자임을 HPLC 분석을 통해 확인한 결과, 리소자임 단백질이 분해되지 않고 그대로의 구조 및 활성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다(도 3b 참조).
따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 본 발명의 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체는 약산성인 pH 7.0 이하의 조건에서 상기 복합체의 구조 변형을 통해 내부에 존재하는 약물을 신속하게 방출할 수 있다는 것을 알 수 있었으며, 방출된 약물의 경우, 특히 단백질의 경우에는 분해되지 않고 그 구조를 그대로 유지하고 있다는 것을 알 수 있었다.
더불어 본 발명자들은 실제적으로 본 발명의 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체가 목적 부위로 타겟팅 된 후 방출된 약물의 생리적 활성(bioactivity)을 잃지 않고 의해 그 효과가 발생하는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, pH 7.4 및 pH 6.8의 조건 하에서 M.lysodeikticus 세포 현탁액에 리소자임을 봉입한 본 발명의 나노 복합체를 각각 첨가한 후, 시간에 따른 상기 리소자임의 활성을 혼탁한 정도를 통해 적색 빛을 적용하여 상기 세포를 관찰함으로써 측정하였다. 그 결과, pH 6.8의 경우에는 나노 복합체를 첨가하고 배양 30분 만에 리소자임이 나노 복합체로부터 방출되어 적색의 투과도가 증가한 것으로 나타난 반면, pH 7.4의 경우에는 나노 복합체를 처리하지 않은 대조군과 동일한 색을 띄는 것으로 나타났다 (도 4 참조).
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제조된 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체는 생체고분자 다당류를 기본으로 하여 생체 내에서 생분해성 및 생체적합성을 확보할 수 있으며, 또한, 상기 다당류가 pH 민감성 물질과 유기적으로 결합되어 있어 이러한 유기적 결합으로 합성된 고분자는 약리 활성 성분과 이온결합을 통해 나노크기의 약물 전달용 나노 복합체를 형성할 수 있으므로 세포 내로 쉽고 빠르게 침투할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에서 제조된 약물 전달용 나노 복합체는 pH 민감성 물질의 사용으로 인해 약산성 조건에서 나노 복합체의 구조가 붕괴(즉, pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산의 부분이 pH의 변화에 의해 화학적으로 변성되어 결국 글리콜 키토산의 아민기가 노출되고 이온결합이 해리되면서 궁극적으로 나노 복합체의 구조가 변형됨)될 수 있으므로 상기 나노 복합체의 내부에 존재하는 약물이 표적 부위로 빠르게 방출될 수 있다. 또한, 이때 약물은 나노 복합체 내부에 존재하면서 약물의 변성 및 면역반응에 의한 손상을 회피하면서 안정하게 표적 부위로 전달될 수 있고, 약물이 방출되었을 경우에도 약물의 구조 및 활성이 그대로 유지되어 표적부위에서 목적하는 반응을 효과적으로 유도할 수 있다.
그러므로 본 발명의 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체는 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 특정 질병 또는 산증과 같은 질병에 대해 선택적 및 효율적으로 약물을 전달하여 치료 효과를 높일 수 있으며, 특히 상기 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 특정 질병인 근무력증, 루게릭병 및 근위축증과 같은 근신경 계(neuromuscular) 질환, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스 관절염 및 고형암과 같은 질병을 치료하는데 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조
<1-1> 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)의 합성
본 발명자들은 키토산 유도체 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산(DMA)을 사용하여 pH에 민감한 약물 전달용 나노 복합체를 제조하였는데, 상기 나노 복합체의 구체적인 제조방법은 다음과 같다. 먼저, 시그마 알드리치사(미국)로부터 구입한 글리콜 키토산(Glycol chitosan:GCS, 250kDa, 82.7%의 탈아세틸화) 100mg을 5ml의 DMSO에 용해시킨 후, 여기에 글리콜 키토산과 같은 몰비의 2,3-디메틸말레산 무수물(DMA) 150mg, 트리에틸아민(TEA) 0.5ml 및 피리딘 0.1ml을 첨가하여 실온에서 7일 동안 반응시켰다. 이후, 상기 혼합용액을 pH 9.0의 붕산 완충용액(1mM)으로 3일 동안 투석시킨 다음, 동결건조 시킴으로써 글리콜 키토산(GSC)의 자유 아민기와 2,3-디메틸말레산(DMA)의 카르복실기가 유기적으로 반응하여 합성된 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)를 합성하였다. 또한, 이때 상기 유기적인 합성을 통해 글리콜 키토산의 1차 아민 당 치환된 2,3-디메틸말레산 무수물의 갯수는 δ 1.88 (-CH3, DMA block) 및 δ 2.73(-CH-, 글리콜 키토산의 반복적인 당 유닛)로부터 유래된 피크들의 도입 비율을 이용한 1H-NMR (TMS를 갖는 DMSO-d6) 피크를 분석함으로써 측정하였다.
그 결과, 상기 방법으로 합성된 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)의 경우 1H-NMR을 통해 분석된 글리콜 키토산의 1차 아민 당 치환된 2,3-디메틸말레산 무수물의 갯수는 0.98인 것으로 확인되었다.
<1-2> 나노 복합체의 제조 및 특성 분석
상기 실시예 <1-1>에서 합성된 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)와 약리 활성을 가지는 물질로서 리소자임(LYS) 단백질을 사용하여 상온에서 다양한 중량 혼합비(즉, GCD:LYS가 1:1, 2.5:1, 5:1, 10:1(중량%))로 10, 100, 150 및 300mM의 PBS 용액에 각각 용해시킨 다음, 14000rpm에서 30초 동안 강하게 혼합시켜 GCD의 내부에 리소자임 단백질이 봉입된 나노 복합체 용액을 제조하였다. 이때, 상기 합성된 글리콜 키토산 유도체 고분자와 리소자임은 수상에서 음전하를 띄는 글리콜 키토산 유도체 고분자가 양전하를 띄는 리소자임과 이온결합에 의해 리소자임이 봉 입된 형태의 구형 나노 복합체를 제조하였으며, 이후, 제조된 상기 나노 복합체의 평균 입자 크기를 고정된 90°의 분산각 및 633nm의 파장에서 He-Ne 레이저 빔이 구비된 Zetasizer 3000(멜버른사, 미국)을 이용하여 PCS 방법으로 측정하였다. 또한, 상기 나노 복합체의 입자 크기를 측정하기 전에 24시간 동안 37℃에서 pH 7.4~5.0의 각기 다른 pH의 조건하에서 노출시켰다. 또한, 상기 제조된 나노 복합체에 대해 제타 전위(zeta potential)를 측정하였는데 상기 측정 역시 pH 7.4~5.0의 각기 다른 pH의 조건하에서 상기 기술된 Zetasizer 3000 기기를 이용하여 측정하였고, 나노 복합체의 형태는 FE-SEM(Hitachi S-4800, 일본)을 이용하여 측정하였으며, GCD에 대한 리소자임의 착물화(complexation) 효율은 BCA 단백질 어세이 키트를 이용하여 측정하였는데, 상기 BCA 단백질 어세이는 제조된 나노 복합체 용액을 0.1N의 HCl에 4시간 동안 노출시킨 다음, pH 7.4(150mM)에서 1일 동안 투석을 수행한 후, 수득한 용액을 가지고 BCA 단백질 키트를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 합성된 글리콜 키토산 유도체 고분자(GCD)에 대해 단백질인 리소자임을 혼합할 경우, 시간 및 pH에 따른 아민의 노출정도는 pH 7.4의 경우, 약 10% 만이 노출된 것으로 나타난 반면, pH 6.8에서는 약 80%가 노출된 것으로 나타났다. 즉, 이러한 결과는 pH 7.4의 중성 조건에서는 나노 복합체의 글리콜 키토산의 아민이 리소자임과 이온결합을 통해 내부에 존재하기 때문에 노출 정도가 극히 일부이지만, pH가 6.8로 낮아질 경우에는 이온결합이 해리되어 글리콜 키토산의 아민이 노출됨으로써 나노 복합체의 구조가 변형 되어 아민의 노출량이 증가한다는 것을 알 수 있었다. 또한, BCA 단백질 키트를 이용한 GCD에 대한 리소자임의 착물화(complexation) 효율은 약 80± 2%인 것으로 나타났다.
각 pH에 따른 나노 복합체의 평균 입자 크기를 측정한 결과, pH 7.4의 중성 조건에서는 입자크기가 약 180nm 정도인 것으로 측정된 반면, pH 5.0, 6.0, 6.4 및 6.8의 약산성 조건에서는 나노 복합체의 구조가 변형 또는 붕괴되어 입자 크기가 약 10nm 이하로 매우 감소된 것으로 나타났으며, pH 6.8에서는 약 6nm로 입자크기가 감소된 것으로 나타났다(도 1b 참조). 또한, 각 pH에 따른 나노 복합체의 제타 전위 측정 결과, pH 7.4의 경우에는 -0.4mV로 측정되었으나, pH가 6.8, 6.4, 6.0 및 5.0으로 점차 낮아지면서 제타 전위는 +4.6mV로 증가한 것으로 나타났다(도 1c 참조). FE-SEM을 이용한 나노 복합체의 형태를 측정한 결과, 또한 pH 7.4의 경우에는 나노 복합체의 형태가 상기 도 1b에서 측정된 크기의 입자들로 관찰되었으나 pH 6.8의 경우에는 분해된 형태의 나노 복합체 입자가 관찰되었다(도 1d 참조).
또한, 본 발명에 따른 나노복합체 평균 입자 크기를 GCD와 LYS의 혼합비에 따라 측정한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, GCD:LYS가 1:1로 혼합되었을 경우, 약 280nm의 평균 입자 크기를 나타내었고, 2.5:1의 비로 혼합되었을 경우에는 약 200nm, 5:1의 비로 혼합되었을 경우에는 약 180nm로 나타났으며, 10:1의 비로 혼합되었을 경우에는 약 220nm의 평균 입자 크기를 가지는 것으로 나타났으며,
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 제조된 약물 전달용 나노 복합체는 중성 조건의 pH 7.4에서는 매우 안정한 형태의 나노 입자 크기를 유지 하는 반면, pH가 조금 낮아진 약산성 조건, 즉, pH 7.0 이하에서는 나노 복합체의 구조가 분해되어 상기 나노 복합체 내부에 존재하는 약물이 방출될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 2>
단백질 방출 테스트
상기 실시예 <1-2>에서 제조한 본 발명의 나노복합체에 대한 단백질의 방출 정도를 측정하였는데, 즉, 상기 실시예에서 제조한 150mM PBS(pH 7.4, 0.01 중량%의 소듐아자이드)에 존재하는 나노 복합체(GCD 0.5mg/ml 및 LYS 0.1mg/ml를 사용하여 제조한 복합체)로부터의 단백질 방출을 BCA 단백질 어세이 키트를 사용하여 측정하였다. 보다 구체적으로, 1mL의 나노 복합체 용액을 포함하는 투석 맴브레인 튜브(Spectra/Por MWCO 15K)를 각기 다른 pH(pH 7.4, 6.8, 6.0)로 조절된 10ml의 PBS가 함유된 바이알(vial)에 넣은 다음, 상기 나노 복합체로부터 리소자임 단백질의 방출 정도를 37℃에서 기계적인 교반(120rev./min) 조건 하에서 수행하였고, 방출된 리소자임의 부피는 각 시간별로 제거하였으며, 방출된 리소자임의 양은 562nm에서 마이크로플레이트 리더로 분석하였다. 또한, 방출된 리소자임의 구조를 HPLC 분석을 통해 측정하였는데, HPLC 분석은 에질런트 1100 시리즈(미국)를 이용하여 수행하였고, 이동상 용매로는 아세토니트릴, 3rd 증류수 및 트리플루오르아세트산이 50:50:0.1%(v/v)가 혼합된 용매를 사용하였으며, 유속은 1ml/min으로 하였고, 주입 부피는 10ul로 하였으며, 220nm에서 방출된 리소자임을 측정하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, pH 7.4의 조건 하에서는 8시간 이내에 단지 약 30%의 리소자임이 나노 복합체로부터 방출되는 것으로 나타난 반면, pH 6.8의 조건 하에서는 8시간 이내에 약 60%의 리소자임이 나노 복합체로부터 방출되는 것으로 나타났으며, 24시간 내로 약 70%의 리소자임이 방출되는 것으로 나타났다. 또한 pH 6.0의 조건 하에서는 8시간 이내에 약 90% 이상의 리소자임이 나노 복합체로부터 방출되는 것으로 나타났으며, 24시간 내로 약 95% 이상이 방출되는 것으로 나타났다. 또한, 방출된 리소자임에 대하여 HPLC를 수행하여 분석한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 방출된 리소자임은 분해되지 않은 형태로 존재함을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 나노 복합체를 이용하여 약물을 전달할 경우, pH 6.8 및 6.4와 같은 약산성 조건에서 나노 복합체의 구조가 변형되어 내부에 존재하는 약물이 약 8시간 이내로 70% 이상 빠르게 방출할 수 있으므로 약산성의 특성을 보이는 질환 부위에서 약물에 의한 치료효과를 증진시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3>
약물의 활성 테스트
나아가 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 나노 복합체에 대한 생리적 활성 을 측정하기 위해 M. lysodeikticus 세포(ATCC 4698) 현탁 용액(0.24mg/ml, PBS pH 7.4 또는 PBS pH 6.8 150mM)을 본 발명의 나노 복합체(GCD 0.5mg/ml, LYS 0.1mg/ml와 함께 배양하였으며, 이때 대조군으로는 나노 복합체를 첨가하지 않은 것을 사용하였다. 또한, 나노 복합체가 첨가되거나 첨가되지 않은 M. lysodeikticus 세포 현탁액의 포토 이미지는 0 내지 120분 동안 배양 다음에 수득하였으며, 포토 이미지를 얻기 이전에 세포 현탁액의 반대편에 대해 통상적인 적색 빛을 적용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, pH 6.8의 경우에는 나노 복합체를 첨가하고 배양 30분 만에 리소자임이 나노 복합체로부터 방출되어 촉매적 활성에 의해 세포벽을 깨는 역할을 함으로써 현탁액의 적색 투과도가 증가한 것으로 나타난 반면, pH 7.4의 경우에는 나노 복합체를 처리하지 않은 대조군과 동일한 색을 띄는 것으로 나타났다
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체는 나노 크기의 입자를 가짐으로써 세포 속으로 약물의 전달을 안전하고 빠르게 전달할 수 있으며, 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 특정 질병 또는 산증과 같은 질병에 대해 선택적 및 효율적으로 약물을 전달하여 치료 효과를 높일 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
도 1a는 본 발명에 따른 pH 민감성 약물 전달용 글리콜 키토산 유도체 고분자 (GCD)에 대하여 pH 7.4(●) 및 6.8(■)에서 시간에 따른 일차 아민의 노출정도를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명의 일실시예 따른 리소자임을 포함하는 약물 전달용 나노 복합체에 대하여 각 pH별에 따른 나노 복합체의 평균 입자 크기를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 1c는 본 발명의 일실시예 따른 리소자임을 포함하는 약물 전달용 나노 복합체에 대하여 각 pH별에 따른 나노 복합체의 제타 전위를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 1d는 본 발명의 일실시예 따른 리소자임을 포함하는 약물 전달용 나노 복합체에 대하여 pH 7.4 및 6.8에서의 나노 복합체의 형태를 FE-SEM으로 관찰한 이미지를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에서 글라이콜 키토산 및 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)이 결합된 글리콜 키토산 유도체의 고분자와 리소자임의 각 혼합 중량비에 따른 나노 복합체의 평균 입자 크기를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 일실시예 따른 리소자임을 포함하는 약물 전달용 나노 복합체에 대하여 pH 7.4 및 6.8에서 각 PBS의 농도별(10, 100, 150, 300mM)에 따른 나노 복합체의 평균 입자 크기를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3a는 각 pH에서(pH 7.4(●), 6.8(■), 6.0(▲)) 본 발명의 일실시예 따른 리소자임을 포함하는 약물 전달용 나노 복합체로부터 방출되는 리소자임의 양을 시간별로 측정하여 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 3b는 pH 6.8에서 본 발명의 일실시예 따른 리소자임을 포함하는 약물 전달용 나노 복합체로부터 방출되는 리소자임을 HPLC 분석을 통해 확인한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체를 M. lysodeikticus 세포 현탁액에 첨가한 후, pH 7.4 및 6.8에서 각 시간별로 본 발명
에 따른 나노 복합체의 상기 세포에서의 활성 정도를 측정하여 비교한 것을 나타낸 사진이다.

Claims (17)

  1. 다당류의 아민기에 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)이 도입되어 형성된 고분자를 포함하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다당류는 풀루란(pullulan), 커드란(cudlan), 히아루론산( hyaluronic acid), 펙틴(pectin), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 헤파린(Heparin) 및 전분(starch)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 생체고분자 다당류인 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노 복합체의 입자 크기는 150~450nm인 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노 복합체는 구형의 나노 복합체 내부에 약리 활성을 갖는 약물이 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 약물은 단백질, 펩타이드 및 합성화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단백질은 양전하를 띄는 단백질로서 리소자임(lysozyme), TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), 판크레아토펩티다제 E(pancreatopeptidase E), 칼시토닌(calcitonin), HIV Tat 단백질(human immunodeficiency virus Tat protein), Antp 호메오 박스 단백질(Antennapedia homeobox protein), HSV VP22 단백질(herpes simplex virus VP22 protein), 트라스투주맙(trastuzumab), 아다리뮤맙(adalimumab), 세투시맙(cetuximab), 알렙투주맙(alemtuzumab). 리투시맙(rituximab), 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 알레파셉트(alefacept), 바실릭시맙(basiliximab), 다실리주맙(daclizumab), 에리트로포이에틴(erythropoietin; epoetin-α), 다베포에틴알파(darbepoetin-α), 오프렐베킨(oprelvekin; interleukin 11), 루트로핀알파(lutropin-α), 인터페론-베타 1a(interferon-β 1a), 인터페론-베타 1b(interferon-β 1b), 인터페론-감마 1b(interferon-γ 1b), 글루카곤(glucagon), 세크레틴(secretin),아르시투모맙(arcitumomab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 토시투모맙(tositumomab), 알테프라제(alteplase; tissue plasminogen activatoerl), 테넥테플라제(tenecteplase), 유로키나아제(urokinase), 살몰 칼시토닌(salmon calcitonin), 팔리퍼민(palifermin; keratinicyte growth factor) 및 베카플러민(becaplermin; platelet-derived growth factor)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 나노 복합체는 pH 7.0 이하에서 나노 복합체 내부에 봉입되어 있는 약리 활성을 갖는 약물을 방출하는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체.
  8. 다당류를 용매에 용해시키는 단계;
    상기 다당류가 용해된 용액에 2,3-디메틸말레산(2,3-dimethylmaleic acid)을 첨가하여 상기 다당류의 아민기와 상기 2,3-디메틸말레산의 카르복실기가 결합된 고분자를 합성하는 단계; 및
    상기 합성된 고분자를 투석 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 다당류는 풀루란(pullulan), 커드란(cudlan), 히아루론산( hyaluronic acid), 펙틴(pectin), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 헤파린(Heparin) 및 전분(starch)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 생체고분자 다당류인 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서.
    상기 고분자를 합성하는 단계는 트리에틸아민(triethylamine:TEA) 및 피리딘(pyridine)을 첨가한 다음, 상온에서 6~8일간 반응시켜 합성하는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 투석 및 동결 건조한 합성된 고분자의 수용액에 약리 활성을 갖는 약물을 첨가하여 상기 고분자의 내부에 상기 약물을 봉입시키는 단계를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 약물은 단백질, 펩타이드 및 합성화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 단백질은 양전하를 띄는 단백질로서 리소자임(lysozyme), TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), 판크레아토펩티다제 E(pancreatopeptidase E), 칼시토닌(calcitonin), HIV Tat 단백질(human immunodeficiency virus Tat protein), Antp 호메오 박스 단백질(Antennapedia homeobox protein), HSV VP22 단백질(herpes simplex virus VP22 protein), 트라스투주맙(trastuzumab), 아다리뮤맙(adalimumab), 세투시맙(cetuximab), 알렙투주맙(alemtuzumab). 리투시맙(rituximab), 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 알레파셉트(alefacept), 바실릭시맙(basiliximab), 다실리주맙(daclizumab), 에리트로포이에틴(erythropoietin; epoetin-α), 다베포에틴알파(darbepoetin-α), 오프렐베킨(oprelvekin; interleukin 11), 루트로핀알파(lutropin-α), 인터페론-베타 1a(interferon-β 1a), 인터페론-베타 1b(interferon-β 1b), 인터페론-감마 1b(interferon-γ 1b), 글루카곤(glucagon), 세크레틴(secretin),아르시투모맙(arcitumomab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 토시투모맙(tositumomab), 알테프라제(alteplase; tissue plasminogen activatoerl), 테넥테플라제(tenecteplase), 유로키나아제(urokinase), 살몰 칼시토닌(salmon calcitonin), 팔리퍼민(palifermin; keratinicyte growth factor) 및 베카플러민(becaplermin; platelet-derived growth factor)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 약물의 봉입은 수용액 상에서 상기 고분자와 약물 간의 이온결합에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 고분자 및 약리 활성을 갖는 약물의 혼합비는 상기 고분자 대 약물의 비가 1:1 내지 10:1인 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  16. 제8항에 있어서,
    상기 나노 복합체는 pH 7.0 이하에서 나노 복합체 내부에 봉입되어 있는 약리 활성을 갖는 약물이 방출되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
  17. 제8항에 있어서,
    상기 나노 복합체의 입자 크기는 150~450nm인 것을 특징으로 하는 pH 민감성 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법.
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