KR101447807B1 - 부추 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
부추 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 부추 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 염증유발인자들의 생성을 저해하고, 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과를 나타내므로 염증성 질환과 관련된 의약품, 건강기능식품 또는 사료 첨가물로서 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 부추 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 건강기능식품, 및 기능성 사료 첨가제에 관한 것이다.
염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염, 면역학적 자극 등이 가해질 때, 이에 대해 방어할 수 있도록 다양한 작용기전을 통해 빠르게 활성화되는 인체의 면역 시스템 중 하나이다. 염증반응은 시간의 경과에 따라 급성염증과 만성염증으로 구분된다. 급성염증은 염증반응이 수 일 내지 수 주간 지속되고, 홍반, 발열, 통증, 부종과 같은 증상을 야기하는 반면, 만성염증은 장기간 염증상태가 지속되는 것으로 때로는 수 년 내지 수십 년에 걸쳐 나타나며, 단핵세포의 침윤, 섬유모세포 및 모세혈관의 증식, 결합조직의 증가로 인한 섬유화, 조직의 파괴 등의 조직학적 변화를 볼 수 있다.
염증성 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민(histamine), 브레디키닌(bradykinin), 프로스타글란딘(prostaglandins), 산화질소(nitric oxide, NO), 각종 전염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines) 등이 합성, 분비되며, 이들은 혈관 확장 뿐 아니라 홍반, 발열, 통증, 부종을 유발시킨다.
특히, 체내 염증 과정에서 인터페론-감마(interferon-γ, INF-γ), 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-1(interleukin-1, IL-1), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 등의 사이토카인과 같은 일반적인 면역 인자들 외에도 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘E2(prostaglandin E2, PGE2)이 주요 염증 유발 물질로 잘 알려져 있다.
NO와 PGE2는 유도성 산화질소 합성효소(inducible NO synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 활성에 의해 주로 생성되어 체내 염증 반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 다양한 경화증, 알츠하이머, 결장암과 같은 만성 질환의 원인이기도 하다.
NO는 체내방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관 확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있으며, 3종류의 산화질소 합성효소(NOS)인 신경원세포에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관 내피세포에서 칼슘 의존적으로 활성화되는 eNOS (endothelial NOS) 그리고 iNOS(inducible NOS)에 의해 합성된다. nNOS와 eNOS는 세포 속에 지속적으로 발현되지만, iNOS는 내독소로 작용하는 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS), 면역조절물질인 INF-γ 혹은 다양한 염증성 사이토카인들(cytokines)에 노출되는 경우에 발현된다. 일반적으로 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.
PGE2는 세포막의 주요 구성요소인 인지질로부터 유도되고, 20개의 탄소로 구성된 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 전환효소인 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)의 작용에 의해 생성되어, 생체 내 염증반응, 면역반응 그리고 암세포 내에서 신생혈관 생성과 전이 및 증식을 도와 악성종양으로 발달하는 것에 관여하는 것으로 알려져 있다.
대식세포(macrophage)는 면역반응 등 다양한 숙주반응을 통해 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 NO, 다양한 사이토카인들을 생산하여 감염초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다. 그람음성균의 지질다당질인 LPS는 대식세포 또는 단핵구(monocytes)에서 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β)와 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
분비된 TNF-α는 대식세포와 호중구를 활성화시켜 과산화 산소기(superoxide anion), 과산화수소(hydrogen peroxide), 수산기(hydroxy radical) 등의 산화제, 단백질 분해효소, IL-1, IL-6 등을 분비하게 한다. 또한 TNF-α는 혈관 내피세포의 투과성을 증가시켜 부종을 조장하는 것으로 알려져 있다.
부추(Allium tuberosum)는 백합과에 속하는 다년생 식물로 지역에 따라 정구지, 졸, 솔, 소풀이라고 불리기도 한다. 예로부터 간 기능을 강화하고, 혈액순환을 도우며 몸을 따뜻하게 하며, 만성요통을 개선하고, 감기나 설사, 빈혈의 치료에도 효능이 있는 것으로 전해져왔다. 여성에게는 나쁜 피를 배출시키는 작용이 있어 생리량을 증가시키고, 생리통을 완화하며, 냉한 체질을 개선하는 효능이 탁월하고, 남성에게는 간 기능을 강화시켜 정력을 증강시키는 스태미나 식품으로 알려져 있다. 부추는 다른 채소류에 비해 비타민 A, B1, C 및 칼슘과 철분을 많이 포함하고 있으며, 부추에 함유되어 있는 베타카로틴을 비롯한 클로로필, 글루타티온은 강력한 항산화 작용을 해서 활성산소를 억제한다. 특히, 베타카로틴은 늙은 호박의 4배 이상, 배추의 83배 이상 함유되어 있다. 또한, 부추는 특유의 향미성분으로 알릴화합물을 함유하고 있어 위암, 유방암, 간암 세포의 성장을 억제하는 등 항암 효과를 지닌 것으로 보고되어 있다.
항염증 활성을 갖는 천연물과 관련하여 종래 특허 등록된 기술을 살펴보면, 항산화활성과 항염증활성을 갖는 뱀톱추출물(대한민국 특허등록 제 10-0829081호), 효소 처리에 의하여 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법(대한민국 특허등록 제 10-1089637호), 항염증 활성을 가지는 메밀 및/또는 메밀껍질 추출물, 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증 식품 조성물 (대한민국 특허등록 제 10-0441565호) 등이 있다. 하지만, 부추 추출물 단독으로 항염증 활성을 보고한 자료는 없다.
이에, 본 발명자들은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물이 염증유발인자에 의해 야기되는 세포독성을 완화하고, 일반적으로 알려진 염증관련 인자의 생성을 저해하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 다양한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 상기 조성물을 이용할 수 있는 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
아울러, 본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 기능성 사료첨가제를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 기능성 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 부추 추출물은 물, 메탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 유기용매 분획물은 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기용매를 이용한 분획물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren’s syndrome), 다발성 경화증 및 급성 또는 만성 염증성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 유도성 산화질소합성효소 (in- ducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2 (cyclooxigenase -2, COX-2) 중 하나 이상의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2) 중 하나 이상의 생성을 저해하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 전염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, MIP-1α, 및 TNF-α 중 하나 이상의 생성을 저해하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물은 염증성 질환을 유발하는 인자들의 생성을 저해하고, 이들 인자들로 유발되는 세포독성을 완화시킴으로써 세포를 보호할 뿐만 아니라, 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과를 나타내어 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한 천연물 성분을 이용하는 면에서 염증성 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품 또는 사료 첨가물로서 활용이 가능하다.
도 1a 및 도 1b는 부추 메탄올 추출물이 세포독성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 부추 메탄올 추출물의 iNOS와 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 부추 메탄올 추출물의 NO 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 부추 메탄올 추출물의 PGE2 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 부추 메탄올 추출물의 전염증성 사이토카인 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 부추 메탄올 추출물(MeOH) 및 이의 헥산(Hx), 디클로로메탄(MC), 에틸아세테이트(EtOAC), 부탄올(BuOH), 물(H2O) 분획물의 NO 생성저해 효과를 나타낸 도이다.
도 7a 및 도 7b는 부추 메탄올 추출물 및 이의 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 분획물의 iNOS와 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 부추 메탄올 추출물의 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 분획물의 NO 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 부추 메탄올 추출물의 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 분획물의 PGE2 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 부추 메탄올 추출물의 iNOS와 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 부추 메탄올 추출물의 NO 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 부추 메탄올 추출물의 PGE2 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 부추 메탄올 추출물의 전염증성 사이토카인 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 부추 메탄올 추출물(MeOH) 및 이의 헥산(Hx), 디클로로메탄(MC), 에틸아세테이트(EtOAC), 부탄올(BuOH), 물(H2O) 분획물의 NO 생성저해 효과를 나타낸 도이다.
도 7a 및 도 7b는 부추 메탄올 추출물 및 이의 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 분획물의 iNOS와 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 부추 메탄올 추출물의 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 분획물의 NO 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 부추 메탄올 추출물의 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 분획물의 PGE2 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 부추는 자연에서 채취하거나 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용할 수 있고, 원산지에 상관없이 시중에서 구할 수 있는 것이라면 모두 사용 가능하다.
본 발명에서의 부추 추출물은 부추에 추출용매를 가하여 추출하는 단계, 추출액을 식힌 후 여과하는 단계, 여과한 추출액을 감압 농축하여 건조하는 단계를 통하여 제조되는 것이 바람직하나, 당 업계에 공지된 일반적인 방법을 통해 수득할 수 있다.
상기 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하며, 70% 메탄올을 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 추출 용매의 양은 부추 건조 중량의 3 내지 10배를 첨가하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10배이나 이에 한정되지는 않는다.
추출 방법으로는 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등을 이용할 수 있으며, 환류냉각추출 방법으로는 1회 내지 5회 추출하는 것이 바람직하며, 3회 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되지는 않는다. 추출온도는 50 내지 100℃인 것이 바람직하고, 70℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.
농축액을 건조하여 추출물을 얻는 방법으로는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다.
상기 부추 추출물의 유기용매 분획물은 부추 추출액의 농축액에 추가적으로 유기용매를 가하여 분획물을 제조하는 방법으로 기존에 알려진 유기용매를 이용한 추출방법을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 유기용매는 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물은 염증유발인자와 전염증성 사이토카인의 생성을 저해함으로써, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren’s syndrome), 다발성 경화증 및 급성 또는 만성 염증성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
상기 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
상기 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 200mg/kg/일의 양으로 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격을 1일 수회, 바람직하게는 1일 1회 내지 3회로 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있다.
아울러, 본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 부추 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며, 상기 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료 또는 섬유질사료가 사용가능하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 사료첨가제는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제, 감미제, 제산제, 지사제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1. 부추 추출물 및 이의
분획물의
제조
포항지역에서 생산된 부추를 동결 분쇄하여 미세분말로 만들어 70% 메탄올에 침적하고, 70℃에서 3회 환류 냉각 추출 후, Whatman No.2로 여과함으로써, 부추 메탄올 추출액을 얻었다. 이 추출액의 상층액을 감압농축장치를 사용하여 농축하고, 농축액의 일부는 동결 건조하여 70% 메탄올 추출물 분말을 얻어 본 발명을 위한 시료로 사용하였다.
또한, 남겨진 농축액을 극성이 낮은 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 극성을 높여가며 순차적으로 추출하여 부추 추출물의 분획물을 제조하였다.
실시예
2. 부추 메탄올 추출물의 세포독성에 미치는 영향 측정
본 실시예에서는 부추 메탄올 추출물이 세포 독성에 미치는 정도를 확인하였다. 부추 메탄올 추출물의 세포 독성과 관련한 농도 결정을 위하여 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 이하 구체적으로 설명한다.
2-1. 부추 메탄올 추출물의 대식세포(
Raw264
.7
cells
)에 대한 세포독성 평가
대식 세포(Raw264.7 cells)를 10% FBS, 1% Antibiotic/Antimycotic 용액을 함유한 DMEM 배지에 잘 혼합하여, 세포의 농도를 1 x 105 cells/mL로 조정한 다음, 96-well 배양판에 준비된 세포를 200㎕씩 첨가하여 배양시켰다. 세포가 어느 정도 성장했을 때, 부추 메탄올 추출물 시료(0, 50, 100, 200㎍/mL)를 세포에 처리하여 24시간 배양한 후, 5mg/ml 농도의 MTT 시약을 넣고 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액을 제거하고 solubilizing solution을 넣고 formazan 결정체를 용해하여, 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존은 추출물을 처치하지 않은 대조군에 비교하여 비율%로 표시하였다.
실험결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, Raw264.7 세포에 대한 부추 메탄올 추출물은 200㎍/mL의 농도까지 세포 독성이 나타나지 않았으며, 오히려 세포생장을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 염증유발인자(
LPS
,
INF
-γ)에 의한 세포독성 완화 효과
Raw264.7 세포에 100ng/mL LPS와 10ng/mL IFN-γ를 30분간 전처리한 다음, 부추 메탄올 추출물을 0, 50, 100, 200㎍/mL 농도가 되도록 처리한 후 24시간 배양하였다. 5mg/ml 농도의 MTT 시약을 넣고 4시간 동안 배양 후, 상등액을 제거하고 solubilizing solution을 넣고 formazan 결정체를 용해하여, 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존은 대조군에 비교하여 %로 표시하였다.
실험결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, LPS와 INF-γ에 의해 유도된 세포독성이 부추 메탄올 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 완화되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 부추 메탄올 추출물이 대식세포에서 염증유발인자에 의해 유발되는 세포독성을 방어하는 효과가 있는 것으로 판단되었다.
실시예
3. 부추 메탄올 추출물의 항염증 지표의 평가
본 실시예에서는 부추 메탄올 추출물이 염증관련인자인 iNOS와 COX-2 발현 및 nitric oxide(NO)와 PGE2 생성량에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해서, Raw264.7 세포에 100ng/mL LPS와 10ng/mL IFN-γ를 30분간 전처리한 다음, 부추 메탄올 추출물을 각각 0, 50, 100, 200㎍/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다.
3-1.
웨스턴
블롯
분석
세포의 단백질을 추출한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액을 Bradford 시약을 사용해 단백질 농도를 정량하여 40㎍의 단백질을 취하였다. 추출된 단백질은 8% SDS-PAGE 젤을 이용하여 전기영동을 실시한 후, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 5% 탈지우유로 1 시간 상온에서 처리한 후, 1:500의 비율로 희석한 iNOS와 COX-2 항체를 4℃에서 하루 밤 동안 처리하였다. TTBS(Tween 2O/Tris-buffered saline)로 10분 간격으로 3회 세척한 다음, 1:5,000의 비율로 희석한 2차 항체를 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후, TTBS로 10분 간격으로 3회 세척하여 ECL로 현상하였다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 부추 메탄올 추출물 처리에 의한 iNOS 발현억제가 농도의존적으로 강하게 나타났다. 또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, 부추 메탄올 추출물 처리에 의한 COX-2 발현 억제 실험에서도 부추 메탄올 추출물을 200㎍/mL로 처리한 군에서 강한 억제활성을 나타내었다.
3-2.
NO
생성량 측정
NO 생성량을 확인하기 위하여 세포배양시 생성된 nitrite의 양을 측정하였다. 즉, 세포배양 상층액 100㎕를 취하여 Griess 시약 (100㎕)과 10분간 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준품 NaNO2를 기준으로 최종적으로 생산된 NO의 상대적인 양을 비교함으로써, 처리농도별 NO 억제활성을 구하고 항염증 활성의 지표로 삼았다.
실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 부추 메탄올 추출물의 처리 농도에 의존적으로 NO 생성이 저해되는 것이 확인되었으며, 특히 부추 메탄올 추출물을 200㎍/mL 농도로 처리한 군의 경우, 음성대조군과 유사한 수준으로 NO 생성이 저해되는 것이 확인되었다. 이는 상기 3-1 실험에서 확인된 부추 메탄올 추출물의 iNOS 발현억제 효과와 일치하는 결과를 보였다.
3-3.
PGE
2
생성량 측정
세포배양 상층액을 취하여 원심분리한 후, PGE2의 농도를 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay; ELISA) 키트(R&D 시스템, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 부추 메탄올 추출물을 200㎍/mL로 처리한 군에서 약 50% 저해활성을 나타내었다. 이는 상기 3-1 실시예에서 확인된 부추 메탄올 추출물의 COX-2 발현 억제 효과와 일치하는 결과를 보였다.
상기의 실시예들로부터, 부추 메탄올 추출물이 염증유발인자인 LPS와 INF-γ에 의해 유도되는 iNOS, COX-2, NO 및 PGE2의 생성 또는 발현을 효과적으로 저해하는 것을 보여주었고, 이는 부추 메탄올 추출물을 유효성분으로 하여, 항염증 활성을 갖는 조성물에 활용될 수 있음을 나타낸다.
실시예
4.
전염증성
사이토카인 발현 억제효과
본 실시예에서는 부추 메탄올 추출물이, LPS에 의해 유도된 전염증성 사이토카인 8종 (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1, MIP-1α, 및 TNF-α)의 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
사람의 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells)를 96-well 시험 플레이트에 2 x 104 cells/well 씩 넣고 1 시간동안 배양한 후, 양성대조군으로 dexamethasone (100 nM)을, 실험군으로 상기 추출물을 100㎍/mL 농도로 처리하였다. 1 시간 경과 후, 50pg/mL LPS를 처리하여 24시간 배양한 다음, 상층액 중에 생성된 각각의 전염증성 사이토카인들의 양을 효소면역분석법으로 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, LPS 자극에 의해 전염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, MIP-1α, 그리고 TNF-α 생성이 증가되었고, 여기에 부추 메탄올 추출물을 처리한 결과, IL-1β, IL-6, MIP-1α, 그리고 TNF-α의 생성이 저해 되는 것을 확인하였다.
실시예
5. 메탄올 추출물을 극성이 다른 용매로 순차 추출한
분획물의
NO
생성저해활성
본 실시예에서는 부추 메탄올 추출물로부터 극성이 낮은 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 순으로 극성을 높여가며 순차적으로 추출한 분획물의 NO 생성을 저해하는 활성 정도를 알아보았다. 이를 위해, Raw264.7 세포에 100ng/mL LPS와 10ng/mL IFN-γ를 30분간 전처리한 다음, 상기 분획물들을 100㎍/mL 농도가 되도록 처리하여 24시간 배양하였다.
생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 nitrite(NO2-)의 형태로 측정하였다. 세포배양 상층액 100㎕와 Griess 시약 100㎕를 혼합하여 96-well 플레이트에서 10분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 질산나트륨(NaNO2)을 표준으로 비교하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 디클로로메탄(MC), 헥산(Hx), 에틸아세테이트(EtOAC) 분획물이 효과적으로 NO의 생성을 저해하는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예
6. 부추
분획물별
항염증 지표의 평가
본 실시예에서는 NO 생성 저해효과가 뛰어난 디클로로메탄, 헥산, 에틸아세테이트 분획물을 이용하여 염증관련인자인 iNOS와 COX-2 발현 및 nitric oxide(NO) 와 PGE2 생성량에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해서, Raw264.7 세포에 100ng/mL LPS와 10ng/mL IFN-γ를 30분간 전처리한 다음, 메탄올, 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 분획물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다.
6-1.
웨스턴
블롯
분석
세포의 단백질을 추출한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액을 Bradford 시약을 사용해 단백질 농도를 정량하여 40㎍의 단백질을 취하였다. 추출된 단백질은 8% SDS-PAGE 젤을 이용하여 전기영동을 실시한 후, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 5% 탈지우유로 1 시간 상온에서 처리한 후, 1:500의 비율로 희석한 iNOS와 COX-2 항체를 4℃에서 하루 밤 동안 처리하였다. TTBS로 10분 간격으로 3회 세척한 다음, 1:5,000의 비율로 희석한 2차 항체를 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후, TTBS로 10분 간격으로 3회 세척하여 ECL로 현상하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 헥산(Hx), 디클로로메탄(MC) 분획물 처리에 의한 iNOS 발현억제가 농도의존적으로 강하게 나타났다. 또한, 도 7b에 나타난 바와 같이, COX-2 발현 억제 실험에서도 헥산(Hx), 디클로로메탄(MC) 분획물이 처리된 군에서 강한 억제활성을 나타내었다.
6-2.
NO
생성량 측정
NO 생성량을 확인하기 위하여 세포배양 시 생성된 nitrite의 양을 측정하였다. 즉, 세포배양 상층액 100㎕를 취하여 Griess 시약(100㎕)과 10분간 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준품 NaNO2를 기준으로 최종적으로 생산된 NO의 상대적인 양을 비교함으로써, 분획물별 NO 생성저해활성을 구하고 항염증 활성의 지표로 삼았다.
실험결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 헥산(Hx), 디클로로메탄(MC), 에틸아세테이트(EtOAC) 분획물의 처리 농도에 의존적으로 NO 생성이 저해되는 것이 확인되었으며, 특히 50㎍/mL 농도로 처리된 헥산, 디클로로메탄 분획물의 경우, 음성대조군과 유사한 수준으로 NO 생성이 저해되는 것이 확인되었다. 이는 상기 6-1 실시예에서 확인된 iNOS 발현 억제 효과와 일치하는 결과를 보였다.
6-3.
PGE
2
생성량 측정
세포배양 상층액을 취하여 원심분리한 후, PGE2의 농도를 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay; ELISA) 키트(R&D 시스템, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 헥산(Hx), 디클로로메탄(MC), 에틸아세테이트(EtOAC) 분획물의 처리 농도에 의존적으로 PGE2 생성이 억제되는 것이 확인되었으며, 특히, 디클로로메탄 분획물 50㎍/mL 농도에서 음성대조군과 유사한 수준으로 PGE2 생성이 저해되는 것이 확인되었다. 이는 상기 6-1 실시예에서 확인된 COX-2 발현 억제 효과와 일치하는 결과를 보였다.
상기의 실시예들로부터, 부추 추출물의 헥산, 디클로로메탄 분획물이 가장 효과적으로 염증유발인자인 LPS와 INF-γ에 의해 유도되는 iNOS, COX-2, NO 및 PGE2의 생성 또는 발현을 저해하는 것을 보여주었고, 이는 상기 분획물을 유효성분으로 하여, 항염증 활성을 갖는 조성물에 활용될 수 있음을 나타낸다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (9)
- 부추 추출물의 헥산 또는 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물로,
상기 조성물은 유도성 산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(cyclooxigenase-2, COX-2)의 발현을 억제하고, 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘E2(prostaglandin E2, PGE2) 생성을 저해하며, 전염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, MIP-1α, 및 TNF-α 생성을 저해하여 염증성 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 부추 추출물은 물, 메탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 부추 추출물의 헥산 또는 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 개선용 건강기능식품으로,
상기 건강기능식품은 유도성 산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(cyclooxigenase-2, COX-2)의 발현을 억제하고, 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘E2(prostaglandin E2, PGE2) 생성을 저해하며, 전염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, MIP-1α, 및 TNF-α 생성을 저해하여 염증성 질환을 개선하는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품.
- 부추 추출물의 헥산 또는 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 개선용 기능성 사료 첨가제로,
상기 사료 첨가제는 유도성 산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(cyclooxigenase-2, COX-2)의 발현을 억제하고, 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘E2(prostaglandin E2, PGE2) 생성을 저해하며, 전염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, MIP-1α, 및 TNF-α 생성을 저해하여 염증성 질환을 개선하는 것을 특징으로 하는, 사료 첨가제.
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KR1020130026315A KR101447807B1 (ko) | 2013-03-12 | 2013-03-12 | 부추 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
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- 2013-03-12 KR KR1020130026315A patent/KR101447807B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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J.R. Vane et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. Vol. 91, No. 6, pp. 2046-2050 (1994) * |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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KR20140112640A (ko) | 2014-09-24 |
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