KR101448074B1 - 석회결핍 둔감형 양배추 품종의 조기 선별을 위한 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

석회결핍 둔감형 양배추 품종의 조기 선별을 위한 바이오 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BoCAX1(Brassica oleracea Ca2+/H+-antiporter 1) 유전자, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BoACA4(Brassica oleracea autoinhibited Ca2 +-ATPase 4) 유전자 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 BoACA11(Brassica oleracea autoinhibited Ca2 +-ATPase 11) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 키트 및 복합 스트레스 조건에서 키운 생장 초기의 배추과 식물체로부터 BoCAX1 유전자, BoACA4 유전자 및 BoACA11 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 생장 초기에 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하는 방법에 관한 것이다.

Description

석회결핍 둔감형 양배추 품종의 조기 선별을 위한 바이오 마커 및 이의 용도{Biomarker for early selection of calcium deficiency insensitive line in Brassica oleracea and uses thereof}
본 발명은 석회결핍 둔감형 배추과 품종의 조기 선별을 위한 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 BoCAX1 유전자(Brassica oleracea Ca2+/H+-antiporter 1), BoACA4(Brassica oleracea autoinhibited Ca2 +-ATPase 4) 유전자 및 BoACA11(Brassica oleracea autoinhibited Ca2 +-ATPase 11) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 키트 및 복합 스트레스 조건에서 키운 생장 초기의 배추과 식물체로부터 BoCAX1 유전자, BoACA4 유전자 및 BoACA11 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 생장 초기에 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하는 방법에 관한 것이다.
칼슘은 식물체에서 세포벽에 다량분포하며 펙틴과 결합하여 세포벽의 구조를 유지하는데 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 세포의 유사분열, 화분관의 생장, 낙엽 및 낙과, 화아분화 등의 생리과정 중 그 농도가 증가하거나 감소하여 여러 가지 생리대사 조절에 직ㆍ간접적으로 관여하는 것으로 밝혀지고 있다. 따라서, 칼슘결핍은 식물체에서 여러 가지 생리장해를 일으키는데, 일반적으로 분열조직의 생장이 감소하고 결핍된 조직의 세포벽이 합성되지 못해 조직이 괴사하는 현상을 보인다. 토마토나 수박의 배꼽 썩음병은 가장 잘 알려진 칼슘결핍 증상이며, 오이, 샐러리, 참외, 배추를 비롯한 십자화과 채소 등의 거의 모든 작물에서 결핍증상이 보고되어 있다.
배추는 우리나라에서는 연평균 채소 소비량의 25%를 차지하는 가장 중요한 채소작물로, 재배역사가 길고 전국적으로 널리 재배되고 있다. 배추의 구성성분은 대부분이 수분이고, 칼슘과 비타민 C가 풍부한 잎을 식용부위로 하는 엽채류이며, 생육 적온이 18~22℃인 비교적 서늘한 기후를 좋아하는 호냉성 채소이기 때문에 내서성이 약하고 약광 하에서도 생육이 잘되며 근군은 넓게 분포한다. 형태적으로 잎차례(葉序)는 2/5이고 나선형으로 착생되며, 줄기는 단축되어 로젯트 모양이며, 자가불화합성이 있어 타가수정을 하며 자식열세와 잡종강세로 나타난다.
배추의 품질을 평가하는 데는 내부적으로는 수분함량, 전고형성 당함량, 조직의 물성 등이 중요한 인자이며 외형적으로는 건전한 외관, 결구 속의 노란 정도 등이 중요한 인자이다. 재배시 배추의 외형적 품질을 크게 저하시키는 팁번(tip-burn) 증상, 즉 잎의 선단이 고사하는 현상은 칼슘결핍이 그 원인으로 알려져 있다.
그러나, 배추의 칼슘결핍이 식물체 내에서 어떠한 변화를 일으키는지에 대해서는 정확하고, 특별한 연구성과가 없어서 칼슘결핍의 진단이나 해소방법 등에 대해서도 별다른 개발이 없는 실정이다.
한국등록특허 제0695718호에는 '채소의 칼슘결핍 증상의 진단방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2007-0052935호에는 '배추의 칼슘결핍 증상과 관련된 유전자'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종의 조기 선별을 위한 바이오 마커 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 석회결핍증의 민감형과 둔감형 양배추를 구별하기 위해 비생물학적 복합 스트레스(저온 및 건조 스트레스)를 처리하여 칼슘 수송체 유전자인 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 발현양 변화를 비교하였는데, 저온 및 건조 스트레스 처리시 24시간이 지속되면 석회 결핍증 민감형 양배추에서는 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 발현양이 60~70% 감소한 반면, 석회 결핍증 둔감형 양배추에서는 저온 스트레스 처리시 BoCAX1 및 BoACA4의 발현양 변화는 없었고, BoCAX11의 발현양은 50% 감소하는 것을 확인하였으며, 건조 스트레스 처리시 BoCAX1의 발현양은 50% 증가하였고, BoACA4와 BoACA11의 발현양은 변화가 없는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 상기와 같은 결과에 근거하여, BoCAX1 유전자, BoACA4 유전자 및 BoACA11 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 분석하여 석회결핍증의 민감형과 둔감형 양배추를 구별할 수 있는 방법을 구축함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BoCAX1 유전자, BoACA4 유전자 및 BoACA11 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 복합 스트레스 조건에서 키운 생장 초기의 배추과 식물체로부터 BoCAX1 유전자, BoACA4 유전자 및 BoACA11 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 석회결핍 둔감형의 배추과 품종 선별법은 생장 초기에 복합스트레스(저온 및 가뭄 스트레스) 조건에서 특정 유전자인 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 발현 수준을 측정함으로써 단시간 내에 확인할 수 있으므로, 재배현장에서 석회결핍 둔감형의 배추과 품종 개발 및 종자 생산에 매우 유용한 방법이 될 수 있다.
도 1은 양배추 생장초기에 저온 및 가뭄 스트레스 조건에서 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11 유전자 발현을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BoCAX1(Brassica oleracea Ca2 +/H+-antiporter 1) 유전자, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BoACA4(Brassica oleracea autoinhibited Ca2 +-ATPase 4) 유전자 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 BoACA11(Brassica oleracea autoinhibited Ca2 +-ATPase 11) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 양배추 유래의 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 유전자 정보는 한국생명공학연구원 양배추 유전체 육종지원사업단에서 구축한 데이터베이스(http://210.219.43.182:8080/brdb/index.jsp)에서 제공(BoCAX1: BOLC10038, BoACA4: BOLC19660, BoACA11: BOLC20008)하고 있으나, BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11 유전자의 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종의 조기 선별에 대한 연관성은 전혀 알려지지 않았다.
본 발명에서, 본 발명의 석회결핍은 칼슘결핍과 혼용하여 사용가능하다.
본 발명에서, 생장 초기는 파종 후 80~100일이고, 바람직하게는 90일일 수 있다.
본 발명의 양배추의 생육 시기는 품종에 따라 다소 차이가 있으나, 보통 만생종 양배추의 경우 파종 후 결구하여 수확하는데 약 210일이 소요되는데, 본 발명에서는 양배추 전체 생육의 1/3 정도 되는 시기에 석회결핍 둔감형 양배추를 진단할 수 있다.
본 발명에서, 복합 스트레스는 저온 및 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 배추과 품종은 배추, 양배추, 꽃양배추, 방울양배추, 녹색꽃양배추 등일 수 있고, 바람직하게는 배추 또는 양배추일 수 있으며, 가장 바람직하게는 양배추일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자가 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 조기에 선별하기 위한 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.
구체적으로, 양배추 종자를 90일 정도 배양 후, 비생물학적 복합 스트레스(저온 및 건조 스트레스)를 처리하여 칼슘 수송체 유전자인 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 발현양 변화를 비교하였는데, 저온 및 건조 스트레스 처리시 24시간이 지속되면 석회 결핍증 민감형 양배추에서는 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 발현양이 60~70% 감소한 반면, 석회 결핍증 둔감형 양배추에서는 저온 스트레스 처리시 BoCAX1 및 BoACA4의 발현양 변화는 없었고, BoCAX11의 발현양은 50% 감소하는 것을 확인하였으며, 건조 스트레스 처리시 BoCAX1의 발현양은 50% 증가하였고, BoACA4와 BoACA11의 발현양은 변화가 없는 것을 확인하였다(도 1).
따라서, 양배추 유래의 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자를 본 발명자들이 고안한 프라이머를 사용하여 역전사 중합효소반응을 실시함으로써 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 구별할 수 있었다.
본 발명에서, 용어 "BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질"란 상기와 같이 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 마커인 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 말한다.
BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11의 유전자의 발현 수준은 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자의 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위하여 생물학적 시료에서 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자의 핵산 서열이 BACEDB(http://210.219.43.182:8080/brdb/index.jsp)에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 석회결핍 둔감형 배추과 품종 조기 선별용 조성물은 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 구체적으로는, BoCAX1 유전자는 서열번호 4 및 5, BoACA4 유전자는 서열번호 6 및 7, BoACA11 유전자는 서열번호 8 및 9로 표시되는 프라이머들이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종 조기 선별용 마커인 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 석회결핍 둔감형 양배추 품종 조기 선별용 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 복합 스트레스 조건에서 키운 생장 초기의 배추과 식물체로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BoCAX1 유전자, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BoACA4 유전자 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 BoACA11 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 생장 초기에 복합 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 생장 초기는 양배추 파종 후 80~100일이고, 바람직하게는 90일일 수 있다.
본 발명의 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자의 발현 수준은 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11 유전자의 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다.
생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 방법들을 통하여, 복합 스트레스 조건에서 키운 생장 초기의 양배추 시료에서의 BoCAX1, BoACA4 또는 BoACA11의 mRNA 발현을 조사하여 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 선별할 수 있다.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 석회결핍 둔감형 배추과 품종 조기 선별용 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
한편, DNA 칩은 상기 석회결핍 둔감형 배추과 품종의 조기 선별용 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 복합 스트레스 조건의 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 석회결핍 둔감형 배추과 품종을 판독할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
양배추 식물체
석회 결핍증 둔감형질 양배추의 분자 진단을 위해서, 본 발명에서는 석회결핍 민감형(DH line HRIGRU009386, Warwick Crop Centre, 영국)과 석회결핍 둔감형(inbred line No107140, 삼성종묘, 한국) 양배추를 이용하였다. 양배추는 약 90일 정도 온도 및 습도가 조절되는 장일 조건의 온실에서 키워 잎을 샘플링하였다.
스트레스 처리
저온 및 건조 스트레스를 처리하기 위해서 온실에서 약 90일 자란 석회결핍 민감형 및 둔감형 양배추 잎을 약 1cm의 디스크를 만들었다. 저온 스트레스 처리를 위해서 잎 디스크를 증류수에 띄운 후 4℃에서 24시간 동안 암조건을 유지시켰다. 건조 스트레스를 처리하기 위해서 3mm 필터 페이퍼 사이에 잎 디스크를 넣고 상온의 암조건에서 24시간 동안 처리하였다. 저온 및 건조 스트레스를 처리한 샘플은 0, 3, 6, 12, 및 24시간에 각각 20개의 디스크를 샘플링하였고, 액체 질소에 얼려 -80℃에 보관하였다.
RNA 추출 및 RT - PCR
스트레스를 처리하여 샘플링한 후 액체 질소에 얼려두었던 양배추 잎을 막자사발로 곱게 갈아, 100mg의 분말로부터 TriZol 용액(Gibco-BRL)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA 5ug을 올리고 (dT) 프라이머로 cDNA를 합성하였다. 전체 반응 볼륨은 20ul로 하였고, RNA 5ug, 올리고 (dT) 20ul 프라이머 (10 pmol), 10 mM dNTP 믹스, 5X RT 버퍼 및 ReverTra Ace 역전사 효소 200 유닛을 넣어 반응시켰다. cDNA 합성을 위한 반응 조건은 42℃에서 20분 처리 후 99℃에서 5분 동안 열처리하여 반응을 중지시켰다. 양배추 액틴2 (BoACT2) 프라이머를 이용해서 정량한 후 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 프라이머를 이용해서 RT-PCR을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다; BoCAX1에 대한 정방향 프라이머 5'-YTTTKARTCAGTRKAGAAATGGC-3'(서열번호 4), 역방향 프라이머 5'-CCGAGAATGACTTCTTGGAGAT-3'(서열번호 5), BoACA4에 대한 정방향 프라이머 5'-ACTTTGTMTCTGCTTGCATCAC-3'(서열번호 6), 역방향 프라이머 5'-AAGACYAAGGAGTTGAAGATGA-3'(서열번호 7), BoACA11에 대한 정방향 프라이머 5'-ATGTGGAGAAACATCATTGGTC-3'(서열번호 8), 역방향 프라이머 5'-TAAGACCAACGGCTAGAATCATG-3'(서열번호 9), BoACT2 정방향 프라이머 5'-ATCACACTTTCTACAATGAG-3'(서열번호 10), 역방향 프라이머 5'-TCGTAGATTGGCACAGTGTG-3'(서열번호 11). RT-PCR 조건은 94℃에서 2분 처리 후 변성을 위해 94℃에서 30초, 프라이머 결합을 위해 55℃에서 30초, 합성을 위해 72℃에서 1분 동안 반응시켰으며 이를 28번 반복하였다. RT-PCR 산물은 1.2% 아가로즈 젤에 전기영동하여 결과를 확인하였다.
실시예 1. 양배추 생장 초기에 저온 및 가뭄 스트레스 조건에서 BoCAX1 , BoACA4 및 BoACA11 발현 변화
BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 발현체 서열을 BACEDB(http://210.219.43.182:8080/brdb/index.jsp)에서 내려받아 발현체 서열을 비교한 후 프라이머를 제작하여 각 유전자 특이적인 엑손 부위가 증폭되도록 하였다. 석회결핍증의 민감형과 둔감형 양배추를 구별할 수 있는 비생물학적 스트레스(저온 및 건조 스트레스)를 처리하여 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 발현양 변화를 비교하였는데, 도 1에서와 같이 저온 및 건조 스트레스 처리 시 24시간이 지속되면 석회결핍증 민감형 양배추에서는 BoCAX1, BoACA4 및 BoACA11의 발현양이 60~70% 감소하였다. 석회결핍증 둔감형 양배추에서는 저온 스트레스 처리 시 BoCAX1와 BoACA4의 발현양 변화는 없었고, BoCAX11의 발현양은 50% 감소하였다. 건조 스트레스에 의해서 BoCAX1의 발현양은 50% 증가하였고, BoACA4와 BoACA11의 발현양 변화가 없어 석회결핍증의 민감형과 둔감형 양배추를 구별할 수 있었다. 비생물학적 스트레스를 처리하는 이유는 식물은 주변의 유해한 환경 변화를 인식해서 반응하도록 신호전달 네트워크가 개발하는 방향으로 진화하였는데, 냉해, 가뭄, 고염도, 호르몬, 빛 및 병원균 침투 등의 다양한 외부 자극은 식물세포의 세포질 내 칼슘 이온 농도를 변화시켜 신호전달 과정을 수행한다. 따라서 칼슘 결핍현상에 둔감한 양배추가 표준형 양배추보다 칼슘 이온 함량이 높아 칼슘 수송체 유전자의 발현양의 차이가 있을 것이고, 또한 비생물학적 스트레스에 저항성을 가질 것으로 예상하여 검정하게 되었다. 정확한 메커니즘과 과정이 밝혀지지 않은 석회결핍증과 관련해서 석회결핍증 민감형과 둔감형 양배추를 생육 단계 초기에 진단할 수 있는 새로운 방법일 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Biomarker for early selection of calcium deficiency insensitive line in Brassica oleracea and uses thereof <130> PN12097 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 866 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 1 ggtggcataa gagtcagcaa cgcaaaatat tataatacca agagcgcccc caaaaacata 60 gctttcattt ttaatcagtg tagaaatggc ggggatcgtg caggaacaat ggtcagcagc 120 ggagaacggg aacgcaacca tgaccacgaa aggatcaagc agagagctga gacatggagg 180 aagaacagct cacagcatgt cttcttcttc gttgaggaag aagtctgacc tccgagtaat 240 ccagaaggtt ccatacaaag gtcttaaaga ttttctctct aatctccaag aagtcattct 300 cggcacaaag ctagccattc tttttccggc catacctgcc gccattatcg gaacttattg 360 cggcttcagt cagccgtgga tatttggact gagtttgcta ggcctcacac ctttggctga 420 gcgagtcagc tttctgacag agcaactagc tttctacacc ggtcctacat tgggtggtct 480 attgaacgca acgtgtggaa acgcaactga actgatcatc gcgattctgg cattgactaa 540 tcacaaggtc gcagtggtga aatactcgtt gcttggttcg attttgtcga accttctatt 600 ggttctcggg acttcgctct tctgtggtgg aattgctaat ctccgaaggg agcaacggtt 660 cgaccggaaa caagccgatg tgaacttctt tttactccta atgggactgt tgtgtcactt 720 gctgccaatg ttgttcggat acgttggaaa cggagagacc tctgctgatt taattgctga 780 catgtccctg aatctttcac gagccagcag tattgttatg ttgatcagtt acatcgcata 840 tctcgttttt cagctttgga ctcatc 866 <210> 2 <211> 838 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 2 gattgataga gaaattgtaa agaagaagac acagtcctct ctctctcttt ctctcactct 60 cagcagctgc taagagtgaa gaatgtcgaa tttgctaagg gattttgagg tggaggcgaa 120 gaatccgtcg ctggaagcga ggcggagatg gaggtcagca gtctccgtcg tgaagaaccc 180 tgctcgtcgt ttccggaaca tccccgacct cgataagcga gctgagaacg agactaagag 240 gcaccagatc caggaaaagc tccgagttgc tttctacgta caaaaggcag ctcttcaatt 300 cattggtgct gctggtaggc cggaatacaa gctcaccgat gaggtcaagg aagctggatt 360 ctctgtcgaa ccagatgagc ttgcatctat ggttcggaat catgacacta ggggtctagc 420 acacaatggt ggagttgtag cgcttgcaaa gaaagtatct gtatctgatc tcaatgaagg 480 cgttaaatcg agtgaactcc ccatcaggga aaagatcttt ggagaaaacc gttacgctga 540 gaaaccaccg agatcgttct tgatgttcgt ctgggaagct ctccaagaca taaccctcat 600 catccttatg gtctgcgctg tagtatcaat aggcgttggt gttgccaccg aagggtttcc 660 aaagggaatg tacgatggga cggggatctt gctgagtata ctcttggtcg tcatggttac 720 tgccatcagc gactacaagc agtctcttca gttcatagac ttggatcgag agaagaagaa 780 gatcattgtc caggtcacga gggatgggac tagacaagag atctccatcc atgacttg 838 <210> 3 <211> 943 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 3 ctggaactcg atcaccaata gatagatgaa ccacatctcc aacaaccaaa tcatcgatag 60 agacctcttg tctattccca tctcttgtga cttgaatatt gattttcttc ttctctctat 120 ccaaatctct gaactggaga gactgtctgt agtcgctgat agcagtgacc ataaccacca 180 agattatact tagcaagatt cctgttccat cgtacattcc ctttggaaac ccctctgtgg 240 ctactcccac tcctatcgat accacagcgc agaccataag gatgataaga gtcacgtctt 300 gaagtgcttc ccaaacgaat gttaagaatg atctggctgg tttctcagcg tatcgatttg 360 ctccgtagat tttttctctg atgtctagat catttgaacg gacaccttca gtgagtgata 420 cggatagttt ctgagcgatt ccttcagctc ctccgctttt agtgaggctc cttgtgtcgt 480 ggtttcgaac catggaagca agttcatcag cttccacgtg aaatcccgct tgtctgacct 540 catcagtgag tttatattca cgacgtgcac cagcatcaat gaactgaaga gctgcctttt 600 gaacatagaa ggcaacccgt atcttttcct ggatctgaca tctcttcttc tcattctcag 660 cgagcttctc gagattgctg atcatacgga aacgacgagc tcgatttttg acgatggaga 720 ctgatgatct ccatcgctgg cgagcctcca gcgacgggtt cttggcctcg acctgaaaat 780 ctttgaggag attagacatt cttttctcta tttctctgct tttactttct gaacagagag 840 agagcgctgt tcctaattct atacagagaa tccgtcagag gcgcgaagga aggaggtgag 900 tgaagcctcc tctcctattc tttagctctc tctctctctc tcc 943 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ytttkartca gtrkagaaat ggc 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccgagaatga cttcttggag at 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 actttgtmtc tgcttgcatc ac 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aagacyaagg agttgaagat ga 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atgtggagaa acatcattgg tc 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 taagaccaac ggctagaatc atg 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atcacacttt ctacaatgag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tcgtagattg gcacagtgtg 20

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BoCAX1(Brassica oleracea Ca2+/H+-antiporter 1) 유전자, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BoACA4(Brassica oleracea autoinhibited Ca2+-ATPase 4) 유전자 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 BoACA11(Brassica oleracea autoinhibited Ca2+-ATPase 11) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 파종 후 80~100일에 건조 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 양배추 품종을 선별하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 BoCAX1 유전자, BoACA4 유전자 또는 BoACA11 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 BoCAX1 유전자, BoACA4 유전자 또는 BoACA11 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 파종 후 80~100일에 건조 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 양배추 품종을 선별하기 위한 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 1) 건조 스트레스 조건에서 키운 파종 후 80~100일의 양배추 식물체로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BoCAX1 유전자, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BoACA4 유전자 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 BoACA11 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    2) 건조 스트레스 조건하의 각 유전자의 발현 수준 차이에 따른 석회 결핍 둔감형 양배추를 구별하는 단계;를 포함하는 파종 후 80~100일에 건조 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 양배추 품종을 선별하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BoCAX1(Brassica oleracea Ca2+/H+-antiporter 1) 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BoACA4(Brassica oleracea autoinhibited Ca2+-ATPase 4) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 파종 후 80~100일에 저온 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 양배추 품종을 선별하기 위한 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 BoCAX1 유전자 또는 BoACA4 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 따른 조성물을 포함하는 파종 후 80~100일에 저온 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 양배추 품종을 선별하기 위한 키트.
  11. 1) 저온 스트레스 조건에서 키운 파종 후 80~100일의 양배추 식물체로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BoCAX1(Brassica oleracea Ca2+/H+-antiporter 1) 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BoACA4(Brassica oleracea autoinhibited Ca2+-ATPase 4) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    2) 저온 스트레스 조건하의 각 유전자의 발현 수준 차이에 따른 석회 결핍 둔감형 양배추를 구별하는 단계;를 포함하는 파종 후 80~100일에 저온 스트레스 조건에서 석회결핍 둔감형 양배추 품종을 선별하는 방법.
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