KR101444209B1 - 신규한 프로투복세핀 ａ, ｂ 및 프로투보닌 ａ 화합물 및 이를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물 및 이를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 해양 침적물에서 분리한 곰팡이 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044로부터 분리 정제한 신규한 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물이 유방암 세포, 간암 세포 또는 골수성 백혈병 세포와 같은 암세포들에 대하여 증식저해 활성을 가지므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 프로투복세핀 Ａ, Ｂ 및 프로투보닌 Ａ 화합물 및 이를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Novel compounds Protuboxepin A, B and protubonnine A and pharmaceutical composition for prevention or treatment of cancer containing thereof}

본 발명은 신규한 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A, 및 이를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 현대사회에서 사망률 1위를 차지하는 주요 질병으로 현재까지 많은 연구에도 불구하고 획기적인 치료법이 없는 실정이다. 현대 의학의 대표적 암 치료법에는 외과적 수술요법, 생물요법, 방사선요법, 항암물질 투여에 의한 화학요법 등이 있다. 화학요법은 항암제를 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식을 억제하는 방법으로 전이된 암을 치료할 수 있다는 것으로 현재 화학요법은 전이성 암 치료에 표준요법으로 사용되고 있다. 물론 화학요법으로 전이된 암을 완치시킬 수 있는 것은 아니지만 증상을 완화시켜 수명 연장에 있어서 중요한 역할을 한다.

천연물 유래의 항암제 중 가장 널리 사용되고 있는 항암제는 택솔(taxol)로서 유방암, 난소암의 치료에 사용되고 있다. 그러나 이러한 화학요법제들은 부작용 및 항암제 내성발현 등의 문제점을 가지고 있으며, 지금까지 암에 대한 많은 연구가 진행되고 있지만 암 자체의 다양성 및 다양한 발병기작으로 인하여 보다 적은 부작용과 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제 개발이 요구되고 있다.

천연물의 탐색과 이용에 관한 연구는 바로 유기체의 생합성 능력을 탐색하고 이용하는 것으로서, 지금까지 주로 식물과 미생물이 그 대상의 주종을 이루어 왔다. 특히 미생물은 종의 다양성과 함께 독특하고 흥미로운 생리활성 물질을 생산하는 예가 많고 세대기간이 짧으며 대량생산이 용이하고 산업적 이용가능성이 높아서 매력 있는 생리활성물질의 탐색원이 되어왔다. 미생물로부터 탐색된 많은 생리활성물질들은 방선균, 곰팡이, 세균들로부터 기인하며 그 중 곰팡이로부터 약 25%가 발견되어 항암물질을 비롯한 생리활성물질의 생산균으로서 산업적 또는 의학적인 측면에서 매우 중요한 미생물 자원으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 항암활성이 우수한 물질에 대해 해양미생물의 대사산물로부터 탐색하던 중, 해양 침적물로부터 항암활성이 우수한 물질을 생산하는 곰팡이 균주 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044를 선별하였고, 이로부터 새로운 구조의 프로투복세핀 A 및 B 및 프로투보닌 A 화합물을 순수하게 분리 및 정제하였으며, 상기 화합물은 유방암 세포, 간암 세포, 골수 백혈병 세포들과 같은 암세포에 대하여 암세포 증식저해 활성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC11886BP로 기탁된 상기 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물을 생산하는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스퍼질러스 속 곰팡이(Aspergillus sp.) SF-5044로부터 분리한 신규한 화합물인 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A를 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물의 제조방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 수탁번호 KCTC11886BP로 기탁된 상기 화학식 1 내지 3의프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A 화합물을 생산하는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주를 제공한다.

아스퍼질러스 속 곰팡이(Aspergillus sp.) SF-5044로부터 분리한 신규한 화합물인 프로투복세핀 A, B 및 프로투보닌 A는 다양한 암세포에 대한 우수한 증식저해 활성을 나타내므로 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 화학식 1의 화합물(프로투복세핀 A)의 ¹H NMR 스펙트럼(400 MHz, CD₃OD)을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 화학식 1의 화합물(프로투복세핀 A)의 ¹³C NMR 스펙트럼(100 MHz, CD₃OD)을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 화학식 2의 화합물(프로투복세핀 B)의 ¹H NMR 스펙트럼(400 MHz, CD₃OD)을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에서 분리한 화학식 3의 화합물(프로투보닌 A)의 ¹H NMR 스펙트럼(400 MHz, CD₃OD)을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명에서 분리한 화학식 3의 화합물(프로투보닌 A)의 ¹³C NMR 스펙트럼(100 Hz, CD₃OD)을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 신규한 프로토복세핀 A 화합물, 하기 화학식 2의 프로토복세핀 B 화합물 및 하기 화학식 3의 프로토보닌 A 화합물을 제공한다.

본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

동량의 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1 내지 3의 프로토복세핀(protoboxepin) A, B 또는 프로토보닌 A(protobonine A)는 유방암 세포, 섬유아 세포, 간암 세포, 골수성 백혈병 세포 등과 같은 암 세포들에 대해 증식 저해 활성을 갖는다. 본 발명에 따른 상기 화합물들의 암세포 증식저해 활성이 있는지 확인하기 위해, 인간 유방암 세포주(MDA-MB-231 세포), 쥐 섬유아 세포주(3Y1 세포), 인간 간암 세포주(Hep3B), 인간 만성골수성 백혈병 세포주(K562 세포) 및 인간 전골수성 백혈병 세포주(HL-60 세포)를 다양한 농도로 첨가한 배지에 배양한 후, 상기 세포들의 생존율을 측정한 실험 결과, 본 발명에 따른 프로토복세핀(protoboxepin) A는 MDA-MB-231 세포, 3Y1 세포, Hep3B 세포, K562 세포 및 HL-60 세포주들에 대해 50% 증식저해 농도인 IC₅₀ 값은 각각 130, 180, 150, 250 및 75 μM로 나타났다. 이로부터, 본 발명에 따른 화합물들은 우수한 암 세포 증식 억제 활성을 나타냄으로써 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 암의 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 암은 유방암, 간암 또는 골수성 백혈병인 것이 바람직하다.

나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 화학식 1 내지 3의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 화학식 1 내지 3의 화합물은 살펴본 바와 같이 유방암 세포, 간암 세포 또는 골수성 백혈병 세포와 같은 암세포들에 대하여 증식저해 활성을 가지므로 암의 예방 또는 개선용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 건강식품으로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료, 껌, 비타민 복합제 또는 건강보조식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.

그 외, 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물의 제조방법을 제공한다.

이하에서는, 본 발명에 따른 상기 화합물들을 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주로부터 제조하는 방법을 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 상기 제조방법은,

아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주를 배양하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 얻어진 균주 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 얻어진 에틸아세테이트 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계(단계 3)를 포함하여 이루어질 수 있다.

이하, 상기 제조방법을 단계별로 상세히 살펴본다.

단계 1

상기 단계 1은 곰팡이 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주를 배양하는 단계이다. 본 발명자는 해양퇴적물 시료로부터 균주를 분리한 후, 상기 균주의 서열분석을 수행하여 얻어진 염기서열의 GenBank 검색 결과, 아스퍼질러스 프로투베루스(Aspergillus protuberus)(FJ176897)에 99.64%의 상동성을 보였다. 이에, 본 균주를 아스퍼질러스 속으로 동정하였고 이를 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) SF-5044로 명명하였으며, 2011년 3월 18일 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였으며(수탁번호 : KCTC11886BP), 상기 균주를 화학식 1 내지 3의 화합물을 제조하는데 사용하였다.

균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양할 수 있다. 영양원으로는 종래 곰팡이의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 탄소원으로는 글루코오스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모 추출물, 황산암모늄, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕 배양 또는 정치배양이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나, 일반적으로 20 내지 37 ℃에서 배양하는 것이 바람직하고, 25 내지 30℃에서 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

단계 2

상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻어진 균주 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 단계로서, 본 발명에 따른 화학식 1 내지 3의 프로토복세핀 A 및 B, 프로토보닌 A 화합물은 균주의 배양액뿐만 아니라 균사체 부분에도 존재할 수 있다. 따라서, 균주의 배양액 및 균사체에 에틸아세테이트 등의 유기용매를 가하여 배양액 및 균사체로부터 유효성분을 추출한 후 수득된 추출액을 감압증발 방법으로 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

단계 3

상기 단계 3은 본 발명에 따른 화학식 1 내지 3의 프로토복세핀 A 및 B, 프로토보닌 A 화합물을 분리하는 단계로서, 상기 단계 2에서 얻은 에틸아세테이트 농축액을 메탄올 : 디클로로메탄 혼합용매를 이용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 실시한 후, 고속액체크로마토그래피로 정제하여 분리할 수 있다.

이때, 상기 메탄올 : 디클로로메탄 혼합용매는 2:8 내지 10:0의 비율을 가지는 것이 바람직하다.

상기 제조방법에 의해 얻어진 화학식 1, 2 및 3의 화합물을 ESI 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, COSY(Correlation Spectroscopy), HMQC(¹H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization) 및 NOESY(Nuclear Overhauser effect spectroscopy) 스펙트럼을 얻고, 상기 화학식 1, 2 및 3의 화합물들의 분자구조를 결정한 결과, 화학식 1 및 2의 화합물은 곰팡이 유래를 포함한 천연물에서는 보기 드문 옥세핀링(oxepin)과 다이케토펩타이드링(diketopiperazine) 시스템 모두 가진 링 시스템의 화학골격을 가지며, 분자 내에 극히 드문 D-Phe 잔기가 존재하는 신규한 골격의 화합물로 동정하였다. 이에 상기 화학식 1 및 2의 화합물을 각각 프로토복세핀(protoboxepin) A 및 B로 명명하였다. 또한 화학식 3의 화합물은 기존에 알려지지 않은 다이케토피페라진 유도체인 알칼로이드 화합물로 동정하여 프로토보닌 A(protobonine A)로 명명하였다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC11886BP로 기탁된, 상기 화학식 1 내지 3의 프로토복세핀(protoboxepin) A, B 및 프로토보닌 A(protobonine A)의 화합물을 제공하는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주를 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1 내지 3의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 화학식 1 내지 3의 화합물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 또한, 제제화할 경우에는 유효성분인 화학식 1 내지 3의 화합물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 화학식 1 내지 3의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

또한, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

본 발명에 따른 화학식 1 내지 3의 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1 내지 3의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 아스퍼질러스 속 ( Aspergillus sp .) SF -5044 균주의 분리, 동정 및 명명

1. 균주의 분리

본 균주는 2006년 4월 부산 다대포해변의 해양퇴적물로부터 분리하였다. 채집한 퇴적물은 채집 즉시 멸균된 플라스틱 백에 넣어, 실험에 사용하기까지 냉동보관하였다. 퇴적물 시료는 멸균된 해수를 이용하여 10배 희석하였다. 희석액 1 ml를 3% NaCl이 함유된 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 배지에 도말하여 25 ℃에서 14일간 배양하여 나타난 집락을 수차례의 분리과정을 통하여 순수분리하였으며 최종 순수분리된 균주를 -70 ℃에 보관하였다.

2. 균주의 동정 및 명명

상기 1에서 분리한 균주의 nRNA 서열 분석을 수행하였다. 서열 분석 결과, 균주의 28S rRNA는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것으로 나타났다.

상기 균주의 28S rRNA 시퀀스 분석을 통하여 얻어진 염기서열의 GenBank 검색 결과, Aspergillus protuberus (FJ176897)에 99.64%의 상동성을 보였다. 이에 본 균주를 아스퍼질러스 속으로 동정하였고 이를 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) SF-5044 (수탁번호 : KCTC11886BP)로 명명하였다.

< 실시예 2> 아스퍼질러스 속 ( Aspergillus sp .) SF -5044 균주로부터 화합물의 분리 및 정제

1. 균주의 배양

상기 곰팡이 균주를 배양하기 위하여, 통상적으로 미생물이 이용하는 영양원과 염화나트륨을 함유하는 배지를 준비하였다. 곰팡이 균주의 조배지 및 생산배지로서 0.4%(w/v) 포테이토 스타치, 2%(w/v) 덱스트로스, 3%(w/v) 염화나트륨, 1.5%(w/v) 아가가 함유된 포테이토 덱스트로스 아가 배지를 사용하였다.

상기 종배지 20 ml이 담긴 100 ml 용량의 삼각플라스크를 121 ℃에서 20분간 멸균한 후, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주의 사면배양 시험관으로부터 백금이 접종하여 4일간 진탕배양하여 종배양으로 하였다. 생산배지 20 ml로 만든 평판배지 110개에 각각 종배양액 2 ml을 접종하여 25 ℃에서 10일 동안 정치배양하였다.

2. 화합물의 분리 및 정제

상기 1에서 배양한 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주의 배양물을 2 L의 에틸아세테이트로 추출하고, 수득된 추출액을 감압건조기를 이용하여 감암증발 방법으로 농축하여 2 g의 추출물을 얻었다. 상기 농축액을 오디에스 알피 18에 흡착시켜 오디에스 알피 18 플래쉬 컬럼크로마토그래피(ODS RP-18 flash column chromatography)를 실시하였으며, 이때 메탄올/물(2/8 내지 10/0, v/v)을 혼합용매로 하여 단계적으로 메탄올 농도를 증가시키면서 용출하였다. 이때 80% 메탄올에서 용출된 분획을 메탄올/디클로메탄(0%-20%, v/v)을 혼합용매로 하여 실리카겔 프레쉬 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 또한, 메탄올/디클로로메탄 (1:19, v/v) 혼합용매로 용출한 분획을 감압농축한 후, 고속액체크로마토그래피(칼럼: Agilent semiprep-C₁₈)를 이용하여 용매로는 0.1% 포름산이 함유된 70%~80% 메탄올 농도구배, 용출 유속 5 ml/분 조건으로 용출하여 210 nm의 UV 흡수 피크로 화합물 1(8.5 mg, t_R = 22.0 min)를 분리하였다. 또한 동일 조건의 고속액체크로마토그래피를 이용하여 0.1% 포름산이 함유된 50%~100% 메탄올/물 농도구배의 조건으로 화합물 2(1.0 mg, t_R = 32.4 min)를 분리하였다. 아울러, 상기 프레쉬 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리 단계에서 4% 메탄올에서 용출된 분획을 동일 조건의 고속액체크로마토그래피를 이용하여 0.1% 포름산이 함유된 60% 내지 73% 메탄올/물 농도구배의 조건으로 화합물 3(5.6 mg, t_R = 13.2 min)을 분리하였다.

3. 화합물 1 내지 3의 구조 분석

상기 곰팡이 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) SF-5044의 배양액으로부터 분리한 화합물 1 내지 3을 ESI 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, COSY(Correlation Spectroscopy), HMQC(¹H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization), NOESY(Nuclear Overhauser effect spectroscopy) 스펙트럼을 얻고, 화합물의 분자구조를 결정한 결과, 화합물 1 및 2는 하기 화학식과 같은 곰팡이 유래를 포함한 천연물에서는 보기 드문 옥세핀링 (oxepin)과 다이케토펩타이드링 (diketopiperazine) 시스템 모두 가진 링 시스템의 화학골격을 가지며, 분자내에 극히 드문 D-Phe 잔기가 존재하는 신규한 골격의 화합물로 동정하였다. 이에 상기 화합물 1 및 2를 각각 화학식 1 및 2로 표시하고 프로토복세핀(protoboxepin) A 및 B로 명명하였다. 또한 화합물 3은 하기와 같은 기존에 알려지지 않은 다이케토피페라진 유도체인 알칼로이드 화합물로 동정하여 화학식 3으로 표시하고 프로토보닌 A(protobonine A)로 명명하였다. 하기에 화학식 1 내지 3의 구조와 스펙트럼 결과를 나타내었고, 각각의 ¹H NMR 및 ¹³C NMR은 표 1 및 2에 나타내었다.

[화학식 1]

프로투복세핀 A(Protuboxepin A): 황색 고체; [α]_D -327 (c 0.35, MeOH); UV(MeOH) λ_max (log ε) 257 (3.59), 336 (3.39); HRESIMS m/z 378.1824 [M+H]⁺ (calcd for C₂₂H₂₄N₃O₃, 378.1818).

[화학식 2]

프로투복세핀 B(Protuboxepin B): 황색 고체; [α]_D -143 (c 0.14, MeOH); UV(MeOH) λ_max (log ε) 260 (3.69), 329 (3.42); HRESIMS m/z 364.1672 [M+H]⁺ (calcd for C₂₁H₂₂N₃O₃, 364.1661).

[화학식 3]

프로투보닌 A(Protubonine A): 황색 고체; [α]_D -155 (c 0.51, MeOH); UV(MeOH) λ_max (log ε) 243 (4.12), 280 (3.31); HRESIMS m/z 358.1768 [M+H]⁺ (calcd for C₁₉H₂₄N₃O₄, 358.1767).

화학식 1 및 2의 화합물의 ¹H 및 ¹³C NMR 결과(CD₃OD)

		화학식 1의 화합물 (프로투복세핀 A)	화학식 2의 화합물 (프로투복세핀 B)
위치	δc	δH, mult. (J in Hz)	δH, mult. (J in Hz)
1	58.4	5.34, br d (4.0)	5.34, br d (4.0)
2	169.3	-	-
4	59.4	2.75, br d (1.4)	2.74, br d (1.8)
5	157.7	-	-
7	164.4	-	-
9	144.6	6.08, d (5.5)	6.08, d (5.5)
10	118.4	5.72, dd (5.9, 5.5)	5.72, dd (5.5, 5.5)
11	129.3	6.21, dd (11.4, 5.9)	6.22, dd (11.0, 5.5)
12	126.1	6.73, d (11.4)	6.73, d (11.0)
13	111.4	-	-
14	162.7	-	-
16	37.8	3.35, m	3.36, m
17	135.8	-	-
18/22	130.9	6.93, br d, (7.0)	6.93, br d, (7.0)
19/21	129.9	7.25, br t (7.7)	7.24, br t (7.7)
20	129.1	7.32, br t, (7.3)	7.31, br t, (7.3)
23	38.8	2.13, m	2.46, m
24	15.4	0.84, d (7.0)	0.87, d (7.4)
25	24.8	1.14, m	0.69, d (7.0)
26	12.3	0.75, t (7.3)	-

화학식 3의 화합물의 ¹H 및 ¹³C NMR 결과(CD₃OD)

화학식 3의 화합물 (프로토보닌 A)
위치	δc	δH, mult. (J in Hz)
1	168.2	-
2	-	5.86, br s
3	53.1	3.91, dd (9.9, 3.3)
4	166.6	-
5a	82.1	5.92, s
6a	143.2	-
7	119.7	7.98, d (8.1)
8	131.2	7.37, dd (8.1, 7.6)
9	125.5	7.17, dd (7.6, 7.3)
10	123.2	7.42, d (7.3)
10a	131.5	-
10b	83.8	-
11	39.0	2.89, dd (12.8, 5.5)
		2.59, dd (12.8, 11.4)
11a	58.8	3.81, dd (11.4, 5.5)
12	38.9	1.99, m
		1.53, m
13	24.5	1.69, m
14	23.4	1.00, d (6.2)
15	21.1	0.91, d (6.6)
16	171.5	-
17	23.8	2.64, s
O-Ac	-	-

< 실험예 1> 암세포 증식저해 활성 측정

본 발명에 따른 화학식 1 내지 3의 화합물의 암세포 증식저해 활성을 알아보기 위해, 다음과 같이 수행하였다.

인간 유방암 세포주(MDA-MB-231 세포, 웰당 5.0×10³ 세포), 쥐 섬유아 세포주(3Y1 세포, 웰당 5.0×10³ 세포), 인간 간암 세포주(Hep3B, 웰당 5.0×10³ 세포)를 DMEM 배지(Dulbeccos modification of Eagles medium, 10% 소 태아혈청 함유)에서 각각 배양하였다. 또한, 인간 만성골수성 백혈병 세포주(K562 세포, 웰당 3.0×10⁴ 세포)와 인간 전골수성 백혈병 세포주(HL-60 세포, 웰당 1.0×10⁵ 세포)를 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640 배지, 10% 소 태아혈청 함유)에서 각각 배양하였다. 각각 배양된 세포주들에 화학식 1 및 2의 화합물을 100 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 3 ㎍/ml 및 1 ㎍/ml의 농도로 각각 첨가하여 37 ℃, 48시간 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후, 고감도 수용성 포르마잔(formazan)을 생성하는 WST-8 시약(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt)을 첨가하여 24시간 동안 배양한 후, 450 nm의 흡광도로 측정하여 세포 생존율을 산출하였다.

본 발명에 따른 화합물들의 암세포 증식저해 활성을 측정하기 위해, 인간 유방암 세포주(MDA-MB-231 세포), 쥐 섬유아 세포주(3Y1 세포), 인간 간암 세포주(Hep3B), 인간 만성골수성 백혈병 세포주(K562 세포) 및 인간 전골수성 백혈병 세포주(HL-60 세포)를 다양한 농도로 첨가한 배지에 배양한 후, 상기 세포들의 생존율을 측정하였고 화학식 1의 화합물인 프로토복세핀 A에 대한 결과값인 IC₅₀값을 하기 표 3에 나타내었다.

화학식 1의 프로토복세핀 A 화합물
세포	IC50 , μM
MDA-MB-231	130
3Y1	180
Hep3B	150
K562	250
HL-60	75

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물인 프로토복세핀 A는 각각의 암세포에 대하여 우수한 증식 저해 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히, 인간 간암 세포주인 Hep3B, 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 및 인간 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포의 경우 150 μM 이하의 증식 저해 활성을 가지는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 효과적으로 암 세포 증식을 저해하므로 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 약제의 제조

1. 산제의 제조

화학식 1, 2 및 3의 화합물 500 ng

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

화학식 1, 2 및 3의 화합물 500 ng

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

화학식 1, 2 및 3의 화합물 500 ng

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 주사제의 제조

화학식 1, 2 및 3의 화합물 500 ng

만니톨 180 ㎎

Na₂HPO₄ㆍ2H₂O 26 ㎎

증류수 2974 ㎎

통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

< 제조예 2> 건강식품의 제조

1. 건강식품의 제조

화학식 1, 2 및 3의 화합물 500 ng

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎎

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강 음료의 제조

화학식 1, 2 및 3의 화합물 500 ng

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

< 제제예 3> 화장료 조성물의 제조

1. 크림의 제조

세토스테아릴알코올 2.8 중량부

밀납 2.6 중량부

스테아린산 1.4 중량부

친유형모노스테아린산글리세린 2 중량부

피이지-100 스테아레이트 1 중량부

세스퀴올레인산소르비탈 1.4 중량부

호호바오일 4 중량부

스쿠알란 3.8 중량부

폴리소르베이트 60 1.1 중량부

마카다이아오일 2 중량부

초산토코페롤 0.2 중량부

메칠폴리실록산 0.4 중량부

에칠파라벤 0.1 중량부

프로필파라벤 0.1 중량부

Euxyl K-400 0.1 중량부

1,3-부칠렌글리콜 7 중량부

메칠파라벤 0.05 중량부

글리세린 6 중량부

d-판데놀 0.2 중량부

화학식 1, 2 및 3의 화합물 4.6 중량부

트리에탄올아민 0.2 중량부

pt 41891 0.2 중량부

p-H2O 46.05 중량부

2. 로션의 제조

세토스테아릴알코올 1.6 중량부

스테아린산 1.4 중량부

친유형모노스테아린산글리세린 1.8 중량부

피이지-100 스테아레이트 2.6 중량부

세스퀴올레인산소르비탈 0.6 중량부

스쿠알렌 4.8 중량부

마카다이아오일 2 중량부

호호바오일 2 중량부

초산토코페롤 0.4 중량부

메칠폴리실록산 0.2 중량부

에칠파라벤 0.1 중량부

프로필파라벤 0.1 중량부

1,3-부칠렌글리콜 4 중량부

메칠파라벤 0.1 중량부

산탄검 0.1 중량부

글리세린 4 중량부

d-판데놀 0.15 중량부

알란토인 0.1 중량부

화학식 1, 2 및 3의 화합물 3.5 중량부

카르보머(2% aq. Sol) 4 중량부

트리에탄올아민 0.15 중량부

에탄올 3 중량부

pt 41891 0.1 중량부

p-H20 48.3 중량부

< 제조예 4> 사료첨가제의 제조

본 발명자들을 화학식 1, 2 및 3의 화합물을 유효성분으로 하여 하기와 같은 조성으로 사료첨가제를 제조하였다.

화학식 1, 2 및 3의 화합물 0.1 ~ 20% 중량부

지방분해효소(Lipase) 0.001 ~ 0.01% 중량부

제 3 인산칼슘 1 ~ 20% 중량부

비타민 E 0.01 ~ 0.1% 중량부

효소 분말 1 ~ 10% 중량부

유산균 0.1 ~ 10% 중량부

바실러스(Bacillus) 배양액 0.01 ~ 10% 중량부

포도당 20 ~ 90% 중량부

한국생명공학연구원 KCTC11886 20110318

<110> korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel compounds Protuboxepin A, B and protubonnine A and pharmaceutical composition for prevention or treatment of cancer containing thereof <130> 10p-12-32 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 858 <212> RNA <213> Aspergillus sp. <400> 1 gggauugccc caguaacggc gagugaagcg gcaagagcuc aaauuugaaa ucuggccccu 60 ccgggguccg aguuguaauu ugcagaggau gcuucgggug cggccccugu cuaagugccc 120 uggaacgggc cgucagagag ggugagaauc ccgucuuggg cagggugccc gugcccgugu 180 gaagcuccuu cgacgagucg aguuguuugg gaaugcagcu cuaaaugggu gguaaauuuc 240 aucuaaagcu aaauaccggc cggagaccga uagcgcacaa guagagugau cgaaagauga 300 aaagcacuuu gaaaagagag uuaaacagca cgugaaauug uugaaaggga agcgcuugcg 360 accagacucg gccucggggu ucagccagca uucgugcugg uguacuuccc cggggccggg 420 ccagcgucgg uucgggcggc cggucaaagg ccccaggaau guaucguccu ccgggacguc 480 uuauagccug gggugcaaug cggccagccu ggaccgagga acgcgcuucg gcacggacgc 540 uggcguaaug gucacaaacg acccgucuug aaacacggac caaggagucu aacaucuacg 600 cgaguguucg ggugucaaac ccguacgcgc agugaaagcg aacggaggug ggagccccuu 660 uuggggcgca ccaucgaccg auccugaagu cuucggaugg auuugaguac gagcguagcu 720 guggggaccc gaaagauggu gaacuaugcc ugaauagggu gaagccagag gaaacucugg 780 uggaggcucg cagcgguucu gacgugcaaa ucgaucguca aauuugggua uaggggcgaa 840 gacuaaucga nccaucgu 858

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 프로투복세핀 A, 하기 화학식 2로 표시되는 프로투복세핀 B 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 프로투보닌 A의 화합물:
   [화학식 1]
   

   

   
   
   [화학식 2]
   

   

   
   
   [화학식 3]
   

   

   .
   
2. 제1항의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 화합물은 암세포에 대한 증식저해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 암은 유방암, 간암 또는 골수성 백혈병인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강식품.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 암은 유방암, 간암 또는 골수성 백혈병인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 개선용 건강식품.
   
7. 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주를 배양하는 단계(단계 1);
   상기 단계 1에서 얻어진 균주 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 단계(단계 2); 및
   상기 단계 2에서 얻어진 에틸아세테이트 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계(단계 3)를 포함하는 제1항의 신규한 화합물의 제조 방법.
   
8. 수탁번호 KCTC11886BP로 기탁된 제1항의 화합물을 생산하는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주.
   

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