KR102022763B1

KR102022763B1 - 광화학 병용 치료를 위한 pH 반응성 고분자 복합체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102022763B1
Application number: KR1020170079728A
Authority: KR
Inventors: 오경택; 임채민
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-09-19
Also published as: KR20190000573A

Abstract

본 발명은 광화학 병용 치료를 위한 pH 반응성 고분자 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 폴리에틸렌글라이콜, 양이온성 폴리아미노산 및 폴리락트산으로 이루어진 마이셀 형태의 고분자 및 상기 고분자 내 봉입된 독소루비신을 포함하며, 상기 고분자 중 양이온성 폴리아미노산의 곁가지에 pH 감응성 반응기와 광감작제(chlorin e6)를 각각 접목시켜 제조된 pH 반응성 다이온성 복합체(Polyionic complex; PIC)는 나노 크기의 응집체를 형성하며, 약산성을 나타내는 암세포 환경에서 마이셀로부터 pH 의존성 광감작제의 해리를 일으켜 일중항 산소 발생 및 항증식 활성을 향상시킬 수 있다.
따라서, 상기와 같은 효과를 갖는 pH 반응성 다이온성 복합체는 치료 효능을 극대화하기 위해 광화학 병용 치료를 위한 나노 약물 플랫폼으로 활용될 수 있다.

Description

광화학 병용 치료를 위한 pH 반응성 고분자 복합체 및 이의 제조방법{pH sensitive polymer complex for photochemo combination therapy and preparing method thereof}

본 발명은 광화학 병용 치료를 위한 pH 반응성 고분자 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

광역학 치료(Photodynamic therapy; PDT)는 암 치료에 있어서 각광받고 있는 연구분야 중 하나이다. 현재 광역학 치료에 사용되는 약물인 광감작제(photosensitizer)를 다양한 항암제(chemodrug)와 접목시켜 두 약물의 병용 치료를 통한 암 치료 연구가 활발히 진행되고 있으며, 광역학 치료가 화학요법(chemotherapy)과 접목될 때, 두 약물의 복합 작용으로 인해 다양한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 특정 항암제는 광역학 치료에 사용되는 약물과 접목되어 병용 투여 시, 약물 치료가 감소되는 효과가 보고된 바 있으며, 이에 대표적인 항암제는 독소루비신(Doxorubicin)이 있다.

독소루비신은 광범위한 항암제로 유방암, 혈액암, 전립선암 등 다양한 종류의 암 질환 치료에 사용되고 있으며, 특히 진행성 유방암(advanced breast cancer)에 치료 효과가 좋은 것으로 알려져 있다. 이러한 독소루비신은 임상적으로도 광범위하게 사용되고 있는 약물이나, 광역학 치료에 사용 시, 상승작용(synergism)이 아닌 길항작용(antagonism)을 나타내는 것이 보고된 바 있다. 그러나 이러한 길항작용에 대한 구체적인 입증은 되어있지 않은 상태이며, 일부 두 약물의 처리 방식에 따라 상승작용을 나타낸다는 보고도 있으나, 보다 정확한 기전은 현재까지 밝혀진 바 없다.

광역학 치료의 주요 기전은 광감작제가 빛을 받아 여기(excitation) 되었다가 방출(emission) 되면서 일중항 산소(singlet oxygen)를 발생시키는 것으로 볼 수 있다. 이때 발생하는 일중항 산소는 주변에 분포하고 있는 방향족 탄화수소(aromatic hydrocarbon), 지방산(fatty acid), 불포화 탄소의 이중결합, 안트라센(anthracene) 구조 등에 의해 포획된다.

독소루비신은 안트라센 구조를 가지는 항암제로 광감작제에 의해 발생되는 일중항 산소를 포획할 수 있기 때문에, 이는 독소루비신을 광역학 치료와 병용하여 사용 시 나타나는 길항작용의 주된 원인이 될 수 있다. 일반적으로 광역학 치료에서 발생하는 일중항 산소의 경우, 반감기는 1us이며 기간 동안 일중항 산소가 확산할 수 거리는 100 nm 이하이다. 이에 세포 내에서 일중항 산소의 발생 위치가 독성을 결정하는데 중요한 요소로 알려져 있다. 즉, 광감작제에 가깝게 분포하고 있는 특정 구조의 항암제는 광감작제로부터 발생하는 일중항 산소를 포획하여 광역학 치료를 포함한 병용 치료의 효과를 감소시킬 수 있다.

따라서 본 발명에서는 일중항 산소를 발생시키는 광감작제와 대표적인 항암제인 독소루비신을 하나의 나노 플랫폼에 봉입시킨 후, 암세포로 전달하여 항암 효능을 평가하고자 하였다. 안트라센 구조를 가지는 독소루비신이 광감작제에 의해 발생하는 일중항 산소를 포획할 수 있을 것으로 예상하였으며, 이에 산성 조건에서 변화할 수 있는 전달체를 이용하여 암세포의 특이적 조건인 산성 환경에서 두 약물 간의 거리를 떨어뜨려 줌으로써 광감작제로부터 발생하는 일중항 산소가 독소루비신에 포획되는 대신 주변 세포막과 반응하여 반응성 산소종(Reactive oxygen species; ROS) 형성 및 세포 성장 억제를 보여 줄 수 있을 것으로 예상하였다. 이는 기존의 단순한 두 약물의 농도, 비율 및 투여 순서의 조절을 통한 병용 치료가 아닌 근본적인 두 약물 간의 상호작용을 조절함으로써, 전체 약물 농도에서 두 약물이 서로 상승작용을 나타낼 수 있도록 도와준다. 특히, 임상연구를 진행 시, 복잡한 in vivo 환경은 원하지 않은 약물의 방출 등으로 인해 두 약물 간의 농도 및 비율 변화로 인한 예상치 못한 약효 감소를 나타낼 수 있다. 그러나 본 발명의 시스템은 단순한 약물 비율의 조절이 아닌 나노 플랫폼의 특성 조절로 광감작제와 독소루비신의 효능을 극대화 시킬 수 있다.

대한민국 공개특허 제 10-2012-0055604호(2012.05.31 공개)

본 발명의 목적은 광화학 병용 치료를 위한 pH 반응성 고분자 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리에틸렌글라이콜, 양이온성 폴리아미노산 및 폴리락트산으로 이루어진 마이셀 형태의 고분자 및 상기 고분자 내 봉입된 항암제를 포함하며, 상기 고분자 중 양이온성 폴리아미노산의 곁가지에 pH 감응성 반응기와 광감작제를 각각 접목시킨 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리에틸렌글라이콜, 폴리L-라이신 및 폴리락트산으로 이루어진 삼중블록 공중합체 용액을 pH 감응성 반응기과 반응시켜 제 1고분자를 제조하는 제 1단계, 폴리에틸렌글라이콜과 폴리[ε-(벤질옥시카르보닐)-L-라이신]으로 이루어진 공중합체에서 벤질기를 제거한 후, 광감작제와 반응시켜 제 2고분자를 제조하는 제 2단계, 상기 제 1고분자를 용매에 용해시킨 후, 마이셀을 제조하는 제 3단계, 상기 제 3단계의 마이셀과 상기 제 2단계의 고분자를 반응시켜 pH 반응성 고분자 복합체를 제조하는 제 4단계 및 상기 pH 반응성 고분자 복합체와 항암제 용액을 반응시켜 마이셀 내 항암제를 봉입하는 제 5단계를 포함하는 pH 반응성 고분자 복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 폴리에틸렌글라이콜, 양이온성 폴리아미노산 및 폴리락트산으로 이루어진 마이셀 형태의 고분자 및 상기 고분자 내 봉입된 독소루비신을 포함하며, 상기 고분자 중 양이온성 폴리아미노산의 곁가지에 pH 감응성 반응기와 광감작제(chlorin e6)를 각각 접목시켜 제조된 pH 반응성 다이온성 복합체(Polyionic complex; PIC)는 나노 크기의 응집체를 형성하며, 약산성을 나타내는 암세포 환경에서 마이셀로부터 pH 의존성 광감작제의 해리를 일으켜 일중항 산소 발생 및 항증식 활성을 향상시킬 수 있다.

따라서, 상기와 같은 효과를 갖는 pH 반응성 다이온성 복합체는 치료 효능을 극대화하기 위해 광화학 병용 치료를 위한 나노 약물 플랫폼으로 활용될 수 있다.

도 1은 광역학 치료 및 광화학 내재화 효과를 도시하여 나타낸 것이다.
도 2는 Ce6 및 Dox가 로딩된 나노 플랫폼을 이용한 pH 반응성 광화학 치료의 주요 개념을 도시하여 나타낸 것이다.
도 3(a)는 PEG-b-PLL(-g-DMA)-b-PLA 및 PEG-b-PLL(-g-Ce6) 합성 과정을 도시하여 나타낸 것이며, (b)는 pH 5.5 및 8.5에서 PEG-b-PLL(-g-Ce6) 및 자유 Ce6의 UV-Vis 흡수 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (c)는 DMSO-d₆에서 PEG-b-PLL(-g-DMA)-b-PLA의 ¹H-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 4(a)는 서로 다른 pH에서 다이온성 복합체(polyionic complex; PIC)의 입자 크기 및 제타 전위의 변화를 나타낸 것이며, (b)는 pH 7.4에서 전계 주사 전자 현미경을 이용하여 PIC의 입자 형태를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5(a)는 Ce6(녹색)의 흡광도 및 Dox(여기 481 nm, 적색)의 형광 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (b)는 PEG-PLL-g-DMA-PLA/Dox(PTM/D) (적색), PTM/D + 자유 Ce6(청색) 및 PTM/D + PEG-PLL-g-Ce6(녹색) (여기 481 nm)의 형광 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (c)는 서로 다른 pH(여기 481 nm)에서 PTM/D + PEG-PLL-g-Ce6 복합체 시스템의 형광 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (d)는 서로 다른 pH(여기 481 nm)에서 PTM/D + 자유 Ce6의 형광 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 (a) PEG-PLL(-g-Ce6), (b) PEG-PLL(-g-Ce6) + Dox-HCl, (c) PEG-PLL-g-Ce6-PLA/Dox 및 (d) PEG-PLL(-g-DMA)-PLA/Dox + PEG-PLL-g-Ce6의 9,10-디메틸 안트라센 형광 변화를 나타낸 것이다. 9,10-디메틸 안트라센 형광 강도(λex 360 nm 및 λem 380 내지 550 nm에서)의 변화를 플롯팅 하여 나타내었다(각 샘플 형광 강도를 제외하고 Ce6로부터 각각의 샘플 형광 강도를 뺀다).
도 7(a)는 서로 다른 빛 노출 시간에서 PEG-PLL(-g-Ce6)-PLA의 IC50 값을 나타낸 것이며, (b)는 서로 다른 Dox 농도(등가 Ce6 = 0.2 μg/ml, 100초 빛 노출 시간)에서 각 샘플로 처리된 MCF-7/Dox 세포 집단의 세포 생존율을 나타낸 것이며, (C)는 서로 다른 Ce6 농도(등가 Dox = 5 μg/ml, 100초 빛 노출 시간)에서 P-Ce6, P-Ce6/Dox 및 PIC/Dox로 처리된 MCF-7/Dox 세포 집단의 세포 생존율을 나타낸 것이며, (d)는 서로 다른 빛 노출 시간(등가 Dox = 2 μg/ml, Ce6 = 0.2 μg/ml)에서 각 샘플로 처리된 MCF-7/Dox 세포 집단의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 8(a)는 MCF-7/Dox 세포(Dox = 20 μg/ml, Ce6 = 0.2 μg/ml)에서 Dox와 DAPI의 형광 이미지를 나타낸 것이며, (b)는 MCF-7/Dox(Dox = 2 μg/ml, Ce6 = 0.2 μg/ml, 100초 빛 노출 시간)에서 Dox 흡수의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9(a)는 KB 종양 누드 마우스에 정맥 내 주사(i.v.)한 PIC의 생체 외 비 침습 형광 이미지 결과를 나타낸 것이며, (b)는 주사 24시간 후 (i) 심장, (ii) 비장, (iii) 신장, (iv) 간, (v) 종양 및 (vi) 폐의 형광 이미지를 나타낸 것이며, (c)는 체외 이미지의 종양 및 기관의 정량적인 형광 강도를 나타낸 것이다.

본 발명의 발명자들은 일중항 산소 발생 과정에서 항암제인 독소루비신과 광감작제인 Ce6 간의 상호 작용을 연구하고, 일중항 산소의 생성과 확산이 독소루비신과 밀접하게 관련되어 있음을 확인하기 위해, PEG-PLL(-g-Ce6) 및 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA/Dox로 구성된 새로운 유형의 pH 반응성 다이온성 복합체를 합성하여 MCF-7/Dox 세포에 대한 일중항 산소 발생 및 항증식 활성을 평가한 결과, 상기 pH 반응성 다이온성 복합체는 약산성을 나타내는 암세포 환경에서 마이셀로부터 PEG-PLL(-g-C6)의 해리를 일으켜 일중항 산소 발생 및 항증식 활성을 향상시키는 것을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 폴리에틸렌글라이콜, 양이온성 폴리아미노산 및 폴리락트산으로 이루어진 마이셀 형태의 고분자 및 상기 고분자 내 봉입된 항암제를 포함하며, 상기 고분자 중 양이온성 폴리아미노산의 곁가지에 pH 감응성 반응기와 광감작제를 각각 접목시킨 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체를 제공한다.

바람직하게는, 상기 양이온성 폴리아미노산은 폴리L-라이신 및 폴리-아르기닌으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리L-라이신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 마이셀 형태의 고분자는 폴리에틸렌글라이콜, 폴리L-라이신 및 폴리락트산으로 이루어진 삼중블록 공중합체일 수 있다.

바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 미톡산트론(mitoxantrone) 및 다우노루비신(daunorubicin)으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 독소루비신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 pH 감응성 반응기는 2,3-디메틸말레산 무수물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 광감작제 클로린 e6(chlorin e6), 포르피린(porphyrin) 및 나프탈로시아닌(naphthalocyanine)으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 클로린 e6일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 pH 반응성 고분자 복합체는 pH 4.5 내지 pH 6.5에서 마이셀 형태의 고분자로부터 광감작제를 해리시켜 일중항 산소 발생을 증가시킬 수 있다.

바람직하게는, 상기 일중항 산소는 암세포의 증식을 억제할 수 있다.

바람직하게는, 상기 pH 반응성 고분자 복합체의 평균 직경은 70 내지 100 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 pH 반응성 고분자 복합체의 평균 제타 전위는 -10 내지 5 mV일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

또한, 본 발명은 상기 pH 민감성 다이온성 복합체를 포함하는 암 질환의 광역학 치료용 약학 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 암은 유방암, 자궁경부암, 난소암, 혈액암, 전립선암, 뇌암, 식도암, 위암, 간암, 췌장암, 방광암, 신장암, 소장암, 대장암, 직장암 및 이의 내성암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 암은 내성암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 약학 조성물은 상기 기재한 pH 민감성 복합체 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 시약 및 세포

메톡시 폴리에틸렌 글라이콜 아민(methoxy polyethylene glycol amine, mPEG-NH2, 분자량 5000), N⁶-카르보벤질옥시-L-라이신(N⁶-Carbobenzyloxy-L-lysine), L-락티드(L-lactide, 3,6-디메틸-1,4-디옥사이트-2,5-디온(3,6-dimethyl-1,4-dioxite-2,5-dione)), 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride; DMAP), 석신산 무수물(succinic anhydride), 피리딘(pyridine), 트리에틸아민(triethylamine; TEA), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinicimide; NHS), N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCC), 9,10-디메틸안트라센(9,10-dimethylanthracene), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA), 33% HBr 아세트산, 무수 1,4-디옥산(1,4-dioxane), DMSO-d₆ 및 무수 디메틸포름아마이드(dimethylformamide; DMF)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, St Louis,, 미국)에서 구입하였다. 트리포스겐(triphosgene)은 알파 에이사(Alfa Aesar® Johnson Matthey Korea, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 디클로로메탄(dichloromethane; DCM)과 톨루엔(toluene)은 허니웰 버딕 & 잭슨(Honeywell Burdick & Jackson®, Muskegon, MI, USA)에서 구입하였다. 클로린 e6(Chlorin e6, Ce6)는 프론티어 사이언티픽(Frontier Scientific Inc., USA)에서 구입하였다. 독소루비신-HCl(Doxorubicin-HCl)은 보령(Boryung Co., Seoul, Korea)에서 구입하였다. 다른 모든 화학 물질은 분석용 등급을 사용하였다. 세포 배양을 위해, 약제 내성 인간 유방암 MCF-7/Dox 세포 및 자궁 경부암 KB 세포는 한국 세포주 은행(Korean cell line bank; KCLB, Seoul, Korea)에서 공급받았다. RPMI 1640 배지, 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)은 웰진(Welgene, Seoul, Korea)에서 구입하였다. Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 도진도(Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan)에서 구입하였다.

실시예 2 : pH 반응성 폴리에틸렌글라이콜 - 폴리 (L- 라이신 -접목- 디메틸말레산 무수물)-폴리락트산 (PEG-P(LL-g-DMA)-PLA)의 합성

PEG-PLL-PLA 삼중블록 공중합체(triblock copolyelectrolyte)는 이전 논문(Colloids Surf B Biointerfaces. 2017 May 1;153:10-18)을 참고하여 합성하였다. DMF에 용해시킨 PEG-PLL-PLA(0.2 mmol)를 TEA의 존재 하에 2,3-디메틸말레산 무수물(DMA, 4 mmol)과 실온에서 48시간 동안 반응시켰다. 수득된 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA는 과량의 디에틸 에테르(diethyl ether)에 침전시키고 진공에서 이틀 동안 건조시켰다. 또한, PEG-PLL-PLA(0.2 mmol)와 DMF에서 활성화된 Ce6(0.4 mmol)를 커플링 시켜 PEG-P(LL-g-Ce6)-PLA를 합성하였다. 생성된 용액은 투석막(Spectra/Pore; MWCO 5-8K)을 이용하여 DMSO로 투석하고, 동결 건조시켰다. DMA 접합은 δ 1.8 내지 2.0에서 ¹H NMR(DMSO-d₆; Cambridge Isotope Lab. Inc., MA, USA) 피크의 존재로 확인하였다.

실시예 3 : PEG-PLL(-g- Ce6 ) 및 PEG-PLL(-g- Ce6 )- PLA의 합성

PEG-PBLL(poly[ε-(benzyloxycarbonyl)-L-lysine])은 매크로 개시제(macro initiator)로서 아민-PEG를 사용하여 L-라이신의 N-카르복시 무수물(N-carboxy anhydride; NCA)의 개환 중합(ring opening polymerization)에 의해 합성되었다. L-라이신 NCA는 무수 DMF에 용해시키고, 아민-PEG를 몰 비 30으로 첨가하여 실온에서 7일 동안 교반하였다. PBLL로부터 벤질기를 제거하기 위해, PEG-PBLL(0.2 mmol)을 TFA(10 ml)에 용해시키고, 33% HBr 아세트산(5 ml)과 실온에서 30분 동안 교반하였다. PEG-PLL(-g-Ce6)은 DCC와 NHS를 이용하여 PEG-PLL과 활성화된 Ce6를 커플링 시켜 합성하였다. DMF 20 ml에서 PEG-PLL(0.2 mmol)과 활성화된 Ce6(0.4 mmol)의 커플링 반응은 3일 동안 수행하였다. 비접합된 Ce6를 제거하기 위해, 생성된 용액은 투석막(Spectra/Pore; MWCO 3.5K)을 이용하여 DMSO로 투석하고, 동결 건조시켰다. Ce6 접합은 NMR 및 서로 다른 pH에서 자유 Ce6와 PEG-PLL(-g-Ce6) 사이의 UV/Vis 스펙트럼 차이로 확인하였다. 서로 다른 pH(pH 5.5 및 8.5)에서 자유 Ce6와 PEG-PLL(-g-Ce6) 사이의 UV/Vis 스펙트럼은 Labentech UV-VIS 분광광도계를 이용하여 측정하였다. PEG-PLL(-g-Ce6)-PLA는 상기 기술한 바와 같이, DCC 및 NHS를 이용하여 PEG-PLL-PLA와 활성화된 Ce6를 커플링 시켜 합성하였다.

실시예 4 : pH 반응성 다이온성 복합체( Polyionic complex; PIC ) 및 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA/PEG-PLL(-g-Ce6) 기반 Dox 로딩 PIC 합성

PIC는 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA의 수용성 마이셀 용액과 PEG-PLL(-g-Ce6) 용액을 혼합하여 합성하였다. PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 마이셀은 막 투석법으로 제조하였다. PEG-PLL(-g-DMA)-PLA(10 mg)를 2ml의 DMF에 용해시키고, 상기 DMF 용액을 수용액에 적가하고 격렬하게 교반한 다음 상기 용액을 투석 주머니(MWCO 3500)로 옮겨 증류수로 24시간 동안 투석하였다. Dox가 로딩된 마이셀을 제조하기 위해, Dox-HCl(2 mg)을 DMF(2 ml)에 용해시키고 4몰 당량의 TEA를 첨가하여 탈양성자화 시킨 다음 24시간 동안 교반하였다. 중합체(10 mg)를 DMF(3 ml)에 용해시키고, 탈양성자화된 Dox 용액에 첨가하였다. Dox 및 중합체 혼합물은 격렬한 교반 하에 수용액에 첨가한 후, 진한 적색 용액을 투석 주머니(MWCO 3500)로 옮겨 증류수로 24시간 동안 투석하였다.

실시예 5 : 서로 다른 pH에서 나노 입자의 크기와 제타 전위 측정

PIC 용액의 입자 크기와 제타 전위(zeta potential)는 멀티 앵글 사이징 옵션(multi-angle sizing option) (BI-MAS)이 장착 된 "Zetasizer Nano-ZS"(Malvern Instruments, UK)를 이용하여 광자 상관 분광법(photon correlation spectroscopy)으로 측정하였다. 각 마이셀은 사용하기 전, 서로 다른 pH 조건(PBS, pH 5.5 내지 8.5)에 4시간 동안 노출시켰다. 평균 입자 크기 및 제타 전위 값은 각 샘플에 대하여 3회 반복 측정하여 계산하였다.

실시예 6 : 주사 전자 현미경을 이용한 PIC의 형태학

PIC의 형태는 전계 방출 주사 전자 현미경(field emission scanning electron microscopy; FE-SEM, Sigma, Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Germany)을 이용하여 확인하였다. 희석된 나노입자 용액은 유리 슬라이드 위에 놓고, 진공 건조시켰다. 샘플은 시료대(specimen stubs)에 부착시키고 백금(Pt)으로 스퍼터 코팅(sputter-coating)하였다.

실시예 7 : 방출 스펙트럼 측정

Dox가 로딩된 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA의 방출 스펙트럼을 위해, 자유 Ce6 및 Dox가 로딩된 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 및 Dox가 로딩된 PIC(등가 Dox 20 μg/ml, Ce6 2 μg/㎖)를 형광 분광기(fluorescence spectrometer, SCINCO Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 각 샘플은 서로 다른 pH(PBS 1X, pH 5.5 내지 8.5)에서 제조하고 2시간 동안 실온에서 안정화시켰다. 샘플은 481 nm에서 여기시키고 Dox의 방출 스펙트럼을 기록하였다. 자유 Ce6는 DMF에 용해시키고 수성 샘플에 1000배 희석시켰다.

실시예 8 : 일중항 산소( singlet oxygen) 발생

PEG-PLL(-g-Ce6), PEG-PLL(-g-Ce6) + Dox-HCl, PIC/Dox 및 PEG-PLL(-g-Ce6)-PLA/Dox로부터 일중항 산소의 발생은 일중항 산소의 매우 빠른 화학 포획인 9,10-디메틸 안트라센을 이용하여 측정하였다. 서로 다른 pH에서 각 샘플은 실온에서 4시간 동안 안정화시킨 후, 9,10-디메틸 안트라센(20 mmol)과 혼합하였다. 그 다음 670 nm 레이저 소스를 이용하여 5.2 mW/cm²의 광도로 10분 동안 조사하였다. 9,10-디메틸 안트라센 형광 강도가 1시간 후 정체기에 도달하면 각 샘플에서 형광 강도의 변화(Scinco FS-2 형광 분광기를 사용하여 측정, 여기 : 360 nm 및 방출 : 380 내지 550 nm)를 플로팅 하였다(각 샘플 형광 강도를 제외하고 Ce6로부터 각각의 샘플 형광 강도를 뺀다).

실시예 9 : in vitro 세포 흡수 분석

Ce6의 세포 흡수는 유세포 분석 및 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 유세포 분석을 위해, MCF-7/Dox 세포를 6-웰 플레이트(6-wll plate)에 또는 형광 현미경 검사를 위해, 6-웰 플레이트의 커버 글라스에 4 X 10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하였다.

다음날, 유세포 분석을 위해, MCF-7/Dox 세포를 자유 Dox 또는 Dox가 로딩된 PIC(2 μg/ml Dox, 0.2 μg/ml Ce6)에 노출시켰다. 2시간 배양 후, 세포는 670 nm 레이저 소스를 이용하여 5.2 mW/cm²의 광도로 100초 동안 조사한 다음 4시간 동안 더 배양하였다. 이어서 세포를 차가운 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)로 3회 세척하고 수확한 후, Cell Quest Pro software(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 이용하여 유세포 분석기(FACSCalibur)로 분석하였다.

형광 영상을 위해, MCF-7/Dox 세포는 Dox가 로딩된 PIC(20 μg/ml Dox, 0.2 μg/ml Ce6)에 노출시켰다. 2시간 배양 후, 세포는 670 nm 레이저 소스를 이용하여 5.2 mW/cm²의 광도로 100초 동안 조사한 다음 4시간 동안 더 배양하였다. 이어서 세포를 차가운 인산완충식염수로 3회 세척하고 수확한 후, DAPI(5 μg/ml)와 5분 동안 배양하였다. 세포를 다시 인산완충식염수로 3회 세척하고 1% 포름알데하이드가 포함되어 있는 인산완충식염수를 이용하여 10분 동안 고정시켰다. 고정된 세포는 software Motic Images Plus 2.0(Richmond, BC, Canada)이 있는 컴퓨터에 결합된 Moticam Pro 205A 카메라를 이용하여 관찰하였다.

실시예 10 : 세포 독성

성장하는 세포 단층으로부터 수확된 MCF-7/Dox 세포는 세포 독성 시험 24시간 전에 96-웰 플레이트의 웰 당 8 X 10³ 세포의 밀도로 접종하였다. Dox 및 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA/Dox가 포함되어 있는 RPMI 1640 배지를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 세포는 인산완충식염수로 3회 세척한 다음 RPMI 1640에서 24시간 동안 추가 배양하였다.

광 독성 실험을 위해, 각 샘플을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 인산완충식염수로 3회 세척하고, 670 nm 섬유 결합 레이저 시스템을 이용하여 5.2 mW/cm²의 광도로 조사한 다음 RPMI 1640에서 24시간 동안 추가 배양하였다. 세포 생존율은 CCK-8을 이용하여 분석하였다. 각 웰에 10 μl의 CCK-8 용액을 포함하는 90 μl의 새로운 배지를 첨가하고, 3시간 동안 추가 배양하였다. 각 웰의 흡광도는 450 nm의 파장에서 마이크로 플레이트 판독기(Flexstation 3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.

실시예 11 : 동물 관리

동물실험은 4 내지 6주령의 암컷 누드 마우스(BALB/c, nu/nu 마우스, Institute of Medical Science, Japan)를 이용하여 수행하였다. 동물실험은 중앙 대학교의 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에서 승인한 프로토콜의 지침에 따라 수행하였다. 모든 실험은 관련 법률 및 제도 지침을 준수하여 수행하였다.

실시예 12 : in vivo 형광 이미지

in vivo 동물실험을 위해, KB 종양 세포는 인산완충식염수(pH 7.4)에 현탁하여 1 X 10⁷ 세포 농도로 피하 주사를 통해 암컷 누드 마우스에 주입하였다. 종양 체적이 150 mm³에 이르면 PIC(i.v. 용량 : Ce6 0.5 mg/kg)를 꼬리 정맥을 통해 종양 보유 누드 마우스에 정맥 내 주사하였다. FOBI in vivo 형광 이미징 시스템(IFLIS, NeoScience, Suwon, Korea)을 이용하여 마우스의 형광 이미지를 획득하였다. 주사 24시간 후, 누드 마우스를 희생시키고 장기를 분석하였다.

실험예 1 : PEG-PLL(-g-DMA)- PLA 및 PEG-PLL(-g- Ce6 )의 합성, 및 특성 분석

본 발명에서는 pH 반응성 병용 치료 항암제로서 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 및 PEG-PLL(-g-Ce6)로 구성된 PIC 시스템을 합성하였다. DMA는 pH 반응성 부분(moiety)으로 선택하였고, PEG-PLL-PLA의 라이신 잔기에 접합하였다. 광역학 치료 및 광화학 내재화 효과는 도 1에 도시하여 나타내었으며, PEG-b-PLL(-g-DMA)-b-PLA 및 PEG-b-PLL(-g-Ce6) 합성 과정은 도 3(a)에 도시하여 나타내었다.

도 3(c)를 참조하여 보면, PEG, PLL 및 PLA에 대한 반복 단위는 각각 114, 20 및 50이었으며, ¹H NMR 분석 결과, DMA의 CH3(δ 1.8 내지 2.0)와 α-CH(δ 3.4 내지 3.6)의 피크 강도 비를 비교하여 결정한 DMA의 접목률(grafting ratio)은 70%인 것을 확인할 수 있었다. 또한, PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 최종 삼중블록 공중합체의 분자량은 ca. 14,200 Da이었다.

광감성 약물인 Ce6는 PEG-PLL에 접합하였으며, UV-VIS 분광광도계(Labentech, Incheon, South Korea)를 이용하여 PEG-PLL 이중블록 공중합체에서 Ce6의 농도를 측정하여 결정한 Ce6의 접목률은 약 5%였다. PEG-PLL에 Ce6의 접합은 서로 다른 pH(PBS 1X, pH 5.5, 7.5)에서 UV/Vis 스펙트럼으로 확인하였다.

도 3(b)는 서로 다른 pH에서 자유 Ce6 및 PEG-PLL(-g-Ce6)의 UV/Vis 스펙트럼 결과이다. Ce6 광감작제는 산성 pH 조건에서 3개의 카르복실 잔기(carboxyl residue)를 가지며 응집체를 형성하는 반면, pH가 중성 이상으로 증가함에 따라 단량체 형태가 우세하게 된다. Ce6의 pH 의존성 용해도로 인해, 자유 Ce6 흡수 스펙트럼의 강도는 pH 8.5 및 pH 5.5에서 서로 상이한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 Ce6가 PEG-PLL에 접합되었을 때, 완충액의 pH는 Ce6의 용해도에 영향을 미치지 않았고 유사한 스펙트럼을 나타내었다.

실험예 2 : pH 반응성 PIC 시스템의 특성 분석

2,3-디메틸말레산 무수물 잔기는 환경 반응성 약물 전달 플랫폼에서 가장 널리 사용되는 pH 반응성 결합 중 하나이다. 라이신 잔기에 DMA의 결합은 완충액의 산성도에 반응하여 양전하를 재생성하여 분해될 수 있다. PIC의 pH 반응성 콜로이드 성질을 평가하기 위해, PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 마이셀을 투석법으로 제조하고 PEG-PLL(-g-Ce6)의 용액과 정전기적 상호 작용으로 혼합하였다. Ce6 및 Dox가 로딩된 나노 플랫폼을 이용한 pH 반응성 광화학 치료의 주요 개념은 도 2에 도시하여 나타내었다. 또한, 각 블럭 고분자의 특성(분자량, 크기 및 제타 전위)은 하기 표 1에 나타내었다.

도 4(a)를 참조하여 보면, 합성된 PIC의 입자 크기 및 제타 전위는 pH 의존적 변화를 나타내었다. 중성 pH에서 PIC의 입자 크기는 80 내지 90 nm를 유지하였고, 제타 전위는 라이신 잔기에 DMA 결합의 우세한 접합을 반영하는 음의 값을 나타내었다. 산성 조건에서 PIC의 제타 전위는 양의 값을 가지며, PIC의 입자 크기는 PLL과 DMA 사이의 아미드 결합이 끊어짐에 따라 약간 증가하는 것을 확인하였다. 이는 양전하의 PEG-PLL(-g-Ce6)을 해리시키고, PIC 형성을 느슨하게 할 수 있다.

도 4(b)를 참조하여 보면, PIC를 전계 주사 전자 현미경으로 분석한 결과로, pH 7.4에서 PIC는 매끄러운 표면을 가진 일정한 구형 입자인 것을 확인하였다.

PIC의 해리를 평가하기 위해, 수성 Dox가 로딩된 PIC의 FRET 스펙트럼을 분석하였다. 모든 스펙트럼은 FRET 공여자(donor)인 Dox의 여기 파장에 해당하는 481 nm에서 각 샘플을 조사하여 획득하였다. Ce6는 FRET 수용자(acceptor)로 사용하였다.

도 5(a)를 참조하여 보면, Ce6(녹색)의 흡광도 및 Dox(여기 481 nm, 적색)의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 5(b)를 참조하여 보면, 500 내지 620 nm 범위에서 Ce6의 흡수는 다소 높지 않았지만, Dox가 로딩된 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 마이셀과 혼합하면 Dox의 방출 강도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Dox가 로딩된 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 마이셀과 복합체를 이루는 자유 Ce6 및 PEG-PLL(-g-Ce6)를 비교해 보면, PEG-PLL(-g-Ce6) 및 Dox가 로딩된 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 마이셀로 구성된 Dox 로딩 PIC의 방출 스펙트럼이 유의하게 감소되어 Ce6와 Dox의 촘촘한 착물을 형성하는 것을 확인하였다.

다음으로 pH에 따른 각 샘플의 방출 스펙트럼의 변화를 분석하였다. 도 5(c)를 참조하여 보면, pH가 감소함에 따라 FRET 효율의 감소로 Dox의 방출 강도에서 순차적인 증가가 관찰되었는데, 이는 PIC의 해리로 인해 Dox에서 Ce6으로 전달되는 에너지가 적음을 의미한다. 그러나, 도 5(d)를 참조하여 보면, Dox가 로딩된 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 마이셀 및 자유 Ce6 복합체에서 방출 스펙트럼의 변화는 관찰되지 않았다.

실험예 3 : 일중항 산소 발생

일중항 산소는 방향족 탄화수소 유도체와 반응할 수 있고, 그러한 구조에 의해 포획될 수 있다. 병용 치료를 위해, 독소와 클로린(chlorine) 간의 scheduled-dependent 상호작용이 보고된 바 있고, pre-PDT + Dox 치료의 항종양 활성이 pre-Dox + PDT 치료보다 더 현저한 효과를 나타내는 것이 보고된 바 있다. 이는 빛 노출 하에서 Dox와 Ce6의 공존이 일중항 산소의 발생과 확산을 방해할 수 있음을 의미한다. 본 발명에서는 일중항 산소의 발생이 공동 투여된 Dox에 의해 영향을 받을 수 있을 것으로 보고, 일중항 산소 발생을 설명하는데 있어서 Dox와 Ce6 간의 거리 인자의 역할을 조사하였다.

도 6(a)를 참조하여 보면, 서로 다른 pH에서 PEG-PLL(-g-Ce6)로부터 일중항 산소의 발생을 나타내었다. Ce6가 PEG-PLL 이중블록 공중합체에 접합되었을 때, 완충액의 pH 변화는 일중항 산소 발생 능력에 영향을 미치지 않았고 유사한 형광 강도를 나타내었다.

도 6(b)를 참조하여 보면, Dox-HCl 용액을 PEG-PLL(-g-Ce6)과 혼합하였을 때, 형광 강도는 PEG-PLL(-g-Ce6) 35%로 감소하였지만, pH 조건에 따른 변화는 관찰되지 않았다.

도 6(c)를 참조하여 보면, 광감작제와 항암제가 밀접하게 인접한 Dox 로딩 PEG-PLL(-g-Ce6)-PLA는 전체 pH 범위에서 60%까지 감소된 일중항 산소 발생을 나타내었다. 이러한 결과는 일중항 산소의 발생과 확산이 동시에 투여된 Dox에 의해 억제될 수 있으며, Dox와 Ce6 사이에 길항작용을 유도하는 이유 중 하나일 수 있음을 시사한다.

도 6(d)를 참조하여 보면, 중성 pH에서 PEG-PLL(-g-Ce6)가 PEG-PLL-PLA/Dox와 복합체를 형성할 때, 일중항 산소 발생 또한 PEG-PLL(-g-Ce6) 50%로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 그러나 PIC 시스템은 pH 5.5 내지 6.5에서 PEG-PLL-PLA/Dox로부터 PEG-PLL(-g-Ce6) 해리로 인해 일중항 산소 발생을 크게 증가시켰다. 이러한 결과는 Ce6와 Dox 사이의 거리가 일중항 산소 발생을 극대화하기 위한 핵심 요소이며, 병용 요법 치료제로부터 광감작제의 제어 방출이 일중항 산소의 발생을 극대화하여 병용 치료 효능을 향상시킬 수 있음을 시사한다.

실험예 4 : in vitro 세포 흡수 분석

Ce6/Dox가 로딩된 플랫폼의 엔도솜 탈출 능력(endosomal escape ability)을 평가하기 위해, Dox의 세포 내 생체 분포를 MCF-7/Dox 세포와 형광 현미경을 이용하여 분석하였다.

도 7(a)를 참조하여 보면, P-Ce6/Dox로 6시간 동안 배양한 후, Dox의 강한 형광 강도가 세포 구획에서 관찰되었으나, 핵에서의 축적은 관찰되지 않았고, 이는 Dox가 로딩된 마이셀이 엔도솜 구획에 포획되어 방출되지 않음을 의미한다. 그러나 빛 조사 하에서는 Dox의 형광 강도가 다른 구획 뿐만 아니라 핵에서도 관찰되었다. 이러한 현상은 일중항 산소의 막 용해능에 의해 세포 내 나노 입자가 세포질로 방출되는 새로운 전략으로 알려진 광화학 내재화(photochemical internalization; PCI) 효과에 기인한 것으로 사료된다.

도 7(b)를 참조하여 보면, MCF-7/Dox 세포에 대한 자유 Dox 및 P-Ce6/Dox의 세포 흡수를 나타낸 것으로, 자유 Dox의 세포 흡수는 빛 조사 또는 어두운 조건에서 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다. 그러나 P-Ce6/Dox의 세포 흡수는 빛 조사 하에서 약간 증가하였다. 이러한 결과는 엔도좀 막 용해와 관련되어 MDR(multidrug resistance) 세포에 의한 세포 외 배출(exocytosis) 감소를 초래할 수 있다.

실험예 5 : 세포 독성

도 8(a)를 참조하여 보면, MCF-7/Dox에 대한 다양한 빛 노출 시간에서 PIC의 IC50 값을 나타내었다. 빛 노출 시간(50초 내지 200초)이 증가함에 따라 IC50 값은 2.8 μg/ml에서 0.23 μg/ml로 점진적으로 감소하였으며, 일중항 산소 발생에 의한 광감작제의 강력한 세포 사멸 효과를 나타내는 0초에서 세포 독성은 관찰되지 않았다.

다음으로 세 가지 요인(Ce6 농도, Dox 농도 및 빛 노출 시간)을 선택하고 변화에 따른 각 샘플의 항암 활성을 조사하였다. 도 8(b)를 참조하여 보면, 먼저 Ce6의 농도와 빛 노출 시간을 고정시키고(0.2 μg/ml, 100초) Dox의 농도를 1 내지 20 μg/ml로 조절하였다. 빛 조사 하에 MCF-7/Dox 세포에 대한 P-Ce6 및 자유 Dox의 유의한 세포 독성은 관찰되지 않은 반면, Dox 로딩 P-Ce6 및 Dox 로딩 PIC에서는 세포 살해 능력이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 엔도좀 막 용해를 위한 새로운 전략으로 알려진 PCI 효과 때문일 것으로 사료된다. 특히, MDR 세포는 세포 외 배출 경로를 통해 세포 내 약물을 활발히 제거할 수 있으므로, PCI 효과는 고분자 치료에 있어서 약물 내성 극복을 효과적으로 도울 수 있다. 흥미롭게도, P-Ce6/Dox와 비교하여 볼 때, Dox 로딩 PIC는 개선된 항증식 활성을 나타내었으며, pH 반응성 Dox 로딩 PIC는 in vitro 산성 조건에서 Dox가 로딩된 마이셀로부터 Ce6의 해리로 인한 일중항 산소 발생을 향상시킬 수 있음을 의미한다.

둘째, 도 8(c)를 참조하여 보면, Dox와 빛 노출 시간을 고정시키고(5 μg/ml, 100초) Ce6의 농도를 0.15 내지 2 μg/ml로 조절하였다. Ce6(≥ 1 μg/ml)가 고농도일 때, P-Ce6, P-Ce6/Dox 및 Dox 로딩 PIC는 광역학 치료에 의한 우수한 항증식 활성을 나타내었고, Ce6(0.15 μg/ml)가 저농도일 때, P-Ce6/Dox 및 Dox 로딩 PIC는 PCI 효과에 의한 개선된 항증식 활성을 나타내었다. 그러나 Ce6 = 0.3 내지 0.5 μg/ml의 범위에서 샘플을 제조한 경우, P-Ce6/Dox의 병용 치료 효과는 매우 낮았으며, Ce6 = 0.5 μg/ml에서도 길항작용이 관찰되었다. 이러한 결과는 도 5에 도시된 바와 같이, 인접하게 위치한 Dox에 의해 감소된 일중항 산소 발생과 직접 관련되어 있음을 의미한다. 그러나 Dox 로딩 PIC는 pH 반응성 특성에 의해 개선된 항증식 활성을 나타내었다.

셋째, 도 8(d)를 참조하여 보면, 다양한 빛 노출 시간(Ce6 = 0.2 μg/ml, 100초)에서 Ce6/Dox 병용에 의한 세포 생존율을 나타내었다. 적은 빛 노출 시간(≤ 100초)에서 MCF-7/Dox 세포에 대한 P-Ce6, 자유 Dox 및 P-Ce6/Dox의 유의한 세포 독성은 관찰되지 않은 반면, P-Ce6/Dox 및 Dox 로딩 PIC는 개선된 항증식 활성을 나타내었으며, 이는 PCI 효과로 인해 약물의 엔도좀 탈출을 가속화할 수 있음을 의미한다. 긴 빛 노출 시간(≥ 200초)에서, 모든 Ce6 함유 샘플은 MCF-7/Dox 세포에 대해 강한 세포 독성을 나타냈다. 그러나 P-Ce6와 비교하여 볼 때, 200 및 400초에서 P-Ce6/Dox의 세포 독성은 감소하였으며, 이러한 길항작용은 방향족 구조에 의한 일중항 산소 포착 때문일 것으로 사료된다. 흥미롭게도, MCF-7/Dox 세포가 Dox 로딩 PIC와 함께 처리되었을 때, 항증식 활성은 유의하게 증가되었으며, 이는 pH 반응성 Dox 로딩 PIC 시스템이 Dox가 로딩된 마이셀로부터 Ce6의 해리로 의한 일중항 산소 발생을 향상시킬 수 있음을 입증하였다. 위에서 가정 한 바와 같이, 해리된 PEG-PLL(-g-Ce6)로부터 발생된 일중항 산소는 Dox에 포획되기보다는 세포 구성 요소와 우선적으로 반응하여 세포 살해 능력을 향상시켰다. 이는 pH 반응성 Dox 로딩 PIC가 다양한 약물 농도 범위에서 병용 치료의 효과를 극대화할 수 있음을 명확하게 입증하였다.

실험예 6 : 동물실험

Dox가 로딩된 PEG-PLL(-g-DMA)-PLA 및 PEG-PLL(-g-Ce6)로 구성된 pH 반응성 PIC 시스템은 Ce6 로딩 플랫폼이 진단 시약 및 치료 플랫폼으로 사용될 수 있다는 가정 하에 설계되었다. 생체 내에서, PIC 시스템은 페길화(PEGylation)를 가지는 약간 음으로 하전된 나노 크기의 입자로 인해 면역 시스템에 의한 인식 없이 혈관 내에서 순환될 수 있다.

도 9(a)를 참조하여 보면, PIC는 종양 부위의 생체 내 형광 강도를 높여서 PIC의 종양 표적화 능력을 향상시켰으며, 이는 투과성 및 보유력 효과(enhanced permeability and retention; EPR)를 높여 주었다. 또한, 도 9(b) 및 도 9(c)를 참조하여 보면, 주사 24시간 후, 종양 및 주요 기관(심장, 비장, 신장, 간, 종양 및 폐)을 절제하여 체외 형광 이미징으로 PIC의 조직 분포를 분석한 결과, 예상대로 종양 부위의 PIC의 축적은 EPR 효과로 인해 다른 기관보다 유의하게 높은 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

폴리에틸렌글라이콜, 폴리L-라이신 및 폴리락트산으로 이루어진 마이셀 형태의 고분자의 폴리L-라이신의 곁가지에 pH 감응성 반응기를 접목시킨 제 1고분자;
상기 제 1고분자 내 봉입된 항암제; 및
폴리에틸렌글라이콜 및 폴리L-라이신으로 이루어진 고분자의 폴리L-라이신의 곁가지에 광감작제를 접목시킨 제 2고분자;를 포함하며,
상기 제 1고분자 및 제 2고분자가 정전기적 상호작용으로 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 마이셀 형태의 고분자는 폴리에틸렌글라이콜, 폴리L-라이신 및 폴리락트산으로 이루어진 삼중블록 공중합체인 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 미톡산트론(mitoxantrone) 및 다우노루비신(daunorubicin)으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 pH 감응성 반응기는 2,3-디메틸말레산 무수물인 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 광감작제 클로린 e6(chlorin e6), 포르피린(porphyrin) 및 나프탈로시아닌(naphthalocyanine)으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 pH 반응성 고분자 복합체는 pH 4.5 내지 pH 6.5에서 마이셀 형태의 고분자로부터 광감작제를 해리시켜 일중항 산소 발생을 증가시키는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체.
제 7항에 있어서, 상기 일중항 산소는 암세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 고분자 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 pH 반응성 고분자 복합체의 평균 직경은 70 내지 100 nm인 것을 특징으로하는 pH 반응성 고분자 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 pH 반응성 고분자 복합체의 평균 제타 전위는 -10 내지 5 mV인 것을 특징으로하는 pH 반응성 고분자 복합체.
제 1항에 따른 pH 반응성 고분자 복합체를 포함하는 암 질환의 광역학 치료용 약학 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 암은 유방암, 자궁경부암, 난소암, 혈액암, 전립선암, 뇌암, 식도암, 위암, 간암, 췌장암, 방광암, 신장암, 소장암, 대장암 및 직장암으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 질환의 광역학 치료용 약학 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 암은 내성암인 것을 특징으로 하는 암 질환의 광역학 치료용 약학 조성물.
폴리에틸렌글라이콜, 폴리L-라이신 및 폴리락트산으로 이루어진 삼중블록 공중합체 용액을 pH 감응성 반응기과 반응시켜 제 1고분자를 제조하는 제 1단계;
폴리에틸렌글라이콜과 폴리[ε-(벤질옥시카르보닐)-L-라이신]으로 이루어진 공중합체에서 벤질기를 제거한 후, 광감작제와 반응시켜 제 2고분자를 제조하는 제 2단계;
상기 제 1고분자를 용매에 용해시킨 후, 마이셀을 제조하는 제 3단계;
상기 제 3단계의 마이셀과 상기 제 2단계의 고분자를 반응시켜 pH 반응성 고분자 복합체를 제조하는 제 4단계; 및
상기 pH 반응성 고분자 복합체와 항암제 용액을 반응시켜 마이셀 내 항암제를 봉입하는 제 5단계;를 포함하는 pH 반응성 고분자 복합체의 제조방법.