KR20080026259A - 약물 전달체로 사용되는 풀루란 아세테이트, 그의 미립구및 그들의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약물 전달체로 사용되는 아세트화된 다당류, 그의 미립구 및 그들의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 휘발성 용매에 대한 용해도가 높고 균일하게 약물을 방출하는 풀루란 아세테이트, 그의 미립구, 그들의 제조방법 및 이들을 이용하는 단백질 약물의 전달 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 풀루란 아세테이트 미립구는 단백질 및 펩타이드 약물의 변성을 억제하고 약물의 활성을 효과적으로 유지하며 약물의 방출 속도도 아세트화 과정으로 조정할 수 있으므로, 기존의 방법을 대체하는 새로운 약물 전달 시스템으로 널리 사용될 수 있다.

아세트화된 다당류, 풀루란 아세테이트 미립구, 단백질 약물의 전달 시스템

Description

약물 전달체로 사용되는 풀루란 아세테이트, 그의 미립구 및 그들의 제조방법 {Pullulan acetate for drug delivery, its microsphere and method for preparing the same}

도 1은 본 발명의 풀루란 아세테이트 (b) 및 풀루란 (a)의 화학 구조들을 나타낸 것이다.

도 2 는 본 발명의 풀루란 아세테이트 (PA 3)를 핵자기 공명 (¹H-NMR)스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 풀루란 아세테이트들을 주사 전자현미경 (SEM)으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.

(a) PA 1; (b) PA 2; (c) PA 3; (d) PA 4; 및 (e) PA 5

도 4는 본 발명의 풀루란 아세테이트 미립구들로부터 라이소자임이 방출되는 양상을 나타낸 것이다.

(a) PA 1 (●); (b) PA 2 (○); (c) PA 3 (▼); (d) PA 4 (△); 및 (e) PA 5 (■)

도 5는 본 발명의 풀루란 아세테이트 미립구에서의 불용성 라이소자임 함량을 대조군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 풀루란 아세테이트 (PA 5) 미립구로부터 방출된 라이소자임의 활성 변화를 나타낸 것이다.

본 발명은 약물 전달체로 사용되는 아세트화된 다당류, 그의 미립구 및 그들의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단백질 및 펩타이드 약물의 변성을 억제하고 효능을 적절히 유지하면서 균일하게 약물을 방출하는 풀루란 아세테이트, 그의 미립구, 그들의 제조방법 및 이들을 이용하는 단백질 약물의 전달 시스템에 관한 것이다.

단백질 또는 펩타이드는 소량으로 뛰어난 약물 효능을 나타낼 수 있고 부작용이 적으며 그 자체가 독특한 생리 활성을 가지고 있어 의약품으로서 많이 연구되고 실제로 사용되고 있다. 그러나, 이들은 반감기가 짧고 불안정성하기 때문에 투약에 있어서 적정한 유효 농도를 유지가 어렵고 만성질환의 치료 시 자주 투약해야 하는 문제점을 가지고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 다양한 방법들이 시도되고 있고, 그 중 하나가 서방성 방출 특성을 가지고 방출 속도가 용이하게 제어되는 생분해성 미립구 (biodegradable microspheres) 개발이며 현재 그 연구가 활발히 진행되고 있다 (W. R. Gombotz 및 D. K. Pettit., Bioconjugation., 6: 332-351, 1995; G. Crotts 및 T. G. Park, J. Microencapsul., 15: 699-713, 1998; J. A. Schrier 및 P. P. DeLuca, Pharm. Dev. Technol., 4: 611-621, 1999)

이러한 생분해성 미립구는 크게 2가지 종류로 나눌 수 있는 데, 먼저 생체적합성이 탁월한 천연 단백질인 알부민 (albumin) 그리고 다당류인 덱스트란 (dextran) 및 전분 (starch) 등을 사용하여 제조된 미립구를 들 수 있다 (H. Thakkar et al., AAPS PharmSciTech., 6(1): E65-73, 2005; B. W. Woo et al., Pharm. Res., 18: 1600-1606, 2001; M. A. McDonald 및 K. L. Watkin, Acad. Radiol., 13(4): 421-7, 2006). 둘째, 생분해성이 탁월한 합성 고분자인 폴리(-카프로락톤) (poly(-caprolactone); PCL), 폴리(락타이드) (poly(lactide); PLA), 폴리(글리코라이드) (poly(glycolide); PGA) 및 폴리(락타이드-co-글리코라이드) ( poly(lactide-co-glycolide); PLGA) 등을 사용하여 제조된 미립구들이 있다 (J. Pean et al., Pharm. Res., 16: 1294-1299, 1999; T. Ehtezazi et al., J. Control Release 66: 27-38, 2000; J. Goodwin et al., J. Biomed. Mater. Res. 40: 204-213, 1998; Y. Y. Yang et al., J. Control. Release, 69: 81-96, 2000).

일반적으로 단백질 약물을 봉입하는 과정에는 W/O/W 이중 에멀젼 방법이 사용되고 있고, 이 과정에는 고분자가 휘발성 용매에 용해되는 특성이 있어야만 한다. 그러나, 천연 고분자의 경우는 화학적 모사과정 (modification)을 거치더라도 휘발성 용매에 용해되는 특성을 거의 가지지 않으므로 상기 W/O/W 방법을 사용하여 단백질 약물을 봉입한 미립구를 제조하는 것은 쉽지 않다. 대조적으로, 합성 고분자의 경우는 휘발성 용매에 잘 용해되며 에스터 결합 (ester linkage)으로 이루어져 있어 인체 내에서 생분해되는 장점을 가진다. 따라서, 지금까지 미립구의 제조에 있어서 합성 고분자가 천연 고분자보다 더욱 많이 연구되어 왔다.

특히 합성 고분자들 중에서 폴리(락타이드-co-글리코라이드) (PLGA)는 락타이드 (lactide)와 글리코라이드 (glycolide)의 비율에 따라 그 분해 속도가 조절될 수 있고, 이미 미국 식품의약청 (FDA)에서 인체 주입용으로 허가를 받은 상태이므로 단백질 약물의 전달 시스템으로 널리 연구되고 있다 (J. L. Cleland et al., Adv. Drug Delivery Rev., 28: 71-84, 1997).

그러나, 이들 약물 전달 시스템은 지난 10여 년 동안 꾸준히 연구되어 온 아주 매혹적인 약물전달 방법이면서도 그 성공 사례는 극히 한정되는 문제점을 가지고 있다. 그 이유는 이들 고분자 모두가 에스터 결합으로 이루어져 있고 가수분해 시 많은 수소 이온을 배출하기 때문이다. 이로부터 배출된 수소 이온은 미립구 안의 환경을 산성으로 만들어 단백질 및 펩타이드 약물의 변성 (denatureation), 응집(aggregation) 및 탈아미노화 (deamidation) 등을 유도하여 약물의 안정성을 크게 손상시킨다 (J. L. Cleland et al., Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 10: 307-377, 1993; F. M. Richards. Cellular and Molecular Life Science, 53: 790-802, 1997; S. D. Putney and P. A. Burke. Nat. Biotechnol., 16: 153-157, 1998; W. Wang. Int. J. Pharm., 203: 1-60, 2000; M. van de Weert et al., Pharm. Res., 17: 1159-1167, 2000). 따라서 많은 연구자들은 이러한 미립구 안의 산성화 과정을 억제하려고 다양한 연구를 시도하였다. 구체적으로, 스웬드만 연구팀은 불용성인 수산화마그네슘 (magnesium hydroxide, Mg(OH)₂))을 미립구의 제조 과정 중에 넣어 PLGA 분해 시 나오는 수소를 중화시키고 미립구 안의 산성화를 억 제하여 봉입된 단백질의 안정성을 증가시키는 연구를 보고하였다 (J. Wang et al., J. Control Release., 82: 289-307, 2002; G. Zhu et al., Nat. Biotechnol., 18: 52-57, 2000). 또한 배 연구팀은 PEG/폴리(L-히스티딘) (PEG/poly(L-histidine)) 이중블록 공중합체를 첨가하여 봉입된 단백질의 활성을 유지시키는 연구를 보고하였다 (J. H. Kim et al., J. Control Release., 109(1-3): 86-100, 2005). 그러나 이들 연구 모두는 별도의 첨가제를 사용해야 한다는 단점을 가지고 있어 그 실용성에 대한 많은 의문이 제기되고 있다.

풀루란 (pullulan)은 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 균주가 생산하는 포도당이 -(1-4) 또는 (1-6)로 연결된 중성이면서 선형인 세포외 다당류 (extracellular polysaccharide)이다. 이러한 풀루란은 생체 적합성이 뛰어나기 때문에, 다양한 화학적 모사 과정을 통하여 생체 재료로서 많이 연구되고 있다 (Y. Xi et al., Pharm Res., 13: 1846-1850, 1996). 구체적으로, 일본의 수나모토 연구팀은 풀루란에 콜레스테롤 기를 도입하여 자기응집 나노 입자를 제조하고 이들의 물리 생화학적 특성 연구한 바 있었다 (T. Nishikawa et al., J. Am. Chem. Soc., 118: 6110-6115, 1996). 또한 나 등은 풀루란에 pH 민감성 물질인 썰폰아미이드 (sulfonamide)를 접합시키어 암세포 주위의 pH 변화에 민감한 나노 입자를 제조하고, 이 나노 입자와 암세포 간의 상호작용이 pH 에 따라 변화하는 양상을 관찰하였고, 이로부터 항암제 방출 특성의 변화에 대해서도 보고하였다 (K. Na et al., J. Control Release, 87: 3-13, 2003; K. Na et al., J. Control Release, 97: 513-525, 2004; K. Na et al., J. Control Release, 69: 225-236, 2000; K. Na 및 Y. H. Bae, Pharm. Res., 19: 681-688, 2002). 또한 나 등은 풀루란에 비타민을 접합시킨 나노 입자를 제조하여 간암 타겟팅 효과를 조사하고 이 나노 입자가 높은 치료 효능이 있는 것을 보고하였다 (K. Na et al., Eur. J. Pharm. Sci., 18: 165-173, 2003). 그러나, 다당류의 일종인 풀루란은 수용성 고분자이기 때문에 그 자체만으로는 미립구의 제작에 사용될 수 없고, 따라서 미립구로 제작되기 위해서는 양친성을 부여할 수 있는 아세틸화가 필수적이다

이에 본 발명자들은 새로운 약물 전달 시스템을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 다당류인 풀루란을 다양한 정도로 아세트화시키고, 여기서 얻은 풀루란 아세테이트에 라이소자임을 봉입하여 단백질 약물 미립구를 제조한 다음 이 미립구가 생체 적합성 및 생분해성이 탁월할 뿐만 아니라 합성 고분자 및 천연 고분자의 단점인 W/O/W 방법 사용 시 휘발성 용매에 대한 난용성을 해결하면서 약물의 변성을 억제하고 활성은 효과적으로 유지하며 약물의 방출 속도도 적절히 조절할 수 있는 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 휘발성 용매에 대한 용해도가 높고 균일하게 약물을 방출하는 풀루란 아세테이트, 그의 미립구, 그들의 제조방법 및 이들을 이용하는 단백질 약물의 전달 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 약물 전달체로 사용될 수 있는 풀 루란 아세테이트를 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 풀루란을 포름아마이드에 용해시키고;

(2) 피리딘 및 무수아세트산을 첨가하여 반응시키고;

(3) 물을 가하여 침전시키어 생산물을 회수하고; 및

(4) 상기 (3) 과정을 3회 이상 반복하여 불순물을 제거하는; 과정으로 이루어진 풀루란 아세테이트의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 단백질 또는 펩타이드 약물의 방출 속도가 조절될 수 있는 풀루란 아세테이트 미립구를 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 단백질 또는 펩타이드 약물을 적절한 완충용액에 녹이고;

(2) 풀루란 아세테이트를 유기용매에 녹이고;

(3) 상기 풀루란 아세테이트 용액을 상기 단백질 또는 펩타이드 약물 용액과 격렬히 혼합하고; 및

(4) 상기 혼합 용액을 폴리비닐알코올 (PVA) / 소듐 클로라이드 용액에 주입하여 원심분리 하는; 과정으로 입자를 회수하는 풀루란 아세테이트 미립구의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 풀루란 아세테이트를 사용하여 미립구를 제조하는 단백질 또는 펩타이드 약물의 전달 시스템을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 약물 전달체로 사용될 수 있는 아세트화된 다당류를 제공한다. 본 발명의 아세트화된 다당류는 단백질 또는 펩타이드 약물의 전달에 적합하도록 아세트화 정도가 적절히 조절될 수 있고, 이 과정으로 약물의 휘발성 용매에 대한 용해도 및 약물 방출 속도 등을 해당 약품에 따라 변화시킬 수 있다.

이 때 다당류로는 풀루란 등을 사용하는 것이 바람직하다. 풀루란은 친수성 고분자로서 아세틸화를 통하여 소수성 (hydrophobicity)이 부여되므로 아세틸화 정도가 클수록 소수성을 나타내면서 메틸렌 클로라이드 용매에 더 잘 용해되는 경향성을 가진다.

또한, 본 발명은

(1) 다당류를 포름아마이드에 용해시키고;

(2) 피리딘 및 무수아세트산을 첨가하여 반응시키고;

(3) 물을 가하여 침전시키어 생산물을 회수하고; 및

(4) 상기 (3) 과정을 3회 이상 반복하여 불순물을 제거하는; 과정으로 이루어진 아세트화된 다당류의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 아세트화된 다당류의 제조방법에 있어서, 상기 (1) 과정은 40 내지 60℃ 범위에서 교반하여 이루어지는 것이 바람직하고, 45 내지 55℃ 범위에서 교반하는 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 (2) 과정에서 무수 아세트산의 양을 적절히 조절하여 풀루란의 아세트화 정도를 다양하게 변화시킬 수 있으며, 무 수 아세트산은 50 내지 60℃ 범위에서 40 내지 50시간 동안 반응시키는 것이 바람직하고, 54℃에서 48시간 동안 반응시키는 것은 더욱 바람직하다.

본 발명의 상기 제조방법에서, 다당류로는 풀루란 등을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 단백질 또는 펩타이드 약물의 방출 속도가 조절될 수 있는 아세트화된 다당류의 미립구를 제공한다.

상기 약물의 방출 속도는 다당류의 아세트화 정도를 다양하게 조절하여 적절히 변화시킬 수 있고, 상기 다당류로는 풀루란을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은

(1) 단백질 또는 펩타이드 약물을 적절한 완충용액에 녹이고;

(2) 아세트화된 다당류를 유기용매에 녹이고;

(3) 상기 다당류 용액을 상기 단백질 또는 펩타이드 약물 용액과 격렬히 혼합시키고; 및

(4) 상기 혼합 용액을 폴리비닐알코올 (PVA) / 소듐 클로라이드 용액에 주입하여 원심분리 하는; 과정으로 입자를 회수하는 아세트화된 다당류 미립구의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 상기 미립구의 제조방법에 있어서, 상기 (1) 과정에서는 인산 완충용액 (pH 5.1)을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 (2) 과정에서는 메틸렌 클로라이드 유기용매를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 (4) 과정에서는 20 중량% 폴리비닐알코올 (PVA) / 0.9 중량% 소듐 클로라이드 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 다당류로는 풀루란을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 아세트화된 다당류를 사용하여 제조된 미립구를 포함하는 단백질 또는 펩타이드 약물의 전달 시스템을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 약물 전달 시스템은 휘발성 용매에 대한 용해도가 높은 다당류 미립구를 사용하여 약물을 전달하는 과정에서 단백질 또는 펩타이드의 변성을 억제하고 동시에 약물의 활성을 효과적으로 유지하며 약물의 방출 속도도 아세트화 정도로 다양하게 조절할 수 있다.

본 발명의 풀루란 아세테이트를 포함한 아세트화된 다당류를 이용하여 의약품 등을 전달하는 시스템이라면 모두 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 아세트화된 풀루란의 제조

본 발명은 풀루란을 아세트화하기 위하여, 풀루란 (분자량 100,000 Da)은 일본 하야시바라 (Hayashibara)사로부터 구입하고, 무수아세트산 (acetic anhydride), 피리딘 (pyridine) 및 라이소자임 (lysozyme) 등은 시그마 (Sigma)사로부터 구입하여 사용하였다. 기타 화학 약품 및 용매는 별도의 정제 과정이 필요 없는 특급 시약을 사용하였다. 또한, 풀루란은 다음의 같이 아세트화 (acetylation)시키어 이에 양친성을 도입하였다 (도 1 참조). 풀루란 2 g 을 20 mL 포름아마이드에 넣고 50℃에서 강력하게 교반하여 용해시킨 다음 이로부터 얻은 용액에 피리딘 6 mL 와 무수아세트산 (acetic anhydride) 315 mL 을 각각 첨가하여 54℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나고 얻은 용액은 다시 물 200 mL에서 침전을 실시하고 여과하여 생산물을 회수하였다. 상기 과정을 3회 이상 반복하여 상기 생산물로부터 불순물을 제거하였고, 여기서 합성된 풀루란 아세테이트는 FT-IR, NMR 및 GPC 등을 실시하여 풀루란에서의 치환도를 측정하였다.

실시예 2. 풀루란 아세테이트 미립구의 제조

본 발명은 풀루란 아세테이트 미립구 (PA)를 제조하기 위하여, 먼저 0.25 mL PBS 완충용액 (phosphate buffer saline (pH 5.1))에 라이소자임 (Sigma사 제품) 50 mg 를 서서히 녹이고, 300 mg의 다양한 풀루란 아세테이트들 (PA; 아세트화 정도 0.3, 0.7, 1.4, 1.7 및 2.1) 및 RG 502H (0, 50, 150 및 300 mg)을 3.0 mL 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride; MC)에 녹였다. 풀루란 아세테이트 (PA)가 녹아 있는 메틸렌 클로라이드 (MC) 용액에 라이소자임이 녹아 있는 수용액을 넣고 15초 동안 격렬하게 볼텍스 (vortex)하여 W/O 상을 준비하였다. 준비한 W/O 용액을 20 중량% PVA / 0.9 중량% NaCl 용액 1 L 에 주사기를 사용하여 15 이내에 주입하여 균질하게 4,000 rpm, 4분 조건으로 혼합하였다. 이와 같이 미립구 입자를 제조하고 다시 40분 동안 서서히 교반하여 입자를 굳히는 과정을 거쳤다. 상기 미립구 입자는 2,500 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 회수하고, 상층액을 제거하여 신선한 0.9 중량% NaCl 용액을 넣고 재분산시킨 다음 다시 원심분리하고, 이 과정을 3회 반복하여 수행하였다. 그 다음 반응물을 동결 건조시키고 3일이 경과한 다음 미립구 입자를 분리하였다.

실시예 3. 풀루란 아세테이트 입자의 형상 분석

본 발명의 풀루란 아세테이트 입자를 분석하기 위하여, 제조된 미립구의 표면을 전자현미경 (scanning electro microscope; SEM (JSM-5800, JEOL))으로 관찰하였다. 먼저, 미립구를 메탈 스터브 (metal stub) 위에 놓고 진공 상태에서 금 입자를 코팅한 다음 전자현미경으로 해당 사진을 촬영하였다.

도 2 는 본 발명의 풀루란 아세테이트 (PA 3)을 핵자기 공명 (¹H-NMR)스펙트럼으로 분석한 것이다. 그 결과, 1.8 내지 2.2 ppm 사이에서 메틸기에 있는 수소 (CH₃)의 화학적 이동 (chemical shift)이 관찰되었고, 이로부터 풀루란의 수산기 (OH)에 아세틸기가 잘 결합된 것을 알 수 있었다. 아세틸화 정도는 포도당 한 분자당 0.3 내지 2.1개에 이르기까지 무수아세트산의 첨가량에 따라 다양한 양상을 나타내었다.

이와 같이 합성된 5가지의 PA 시료들 (PA 1, 2, 3, 4, 5)은 W/O/W 방법을 이용하여 미립구를 제조하는 데 사용되었다. 도 3은 본 발명의 풀루란 아세테이트들을 주사 전자현미경 (SEM)으로 관찰한 사진, (a) PA 1; (b) PA 2; (c) PA 3; (d) PA 4; 및 (e) PA 5이다. PA 미립자들의 표면을 관찰한 결과, 모든 시료로부터 제 조된 미립자의 모양이 구형을 이루고, 입자 크기는 PA 1, PA 2 및 PA 3의 경우 10 내지 50 μm 정도로 분포가 좀 넓은 편이지만 아세틸화 정도가 높은 미립자 PA 4 및 PA 5의 경우 20 내지 50 μm 정도로 미립자의 크기 분포가 좁아지는 것을 확인하였다. 특히 미립구 PA 5 입자는 30 내지 50 μm 정도로 훨씬 좁게 분포하였다. 따라서 아세틸화 정도가 낮은 시료의 미립자는 작은 입자의 분포에 있어서 훨씬 우세한 반면, 아세틸화 정도가 높아질수록 입자의 분포 범위가 좁아지는 동시에 작은 입자의 수가 크게 감소하는 것을 알 수 있었다.

상기에서 언급한 바와 같이, 풀루란은 친수성 고분자로서 아세틸화를 통하여 소수성 (hydrophobicity)이 부여되므로 아세틸화 정도가 클수록 소수성을 나타내면서 메틸렌 클로라이드 용매에 더 잘 용해되는 경향성을 가진다. 따라서 아세틸화 정도가 낮은 경우에는 용매인 메틸렌 클로라이드에 대한 용해도가 낮아져서 부분적으로 녹지 않은 부분이 존재할 수 있다는 점을 시사하였다. 그러므로 용매의 증발 시 다른 PA 분자와의 상호 작용 (소수성 작용)이 충분치 않아 아주 다양한 크기의 미립자가 만들어진 것을 사료되었다.

실시예 4. 풀루란 아세테이트 입자의 약물 봉입도 분석

본 발명은 풀루란 아세테이트의 약물 봉입도를 조사하기 위하여, 제조된 미립구의 라이소자임 봉입도 (lysozyme encapsulation %)를 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 20 mg 표준 시료 (라이소자임 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0.15625 mg)을 1 ml 6 M HCl 에 넣고 24시간 동안 37℃, 100 rpm으로 교반하였다. 다시 이 반응액을 6 ml 1 M NaOH 에 넣고 24시간 동안 37℃, 100 rpm으로 교반한 다음, 50 μl의 라이소자임 용액을 96-웰 마이크로 플레이트로 옮기고 125 μl의 4% (w/v) NaHCO₃ (pH 9.0) 및 50 μl의 0.5% (w/v) 2,4,6-트리니트로벤젠술포네이트 용액을 넣어 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 이 과정은 가수분해에 의하여 작은 조각들로 잘린 자유 아미노산을 정량하는 것이다. 상기 반응이 끝나면 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 최종적으로 상기 봉입도를 분석하였다.

그 결과, PAM 의 라이소자임 봉입도은 아세틸화 정도에 따라 달라지는 것을 관찰할 수 있었다. 구체적으로, PA 1는 가장 낮은 봉입도 값을 나타낸 반면 PA 5의 경우 가장 높은 봉입도를 나타내어 아세틸화가 클수록 라이소자임의 봉입도가 큰 것을 알 수 있었다. 따라서, W/O/W 방법을 이용한 미립자 제조과정에서 아세틸화가 증가할수록 용매가 증발할 때 완벽한 막을 만들어 단백질의 봉입에 유리하게 작용하기 때문이라고 사료된다.

<표 1> 풀루란 아세테이트 미립구 (PAMs)의 라이소자임 봉입도

상기 표 1에서 아세틸화 정도는 풀루란의 무수 포도당 단위 당의 수치를 ¹H-NMR 및 GPC 로 분석한 것이고, 라이소자임 함량은 전체 무게 당 라이소자임의 무게를 백분율로 계산한 것이며, 라이소자임 봉입도는 초기 라이소자임 무게 당 방출된 전체 무게를 백분율로 계산한 것이다.

실시예 5. 불용성 라이소자임의 응집도 분석

본 발명은 불용성 라이소자임의 응집도를 분석하기 위하여, 40 mg의 미립구를 1 ml 메틸렌 클로라이드에 녹이고 30분 동안 교반하였다. 이 용액을5,000 rpm 에서 20분 동안 원심분리시키어 부유액을 제거하고 단백질이 포함된 침전물을 1 ml의 10 mM 인산 완충용액 (phosphate buffer, pH 5.1)에 녹였다. 이 때 녹지 않는 응집물 (aggregates)은 원심분리하여 6 M 우레아 (urea)가 포함된 10 mM 인산 완충용액 (pH 5.1) 1 ml에 녹이고, 상기 용액은 다시 1 ml의 6 M HCl에 넣고 24시간 동안 37℃, 100 rpm으로 교반시켰다. 그 결과 얻은 용액은 6 ml 1 M NaOH 에 넣고 24시간 동안 37℃, 100 rpm으로 다시 교반시키고, 50 μl의 라이소자임 용액을 96-웰 마이크로 플레이트로 옮기고 125 μl의 4% (w/v) NaHCO₃ (pH 9.0) 및 50 μl의 0.5% (w/v) 2,4,6-트리니트로벤젠술포네이트 용액을 넣어 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 상기 반응이 끝나면 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

<표 2> 각 풀루란 아세테이트 시료에서의 결과값

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 풀루란 아세테이트를 단독으로 사용한 것이 일반 PLGA 미립구를 사용하여 단백질을 봉입한 것보다는 봉입도가 높지만, PLGA 첨가제를 함께 사용하면 단백질의 봉입도는 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 풀루란 아세테이트 내의 라이소자임 활성도 조사

본 발명은 풀루란 아세테이트 내의 라이소자임 활성도를 조사하기 위하여, 2.3 mg/ml 마이크로코커스 라이소데이티쿠스 (Micrococcus lysodeikticus; ATCC 4698) 균주의 세포 현탁액 (66 mM 인산 완충용액, pH 6.2) 중 100 μ을 상기 실험 과정에서 얻은 시료 라이소자임 1 ml 중 150 μl (또는 표준 시료용액 0 내지 1 mg/ml)과 섞고 450 nm에서 15초 간격으로 4분 동안 시간에 따른 흡광도 감소를 측정하였다. 이로부터 얻은 곡선의 선형 부분의 기울기는 표준시료의 기울기와 상관 관계가 있어, 상기 결과는 초기 반응율 (kinetic rate)로 표시가 된다 (흡광도의 기울기 vs. t ₅₀ 시간). 여기서 라이소자임의 활성도는 각 시료의 초기 기울기와 관계가 있고, 표준시료 라이소자임 농도 별 초기속도에 대한 표준 값을 정하고, 이 때 각 표준시료 라이소자임의 초기속도는 활성도 100% 를 의미한다. 각 측정 시료의 초기 속도를 계산하고 표준시료 초기 속도와 비교하여 상대적 활성도를 계산하였다.

본 발명에서는 미립구 안에 봉입된 라이소자임의 안정성을 두 가지 방식, 즉 미립구 내에 봉입된 단백질의 안정성 그리고 방출된 단백질의 안정성으로 나누어 분석하였다. 첫째, 미립구 제조 시 생기는 문제점으로 단백질 약물이 유기용매와 접촉하면서 불용성 응집체 (aggregate)로 변성되는 것을 의미하는 데, PLGA 미립구를 이용한 단백질 약물의 봉입에서 가장 큰 문제점 중의 하나이다. 둘째, 단백질 활성에는 손상 없이 미립구 안에 봉입되었더라도 미립구 안의 여러 가지 환경 변화에 의해 활성을 잃게 되는 문제점이다.

도 5는 본 발명의 풀루란 아세테이트 미립구에서 불용성 라이소자임의 함량을 대조군과 비교하여 나타낸 것이다. PA 1의 경우 약 23% 정도의 불용성화를 보이고, 이 수치는 아세틸화가 증가할수록 감소하였다. PA 5의 경우 약 17% 정도로 상대적으로 가장 낮은 불용성 수치를 나타내었다. 이것은 아세틸화가 높은 미립구일수록 라이소자임이 활성을 유지한 상태로 봉입되는 것을 의미한다. PLGA 미립구의 경우 약 35-40% 정도의 불용성화를 보이는 것을 보면, PA 미립구가 라이소자임 봉입 시 PLGA 보다 훨씬 우수한 활성 유지도를 나타내는 것을 알 수 있었다.

도 6은 본 발명의 풀루란 아세테이트 (PA 5) 미립구로부터 방출된 라이소자임의 활성을 나타낸 것이다. 라이소자임은 25일의 방출 기간이 경과하여도 거의 100% 의 활성도를 유지하였고, 이는 미립구안의 환경이 산성으로 크게 바뀌지 않은 것을 나타내는 동시에 단백질과 미립구 사이에 아실레이션 (acylation)과 같은 화학적 공유결합이 존재하지 않은 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 풀루란 아세테이트 미립구의 단백질 방출 정도의 조사

본 발명은 풀루란 아세테이트의 방출 정도를 조사하기 위하여, 각 PAM 으로부터 라이소자임 방출 시험을 다음과 같이 실시하였다. 풀루란 아세테이트 미립구 20 mg 을 3 ml PBS 완충용액 (pH 7.4, 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.24 g KH₂PO₄, 1.81 g Na₂HPO₄ ㅇ H₂O, 0.5 g NaN₃, 0.1 g 트윈-20, 1,000 ml 증류수)에 현탁하고 다이알리시스 백 (dialysis bag; 분자량 컷-오프 300,000)에 넣고 37℃에서 교반하면서 주어진 각 시간 마다 2 ml을 회수하고 신선한 PBS 완충용액 2 ml를 첨가하였다. 이로부터 회수된 용액은 마이크로 BCA 반응 키트 (micro BCA reagent kit)를 사용하여 각 반응용액을 주입하고 40℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음 20 내지 2,000 g/ml의 민감도 범위 (sensitivity range)에서 마이크로플레이트 리더로 562 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.

<표 3> 생체 외 (in vitro) 방출량 조사

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 단백질 약물의 방출량은 상당히 탁월한 수치를 나타내었고, 특히 시료 5-3 및 5-4의 경우 49일 경과 시 방출량이 90% 이상인 것을 알 수 있다. 이 결과는 지금까지 개발된 기존 미립구과 비교하여 가장 높은 방출 특성을 보여주는 것이다.

<표 4> 장기 방출 활성 조사

도 4는 본 발명의 풀루란 아세테이트로 제조된 미립구들로부터 라이소자임이 방출되는 양상을 나타낸 것이다. 상대적으로 아세틸화 정도가 낮은 PA 1 및 PA 2의 경우 약물의 초기 방출 정도가 약 45% 정도로 매우 크게 나타나지만, 아세틸화 정도가 높은 PA 4 및 PA 5의 경우 10% 내외로 크게 감소하였다. 이러한 낮은 초기 방출 값은 PLGA 미립구의 경우에 비해서도 매우 낮은 값으로 약물 전달체로서의 가능성을 제시한다. 또한 PA 1 및 PA 2의 경우 방출 시작 10일 후 방출이 거의 멈춘 것으로 보이는 반면, PA 4 및 PA 5의 경우 꾸준히 방출이 지속되어 40일 동안 단백질의 방출이 계속되었다. PLGA 미립구를 이용한 라이소자임의 방출이 거의 PA 1 및 PA 2 미립구와 유사한 경향을 보이는 것을 감안하면, PA 4 및 PA 5 미립구는 단백질 약물의 방출을 충분히 조절할 수 있기 때문에 매우 의미가 있는 결과로 사료되었다.

상기 PA 4 및 PA 5 미립구의 방출 속도는 먼저 미립구 표면의 소수성으로 인해 조절되는 데, 높은 아세틸화는 미립구 표면의 더 높은 소수화를 유도하고 이로 인해 미립구 안으로 물의 침투가 억제되었으며, 따라서 확산에 의한 단백질 약물의 방출이 최대한 억제된 것으로 판단되었다. 또한, 상기 방출 속도는 PA의 수산기 (OH)와 라이소자임의 아민기 (NH₂) 사이의 수소결합 (hydrogen bonding)에 의해서도 조절될 수 있다. 라이소자임은 PAM 에 분자 수준으로 분산되어 고르게 분포하고, 이러한 분포는 PA 와 라이소자임의 수소결합을 가능하게 하여 초기 방출을 줄이는 역할을 담당하였을 것으로 사료되었다.

그 결과, PA는 휘발성 용매인 메틸렌 클로라이드에 대해 용해도가 높아 W/O/W 방법을 이용한 단백질 약물전달체의 있어서 매우 효율적인 것을 알 수 있었다. PA로부터 제조된 미립구 (PAM)는 아세틸화가 증가할수록 균일한 입자 분포를 보이고, 봉입 효율도 역시 증가하였다. 단백질 약물의 초기 방출은 미립구제조의 성패를 좌우하는 데, 높은 아세틸화를 갖는 PAM의 경우 10% 내외의 초기방출을 보일 뿐만 아니라 봉입된 단백질의 불활성 정도를 나타내는 불용성화도 높은 아세틸화 PAM 에서 좋게 나타났다. 또한, PA 5 에서 방출된 라이소자임은 거의 100%의 활성을 그대로 유지하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 휘발성 용매에 대한 용해도가 높고 균일하게 약물을 방출하는 풀루란 아세테이트, 그의 미립구, 그들의 제조방법 및 이들을 이용하는 단백질 약물의 전달 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 풀루란 아세테이트 미립구는 단백질 및 펩타이드 약물의 변성을 억제하고 약물의 활성을 효과적으로 유지하며 약물의 방출 속도도 아세트화 과정으로 조정할 수 있으므로, 기존의 방법을 대체하는 새로운 약물 전달 시스템으로 널리 적용될 수 있다.

Claims (4)

1. 단백질 또는 펩타이드 약물의 방출 속도가 조절될 수 있는 풀루란 아세테이트 미립구.
2. (1) 단백질 또는 펩타이드 약물을 적절한 완충용액에 녹이고;

   (2) 풀루란 아세테이트를 유기용매에 녹이고;

   (3) 상기 풀루란 아세테이트 용액을 상기 단백질 또는 펩타이드 약물 용액과 격렬히 혼합하고; 및

   (4) 상기 혼합 용액을 폴리비닐알코올 (PVA) / 소듐 클로라이드 용액에 주입하여 원심분리 하는; 과정으로 입자를 회수하는 제 1항의 풀루란 아세테이트 미립구의 제조방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 (1) 과정에서 인산 완충용액 (pH 5.1)을 사용하고, 상기 (2) 과정에서 메틸렌 클로라이드 유기용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제 1 항의 풀루란 아세테이트 미립구를 포함하는 단백질 또는 펩타이드 약물의 전달 시스템.

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