KR101429247B1 - ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도 - Google Patents

ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101429247B1
KR101429247B1 KR1020120068249A KR20120068249A KR101429247B1 KR 101429247 B1 KR101429247 B1 KR 101429247B1 KR 1020120068249 A KR1020120068249 A KR 1020120068249A KR 20120068249 A KR20120068249 A KR 20120068249A KR 101429247 B1 KR101429247 B1 KR 101429247B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
target protein
ifret
probe
light
wavelength
Prior art date
Application number
KR1020120068249A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130001178A (ko
Inventor
정상전
김주환
엘레나 러치키나
강효진
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Publication of KR20130001178A publication Critical patent/KR20130001178A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101429247B1 publication Critical patent/KR101429247B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/81—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/82—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/87—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material

Abstract

본 발명은 iFRET용 탐침 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신규 iFRET용 탐침, iFRET용 탐침의 제조 방법, iFRET용 탐침을 이용하여 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 검색하는 방법, iFRET용 탐침을 통해 표적 단백질을 이미지화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 iFRET용 탐침은 기존의 FRET 방법과 달리 단백질 내의 아미노산을 형광 주게(donor)로 사용하므로 하나의 형광물질만 사용되어지고, 단백질고유 형광과 분리된 발광파장을 가지므로 높은 특이성과 민감도를 가지므로 다양한 단백질의 양, 활성 및 기작 등을 보다 쉽고 정확하게 분석할 수 있다.

Description

ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도{A probe for iFRET and use thereof}
본 발명은 iFRET용 탐침 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신규 iFRET용 탐침, iFRET용 탐침의 제조 방법, iFRET용 탐침을 이용하여 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 검색하는 방법 및 iFRET용 탐침을 통해 표적 단백질을 검출 또는 이미지화하는 방법에 관한 것이다.
생명과학과 관련된 많은 분야에서 다양한 물질들이 생체 내 또는 외에서 생체 물질을 분석하기 위한 탐침자 또는 리포터로 활용되고 있다. 이러한 탐침자 또는 리포터 시스템은 크게 특정 기질 자체 또는 기질이 효소 반응에 의해 분해 또는 변형되어 나타나는 착색, 발색, 발광을 측정하는 방법과 형광이나 착색능을 지닌 물질 자체를 관찰하는 것으로 구분할 수 있다.
전자의 방법들은 목적하는 단백질에 융합된 형태로 단백질의 발현량, 프로모터의 세기 측정, 재조합 균체의 선별 등의 세포 내 관찰뿐만 아니라 웨스턴/노던 블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)등의 세포 외 관찰에도 활용되고 있으며, 대표적인 예로는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 크산틴옥시다아제(xanthine oxidase) 등의 효소와 기질로서 루미놀(luminol), 루시게닌(lucigenin), 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디옥시제닌(dioxigenin) 등의 화합물이 이용되고 있다.
그러나, 이들이 세포 내에서 발현될 경우 생체 내 대사경로들을 교란시켜 성장을 저해하거나 세포사멸을 유도하는 등의 위험성이 존재하는 단점을 갖는다. 또한, 상기 효소들의 촉매 특성에 기인하는 문제뿐만 아니라 사용되는 기질의 낮은 안정성은 실험오차의 주요한 원인이 되며, 이들 대부분이 생물소재가 아닌 화학 합성물이기 때문에 세포에 유해할 수 있는 가능성이 있어 생체 내에서 지속적인 관찰이 어렵다는 단점도 상존한다. 따라서 전술한 탐침자 또는 리포터의 대부분은 생체 내 보다는 생체 외 탐침에 주로 이용되고 있다.
따라서, 상기 문제점을 개선하기 위하여 단백질 자체가 탐침자로서 작용하는 리포터에 관한 연구가 활발히 진행되었다. 단백질 자체가 탐침자인 대표적인 예로는 특정 파장의 빛을 받아 흡수하여 활성화된 형광단이 낮은 에너지를 지닌 정상상태로 되돌아가는 과정에서 방출되는 에너지가 빛의 형태로 나타나는 특성을 갖는 형광 단백질이 있다. 대표적인 예로는 해파리(jellyfish)인 Aequorea victoria로부터 유래한 녹색형광을 나타내는 GFP(green fluorescent protein)와, Discocosoma 종에서 유래한 DsRed(Discosoma red fluorescent protein)가 존재한다.
상기 형광 단백질은 기질이나 보조인자 없이 단백질 자체가 형광을 나타내기 때문에 전자의 경우처럼 대사교란 및 세포생리학적 인자들에 대한 간섭이 적어, 전자의 효소들이 활용되는 여러 탐침 분야와 그 외의 분야 즉, 효소 및 기질이 지닌 단점으로 인해 적용하기 힘든 분야에서도 활용이 가능하다. 특히 단백질이 특정 파장의 빛에 의해 생성하는 고유한 파장을 갖는 형광을 통하여 세포나 생물체를 파괴하지 않고 정상생리를 유지하는 살아있는 상태에서 특정 단백질의 이동과 활성 경로, 세포분열 및 분화과정 등과 같이 세포 내부에서 일어나는 복잡한 변화들을 직접 모니터링 하는 것에 있어 현존하는 어떠한 방법보다도 우수한 요소로 인정받고 있다. 또한 형광 단백질들은 β-barrel 구조 내부에 형광단이 있는 견고한 3차 구조를 갖는다. 상기 구조로 인해 물리화학적으로 매우 안정적이며 우수한 빛 안정성을 지녀, 넓은 범위의 pH, 온도 구간, 변성제나 유기용매 등이 존재하는 환경에서도 적용이 가능하며 반복적인 실험에서도 재현성을 유지할 수 있어 기존의 탐침자에 비해 안정적인 실험 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 또한, 단백질 공학 기술을 활용하여 야생형 형광 단백질과 다른 파장의 빛을 방출하도록 개량된 적색의 RFP, 노란색의 YFP, 청록색의 CFP, 청색의 BFP 등을 조합하여 활용하는 경우에는 여러 현상들을 동시에 관찰할 수 있으며, 다른 파장의 빛을 방출하는 형광 단백질들이 인접하거나 융합된 형태로 발현되었을 때 일어나는 FRET 현상을 활용하여 시료 내 특정 물질의 존재 여부 탐색, 단백질간의 상호작용 관찰 등의 연구 목적에 다양하게 활용 될 수 있는 장점을 갖는다.
그러나, 상기 GPF, YFP 및 CFP의 경우 조사하는 빛의 파장이 유사해 단일 파장의 빛을 이용하여 여러 파장의 형광을 동시에 측정할 수 있는 장점이 있으나, 방출되는 빛의 파장도가 GFP와 유사해 함께 사용하는 경우 각각의 형광을 측정하기 위해서는 고가의 장비가 필요한 단점이 있다. 또한, GFP 골격(scaffold)을 지닌 모든 단백질의 경우, 형광단을 구성하는 시간(maturation time)이 필요하여 발현 시점에서부터의 관찰이 어려운 단점과 구조형성에 산소가 필요하기 때문에 무산소(anoxic) 환경에서 활용하기 어려운 단점, 산화과정에서 생산되는 활성산소(ROS)가 생체 물질(지방산, 아미노산, 단백질, 핵산)에 대한 잠재적인 독성을 지닌다는 문제점들로 인해 활용 범위가 크게 제한되고 있다.
한편, 형광 공명 에너지 전이란, 단파장 형광 단백질(shorter wavelength dye)인 에너지 공여체(donor)가 외부에서 에너지를 흡수하면 공여체의 여기에너지가 빛 에너지로 방출되는 대신, 소정의 거리 안에 위치한(<10 nm) 장파장 형광 단백질(longer wavelength excitation dye)인 에너지 수용체(acceptor)로 발광없이(radiationless) 전달되어, 수용체의 장파장 형광만이 방출되는 현상을 말한다. Miyawaki 등(Miyawaki et al., Nature, 1997, 388:882-887)은 FRET 원리를 이용하여 칼모둘린(calmodulin)과 칼모둘린 결합 펩티드(calmodulin-binding peptide)간의 상호작용을 분석하면서, 새로운 개념의 단백질 상호작용 분석 시스템을 개발하였다. 형광 단백질은 서로 다른 고유한 파장 영역의 빛을 흡수하여 여기(excitation)되며, 그 에너지가 빛 또는 열로 발산되고 나면 기저 상태로 회복되면서 형광단백질 마다 독특한 파장대의 빛을 발산(emission)하게 된다. 형광 공명에너지 전이 원리는 서로 다른 두 형광단백질이 10 내지 100 Å 내에 있을 경우, 단파장 형광단백질이 여기된 후 방출하는 빛이 장파장 형광단백질의 여기를 유도하여 형광을 발산하는 현상이다. 즉 상호작용을 알아보고자 하는 두 단백질 뒤에 서로 다른 두 형광단백질을 각각 부착시킨 후, 단백질 상호작용에 의해 두 형광단백질이 10 내지 100 Å 이내로 가까워졌을 때 일어나는 형광 공명에너지 전이 현상에 의한 형광을 탐지함으로써 단백질 상호작용을 분석할 수 있는 것이다. 예를 들면, 488 nm 파장의 빛으로 여기되는 형광단백질은 520 nm 파장대의 형광을 발산하게 되며, 이는 다시 짝을 이룬 다른 형광단백질을 자극하는 파장으로 작용하게 되고 630 nm 파장대의 형광을 발산하게 된다. 따라서 488 nm로 여기시키고 630 nm 파장대의 형광을 탐지함으로써 두 단백질의 상호작용을 분석할 수 있다. 이 시스템은 살아있는 세포내에서 단백질의 동적인 상호작용 분석이 가능한 장점이 있지만, 두 형광단백질의 거리가 매우 가까이 있어야만 탐지가 가능하고 미묘한 형광 파장의 변화를 감지하기 위해서는 단백질의 과량발현이 필요한 경우가 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 최근 단백질 고유 형광을 이용하려는 연구가 진행되어 아미노산 중 하나인 트립토판을 FRET에 응용할 수 있음이 보고되었고(Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4562-4588), 트립토판 결합 도메인 및 이를 검출할 수 있는 형광 부분을 이용하여 FRET를 측정하는 다중결합 트립토판 바이오센서 기술이 알려져 있다(미국공개특허 제2008/0311047호).
그러나, 현재까지 알려진 단백질 고유 형광을 이용한 FRET 기술에 사용되는 탐침들은 단백질 자체와 형광 분자의 발광 파장이 서로 중첩되어 불필요한 신호가 측정되어지고, 이로 인해 측정 결과의 민감도와 특이성이 저해되는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 기존의 광범위하게 활용되고 있는 탐침 시스템들이 갖는 근본적인 문제를 해결하고자 지속적인 연구를 수행한 결과, 단백질 고유 형광을 이용하는 새로운 형광 분자들을 확인하고, 이들을 표적 단백질 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자와 결합한 탐침 시스템들을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 다양한 후보군에서 수득하여 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 제조하는 제1단계; 상기 표적 단백질에 제1단계에서 제조된 iFRET용 탐침을 처리하는 제2단계; 및 표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 발광하는 iFRET용 탐침을 확인하는 제3단계를 포함하여, 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 검색하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 다양한 후보군에서 수득하여 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 제1 형광분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 제1 iFRET용 탐침을 제조하는 제1단계; 상기 표적 단백질에 제1 iFRET용 탐침을 처리하는 제2단계; 표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 발광하는 제1 iFRET용 탐침을 확인하는 제3단계; 및 상기 제3단계에서 발광하는 제1 iFRET용 탐침을 구성하는, 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 단백질의 고유 형광에대한 받게 기능을 갖는 제2 형광분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 제2 iFRET용 탐침을 제조하는 제4단계를 포함하여 iFRET용 탐침을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 iFRET 받게(acceptor)기능을 갖는 형광분자로 하기 화학식 I 내지 XXII로 이루어진 군으로부터 선택되어진 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 iFRET용 탐침을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 iFRET 받게(acceptor)기능을 갖는 형광분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 iFRET용 탐침으로서, FRET 효율이 50%가 되는 형광공여체와 형광수용체 사이의 거리인 R0값이 1 내지 4 nm인 것이 특징인 iFRET용 탐침을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의해 제조된 제2 iFRET용 탐침 또는 상기 기재된 iFRET용 탐침을, 표적 단백질이 함유된 샘플 내에 첨가하는 제1단계; 및 표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적하는 제2단계를 포함하여, iFRET 에 의해 표적 단백질을 이미지화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조 방법에 따른 하기 화학식 XXIII, XXIV, 또는 XXVI 내지 XXXII로 구성된 군으로부터 선택된 화학식으로 표시되는 화합물 및 이의 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 하나의 목적은 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법으로서, 상기 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이고, 상기 iFRET용 탐침을 표적 단백질이 함유된 시료 내에 도입시키는 제1단계; 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 번갈아 제1단계에서 제조된 시료에 조사하는 제2단계; 및 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태는 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 다양한 후보군에서 수득하여 단백질의 고유 형광(intrinsicfluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 제조하는 제1단계; 상기 표적 단백질에 제1단계에서 제조된 iFRET용 탐침을 처리하는 제2단계; 및 표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 발광하는 iFRET용 탐침을 확인하는 제3단계를 포함하여, 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 검색하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "FRET"이란 서로 다른 발광 파장대의 두 형광물질 사이에서 발생하는 비방사성(non-radiative) 에너지 전이현상으로, 여기(excitation)된 상태의 형광 공여체의 여기 준위 에너지가 형광 받게로 전달되어 형광수용체로부터 발광 (emission)이 관찰되거나, 형광 공여체의 형광감소(quenching)가 관찰되는 현상을 의미한다(Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999).
FRET은 일반적으로 형광공여체로부터 방출되는 파장이 형광수용체의 흡광스펙트럼과 겹치며, 광자(photon)의 출현 없이 발생하기 때문에 공명에너지전이라 하고, 이는 형광공여체와 형광수용체 사이의 장거리쌍극자 상호작용에 의한 결과이다. FRET의 에너지전이 효율은 형광공여체의 발광스펙트럼과 형광수용체의 흡광스펙트럼이 겹치는 범위와 형광공여체의 양자효율, 형광공여체와 형광수용체의 전이쌍극자들(transition dipoles)의 상대적 방향(relative orientation), 그리고 형광공여체와 형광수용체 사이의 거리에 따라 달라진다. 따라서 FRET의 에너지전이 효율은 형광공여체와 형광수용체의 거리와 상대적 방향에 따라 다르게 나타나는데, Forster의 수식에 따르면 다음과 같이 표현된다.
[수식 1]
E = R0 6 / (R6 + R0 6)
상기의 수식에서 E는 FRET 효율을 나타내며, R은 형광공여체와 형광수용체 사이의 거리로서 형광 물질에 따라 차이는 있지만 통상 2 내지 9 nm 이내로 정의된다. 또한 R0는 FRET 효율이 50%가 되는 형광공여체와 형광수용체 사이의 거리를 말하며, 일반적으로 Forster distance 또는 Forster radius로 불려진다. R0는 다음의 수식으로 표현된다.
[수식 2]
R0 = 0.211[k 2 n -4 Q D J(λ)]1/6 (in Å)
상기의 수식에서 k 2 는 방향계수(orientation factor)로 통상 2/3로 계산하며, 형광공여체 발광과 형광수용체 흡광의 상대적 방향에 따라 0 내지 4 범위의 값을 갖는다. n은 매질의 굴절율로 통상 25℃의 물은 약 1.334이며, Qn는 형광공여체의 양자효율이다. J(λ)는 형광공여체의 발광과 형광수용체의 흡광스펙트럼상의 겹침(overlap) 정도로 M-1cm-1nm4의 단위 값을 갖는다(Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999; Patterson et al., Anal. Biochem. 284: 438, 2000; Patterson et al., J. of Cell Sci. 114: 837, 2001).
본 발명에서 "형광 공여체"는 단백질의 고유 형광을 발휘하는데 관여하는 아미노산이다. 대부분의 단백질은 고유 형광(intrinsic fluorescence)을 발휘하는데, 이때 방향족고리 구조를 갖는 아미노산들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 그 예로는 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 페닐알라닌(Phenylalanine)이 있다. 이러한 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌은 260 내지 300 nm 파장의 빛에 의해 여기되어 290 내지 400 nm의 파장의 빛을 발광하고, 그 빛이 440 nm 파장까지 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 "형광 받게" 및 "형광 수용체"는 혼용하여 사용되며, 단백질의 고유 형광에 의해 여기되어 발광하는 형광분자를 의미한다.
본 발명에 따른 iFRET용 탐침은, 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자(이하 '결합분자'로 약칭함)와 iFRET 받게 기능을 갖는 형광분자를 포함하며, 상기 결합분자와 형광분자가 직접 또는 링커를 통해 결합되어 있다.
상기 결합분자 부위는 iFRET용 탐침이 표적 단백질에 특이적인 결합을 하도록 유도한다.
본 발명에서 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자는 2개 이상의 표적 단백질들에 공통적으로 결합하는 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자도 포함한다.
상기 결합분자는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 공지 화합물일 수 있으며, 본 발명에 따른 결합분자 검색 방법에 의해 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자가 다양한 후보군에서 선별될 수 있다.
본 발명에 따른 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 형광분자는 상기 단백질의 고유 형광을 나타내는 아미노산인 트립토판, 티로신 및/또는 페닐알라닌의 발광 파장인 300 내지 400 nm의 빛에 의해 여기되는 것이 바람직하고, 단백질 고유 형광과 분리되는 파장인 450 nm 이상의 발광 파장을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
한편, iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적시 iFRET용 탐침이 발광하는 모든 영역의 파장대를 측정할 수 있으나, iFRET용 탐침이 방출하는 빛 중 450nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 측정하는 것이 바람직하다. 세포 혹은 조직(tissue)에는 260 내지 400 nm의 빛에 의하여 형광을 내는 세포자가형광(cellular autofluorescence)물질인 핵산, NAD(P)H나 콜라겐, 혹은 세포단백질 등이 존재하며, 이들이 생성하는 형광 발광파장이 주로 300 내지 450 nm에 걸쳐 존재한다. 따라서, 본 발명의 iFRET용 탐침은 세포 이미징에 사용되거나 세포추출물 혹은 조직염색(tissue staining)에 사용될 경우 이들의 간섭을 피하기 위하여 본 발명의 iFRET용 탐침은 발광영역이 450 nm 이상인 것이 바람직하다.
본 발명은 실험을 통해, 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자로 하기 표 1의 화학식 I 내지 XXII로 표시되는 화합물들을 확인하였다(실시예 1 내지 7 참조).
Figure 112012050614407-pat00001
Figure 112012050614407-pat00002
Figure 112012050614407-pat00003
화학식 I 내지 XXII로 표시되는 각 화합물의 유도체 및 이의 염은 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 형광 분자로 기능을 하는 한 본 발명의 범주에 속한다.
링커의 예로는 양말단에 적절한 기능단(-NH2, CO2H, -N3, -C≡C-, 등)을 가진 각종 알킬(-(CH2)n-), 아릴, 에틸렌글리콜(-(CH2CH2O)n-; n = 1 내지 20) 등이 있다. 상기 링커들은 형광물질과 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-질소 결합 등 가능한 모든 형태의 결합을 통하여 연결될 수 있다. 링커는 본 발명에 따른 iFRET용 탐침의 결합분자가 표적 단백질에 결합시 iFRET용 탐침의 형광분자가 결합부위 또는 근처에서 발산되는 표적 단백질의 고유 형광을 최대한도로 퀀칭할 수 있도록 배향시킬 수 있는 것이 바람직하다. 상기 링커는 표적 단백질에 결합분자를 결합시킨 후 3차원적 배향 시뮬레이션을 통해 적절히 디자인될 수 있다.
한편, 표적 단백질에 본 발명에 따른 iFRET용 탐침을 처리하는 경우, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 빛을 조사하여 발광하는 iFRET용 탐침을 확인하기 위해, 통상의 형광 물질 처리 조건을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 물, 완충용액, 탄소수 1 내지 6의 저급알콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매 내, 혹은 바이오칩이나 (극)미세입자 상, 혹은 세포나 조직(tissue)에서 수행되어질 수 있다.
표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 UV영역의 빛을 조사하여 발광하는 iFRET용 탐침을 확인하기 위해, 동일자로 출원된 본 발명자의 한국출원(iFRET용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징방법)에 기재된 현미경 장치를 사용할 수 있으나, 통상의 형광 측정법이 이용되어질 수 있으며, 예컨대 형광 분석 장비를 이용할 수 있다. 형광분석장비로는 필터방식 및 모노크롬 방식의 형광분광기 등이 있다. 상기 동일자 한국출원은 본 발명의 명세서 일부로 통합된다.
본 발명에 따른 표적 단백질에 특이적인 결합분자 검색 방법에 의해 확인된, 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자는 상기 표적 단백질이 관여하는 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 물질 또는 이의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명의 제2양태는 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 다양한 후보군에서 수득하여 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 제1 형광분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 제1 iFRET용 탐침을 제조하는 제1단계; 상기 표적 단백질에 제1 iFRET용 탐침을 처리하는 제2단계; 표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 발광하는 제1 iFRET용 탐침을 확인하는 제3단계; 및 상기 제3단계에서 발광하는 제1 iFRET용 탐침을 구성하는, 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 제2 형광분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 제2 iFRET용 탐침을 제조하는 제4단계를 포함하여 iFRET용 탐침을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2양태에서 제1단계 내지 제3단계에 대한 설명은 본 발명의 제1양태에서 설명한 제1단계 내지 제3단계와 대동소이하다.
본 발명의 제2양태에서 제4단계는 제3단계로부터 얻어진 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 제2 형광분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 제2 FRET용 탐침을 제조하는 단계로서, 본 발명에 따라 표적 단백질에 특이적인 결합분자를 검색하기 위해 사용된 제1 iFRET용 탐침의 제1 형광분자 및 제2 iFRET용 탐침의 제2 형광분자는 동일 또는 상이할 수 있다.
상기 표적 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 제1형광분자 및 제2형광분자는 각각 독립적으로 단백질의 고유 형광을 나타내는 아미노산인 트립토판, 티로신 및/또는 페닐알라닌의 발광 파장인 300 내지 400 nm의 빛에 의해 여기되는 것이 바람직하고, 단백질 고유 형광과 분리되는 파장인 450 nm 이상의 발광 파장을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
상기 제1형광분자 및 제2형광분자는 각각 독립적으로 상기 표 1의 화학식 I 내지 XXII로 표시되는 화합물들 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 제3양태는 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 iFRET 받게(acceptor)기능을 갖는 형광분자로 상기 화학식 I 내지 XXII로 이루어진 군으로부터 선택되어진 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 iFRET용 탐침을 제공한다.
상기 본 발명의 iFRET용 탐침은 450nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 방출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제4양태는 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 iFRET 받게(acceptor)기능을 갖는 형광분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 iFRET용 탐침으로서, FRET 효율이 50%가 되는 형광공여체와 형광수용체 사이의 거리인 R0값이 1 내지 4 nm인 것이 특징인 iFRET용 탐침을 제공한다.
종래 일반적인 FRET 쌍에 대한 R0 값은 약 5 nm 이상인 것에 반면, 본 발명에 의한 iFRET 탐침은 표적 단백질 내의 Trp 등의 형광공여체와 1 내지 4 nm의 R0 값을 가지도록 고안될 수 있다. 따라서, 본 발명의 iFRET 탐침은 일반적인 FRET 탐침에 비해 표적 단백질 내의 형광공여체에 근접하였을 때 즉, 약 2 nm 내외의 거리에 위치할 때 검출 가능하므로 일반적인 FRET 검출에서 발생할 수 있는 저분자물질의 비특이적 결합에 의한 노이즈 발생 가능성을 배제할 수 있다.
또한, 본 발명의 제5양태는 신규화합물로 하기 화학식 XXIII, XXIV, 또는 XXVI 내지 XXXII로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 제공한다.
[화학식 XXIII]
Figure 112012050614407-pat00004
[화학식 XXIV]
Figure 112012050614407-pat00005
[화학식 XXVI]
Figure 112012050614407-pat00006
[화학식 XXVII]
Figure 112012050614407-pat00007
[화학식 XXVIII]
Figure 112012050614407-pat00008
[화학식 XXIX]
Figure 112012050614407-pat00009
[화학식 XXX]
Figure 112012050614407-pat00010
[화학식 XXXI]
Figure 112012050614407-pat00011
[화학식 XXXII]
Figure 112012050614407-pat00012
상기 화학식 XXIII, XXIX, XXX, XXXI 또는 XXXII로 표시되는 화합물 또는 이의 염; 화학식 XXVI, XXVII 또는 XXVIII로 표시되는 화합물 또는 이의 염; 및 화학식 XXIV로 표시되는 화합물 또는 이의 염은 각각 캐스파제-3(Caspase-3), 스트렙트아비딘(Streptavidin) 및 HSP90(heat shock protein 90)을 표적 단백질로 하는 iFRET용 탐침으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 화학식 XXIII 내지 XXXII으로 표시되는 화합물의 유도체도 본 발명의 범주에 속한다.
상기 화학식 XXIII으로 표시되는 화합물 또는 이의 염; 및 화학식 XXIV로 표시되는 화합물 또는 이의 염은 하기 화학식 I의 1-나프틸에틸렌디아민(1-naphthylethylenediamine)이 형광분자로 사용되고, 각각 표적 단백질 캐스파제-3(Caspase-3) 및 HSP90에 결합할 수 있는 결합분자가 상기 형광분자에 직접 또는 링커를 통해 결합된 것으로, 캐스파제-3(Caspase-3) 및 HSP90에 특이적인 iFRET용 탐침으로 사용될 수 있다.
[화학식 I]
Figure 112012050614407-pat00013
상기 화학식 XXVI, XXVII 또는 XXVIII로 표시되는 화합물 또는 이의 염은 각각 하기 화학식 XII의 하이드록시쿠마린 아세트산(hydroxycumarin acetic acid), 하기 화학식 IX의 하이드록시쿠마린 아크릴산(hydroxycumarin acrylic acid) 및 하기 화학식 XXI의 디메틸아미도쿠마린 아세트산(dimethylcumarin acetic acid)이 형광분자로 사용되고, 표적 단백질인 스트렙트아비딘에 특이적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합분자로서 상기 형광분자에 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이다. 따라서, 상기 화학식 XXVI, XXVII 또는 XXVIII로 표시되는 화합물 또는 이의 염은 스트렙트아비딘에 특이적인 iFRET용 탐침으로 사용될 수 있다.
[화학식 XII]
Figure 112012050614407-pat00014
[화학식 IX]
Figure 112012050614407-pat00015
[화학식 XXI]
Figure 112012050614407-pat00016
상기 화학식 XXIX, XXX, XXXI 또는 XXXII로 표시되는 화합물 또는 이의 염은 상기 화학식 I의 1-나프틸에틸렌디아민(XXXI 및 XXXII) 또는 화학식 XII의 하이드록시쿠마린 아세트산(XXIX 및 XXX)이 형광분자로 사용되고, 표적 단백질인 캐스파제-3에 특이적으로 결합할 수 있는 Asp-L-Glu-L-Val-Asp-(ketone)-CF3(XXIX 및 XXXI) 또는 Asp(CO2Me)-L-Glu(CO2Me)-L-Val-Asp(CO2Me)-(ketone)-CF3(XXX 및 XXXII)이 결합분자로서 상기 형광분자에 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이다. 따라서, 상기 화학식 XXIX, XXX, XXXI 또는 XXXII로 표시되는 화합물 또는 이의 염은 캐스파제-3에 특이적인 iFRET용 탐침으로 사용될 수 있다.
일반적으로 형광체의 경우 여기(absorbance) 파장과 발광(emission) 파장대가 높을수록, 즉, 낮은 에너지로 여기가 가능할수록 보다 저렴한 형태의 광원을 선택할 수 있어 측정 장비들을 경제적으로 제작할 수 있게 된다. 또한, 세포의 자가형광(autofluorescence)과 형광체의 발광 파장이 서로 중복되지 않도록 형광체의 감도를 높이기 위해서는 발광 파장이 자가 파장과 서로 중복되지 않는 형광체의 개발이 매우 중요하다.
상기 화학식 I의 1-나프틸에틸렌디아민(1-naphthylethylenediamine)은 LED(light-emitting diode)에 효과적으로 검출 가능하여 형광탐침자로 사용될 수 있으며, 여기 파장이 340 nm 내지 380 nm이고, 발광 파장이 400 nm 내지 600 nm이므로 공지된 형광체와 비교하여 발광(emission) 파장대가 높아 세포의 자가 형광과 분리되어 측정될 수 있는 형광분자이다.
본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 이의 염 및 용해성 화합물로 제조될 수 있다.
염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과같은 수혼화성 유기용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 제조할 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예를 들어, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 화학식 XXIII, XXIV, 또는 XXVI 내지 XXXII의 화합물의 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 XXIII, XXIV, 또는 XXVI 내지 XXXII의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들면, 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 염으로는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 제6양태는 상기 본 발명의 제2양태에 따라 제조된 제2 iFRET용 탐침 또는 상기 본 발명의 제3양태에 따른 iFRET용 탐침을, 표적 단백질이 함유된 샘플 내에 첨가하는 제1단계; 및 표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적하는 제2단계를 포함하여, iFRET 에 의해 표적 단백질을 검출 또는 이미지화하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제7양태는 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법으로서, 상기 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이고, 상기 iFRET용 탐침을 표적 단백질이 함유된 시료 내에 도입시키는 제1단계; 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 번갈아 제1단계에서 제조된 시료에 조사하는 제2단계; 및 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인 방법을 제공한다.
본 발명에서 "시료" 또는 "샘플"이란, 표적 단백질을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 표적 단백질 자체, 세포, 혈액, 뇨, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내, 동식물 조직 및 생물체 자체 중 어느 하나 이상에서 수집된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 시료 또는 샘플은 표적 단백질을 함유하는 물, 완충용액, 탄소수 1 내지 6의 저급알콜, 또는 이들의 혼합물, 바이오칩이나 (극)미세입자 상일 수 있다.
본 발명의 제7양태는 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을, 표적 단백질 및 이에 결합된 iFRET용 탐침이 함유된 시료에 번갈아 조사하는 것이 특징이다.
iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광은 표적 단백질 내 아미노산을 여기하지 아니하고 iFRET용 탐침의 형광분자를 직접 여기시키는 광이다.
본 발명의 제7양태에서는, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출할 수 있다.
제3 발광 신호값은 측정시료(예: 세포, 검액 등)에 존재하는 iFRET용 탐침 (제2 발광 신호값)의 양에 대한 표적 단백질에 결합한 iFRET용 탐침의 양(제1 발광 신호값)의 비로서, 측정의 시간적 공간적 변화에 관계없이 늘 기준값(제2 발광 신호값)이 제공되어 표적 단백질과 iFRET용 탐침의 결합을 정량화하는 것을 가능하게 한다. 또한, 비율계량법(ratiometric measurement)을 사용하면, 시료에 조사되는 빛의 량이 변해도 보정가능하다.
제3 발광 신호값은 다음과 같은 식에 의하여 계산될 수 있다.
[수식 3]
제3 발광 신호값 = 제1 발광 신호값 ÷ 제2 발광 신호값
비율 계량법에 따라 제2 발광 신호값을 기준값(reference)으로 사용하여 제1 발광 신호값의 세기를 제3 발광 신호값으로 환산함으로써, iFRET용 탐침의 편재화(localization)에 따른 측정오차를 최소화하며, 선명한 이미지를 얻을 수 있어서, 표적 단백질의 양과 표적 단백질에 대한 약물결합의 정량적 측정, 표적 단백질의 공간적 이동 추적 등이 가능하다.
제3 발광 신호값은 기존의 비율계량법(ratiometric measurement) 소프트웨어를 사용하여 계산될 수 있다.
한편, iFRET용 탐침은, 표적 단백질에 특이적인 결합 분자와 iFRET 받게 기능을 갖는 형광분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것으로, 상기 결합분자 부위는 iFRET용 탐침이 표적 단백질에 특이적인 결합을 하도록 유도하여, iFRET을 통해 표적 단백질의 정량이 가능하게 할 뿐만 아니라, iFRET용 탐침이 표적 단백질과 함께 이동하게 하여 표적 단백질의 거동을 확인할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 제7양태에 따른 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법에서, 제1 발광 신호값, 제2 발광 신호값 및 제3 발광 신호값은 시료의 2차원 각 지점에 대응되는 2차원적인 영상값일 수 있다.
본 발명의 제7양태에서, 제1광의 파장 범위는 260㎚ 내지 300㎚이고, 제2광의 파장 범위는 300㎚ 내지 400㎚인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 제7양태에서, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 일정한 시간 간격으로 번갈아 조사하면, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값(A1, A2, A3,…)과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값(B1, B2, B3,…)으로부터 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값(C1, C2, C3,…)이 일정한 시간 간격으로 산출되고 축적되어, 시간에 따른 표적 단백질의 위치, 양 또는 둘다의 변화를 확인할 수 있다.
이로부터, 시간에 따른 표적 단백질의 세포내 위치와 공간적 이동, 양적변화, 활성변화, 약물의 결합정도, 또는 상기한 모든 변화를 확인할 수 있다. 또한, 시간에 따른 표적 단백질의 변화는 동영상으로 산출될 수 있다.
본 발명의 제6양태 또는 제7양태에 따른 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법에 의해, 표적 단백질의 양 또는 표적 단백질의 활성을 측정하거나, 표적 단백질의 작용기전 또는 이동 경로를 추적할 수 있다.
본 발명의 제6양태 또는 제7양태에 따른 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법은, 표적 단백질의 기능을 확인하거나, 다양한 검체로부터 질병관련 표적 단백질을 검출하는 방법으로 이용하여 질병진단하거나, 식품, 사료, 음료에서 미생물 혹은 미생물 유래 표적 단백질을 검출하는 방법으로 사용될 수 있다.
한편, 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적시 iFRET용 탐침이 발광하는 모든 영역의 파장대를 측정할 수 있으나, iFRET용 탐침이 방출하는 빛 중 450 nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 측정하는 것이 바람직하다. 세포 혹은 조직(tissue)에는 260 내지 400 nm의 빛에 의하여 형광을 내는 세포자가형광(cellular autofluorescence)물질인 핵산, NAD(P)H나 콜라겐, 혹은 세포단백질 등이 존재하며, 이들이 생성하는 형광발광파장이 주로 300 내지 450 nm에 걸쳐 존재한다. 따라서, 본 발명의 iFRET용 탐침은 세포 이미징에 사용되거나 세포추출물 혹은 조직염색(tissue staining)에 사용될 경우 이들의 간섭을 피하기 위하여 본 발명의 iFRET용 탐침은 발광영역이 450 nm 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 제6양태 또는 제7양태에 따른 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법은 상기 iFRET용 탐침과 병용하여 특정 물질을 샘플 내에 첨가하고 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 빛을 조사하여 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적하는 단계를 더 포함하고, 특정 물질의 존재 여부에 따라, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 빛을 조사하여 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛의 변화를 확인하여, 표적 단백질에 대해 소정의 기능을 갖는 특정 물질을 스크리닝하거나 상기 특정 물질의 표적 단백질에 대한 기능을 확인하는데에도 응용될 수 있다.
이때, 상기 방법에 의해 확인된 특정 물질은 표적 단백질과 관련된 질환을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약물 또는 식품 첨가제로 사용될 수 있다.
본 발명의 제6양태 또는 제7양태에 따른 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법은 형광 현미경을 이용한 이미지화 및 신속 형광 면역크로마토그래피 등의 통상의 형광 이미지화 방법을 통해 수행되어질 수 있으나, 자동화 워크스테이션에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 iFRET용 탐침은 기존의 FRET 방법과 달리 단백질 내의 아미노산을 형광 공여체로 사용하므로 표적 단백질에 인위적인 표지(형광단백질 등)가 필요 없을 뿐 아니라, 하나의 형광물질만 사용되여도 되고, 단백질고유 형광과 분리된 발광파장을 가지므로 높은 특이성과 민감도를 가져, 다양한 단백질의 양, 활성 및 기작 등을 보다 쉽고 정확하게 분석할 수 있으며, 상기 표적 단백질과 관련된 질병의 진단 및 치료제의 개발에 이용할 수 있다.
도 1은 화학식 XXIII의 화합물이 iFRET을 발휘하는 작용기전에 대한 모식도이다.
도 2는 화학식 XXIV의 화합물이 iFRET을 발휘하는 작용기전에 대한 모식도이다.
도 3 내지 도 15은 본 발명의 형광분자, 즉 화학식 I 내지 XXII로 표시되는 화합물들의 형광특성을 보여주는 그래프이다.
도 16는 본 발명에 따른 화학식 XXIII의 화합물을 이용한 캐스파제-3의 검출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 화합물 XXIV 형광특성 스펙트럼결과이다.
도 18은 화합물 XXIV와 HSP90(heat shock protein 90) 단백질을 이용하여 IFRET 시그널을 검출한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19은 화학식 XXIV의 화합물을 이용한 HSP90의 검출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 HSP90와 결합하는 것으로 알려진 geldanamycin과 PU-H64를 이용한 competition assay로서, 결합경쟁자 존재 여부에 따른 경쟁 화합물 XXIV와 HSP90 단백질의 iFRET 시그널 변화를 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명에 따른 화학식 XXIV의 화합물을 이용한 HSP90의 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 본 발명에 따른 화학식 XXIII의 화합물의 질량분석 그래프이다.
도 23은 본 발명에 따른 화학식 XXV의 화합물을 iFRET용 탐침으로 이용하여 스트렙트아비딘을 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 본 발명에 따른 화학식 XXVI의 화합물을 iFRET용 탐침으로 이용하여 스트렙트아비딘을 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 본 발명에 따른 화학식 XXVII의 화합물을 iFRET용 탐침으로 이용하여 스트렙트아비딘을 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 본 발명에 따른 화학식 XXVIII의 화합물을 iFRET용 탐침으로 이용하여 스트렙트아비딘을 검출한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< iFRET 탐침용 형광분자의 제조 >
실시예 1: 화학식 II 의 제조방법
Figure 112012050614407-pat00017

메틸 -3-( 메틸아미노 ) 아크릴레이트 (1)의 합성
0℃에서 2 M 메틸아민-테트라하이드로퓨란 용액(2 M methylamine in THF)(12.8 ㎖)을 메틸프로피올레이트(methyl propiolate, 2.89 ㎖)와 THF(15 ㎖)용액에 적가하고 상온에서 8 시간 교반하였다. 휘발성용매와 메틸프로피올레이트를 감압유거 후 진공 건조하여 2.2 g(수율: 81%)의 화합물 1을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.648-7.574(b.s,1H), 6.621-6.568(q,1H), 4.483-4.468(d,1H), 3.654(s,3H), 2.971-2.957(d,2H).
메틸 1,4,4- 트라이메틸 -1,4- 디히드로피리딘 -3- 카르복실레이트(II)의 합성
화합물 1(2.1 g), 3-메틸-2-부텐날(3-methyl-2-butenal, 1.04 ㎖), 무수황산나트륨(sodium sulfate, anhydrous, 3 g), 스칸디움트라이플루오르메탄술폰네이트(scandium triflate, 267 mg)을 디클로로메탄(dichloromethane, 80 ㎖)에 현탁한 후 상온에서 24 시간 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(에틸아세테이드:헥산=3:7)로 정제하여 470 mg(수율: 14%)의 화합물 II를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.031-7.027(d,1H), 5.592-5.568(q,1H), 4.481-4.462(d,1H), 3.657(s,3H), 2.963(s,3H), 1.341(s,6H).
실시예 2: 화학식 III 및 IV 의 제조방법
Figure 112012050614407-pat00018

디메틸 피리딘-3,5- 디카르복실레이트(2)의 합성
피리딘-3,5-디카르복실산(pyridine-3,5-dicarboxylic acid, 7.94 g), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC, 20 g)와 2.2 g의 4-디메틸아미노피리딘((4-dimethyl amino)pyridine, DMAP)을 메탄올(150 ㎖)에 가한 후 상온에서 10 시간 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 디클로로메탄으로 희석한 후 10% 시트르산 수용액으로 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘(anhydrous MgSO4)으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후 잔류물을 진공 건조하여 8.2 g(수율: 88%)의 화합물 2를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.418(s,2H), 8.920(s,1H), 4.046(s,3H).
3,5- bis ( 메톡시카보닐 )-1- 메틸피리디니움(3)의 합성
화합물 2(8.1 g)의 아세톤용액(40 ㎖)에 요오도메틸(methyl iodide, 7.77 ㎖)을 가한 후 20 시간 환류·교반하였다. 반응물을 상온으로 식히고 용매를 감압유거 후 형성된 결정성 목적물을 아세톤으로 3회 세척한 후, 진공 건조하여 13.2 g(수율: 95%)의 화합물 3을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO): 9.773(s,2H), 9.119(s,1H), 4.500(s,2H), 4.020(s,6H).
디메틸 1- 메틸 -1,4- 디히드로피리딘 -3,5- 디카르복실레이트(III)의 합성
0℃, 아르곤 기류하에서 화합물 3(13.2 g) 수용액(50 ㎖)을 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, 16.5 g)과 아황산수소나트륨(sodium hydrosulfite, 20.5 g) 수용액(150 ㎖)에 적가하였다. 반응액을 상온에서 3 시간 교반 후 디클로로메탄으로 생성물을 추출하였다. 추출액을 감압농축 후 진공 건조하여 6.92 g(수율: 84%)의 화합물 III을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 6.918(s,1H), 3.722(s,6H), 3.191(s,2H), 3.108(s,3H).
5-( 메톡시카보닐 )-1- 메틸 -1,4- 디히드로피리딘 -3- 카르복실산 ( IV )의 합성
화합물 III(6 g)을 1 N 수산화리튬 수용액(lithium hydroxide solution, 40 ㎖), THF용액(250 ㎖), 메탄올(150 ㎖)에 녹인 후 상온에서 24 시간 교반하였다. 반응물을 1 N 염산 수용액(hydrochloric acid solution)으로 산성화 후, 에틸아세테이트로 3번 추출하였다. 유기층을 수용액으로 3번, 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=10:1)로 정제하여 3.5 g(수율: 62.5%) 화합물 IV을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.015(s,2H), 3.672(s,3H), 3.105(s,2H), 3.067(s,3H).
실시예 3: 화학식 V의 제조방법
Figure 112012050614407-pat00019

N-(3- 메틸 - 2부텐닐리덴 )-1- 페닐메탄아민 (4)의 합성
벤질아민(benzylamine, 5.3 ㎖), 3-메틸-2-부텐날(3-methyl-2-butenal, 4.54 ㎖), 분자체(molecular sieve, 30 g)을 디클로로메탄(60 ㎖)에 가한 후 상온에서 12 시간 교반하였다. 분자체 제거 후 용액을 감압농축한 뒤, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(에틸아세테이드:헥산=1:1)로 정제하여 3.4 g(수율: 38%)의 화합물 4를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 8.302-8.261(d,1H), 7.336-7.192(m,5H), 6.089-6.040(d,1H), 4.627(s,2H), 1.918(s,3H), 1.864(s,3H).
메틸 1-벤질-2,4,4- 트라이메틸 -1,4- 디히드로피리딘 -3- 카복실레이트 (V)의 합성
화합물 4(1.73 g), 메틸-3-옥소부타노에이트(methyl-3-oxobutanoate, 1.08 ㎖), 요오드화리튬(lithium iodide, 134 mg)을 1,2-디메톡시에탄(1,2-dimethoxyethane, 15 ㎖)에 녹인 후 상온에서 24 시간 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(디에틸에테르:헥산=1:1)로 정제하여 200 mg(수율: 7.4%)의 화합물 V를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.355-7.330(m,2H), 7.268-7.259(m,1H), 7.213-7.200(d,2H), 5.781-5.768(d,1H), 4.478(s,3H), 4.195-4.159(q,2H), 1.957(s,3H), 1.311-1.274(t,9H).
실시예 4: 화학식 VI 및 VII 의 제조방법
Figure 112012050614407-pat00020

디메틸 1- 메틸 -4-(2- 메틸 -1- 프로펜닐 )-1,4- 디히드로피리딘 -3,5- 디카르복실레이트 ( VI )의 합성
화합물 1(2 g), 3-메틸-2-부텐날(2.5 ㎖), 무수황산나트륨(25 g), 염화철 6수화물(Iron(III) chloride hexahydrate, 235 mg)을 디클로로메탄(120 ㎖)에 현탁한 후 44 시간 환류 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(디클로로메탄:헥산=1:1)로 정제하여 26 mg (수율: 0.6%)의 화합물 VI을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.272(s,2H), 4.891-4.870(d,1H), 4.489-4.472(d,1H), 3.711(s,6H), 3.168(s,3H), 1.827(s,3H), 1.628(s,3H).
5-( 메톡시카보닐 )-1- 메틸 -4-(2- 메틸 -1- 프로펜닐 )-1,4- 디히드로피리딘 -3- 카르복실산 ( VII )의 합성
화합물 VI(19 mg)을 3N 수산화리튬 수용액(0.12 ㎖), THF(0.1 ㎖)용액, 메탄올(0.1 ㎖)에 녹인 후 상온에서 48 시간 교반하였다. 반응물을 1 N 염산 수용액(hydrochloric acid solution)으로 산성화 후, 에틸아세테이트로 3번 추출하였다. 유기층을 수용액으로 3번, 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(에틸아세테이트:헥산=3:7)로 정제하여 12 mg(수율: 67%)의 화합물 VII을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.121(s,1H), 7.025(s,1H), 4.898-4.880(q,1H), 4.469-4.453(d,1H), 3.673(s,3H), 3.183(s,3H), 1.811(s,3H), 1.629(s,3H).
실시예 5: 화학식 VIII 의 제조방법
Figure 112012050614407-pat00021

디메틸 4-(2- 메톡시 -2- 옥소에틸 )-1- 메틸 -1,4- 디히드로피리딘 -3,5-디카르복실레이트( VIII)의 합성
2 M 메틸아민-테트라하이드로퓨란용액(0.62 ㎖)을 2,2-디메톡시프로판(2,2-dimethoxy propane, 3.9 ㎖), 메탄올(1.3 ㎖), 메틸프로피올레이트(0.8 ㎖)와 스칸디움트라이플루오르메탄술폰네이트(78 mg)에 적가해주고, 18 시간 환류 교반하였다. 감압유거 후 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(에틸아세테이트:헥산=2:8)로 정제하여 24 mg(수율: 28%)의 화합물 VIII을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 7.120(s,2H), 4.200-4.165(t,1H), 3.793(s,6H), 3.599(s,3H), 3.180(s,3H), 2.467-2.449(d,2H).
실시예 6: 화학식 IX 내지 XI 의 제조방법
Figure 112012050614407-pat00022

메틸 3-(7- 하이드록시 -2-옥소-2 H - 크로멘 -3-일) 아크릴레이트 (X)의 합성
디메틸글루타코네이트(dimethyl glutaconate, 5.63 ㎖), 2,4-디히드록시벤즈알데하이드(2,4-dihydroxybenzaldehyde, 5 g), 피페리딘(piperidine, 0.36 ㎖)을 에탄올(100 ㎖)에 녹인 후 16 시간 환류 교반을 하였다. 반응물을 상온으로 식히고 용매를 감압유거 후 형성된 결정성 목적물을 에탄올으로 3회 세척한 후, 진공 건조하여 8.01 g(수율: 90%)의 화합물 X을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO): 8.445(s,1H), 7.833-7.806(d,1H), 7.614-7.600(d,1H), 7.124-7.097(d,1H), 6.893-6.881(d,1H), 6.774(s,1H), 3.77(s,3H).
3-(7-히드록시-2-옥소-2 H - 크로멘 -3-일)아크릴산 ( IX )의 합성
33% 브롬화수소-아세트산용액(33% hydrogen bromide in acetic acid)(150 ㎖)에 화합물 X(16 g)을 녹인 후 18 시간 환류 교반을 하였다. 반응물을 상온으로 식히고 용매를 감압유거 후 형성된 결정성 목적물을 수용액으로 3회 준 후, 진공 건조하여 13.5 g(수율: 90%)의 화합물 IX을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO): 8.413(s,1H), 7.587-7.566(d,1H), 7.486-7.446(d,1H), 6.862-6.860(dd,1H), 6.824-6.784(d,1H), 6.757(s,1H).
tert -부틸 2- 아미노에틸카바메이트 (5)의 합성
에틸렌디아민(ethylenediamine, 4 ㎖)의 디클로로메탄(140 ㎖)에 디터셔리부틸다이카보네이트(di-tert-butyl-dicarbonate, 2.2 g)의 디클로로메탄(20 ㎖)을 6 시간 적가한 후 상온에서 18 시간 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 디클로로메탄(dichloro methane)으로 희석한 후 2 M 탄산나트륨(2 M sodium carbonate solution)수용액으로 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 진공 건조하여 1.4 g(수율: 88%)의 화합물 5을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 5.01(br s,1H), 3.20-3.12(m,2H), 2.78(t,2H), 1.43(s,9H), 1.31(s,2H).
tert -부틸 2-(3-(7- 하이드록시 -2-옥소-2 H - 크로멘 -3-일) 아크릴아마이도 ) 에틸카바메이트 ( XI )의 합성
0℃에서 화합물 5(41 mg), 생성물 IX(50 mg), N,N-디아이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, 0.19 ㎖)을 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide,DMF, 1 ㎖)에 녹이고 15분 후 EDC(50 mg), 히드록시벤조트라이아졸(hydroxybenzotriazole, HOBt, 40 mg)을 가한 후 상온에서 20 시간 교반하였다. 감압농축한 후, 잔류물을 에틸아세테이트에 희석한 후 수용액과 10% 시트르산 수용액으로 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후 잔류물을 진공 건조하여 75 mg(수율: 91%)의 화합물 XI을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO): 8.252(s,2H), 7.584-7.563(d,1H), 7.305-7.267(d,1H), 6.847-6.842(d,1H), 6.826-6.820(q,2H,), 6.746(d,1H), 3.208-3.161(q,2H), 3.040-2.994(q,2H), 1.379(s,9H).
실시예 7: 화학식 XX 내지 XXII 의 제조방법
Figure 112012050614407-pat00023

에틸 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H- 크로멘 -4-일)아세테이트 ( XX )의 합성
3-(디메틸아미노)페놀((3-Dimethylamino)phnol, 6.86g), 디에틸-1,3-아세톤디카복실레이트(Diethyl-1,3-acetonedicarboxylate, 10 ㎖), 무수염화아연(anhydrous ZnCl2, 8.2g)를 에탄올(30 ㎖)에 녹인 후 12 시간 환류 교반하였다. 반응물과 4℃ 수용액에서 형성된 결정성 물질을 클로로포름과 디에틸에테르로 재결정한 후 진공 건조하여 3.4 g(수율: 25%)의 화합물 XX을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.415-7.393(d,1H), 6.633-6.604(dd,1H), 6.526-6.517(d,1H), 6.059(s,1H), 4.207-4.153(q,2H), 3.677(s,2H), 3.060(s,6H), 1.268-1.232(t,3H).
2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H- 크로멘 -4-일)아세트산 ( XXI )의 합성
0℃에서 화합물 XX(1 g)을 2 N 수산화리튬 수용액(3.6 ㎖), THF용액(4.5 ㎖), 메탄올(1.5 ㎖)에 녹인 후 상온에서 1 시간 교반하였다. 수용액 6 ㎖를 가한 후 디에틸에테르로 3번 세척하였다. 2 N 염산용액으로 수용액 층을 산성화한 후 형성된 결정성 물질을 진공 건조하여 760 mg(수율: 85%)의 화합물 XXI을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO): 12.798(bs,1H), 7.49-4.456(d,1H), 6.755-6.749(d,1H), 6.571(s,1H), 6.049(s,1H), 3.786(s,2H), 3.022(s,6H).
에틸 2-(7-( 디에틸아미노 )-2-옥소-2H- 크로멘 -4-일)아세테이트 ( XXII )의 합성
3-(디에틸아미노)페놀((3-Diethylamino)phnol, 100 mg), 디에틸-1,3-아세톤디카복실레이트(Diethyl-1,3-acetonedicarboxylate, 0.12 ㎖), 무수염화아연(anhydrous ZnCl2, 99 mg)를 에탄올(5 ㎖)에 녹인 후 12 시간 환류 교반하였다. 반응물과 4℃ 수용액에서 형성된 결정성 물질을 클로로포름과 디에틸에테르로 재결정한 후 진공 건조하여 17 mg(수율: 9.3%)의 화합물 XXII을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.477-7.454(d,1H), 6.806-6.778(dd,1H), 6.670(s,1H), 6.046(s,1H), 4.198-4.180(q,2H), 3.486-3.407(m,4H), 2.379(s,2H), 1.281-1.260(t,3H), 1.226-1.190(t,6H).
< 형광분자의 형광특성 실험 >
본 발명의 형광분자, 즉 화학식 I 내지 XXII로 표시되는 화합물들의 여기 파장 및 발광 파장은 표 1에 기재되어 있으며, 이들의 형광특성을 보여주는 그래프를 도 3 내지 도 15에 도시하였다.
실시예 8: 화학식 XXIII 의 제조 방법
Figure 112012050614407-pat00024
→→→
Figure 112012050614407-pat00025

형광분자로 화학식 I의 화합물(화합물 I)에 링커를 결합하여 형광체(A)를 합성하였다.
하기와 같은 과정을 통해, 캐스파제 활성을 억제하는 펩타이드 저해제인 DEVD-CHO를 형광체(A)에 결합하여 화학식 XXIII의 화합물을 제조하였다.
N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride 4 mM과 succinic anhydride 4.8 mM을 DMF 상에서 반응시켰으며, 이때 약 12 mM의 triethylamine을 염기로 사용하였다. 반응의 종결은 TLC를 이용하여 확인하였으며, 최종 생성물은 메탄올을 이용하여 재결정하여 분리하였으며, 분리된 물질은 질량분석하였다(도 22).
화학식 XXIII의 LC/MS:728.5 (M)
<화학식 XXIII 의 iFRET 탐침을 이용한 캐스파제 -3 단백질의 검출 및 활성 확인>
화학식 XXIII과 캐스파제 단백질을 이용하여 iFRET 시그널을 검출하였다. 캐스파제 단독으로 존재할 때는 280 nm 의 파장으로 여기시켰을 때 약 350 nm 파장에서 형광 값을 관찰할 수 있으며, 화학식 XXIII의 경우 280 nm 의 파장으로 여기 시켰을 때 약 445 nm에서 형광 값을 관찰 할 수 있었다.
도 16의 왼쪽 그림에서처럼 화학식 XXIII(DEVD-Dye로 표시됨)과 활성형 캐스파제가 혼합되면 캐스파제 혹은 화학식 XXIII이 단독으로 존재할 때의 그래프와는 다르게 350 nm 에서는 감소된 형광값을, 445 nm에서는 약 300% 이상의 증가된 형광 값을 확인할 수 있었다.
반면, 오른쪽 그림은 비활성형 캐스파제와 화학식 XXIII을 이용하여 280 nm의 파장으로 여기시켰을 경우인데, 이때는 iFRET 시그널을 관찰 할 수 없었다. 이는 iFRET 현상이 캐스파제와 화학식 XXIV의 선택적 결합에 의한 현상임을 증명하는 결과라 할 수 있다.
실시예 9: 화학식 XXIV 의 제조 방법
Figure 112012050614407-pat00026

에틸 3-(6-아미노-9 H -퓨린-9-일) 프로파노에이트 (6)의 합성
아데닌(adenine, 7 g), 나트륨(sodium, 52 mg), 에틸아크릴레이트(ethyl acrylate, 16.8 ㎖)을 에탄올(140 mL)에 가한 후 4 시간 환류 교반하였다. 용액을 감압농축 후 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 50:1→30:1→10:1)로 정제하였다. 에탄올으로 재결정하여 8.79 g(수율: 73%)의 화합물 6을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600MHz, CDCl3)(I): 8.36(s,1H,H-2), 7.90(s,1H,H-8), 5.60(b.s.,2H,NH2), 4.51-4.49 t,2H,CH2N), 4.15-4.11(q,2H,CH2), 2.94-2.92(t,2H,CH2CO), 1.23-1.21(t,3H,CH3).
5- 브로모 -6- 아이오도 -벤조[1,3] 디옥솔 (9)의 합성
5-브로모-벤조[1,3]디옥솔(5-bromo-benzo[1,3]dioxole, 1.5 g), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, 1.15 ㎖), N-요오드화숙신이미드(N-iodosuccinimide, 5.06 g)을 아세토나이트릴(acetonitrile, 23 ㎖)에 가한 후 상온에서 26 시간 교반하였다(암실조건). 감압농축 후 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(헥산)로 정제하여 2.126 g(수율: 88%)의 화합물 9를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO)(IA): 7.478(s,1H), 7.363(s,1H), 6.092(s,2H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)(IA): 7.26(s,1H), 7.10(s,1H), 5.99(s,2H).
에틸 3-(6-아미노-8- 브로모 -9 H -퓨린-9-일) 프로파노에이트 (7)의 합성
화합물 6(9.242g)을 아세테이트 버퍼(acetate buffer, 54 ㎖), 메탄올(6 ㎖), 디클로로메탄(15 ㎖)에 가한 후 브롬(bromine, 2.86 ㎖)을 10분 동안 적가하였다. 메탄올(10 ㎖)로 반응물의 고체화를 관찰 후, 과량의 메탄올을 가한 뒤 1 시간 교반하였다. 감압농축 후, 잔류물을 디클로로메탄과 소량의 메탄올 혼합용액으로 추출하였다. 유기층을 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 포화수용액으로 세척한 후 디클로로메탄으로 수용액 층의 목적물을 추출하였다. 유기층을 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄=100:1→50:1→40:1)로 정제하였다. 감압농축 후, 결정성 물질을 에틸아세테이트와 헥산으로 세척한 후 진공 건조하여 9.517 g(수율: 77%)의 화합물 7을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO)(II): 8.19(s,1H,H-2), 7.38(b.s.,2H,NH2), 4.38-4.36(t,2H,CH2N), 4.03-3.99(q,2H,CH2), 2.90-2.88(t,2H,CH2CO), 1.12-1.09(t,3H,CH3).
에틸 3-(6-아미노-8- 머캅토 -9 H -퓨린-9-일) 프로파노에이트 (8)의 합성
화합물 7(1 g)과 티오우레아(thiourea, 1.21 g)를 부탄올(n-butanol, 24 ㎖)에 가한 후 5 시간 환류 교반하였다. 반응물을 상온으로 식히고 용매를 감압유거 후 형성된 결정성 목적물을 메탄올으로 재결정 하였다. 진공 건조하여 0.661 g(수율: 75%)의 화합물 8을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO)(III): 12.35(s,1H,SH), 8.15(s,1H,H-2), 6.85(b.s.,2H,NH2), 4.37-4.34(t,2H,CH2N), 4.03-3.99(q,2H,CH2), 2.81-2.79(t,2H,CH2CO), 1.13-1.10(t,3H,CH3).
에틸 3-(6-아미노-8-(6- 브로모벤조[1,3]다이옥솔 -5- 일싸이오 )-9 H -퓨린-9-일)프로파노에이트( 10)의 합성 [2]
화합물 8(1.467 g), 화합물 9(2.81 g), 요오드화구리(copper iodide, 0.1067 g), 네오퀴프로인 수화물(neocuproine hydrate, 0.1156 g), 나트륨부톡사이드(sodium butoxide, 0.646 g)를 DMF(20 ㎖)에 녹인 후 25 시간 110℃에서 교반하였다. 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=200:1→100:1→50:1)로 정제하였다. 감압농축 후 형성된 결정성 목적물을 디클로로메탄과 헥산 혼합액으로 세척한 후 진공 건조하여 1.386 g(수율: 54%)의 화합물 10을 제조하였다.
생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO)(IV): 8.15(s,1H,H-2), 7.399(b.s.,2H,NH2), 7.35(s,1H,CHBr), 6.82(s,1H,CHS), 6.08(s,2H,OCH2O), 4.44-4.41(t,2H,CH2N), 4.02-3.97(q,4H,CH2O), 2.86-2.82(t,2H,CH2CO), 1.12-1.09(t,3H,CH3).
생성물의 구조는 13C-NMR을 통하여 확인하였다.
13C-NMR (400 MHz, DMSO)(IV): 14.459, 33.88, 40.025, 60.98, 103.29, 111.94, 113.68, 115.57, 120.24, 125.61, 143.86, 148.62, 149.09, 151.45, 153.71, 155.92, 170.85.
LC/MS: 466.3 (M+H,98%)
3-(6-아미노-8-(6- 브로모벤조[1,3]다이옥솔 -5- 일싸이오 )-9 H -퓨린-9일)프로피온산(11)의 합성
화합물 10(540 mg)을 THF(13 ㎖), 1 N 수산화리튬 수용액(32 ㎖), 메탄올(32 ㎖)에 녹인 후 상온에서 16 시간 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 소량의 수용액으로 희석한 후 1 N 염산 수용액(hydrochloric acid solution)으로 산성화하였다. 형성된 결정성 목적물을 수용액으로 세척한 후 진공 건조하여 397.4 mg(수율: 76%)의 화합물 11을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO)(V): 12.50(b.s,COOH), 8.15(s,1H,H-2), 7.42(bs,2H,NH2), 7.36(s,1H,CHBr), 6.84(s,1H,CHS), 6.09(s,2H,OCH2O), 4.40-4.38(t,2H,CH2N), 2.80-2.77(t,2H,CH2CO).
13C-NMR (400 MHz, DMSO)(V): 34.605, 40.48, 103.272, 112.157, 113.666, 115.812, 120.274, 125.628, 144.146, 148.600, 149.120, 151.384, 153.61, 155.859, 172.641.
LC/MS: 438.2 (M+H,98%)
3-(6-아미노-8-(6- 브로모벤조[1,3]디옥솔 -5- 일싸이오 )-9 H -퓨린-9-일)-N-(2-(나프탈렌-1- 일아미노 )에틸) 프로판아마이드 ( XXIV )의 합성
0℃에서 화합물 11(46 mg)과 N-(1-나프틸)에틸렌디아민 중염산염(N-(1-naphtyl)ethylenediamine hydrochloride, 30 mg)을 DMF(0.4 ㎖),THF(1.6 ㎖)에 녹인 후 교반하였다. HOBt(19 mg), EDC(24 mg)와 N,N-디아이소프로필에틸아민(0.054 ㎖)을 가한 후 상온에서 12 시간 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 디클로로메탄으로 희석한 후 수용액으로 3번 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=100:1→50:1→30:1)로 정제하여 40.3 mg(수율: 92%)의 화합물 XXIV를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO)(VI): 8.23-8.21(t,1H,NHCO), 8.15(s,1H,H-2), 8.07-8.05(d,1H,Ar), 7.74-7.73(d,1H,Ar), 7.43-7.364(m,4H,Ar+NH2), 7.33(s,1H,CHBr), 7.28-7.25(t,1H,Ar), 7.10-7.09(d,1H,Ar), 6.83(s,1H,CHS), 6.54-6.52(d,1H,Ar), 6.20-6.18(t,1H,NH), 6.07(s,2H,OCH2O), 4.44-4.42(t,2H,CH2N), 3.35-3.29(m,2H,CH2NH), 3.24-3.21(m.2H,CH2NH), 2.699-2.67(t,2H,CH2CO).
13C-NMR (400 MHz, DMSO)(VI): 35.455, 38.327, 40.84, 43.667, 103.24, 103.36, 112.208, 113.644, 115.812, 116.113, 120.303, 122.083, 123.577, 124.647, 125.731, 126.251, 127.482, 128.61, 134.689, 144.271, 144.469, 148.556, 149.069, 151.398, 153.537, 155.823, 170.378.
LC/MS:608.5 (M+H,98%)
References:
[1] JACS, 2000, 122, p.87-95
[2] WO 2008/ 115262
[3] JOC, 2005, 70, p.717-720
<화학식 XXIV 의 iFRET 탐침을 이용한 HSP 90( heat shock protein 90) 단백질의 검출 및 활성 확인>
합성된 화합물 XXIV의 형광특성을 분석하여 도 17에 도시하였다. 260, 280, 340, 360 nm에서 여기시킨 후 생성되는 형광스펙트럼을 관찰하였다. 280 nm 에서 여기시켰을 때보다 340 nm에서 여기시켰을 때 약 2배 정도 더 큰 형광값을 방출하였다.
도 18의 왼쪽 그림은 화합물 XXIV와 정제된 HSP90(heat shock protein 90) 단백질을 이용하여 iFRET 시그널을 검출한 결과이다. 화합물 XXIV는 DMSO에 녹인 뒤 증류수에 희석하여 최종농도 2 μM 이 되도록 사용하였다. 화합물 XXIV 단독으로 존재하거나 혹은 단백질만 존재할 때는 450 nm 부근에서 새로 생성되는 형광 값을 관찰할 수 없었다. 그러나 HSP90 단백질과 화합물 XXIV가 함께 존재할 때에만 약 450 nm 부근에서 새로운 형광 값을 관찰할 수 있으며, 이는 iFRET 현상에 의한 결과이다.
도 18의 오른쪽 그림은 화합물 XXIV와 정제된 HSP90 단백질, 또 대조군인 BSA(bovine serum albumin)를 이용하여 iFRET 시그널을 재검증한 결과이다. 화합물 XXIV는 2 μM, HSP90 단백질과 BSA 단백질은 최종 농도 200 nM이 되도록 사용하였으며 이때 사용한 버퍼는 인산 완충 염용액(phosphate buffered saline, PBS; pH 7.4)이다. 그림에서도 보여지듯이 iFRET 시그널은 단백질에 선택적인 화합물 XXIV와 HSP90 단백질에 의해 나타나는 현상이며, 화합물 XXIV와 BSA는 iFRET 시그널을 나타내지 않는다.
도 19는 HSP90 단백질과 이와 선택적으로 결합하는 화학식 XXIV를 이용하여 iFRET 시그널을 검출한 그래프이다. HSP90 단독으로 존재할 때는 280 nm의 파장으로 여기시켰을 때 약 350 nm 파장에서 형광 값을 관찰할 수 있으며, 화학식 XXIV(Dye로 표시됨)의 경우 280 nm의 파장으로 여기시켰을 때 약 430 nm에서 형광 값을 관찰할 수 없었다. 화학식 XXIV와 HSP90 단백질이 혼합되면 HSP90 단백질 단독으로 존재 시 혹은 화학식 XXIV가 단독으로 존재할 때의 그래프와는 다르게 430 nm에서 증가된 형광 값을 확인할 수 있다. 대조군으로는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였으며, BSA와 화학식 XXIV가 혼합되었을 때는 iFRET 시그널을 관찰 할 수 없었다. 이는 iFRET 현상이 HSOP90 단백질과 화학식 XXIV의 선택적 결합에 의한 현상임을 증명하는 결과라 할 수 있다.
HSP90과 화학식 XXIV에 의한 iFRET 현상을 도 18 및 도 19를 통하여 확인하였다. 선택적 결합에 의한 iFRET 현상을 증명하기 위하여 HSP90와 결합하는 것으로 알려진 geldanamycin과 PU-H64를 이용하여 competition assay를 실시하였다. Geldanamycin과 PU-H64, 화학식 XXIV는 모두 HSP90의 ATP 결합 자리에 결합하며, 이들이 함께 존재할 경우 화합물들은 서로 경쟁하게 된다. 이를 이용하여 도 20의 왼쪽 그림은 Geldanamycin과 화학식 XXIV, 오른쪽 그림은 PU-H64와 화학식 XXIV를 이용하여 단일 결합자리에 대해 경쟁을 유도하여 iFRET 시그널의 감소를 유도하였다. HSP90 단백질과 화학식 XXIV를 이용하여 iFRET 시그널의 생성을 확인하였고, 경쟁적 저해제인 Geldanamycin 혹은 PU-H64 를 농도별로 첨가하여 줌으로써 iFRET 시그널이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 화학식 XXIV가 HSP90 단백질의 ATP 결합자리에 선택적으로 결합하여 iFRET 시그널을 생성한다는 것을 증명하는 결과이다.
도 21은 합성된 화학식 XXIV와 HSP90 단백질의 결합정도를 나타내는 결과이다. 화학식 XXIV의 합성에 사용된 핵심 구조는 PU-H64(J. Med . Chem . 2006, 49, 4953-4960)이며 이 구조가 HSP90와 결합한다. 본 실험에 사용된 iFRET 탐침은 PU-H64에 형광모핵이 도입된 구조이며, 실제 이 탐침과 HSP90 단백질 간의 결합 정도를 알아보기 위하여 효소동역학적 분석을 통해 해리상수가 약 160 nM임을 확인하였다. iFRET 탐침인 화학식 XXIV의 농도를 일정하게 고정하고 HSP90의 농도는 다양하게 반응하여 생성된 형광값을 측정하였으며 이 측정값을 바탕으로 해리상수를 계산하였다. HSP90의 농도의 역수와 형광값의 역수를 plot하여 해리상수를 구하였다.
실시예 10: 스트렙트아비딘 ( Streptavidin ) 특이적인 화학식 XXV 내지 XXVIII 의 iFRET 용 탐침 제조
Figure 112012050614407-pat00027

N- 바이오티닐 N' -(1- 나프틸 ) 에틸렌디아민 ( XXV )의 합성
N-(1-나프틸)에틸렌디아민(N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, 254 ng), 바이오틴(biotin, 200 mg) 및 트리에틸아민(triethylamine, 0.58 ㎖)을 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide, DMF, 10㎖)에 녹이고 0℃에서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC, 236 mg) 및 히드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole, HOBt, 166 mg)을 가하여 상온에서 12 시간 동안 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석시켜 증류수로 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘(anhydrous MgSO4)으로 건조시켰다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄=1:10)로 정제하여 화합물 XXV(380 mg, 수율: 83%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 8.17(d,1H), 8.05(d,1H) 7.74(d,1H), 7.44-7.36(d,1H), 7.28(t,2H), 7.10(dd,1H), 6.54(d,1H), 6.52(d,1H), 4.23(t,1H), 4.01(dd,1H), 3.39(t,2H), 3.28(m,1H), 3.27(t,2H), 2.74(dd,1H), 2.55(d,1H), 2.11(t,2H), 1.56(m,2H), 1.55(m,2H), 1.27(m,2H).
Figure 112012050614407-pat00028

N-(7-하이드록시쿠마린-4-아세틸)- N' - Boc - 에틸렌디아민(12)의 합성
7-하이드록시쿠마린-4-아세트산(7-hydroxycoumarin-4-acetic acid, 2 g), N-Boc-1,2-디아미노에탄(N-Boc-1,2-diaminoethane, 3g) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, 8 ㎖)을 DMF(30 ㎖)에 녹이고 0℃에서 15분간 교반시킨 후, EDC(2.6 g) 및 HOBt(1.37 g)를 가한 후 상온에서 4 시간 더 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석시키고 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 각각 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄=1:10)로 정제하여 화합물 12(2.6 g, 수율: 79%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 7.55-7.52(d,1H), 6.82(d,1H), 6.79(s,1H), 6.23(s,1H), 3.83(s,2H), 3.17-3.11(q,2H), 2.96-2.91(q,2H), 1.51(s,9H).
(7-하이드록시쿠마린-4-아세트산)-2- 아미노에틸아미드(13)의 합성
화합물 12(60 mg)를 MC:TFA(3:1, 1 ㎖)에 녹이고 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응물을 다시 메틸렌클로라이드에 녹인 후 감압증류하였다. 같은 과정을 2회 반복한 후, 메탄올과 디에틸에테르의 조합으로 재결정하였다. 결정성 목적물을 진공 건조하여 화합물 13(40 mg, 수율: 81%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.38(t,1H), 7.60(d,1H), 6.81(d,1H), 6.73(s,1H), 3.67(s,2H), 3.30-3.27(q,2H), 2.88-2.84(t,2H).
N-(7-하이드록시쿠마린-4-아세틸)- N' -( 바이오티닐 ) 에틸렌디아민 ( XXVI )
화합물 13(50 mg), 바이오틴-N-하이드록시석신이미드 에스테르(Biotin N-hydroxysuccinimide ester, 55 mg) 및 TEA(0.036 ㎖)을 0℃에서 DMF(1 ㎖)에 녹이고 상온에서 5 시간 동안 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물에 과량의 물을 가하여 형성된 결정성 목적물을 여과하여 얻은 후 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄=1:10)로 한번 더 정제하여 화합물 XXVI(40 mg, 수율: 63%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.22(s,1H), 7.82(s,1H), 7.59-7.56 (d,1H), 6.80-6.77(q,1H), 6.71-6.71(d,1H), 6.43-6.37(d,2H), 6.16(s,1H), 4.32(m,1H), 4.12(m,1H), 3.63(s,2H), 3.10(s,5H), 2.84-2.79(dd,1H), 2.59(d,1H), 2.03(t,1H), 1.48-1.28(m,6H).
Figure 112012050614407-pat00029

(E)-7-하이드록시쿠마린-3- 아크릴 산 2- 아미노에틸아미드(14)의 합성
N-((E)-7-하이드록시쿠마린-3-아크릴 산)-N'-tert-부틸 에틸렌디아민(N-((E)-(7-hydroxycoumarin-3-acrylic acid)-N`-tert-butyl ethylenediamine, 70 mg)을 MC:TFA(2:1, 1 ㎖)에 녹이고 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응물을 다시 메틸렌클로라이드(methylenechloride)에 녹인 후 감압 증류하였다. 같은 과정을 2회 반복한 후, 형성된 결정성 목적물을 진공 건조하여 화합물 14(65 mg, 수율: 95%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.45(t,1H), 8.28(s,1H), 7.83(b.s,2H), 7.59-7.57(d,1H), 7.34-7.30(d,1H), 7.09-7.05(d,1H), 6.86-6.83(dd,1H), 6.76(d,1H), 3.42-3.37(q,2H), 2.94-2.89(q,2H).
N-((E)-7-하이드록시쿠마린-3-아크릴)- N' -( 바이오티닐 ) 에틸렌디아미드 ( XXVII )의 합성
화합물 14(100 mg), 바이오틴-N-하이드록시석신이미드 에스테르(Biotin N-hydroxysuccinimide ester, 89 mg) 및 TEA(0.06 ㎖)를 DMF(1 ㎖)에 녹이고 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응물에 과량의 에틸 아세테이트를 가하여 얻은 침전물을 여과 후, 메탄올과 디에틸에테르 조합으로 재결정을 시도하였다. 형성된 결정성 목적물을 진공 건조하여 화합물 XXVII(59 mg, 수율: 46%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.28(d,2H), 8.25(s,1H), 7.58-7.63(d,1H), 7.06-7.02(d,1H), 6.88-6.86(d,1H), 6.84-6.82(d,1H), 6.74(s,1H), 6.54(d,1H), 6.52(d,1H), 4.23(t,1H), 4.01(dd,1H), 3.27(t,2H), 3.19(q,2H), 3.02(q,2H), 2.74(dd,1H), 2.55(d,1H), 2.11(t,2H), 1.56(m,2H), 1.55(m,2H), 1.27(m,2H).
Figure 112012050614407-pat00030

N-(7- 디메틸아미노쿠마린 -4-아세틸)- N' - Boc - 에틸렌디아민(15)의 합성
7-디메틸아미노쿠마린-4-아세트산(7-Dimethylaminocoumarin-4-acetic acid, 100 mg), N-Boc-1,2-디아미노에탄(N-Boc-1,2-diaminoethane, 71 mg)을 0℃에서 DMF(4 ㎖)에 녹이고 15분간 교반시킨 후, EDC(116 mg)와 4-(디메틸아미노)피리딘(4-(Dimethylamino)pyridine, DMAP, 6 mg)을 가하고 상온에서 12 시간 더 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석한 후 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 각각 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘(anhydrous MgSO4)으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그라피(메탄올:디클로로메탄=1:20)로 정제하여 중간체 15(87 mg, 수율: 55%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.48(d,1H), 6.63(d,1H), 6.61(d,1H), 6.05(s,1H), 4.84(s,1H), 3.62(s,2H), 3.35-3.31(q,2H), 3.23-3.20(q,2H), 3.06(s,6H), 1.41(s,9H).
(7- 디메틸아미노쿠마린 -4-아세트산)-2- 아미노에틸아미드(16)의 합성
화합물 15(80 mg)를 MC:TFA(2:1, 1 ㎖)에 녹이고 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응물을 다시 메틸렌클로라이드(methylenechloride)에 녹인 후 감압 증류하였다. 같은 과정을 2회 반복한 후, 잔류물을 메탄올과 디에틸에테르 조합으로 재결정을 하였다. 형성된 결정성 목적물을 진공 건조하여 화합물 16(53 mg, 수율: 67%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.54(d,1H), 6.75(d,1H), 6.57(s,1H), 6.04(s,1H), 3.73(s,2H), 3.47(t,2H), 3.31(s,6H), 3.05(t,2H).
N-((E)-7- 디메틸아미노쿠마린 -3-아크릴)- N' -( 바이오티닐 ) 에틸렌디아미드 ( XXVIII )의 합성
화합물 16(40 mg), 바이오틴-N-하이드록시석신이미드 에스테르(Biotin N-hydroxysuccinimide ester, 41 mg) 및 TEA(0.03 ㎖)을 DMF(1 ㎖)에 녹이고 상온에서 5 시간 동안 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물에 과량의 물을 가하여 형성된 결정성 목적물을 여과하여 얻은 후 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄=1:10)로 한번 더 정제하여 화합물 XXVIII(30 mg, 수율: 52%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.23(s,1H), 7.83(s,1H), 7.54-7.52(d,1H), 6.74-6.71(q,1H), 6.56-6.55(d,1H), 6.43-6.37(d,2H), 6.00(s,1H), 4.32(m,1H), 4.13(m,1H), 3.56(s,2H), 3.02(s,5H), 2.89(s,6H), 2.84-2.79(dd,1H), 2.59(d,1H), 2.03(t,1H), 1.48-1.28(m,6H).
<화학식 XXV 내지 XXVIII 의 iFRET 탐침을 이용한 스트렙트아비딘 단백질의 검출 및 활성 확인>
화학식 XXV 내지 XXVIII의 화합물을 iFRET용 탐침으로 이용하여 스트렙트아비딘을 검출한 결과를 도 23 내지 26에 각각 나타내었다.
화학식 XXV의 화합물을 iFRET용 탐침으로 사용하여 얻은 도 23을 살펴보면, 탐침 자체는 280 nm 파장의 UV 조사에 의하여 430 nm에서 낮은 형광값을 나타내며(파랑색 선); 단백질(streptavidin)은 280 nm 파장의 UV의 조사에 의하여 340 nm에서 발광하는 특성을 보여주고 있다(녹색선). iFRET용 탐침과 목적단백질인 스트렙트아비딘을 혼합하였을 경우 280 nm UV 조사에 의하여 430 nm에서 높은 형광 증가가 관찰되었다(검정색 선). 상기 결과는 본 발명에서 개발된 탐침은 화합물 자체로서는 특정 파장의 UV 조사에 의해서 낮은 형광값을 가지지만, 스트렙트아비딘과 결합하여 스트렙트아비딘 내부에 존재하는 에너지 공여자인 트립토판에 인접하게 됨으로써 상기 트립토판으로부터 에너지를 전달받는 FRET 현상이 일어나게 되며, 이는 본 발명의 탐침이 결합 감응성 점화 형광탐침(binding sensitive turn-on fluorescence probe)라는 것을 의미한다.
화학식 XXVI의 화합물을 형광탐침으로 사용하여 얻은 도 24를 살펴보면, 형광탐침 자체는 280 nm 파장의 UV 조사에 의하여 460 nm에서 낮은 형광값을 나타내며(파랑색 선); 단백질(streptavidin)은 280 nm UV의 조사에 의하여 340 nm에서 발광하는 특성을 보여주고 있다(녹색선). iFRET용 탐침과 스트렙트아비딘을 혼합하였을 경우 280 nm 파장의 UV 조사에 의하여 탐침 XXV의 발광파장보다 장파장인 460 nm에서 높은 형광 증가가 관찰되었다(검정색 선). 또한, 상기 발광 파장에서의 형광 증가율이 600% 이상임이 확인되었기에 효과적인 iFRET 신호를 생성한다는 것을 확인할 수 있었다.
화학식 XXVII의 화합물을 탐침으로 사용하여 얻은 도 25로부터, 방출파장이 다른 탐침의 경우에도 탐침과 스트렙트아비딘을 혼합하였을 때, 280 nm 파장의 UV 조사에 의하여 480 nm에서 높은 형광 증가가 관찰되었다(검정색 선). 상기 화학식 XXVII의 화합물은 기존의 iFRET 탐침에 비해 장파장에서의 형광을 방출하므로 실시간 세포이미징 시에 신호대잡음비를 최소화하여 보다 선명한 이미지를 제공할 수 있다.
도 26은 합성된 iFRET용 탐침인 화학식 XXVIII의 화합물과 스트렙트아비딘의 결합에 의해 생성되는 iFRET 신호를 나타낸다(그림의 검정색 선). 화학식 XXVIII을 갖는 탐침의 표적특이성을 관찰하기 위하여 BSA에 노출시켜 BSA와도 결합에 의해서 iFRET 신호를 생성하는지를 확인하였다. 그러나, 본 발명의 형광탐침을 BSA와 반응시킨 경우에는 iFRET 신호가 관찰되지 않았다(남색 선). 따라서 바이오틴이 결합된 본 발명의 iFRET 형광탐침은 스트렙트아비딘에 선택적으로 결합하여 iFRET 신호를 생성하는 것을 확인하였다.
표 2에는 바이오틴과 결합된 화학식 XXV 내지 XXVIII을 갖는 형광탐침에 대한 형광특성 및 FRET 효율을 나타내었다.
Figure 112012050614407-pat00031
각 화합물의 양자수율은 0.1 M pH 10.0 phosphate buffer 상에서 측정하였다. 기준물질로는 4-메틸-움벨리페론(4-Methyl-umbelliferone; ΦF = 0.63)을, FRET 공여체로는 트립토판(Tryptophan; ΦF = 0.12)을 이용하여 양자수율을 계산하였다. FRET 전달효율은 pH 7.4의 PBS 완충액 상에서 측정된 결과를 토대로 도출하였으며, 형광측정은 Perkin Elmer사의 LS55 형광스펙트럼 장비를 이용하였다. 화합물의 각 단계별 양자수율은 표에 나타내었으며, FRET 효율은 합성된 화합물에 따라 각각 0.225, 0.141, 0.22 및 0.359로 높은 에너지 전달 효율을 나타내었다. iFRET 형광탐침과 단백질 사이의 Foster distance는 데이터를 통해 얻어진 값으로 확인 할 수 있다. 이는 iFRET 형광탐침과 스트렙트아비딘이 효과적인 iFRET 신호를 생성할 수 있는 거리 내에 존재함을 의미한다.
실시예 11: 캐스파제 -3 단백질 특이적인 화학식 IXXX 내지 XXXII 의 iFRET 용 탐침의 제조
Figure 112012050614407-pat00032

2-(3-( 벤질옥시카보닐 -5- 옥소옥사졸리딘 -4-일)아세트산(17)의 합성
N-Cbz-L-아스파르트 산(N-Cbz-L-aspartic acid, 2.16 g), 파라포름알데히드(paraformaldehyde, 1.53 g) 및 p-톨루엔술폰 산(p-Toluenesulfonic acid, 0.16 g)을 톨루엔(Toluene, 150 ㎖)에 녹인 후 딘스탁(Dean-stark) 트랩으로 2 시간 동안 환류 교반하였다. 반응물을 상온에서 식히고 용매를 실리카겔에 가하였다. 디에틸에테르로 여과한 후, 감압농축하여 화합물 17(2.04 g, 90 %)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.40-7.35(m,5H), 5.45(br,1H), 5.30-5.10(m,3H), 4.38(t,1H), 2.93(d,2H).
tert -부틸-2-(3-( 벤질옥시카보닐 -5- 옥소옥사졸리딘 -4-일)아세테이트(18)의 합성
화합물 17(1.8 g), t-BuOH(1.8 ㎖), EDC(1.5 g) 및 DMAP(0.35 g)을 드라이 THF(70 ㎖)에 녹인 후 5분간 교반하였다. 반응물에 TEA(0.9 ㎖)를 가한 후, 상온에서 16 시간 더 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석하고 5% 시트르산 수용액과 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=1:9 → 1:4)로 정제하여 화합물 18(1.01 g,수율: 47%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.38-7.34(m,5H), 5.55(br,1H), 5.34(s,1H), 5.22-5.17(q,2H), 4.29(br,1H), 2.96-2.93(d,2H), 1.42(s,9H).
벤질 4-(2-( tert - 부톡시 )-2- 옥소에틸 )-5-( 트리플루오르메틸 )-5-( 트리메틸실록시 ) 옥사졸리딘 -3- 카르복실레이트 (19)의 합성
화합물 18(0.1 g), 세슘플루라이드(Cecium fluride, 0.006 g) 및 2 M (트리플루오로메틸)트리메틸실란((Trifluoromethyl)trimethylsilane, 0.18 ㎖)을 드라이 THF(3 ㎖)에 녹인 후 상온에서 2 시간 동안 초음파처리 하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석하고 수용액으로 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=1:10)로 정제하여 화합물 19(0.1 g, 수율: 70%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.38-7.33(m,5H), 5.32-5.17(br,3H), 4.95(s,1H), 4.84(q,1H), 2.46(d,2H), 1.43(s,9H), 0.21(s,9H).
tert -부틸 3-( 벤질옥시카보닐 )아미노)-5,5,5- 트리플루오르 -4- 하이드록시펜타노에이트(20)의 합성
화합물 19(0.46 g)가 녹여진 메탄올(20 ㎖)에 수소화붕소나트륨(sodium borohydride, 0.36 g)을 천천히 적가 후, 상온에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응물에 수용액(20 ㎖)을 가한 후, 에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 유기층을 포화소금용액으로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=1:5)로 정제하여 화합물 20(0.22 g, 수율: 61%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.36-7.31(m,5H), 5.55(d,1H), 5.13-5.07(q,2H), 4.68(s,1H), 4.65(s,1H), 4.25-4.11(d,2H), 2.70(q,2H), 1.46(s,9H).
tert -부틸 3-아미노-5,5,5- 트리플루오르 -4- 하이드록시헥사펜타노에이트(21)의 합성
화합물 20(0.17 mg)과 10 % Pd/C(Palladium on activated charcoal, 23 mg)을 메탄올(10 ㎖)에 녹인 후, 수소기류 하에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응물을 셀라이트(celite)를 이용하여 여과한 후, 감압농축하여 화합물 21(0.1 g, 수율: 81%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 5.22(bs,2H), 4.26(q,1H), 3.82(q,1H), 2.78(d,2H), 1.31(s,9H).
Figure 112012050614407-pat00033

N- Cbz -아스파르트산 4- tert -부틸 에스테르(22)의 합성
물(100 ㎖)에 L-아스파르트산 4-tert-부틸 에스테르(L-Aspartic acid 4-tert-butyl ester, 5 g)와 NaHCO3(4.43 g)을 녹인 후 교반하였다. 벤질 클로로포르메이트(Benzyl chloroformate, 4.14 ㎖)를 THF(100 ㎖)에 희석시킨 용액을 반응물에 적가한 후, 상온에서 18 시간 동안 교반하였다. 유기용매를 감압농축하여 제거한 후, 수용액 층을 에틸아세테이트로 2회 세척하였다. 10% 시트르산 수용액으로 산성화한 후, 에틸아세테이트로 목적물을 추출하였다. 유기층을 포화소금용액으로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 진공 건조하여 화합물 22(7.2 g, 수율: 85%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.24-7.34(m,5H), 5.31-5.18(s,3H), 4.58-4.67(m,1H), 2.71(q,2H), 1.46(s,9H).
N- Cbz - 아스파르트 산 - N` - 하이드록시석신이미드 에스테르-4- tert -부틸 에스테르( 23)의 합성
화합물 22(3 g), EDC(1.95 g) 및 NHS(1.18 g)를 디클로로메탄(40 ㎖)에 녹인 후 상온에서 12 시간 동안 교반하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화소금용액으로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 메탄올과 디에틸에테르로 재결정한 후, 진공 건조하여 화합물 23(3 g, 수율: 77%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.24-7.34(m,5H), 5.33-5.21(s,3H), 4.72(m,1H), 2.94(s,4H), 2.67(q,2H), 1.46(s,9H).
N- Cbz - Asp ( CO 2 tBu )-L- Glu ( CO 2 tBu )-L- Val (24)의 합성
화합물 23(0.15 g)과 아미노산 EV(0.1 g)를 녹인 디클로로메탄(40 ㎖)에 TEA(0.15 ㎖)을 천천히 적가한 후, 상온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응물을 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화소금용액으로 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄 = 1:10)로 정제하여 화합물 24(0.14 g, 수율: 66%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6): 10.52(s,1H), 7.38-7.33(m,5H), 5.33-5.21(s,3H), 4.60(m,1H), 4.33(m,1H), 4.12(m,1H), 2.89(s,1H), 2.73(s,1H), 2.20(m,2H), 2.06(m,1H), 1.99(m,1H), 1.74(m,1H), 1.38(s,9H), 1.35(s,9H), 0.88(q,6H).
N- Cbz - Asp ( CO 2 tBu )-L- Glu ( CO 2 tBu )-L- Val - Asp ( CO 2 tBu )-( OH )- CF 3 (25)의 합성
화합물 24(0.13 g), 화합물 21(0.05 g) 및 TEA(0.15 ㎖)를 디클로로메탄(6 ㎖)에 녹인 후 5분간 교반하였다. 반응물에 EDC(0.05 g)와 HOBt(0.06 g)를 가한 후, 상온에서 12 시간 더 교반하였다. 반응물을 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄 = 1:10)로 정제하여 화합물 25(0.12 g,수율: 67%)를 제조하였다. 생성물은 질량분석을 통해 확인하였다.
LC/MS: 833.4 (M+H).
N- Cbz - Asp ( CO 2 tBu )-L- Glu ( CO 2 tBu )-L- Val - Asp ( CO 2 tBu )-( ketone )- CF 3 (26)의 합성
화합물 25(0.2 g)와 마틴 시약(Dess-Martin`s reagent, 0.45 g)을 디클로로메탄(12 ㎖)에 녹인 후 상온에서 12 시간 동안 교반하였다. 침전물을 셀라이트로 여과한 후, 여과액을 감압농축 하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄 = 1:10)로 정제하여 화합물 26(0.17 g,수율: 86%)을 제조하였다. 생성물은 질량분석을 통해 확인하였다.
LC/MS: 831.4 (M+H).
L- Asp ( CO 2 tBu )-L- Glu ( CO 2 tBu )-L- Val - Asp ( CO 2 tBu )-( ketone )- CF 3 (27)의 합성
화합물 27(0.05 g)과 10 % Pd/C(Palladium on activated charcoal, 22 mg)를 메탄올(5 ㎖)에 녹인 후, 수소기류 하에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응물을 셀라이트를 이용하여 여과한 후, 감압농축하여 화합물 27(0.03 g, 수율: 71%)을 제조하였다. 생성물은 질량분석을 통해 확인하였다.
LC/MS: 697.4 (M+H).
Figure 112012050614407-pat00034

Cbz -3- 아미노프로피온산 , Cbz -6-아미노헥산 산(28)의 합성
아미노카르복실산(3-aminopropanoic acid or 6-aminohexanoic acid, 56 mmol or 38 mmol)을 물(15 ㎖)에 녹인 후 0℃에서 15 분간 교반하였다. CbzCl(1.1 eq)과 5 N NaOH(1 eq)을 반응물에 천천히 적가하여, pH 10.0을 유지하였다. 수용액 층을 디에틸에테르로 2회 세척한 후, 1 N 염산으로 산성화하고, 디클로로메탄으로 목적물을 추출하였다. 유기층을 포화소금용액으로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. -70℃에서 디에틸에테르로 재결정한 후 진공 건조하여 화합물 28(n =3, 10 g, 수율: 77% / n = 5, 7.6 g, 75%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, n=2): 7.34(br,5H), 5.33(br,1H), 5.09(s,2H), 3.46(m,2H), 2.58(t,2H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, n=5): 7.30-7.40(m,5H), 5.09(s,2H), 4.80(br,1H), 3.19(q,2H), 2.34(t,2H), 1.64(q,2H), 1.52(q,2H), 1.37(m,2H).
tert -부틸 Cbz -3- 아미노프로피오네이트 , tert -부틸 Cbz -6- 아미노헥사노에이트(29)의 합성
화합물 28(1 eq)과 피리딘(pyridine)(18 eq)을 tert-부탄올에 녹인 후 -10℃에서 15 분간 교반하였다. 반응물에 POCl3(1.1 eq)을 천천히 적가한 후 상온에서 16 시간 동안 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석하고 물과 포화 탄산나트륨 수용액으로 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄 = 1:50)로 정제하여 화합물 29(n =3, 1 g, 수율: 60% / n = 5, 1.35 g, 56%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, n=2): 7.33(m,5H), 5.34(br,1H), 5.10(s,2H), 3.42(q,2H), 2.44(t,2H), 1.44(s,9H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, n=5): 7.30-7.36(m,5H), 5.09(s,2H), 4.78(br,1H), 3.19(q,2H), 2.20(t,2H), 1.65-1.30(m,6H), 1.43(s,9H).
tert -부틸 3- 아미노프로피오네이트 , tert -부틸 6- 아미노헥사노에이트(30)의 합성
화합물 29(1 eq)와 10% Pd/C(Palladium on activated charcoal, catalytical amount)를 에탄올에 녹인 후, 수소기류 하에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응물을 셀라이트를 이용하여 여과한 후, 감압농축하였다. 침전물을 에틸 아세테이트로 희석한 뒤 한번 더 여과, 감압농축하였다. 생성물을 진공건조하여 화합물 30(n =3, 0.32 g, 수율: 95% / n = 5, 0.51 g, 92%)을 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, n=2): 2.73(t,2H), 2.27(t,2H), 1.93(br,2H), 1.39(s,9H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, n=5): 2.67(t,2H), 2.21(t,2H), 1.65(s,2H), 1.60(m,2H), 1.40-1.50(m,2H), 1.44(s,9H), 1.36(m,2H).
Figure 112012050614407-pat00035

tert -부틸 3-(N-(7-하이드록시쿠마린-4-아세틸)) 프로피오네이트 , tert -부틸 3-(N-(7-디 메틸아미 노쿠마린-4-아세틸)) 프로피오네이트 (31)의 합성
7-R-쿠마린-4-아세트산(R = dimethylamino, hydroxy, 1.1 eq),중간체 30( 0.1g)과 TEA(5 eq)을 DMF에 녹이고 0 ℃에서 15분 교반 후, EDC(1.5 eq)와 HOBt(1.5 eq)를 가한 후 상온에서 12 시간 더 교반하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석하고 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 각각 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘(anhydrous MgSO4)으로 건조하였다. 용액을 감압농축 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그라피(메탄올:디클로로메탄=1:10)로 정제하여 중간체 31(R = -OH, n = 2, 0.14 g, 수율:61 %)(R = -OH, n = 5, 0.15 g, 수율: 74%),(R = -NMe2, n = 2, 0.10 g, 수율:39 %)(R = -NMe2, n = 5, 0.11 g, 수율: 43%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-OH, n=2): 8.68(d,1H), 7.63(d,1H), 6.81(d,1H), 6.75(s,1H), 6.39(s,1H), 3.79(t,2H), 3.73(s,2H), 2.65(t,2H), 1.42(s,9H).
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-OH, n=5): 8.66(s,1H), 7.61(d,1H), 6.76(d,1H), 6.74(s,1H), 6.24(s,1H), 3.70(s,2H), 3.19(q,2H), 2.20(t,2H), 1.65-1.30(m,6H), 1.43(s,9H).
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-NMe2, n=2): 8.01(s,1H), 7.48(d,1H), 6.63(d,1H), 6.61(d,1H), 6.51(s,1H), 3.77(t,2H), 3.61(s,2H), 3.05(s,6H), 2.62(t,2H), 1.42(s,9H).
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-NMe2, n=5): 8.03(s,1H), 7.45(d,1H), 6.62(d,1H), 6.60(d,1H), 6.49(s,1H), 3.71(s,2H), 3.23(q,2H), 3.19(s,6H), 2.24(t,2H), 1.66-1.34(m,6H), 1.42(s,9H).
3-(N-(7-하이드록시쿠마린-4-아세틸)) 프로피온아미드 (32)의 합성
화합물 31(0.1 g)을 MC:TFA(2:1, 1 ㎖)에 녹이고 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응물을 다시 메틸렌클로라이드(methylenechloride)에 녹인 후 감압 증류하였다. 같은 과정을 2회 반복한 후, 잔류물을 메탄올과 디에틸에테르 조합으로 재결정을 하였다. 형성된 결정성 목적물을 진공 건조하여 화합물 32(R = -OH, n = 2, 0.060 g, 수율: 78%)(R = -OH, n = 5, 0.080 g, 수율: 84%),(R = -NMe2, n = 2, 0.051 g, 수율:67 %)(R = -NMe2, n = 5, 0.081 g, 수율: 88%)를 제조하였다. 생성물의 구조는 1H-NMR을 통하여 확인하였다.
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-OH, n=2): 8.68(d,1H), 7.63(d,1H), 6.81(d,1H), 6.75(s,1H), 6.39(s,1H), 3.73(s,2H), 3.79(t,2H), 2.65(t,2H), 1.42(s,9H).
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-OH, n=5): 8.66(s,1H), 7.61(d,1H), 6.76(d,1H), 6.74(s,1H), 6.24(s,1H), 3.70(s,2H), 3.19(q,2H), 2.20(t,2H), 1.65-1.30(m,6H).
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-NMe2, n=2): 8.22(s,1H), 7.53(d,1H), 6.74(d,1H), 6.56(s,1H), 6.43(s,1H), 3.75(t,2H), 3.61(s,2H), 3.05(s,6H), 2.62(t,2H).
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-NMe2, n=5): 8.20(s,1H), 7.47(d,1H), 6.64(d,1H), 6.60(d,1H), 6.49(s,1H), 3.71(s,2H), 3.23(q,2H), 3.19(s,6H), 2.24(t,2H), 1.68-1.32(m,6H).
3-(N-(7-하이드록시쿠마린-4-아세틸)) 프로피온아미드 - Asp ( CO 2 tBu )-L-Glu(CO 2 tBu)-L-Val-Asp(CO 2 tBu)-(ketone)-CF3(33)의 합성
화합물 32(1.2 eq), 화합물 27(0.03 g) 및 TEA(5 eq)을 DMF에 녹이고 0℃에서 15분간 교반시킨 후, EDC(1.5 eq)와 HOBt(1.5 eq)를 가하고 상온에서 12 시간 더 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석하고 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 각각 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(메탄올:디클로로메탄=1:10)로 정제하여 화합물 33(R = -OH, n = 2, 0.013 g, 수율: 32%)(R = -OH, n = 5, 0.017 g, 수율: 40%),(R = -NMe2, n = 2, 0.016 g, 수율:39 %)(R = -NMe2, n = 5, 0.013 g, 수율:30 %)을 제조하였다. 생성물은 질량분석을 통해 확인하였다.
LC/MS(R = -OH, n = 2): 970.4(M+H).
LC/MS(R = -OH, n = 5): 1012.5(M+H).
LC/MS(R = -NMe2, n = 2): 997.5(M+H).
LC/MS(R = -NMe2, n = 5): 1039.5(M+H).
3-(N-(7-하이드록시쿠마린-4-아세틸)) 프로피온아미드 - Asp -L- Glu -L- Val - Asp -(ketone)-CF 3 (XXIX)의 합성
화합물 33을 MC:TFA(2:1, 1 ㎖)에 녹이고 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응물을 다시 메틸렌클로라이드(methylenechloride)에 녹인 후 감압 증류하였다. 같은 과정을 2회 반복한 후, 잔류물을 메탄올과 디에틸에테르 조합으로 재결정을 하였다. 형성된 결정성 목적물을 진공 건조하여 화합물 XXIX를 제조하였다.
3-(N-(7-하이드록시쿠마린-4-아세틸)) 프로피온아미드 - Asp ( CO 2 Me )-L-Glu(CO 2 Me)-L-Val-Asp(CO 2 Me)-(ketone)-CF 3 (XXX)의 합성
화합물 XXIX, MeOH, EDC 및 DMAP를 적당량의 THF에 녹인 후 0℃에서 15분간 교반하였다. 반응물에 TEA를 천천히 적가한 뒤, 상온에서 16 시간 더 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석하고 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 각각 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 화합물 XXX을 제조하였다.
Figure 112012050614407-pat00036

N-(1- 나프틸 ) 에틸렌아미드 -4- 부탄아미드 - Asp ( CO 2 tBu )-L- Glu ( CO 2 tBu )-L- Val -Asp(CO 2 tBu)-(ketone)-CF 3 (34)의 합성
N-(1-나프틸)에틸렌아미드-4-부탄산(N-(1-naphthyl)ethyleneamide-4-butanoic acid(1.1 eq)), 화합물 27(1 eq) 및 TEA(5 eq)를 DMF에 녹이고 0℃에서 15분간 교반 후, EDC(1.5 eq)와 HOBt(1.5 eq)를 가하고 상온에서 12 시간 더 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석하고 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 각각 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 화합물 34를 제조하였다.
N-(1- 나프틸 ) 에틸렌아미드 -4- 부탄아미드 - Asp -L- Glu -L- Val - Asp -( ketone )-CF 3 (XXXI)의 합성
화합물 34를 MC:TFA(2:1)에 녹이고 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응물을 다시 메틸렌클로라이드(methylenechloride)에 녹인 후 감압 증류하였다. 같은 과정을 2회 반복한 후, 잔류물을 메탄올과 디에틸에테르 조합으로 재결정을 하였다. 형성된 결정성 목적물을 진공 건조하여 화합물 XXXI을 제조하였다.
N-(1- 나프틸 ) 에틸렌아미드 -4- 부탄아미드 - Asp ( CO 2 Me )-L- Glu ( CO 2 Me )-L- Val -Asp(CO 2 Me)-(ketone)-CF 3 (XXXII)의 합성
화합물 XXXI(1 eq), MeOH(5 eq), EDC(1.2 eq) 및 DMAP(0.1 eq)를 적당량의 THF에 녹인 후 0℃에서 15분간 교반하였다. 반응물에 TEA(3 eq)를 천천히 적가한 뒤, 상온에서 16 시간 더 교반하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트로 희석하고 10% 시트르산 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 각각 세척하였다. 유기층을 포화소금용액으로 한번 더 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용액을 감압농축시킨 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 화합물 XXXII를 제조하였다.
세포 내 특정 신호 전달에 의해 세포 사멸이 유도되는 과정을 실시간으로 이미징하기 위하여 세포 투과가 용이한 캐스파제(Caspase) iFRET 탐침을 합성하였다. 널리 알려진 캐스파제에 선택적으로 결합하는 펩타이드 저해제인 (27)을 합성하였으며, 이를 위해 화합물 (21)이 사용되었다. (27)의 N-terminal 부분은 iFRET 형광 모핵의 도입부위로서의 역할을 한다. 캐스파제 활성을 억제하는 펩타이드 저해제인 DEVD-CF3에 형광체로 작용하는 합성물을 도입하기 위한 링커 20(n = 2 내지 5)을 합성하였다. 합성된 세포투과용 Trifluoromethyl aspartic acid (21)는 말단에 -CF3 그룹을 가지며, 이는 표적 단백질인 캐스파제-3과 결합하여 효소의 기능을 저해하게 된다. 다양한 형광파장을 나타내도록 하기 위하여 형광프로브의 R 그룹을 (-OH), (-N(CH3)2)의 같이 두 가지를 도입하였으며, 430 nm의 형광값을 갖는 화학식 XXXII을 갖는 형광탐침도 합성하였다.

Claims (46)

  1. 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 iFRET 받게(acceptor)기능을 갖는 형광분자로 하기 화학식 I 내지 XXII로 기재되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되어진 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 iFRET용 탐침으로서, 450 nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 방출하는 iFRET용 탐침을 준비하는 제1단계;
    상기 표적 단백질에 제1단계에서 준비된 iFRET용 탐침을 처리하는 제2단계; 및
    표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 발광하는 iFRET용 탐침을 확인하는 제3단계를 포함하여,
    표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 검색하는 방법.
    [화학식 I]
    Figure 112014022593651-pat00147

    [화학식 II]
    Figure 112014022593651-pat00148

    [화학식 III]
    Figure 112014022593651-pat00149

    [화학식 IV]
    Figure 112014022593651-pat00150

    [화학식 V]
    Figure 112014022593651-pat00151

    [화학식 VI]
    Figure 112014022593651-pat00152

    [화학식 VII]
    Figure 112014022593651-pat00153

    [화학식 VIII]
    Figure 112014022593651-pat00154

    [화학식 IX]
    Figure 112014022593651-pat00155

    [화학식 X]
    Figure 112014022593651-pat00156

    [화학식 XI]
    Figure 112014022593651-pat00157

    [화학식 XII]
    Figure 112014022593651-pat00158

    [화학식 XIII]
    Figure 112014022593651-pat00159

    [화학식 XIV]
    Figure 112014022593651-pat00160

    [화학식 XV]
    Figure 112014022593651-pat00161

    [화학식 XVI]
    Figure 112014022593651-pat00162

    [화학식 XVII]
    Figure 112014022593651-pat00163

    [화학식 XVIII]
    Figure 112014022593651-pat00164

    [화학식 XIX]
    Figure 112014022593651-pat00165

    [화학식 XX]
    Figure 112014022593651-pat00166

    [화학식 XXI]
    Figure 112014022593651-pat00167

    [화학식 XXII]
    Figure 112014022593651-pat00168
  2. 제1항에 있어서,
    상기 검색 방법에 의해 확인된, 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자는 상기 표적 단백질이 관여하는 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 물질 또는 이의 일부로 사용되는 것이 특징인 검색 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    단백질의 고유 형광을 발휘하는 아미노산은 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 페닐알라닌(Phenylalanine) 또는 이들의 조합인 것이 특징인 검색 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    제2단계는 물, 완충용액, 탄소수 1 내지 6의 저급알콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매 내에서 또는 바이오칩, 미세입자 상, 극미세입자상, 세포 또는 조직(tissue)에서 수행하는 것이 특징인 검색 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    표적 단백질은 260 내지 300 nm 파장의 빛에 의해 여기되어 290 내지 400 nm 파장의 빛을 발광하고,
    iFRET용 탐침은 300 내지 400 nm 파장의 빛에 의하여 선택적으로 여기되는 것이 특징인 검색 방법.
  6. 삭제
  7. 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 다양한 후보군에서 수득하여 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 제1 형광분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 제1 iFRET용 탐침을 제조하는 제1단계;
    상기 표적 단백질에 제1 iFRET용 탐침을 처리하는 제2단계;
    표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 발광하는 제1 iFRET용 탐침을 확인하는 제3단계; 및
    상기 제3단계에서 발광하는 제1 iFRET용 탐침을 구성하는, 표적 단백질에 특이적인 결합부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자를 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 제2 형광분자와 직접 또는 링커를 통해 연결하여 제2 iFRET용 탐침을 제조하는 제4단계를 포함하여 iFRET용 탐침을 제조하는 방법으로서,
    상기 제1 형광분자 및 제2 형광분자는 각각 독립적으로 하기 화학식 I 내지 XXII로 기재되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되어진 분자이고,
    제2 iFRET용 탐침은 450 nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 방출하는 것이 특징인 iFRET용 탐침 제조방법.
    [화학식 I]
    Figure 112014022593651-pat00169

    [화학식 II]
    Figure 112014022593651-pat00170

    [화학식 III]
    Figure 112014022593651-pat00171

    [화학식 IV]
    Figure 112014022593651-pat00172

    [화학식 V]
    Figure 112014022593651-pat00173

    [화학식 VI]
    Figure 112014022593651-pat00174

    [화학식 VII]
    Figure 112014022593651-pat00175

    [화학식 VIII]
    Figure 112014022593651-pat00176

    [화학식 IX]
    Figure 112014022593651-pat00177

    [화학식 X]
    Figure 112014022593651-pat00178

    [화학식 XI]
    Figure 112014022593651-pat00179

    [화학식 XII]
    Figure 112014022593651-pat00180

    [화학식 XIII]
    Figure 112014022593651-pat00181

    [화학식 XIV]
    Figure 112014022593651-pat00182

    [화학식 XV]
    Figure 112014022593651-pat00183

    [화학식 XVI]
    Figure 112014022593651-pat00184

    [화학식 XVII]
    Figure 112014022593651-pat00185

    [화학식 XVIII]
    Figure 112014022593651-pat00186

    [화학식 XIX]
    Figure 112014022593651-pat00187

    [화학식 XX]
    Figure 112014022593651-pat00188

    [화학식 XXI]
    Figure 112014022593651-pat00189

    [화학식 XXII]
    Figure 112014022593651-pat00190
  8. 제7항에 있어서,
    제1 형광분자 및 제2 형광분자는 동일 또는 상이한 것이 특징인 iFRET용 탐침 제조 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    단백질의 고유 형광을 발휘하는 아미노산은 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 페닐알라닌(Phenylalanine) 또는 이들의 조합인 것이 특징인 iFRET용 탐침 제조 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    제3단계는 물, 완충용액, 탄소수 1 내지 6의 저급알콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매 내에서 또는 바이오칩, 미세입자 상, 극미세입자상, 세포 또는 조직(tissue)에서 수행하는 것이 특징인 iFRET용 탐침 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 제7항에 있어서,
    표적 단백질은 260 내지 300 nm 파장의 빛에 의해 여기되어 290 내지 400 nm 파장의 빛을 방출하고, 제1 iFRET용 탐침은 300 내지 400 nm 파장의 빛에 의하여 선택적으로 여기되는 것이 특징인 iFRET용 탐침 제조 방법.
  13. 삭제
  14. 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 iFRET 받게(acceptor)기능을 갖는 형광분자로 하기 화학식 I 내지 XXII로 기재되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되어진 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 iFRET용 탐침으로서,
    450 nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 방출하는 것이 특징인 iFRET용 탐침.
    [화학식 I]
    Figure 112014022593651-pat00081

    [화학식 II]
    Figure 112014022593651-pat00082

    [화학식 III]
    Figure 112014022593651-pat00083

    [화학식 IV]
    Figure 112014022593651-pat00084

    [화학식 V]
    Figure 112014022593651-pat00085

    [화학식 VI]
    Figure 112014022593651-pat00086

    [화학식 VII]
    Figure 112014022593651-pat00087

    [화학식 VIII]
    Figure 112014022593651-pat00088

    [화학식 IX]
    Figure 112014022593651-pat00089

    [화학식 X]
    Figure 112014022593651-pat00090

    [화학식 XI]
    Figure 112014022593651-pat00091

    [화학식 XII]
    Figure 112014022593651-pat00092

    [화학식 XIII]
    Figure 112014022593651-pat00093

    [화학식 XIV]
    Figure 112014022593651-pat00094

    [화학식 XV]
    Figure 112014022593651-pat00095

    [화학식 XVI]
    Figure 112014022593651-pat00096

    [화학식 XVII]
    Figure 112014022593651-pat00097

    [화학식 XVIII]
    Figure 112014022593651-pat00098

    [화학식 XIX]
    Figure 112014022593651-pat00099

    [화학식 XX]
    Figure 112014022593651-pat00100

    [화학식 XXI]
    Figure 112014022593651-pat00101

    [화학식 XXII]
    Figure 112014022593651-pat00102

  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서,
    표적 단백질은 캐스파제-3(Caspase-3), HSP90(heat shock protein 90) 또는 스트렙트아비딘(streptavidin)인 것이 특징인 iFRET용 탐침.
  17. 제14항에 있어서,
    하기 화학식 XXIII, XXIV, 또는 XXVI 내지 XXXII로 구성된 군으로부터 선택된 화학식으로 표시되는 것이 특징인 iFRET용 탐침.
    [화학식 XXIII]
    Figure 112012050614407-pat00103

    [화학식 XXIV]
    Figure 112012050614407-pat00104

    [화학식 XXVI]
    Figure 112012050614407-pat00105

    [화학식 XXVII]
    Figure 112012050614407-pat00106

    [화학식 XXVIII]
    Figure 112012050614407-pat00107

    [화학식 XXIX]
    Figure 112012050614407-pat00108

    [화학식 XXX]
    Figure 112012050614407-pat00109

    [화학식 XXXI]
    Figure 112012050614407-pat00110

    [화학식 XXXII]
    Figure 112012050614407-pat00111

  18. 삭제
  19. 제7항 내지 제10항 및 제12항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 제2 iFRET용 탐침 또는 제14항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 기재된 iFRET용 탐침을, 표적 단백질이 함유된 샘플 내에 첨가하는 제1단계; 및
    표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적하는 제2단계를 포함하여,
    iFRET에 의해 표적 단백질을 검출 또는 이미지화하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    표적 단백질의 양 또는 표적 단백질의 활성을 측정하거나, 표적 단백질의 작용기전 또는 이동 경로를 추적하는데 사용되는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 iFRET용 탐침과 병용하여 특정 물질을 샘플 내에 첨가하고 표적 단백질 내 아미노산을 여기시키는 파장을 포함하는 빛을 조사하고 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적하는 제3단계를 더 포함하고,
    특정 물질의 존재 여부에 따라, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 빛을 조사하여 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛의 변화를 확인하여,
    표적 단백질에 대해 소정의 기능을 갖는 특정 물질을 스크리닝하거나 상기 특정 물질의 표적 단백질에 대한 기능을 확인하는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 특정 물질은 표적 단백질과 관련된 질환을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약물 또는 식품 첨가제인 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  23. 제19항에 있어서,
    샘플은 표적 단백질 자체, 세포, 조직(tissue), 혈액, 분뇨, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 및 생물체 자체로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  24. 제20항에 있어서,
    표적 단백질의 기능을 확인하거나, 다양한 검체로부터 질병관련 표적 단백질을 검출하는 방법으로 이용하여 질병진단하거나, 식품, 사료, 음료에서 미생물 혹은 미생물 유래 표적 단백질을 검출하는 방법으로 사용되는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  25. 제19항에 있어서,
    제2단계에서 iFRET용 탐침이 방출하는 빛 중 450nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 확인 또는 추적하는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  26. 제19항에 있어서,
    자동화 워크스테이션에 의해 수행되는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  27. 하기 화학식 XXIII로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXIII]
    Figure 112012050614407-pat00112

  28. 하기 화학식 XXIV으로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXIV]
    Figure 112012050614407-pat00113

  29. 하기 화학식 XXVI으로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXVI]
    Figure 112012050614407-pat00114

  30. 하기 화학식 XXVII으로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXVII]
    Figure 112012050614407-pat00115

  31. 하기 화학식 XXVIII으로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXVIII]
    Figure 112012050614407-pat00116

  32. 하기 화학식 XXIX으로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXIX]
    Figure 112012050614407-pat00117

  33. 하기 화학식 XXX으로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXX]
    Figure 112012050614407-pat00118

  34. 하기 화학식 XXXI으로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXXI]
    Figure 112012050614407-pat00119

  35. 하기 화학식 XXXII으로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 XXXII]
    Figure 112012050614407-pat00120

  36. 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법으로서,
    상기 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이고, 상기 형광분자는 하기 화학식 I 내지 XXII로 기재되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되어진 분자이고, 상기 iFRET용 탐침은 450 nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 방출하는 것이고,
    상기 iFRET용 탐침을 표적 단백질이 함유된 시료 내에 도입시키는 제1단계;
    표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 번갈아 제1단계에서 제조된 시료에 조사하는 제2단계; 및
    표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
    [화학식 I]
    Figure 112014022593651-pat00191

    [화학식 II]
    Figure 112014022593651-pat00192

    [화학식 III]
    Figure 112014022593651-pat00193

    [화학식 IV]
    Figure 112014022593651-pat00194

    [화학식 V]
    Figure 112014022593651-pat00195

    [화학식 VI]
    Figure 112014022593651-pat00196

    [화학식 VII]
    Figure 112014022593651-pat00197

    [화학식 VIII]
    Figure 112014022593651-pat00198

    [화학식 IX]
    Figure 112014022593651-pat00199

    [화학식 X]
    Figure 112014022593651-pat00200

    [화학식 XI]
    Figure 112014022593651-pat00201

    [화학식 XII]
    Figure 112014022593651-pat00202

    [화학식 XIII]
    Figure 112014022593651-pat00203

    [화학식 XIV]
    Figure 112014022593651-pat00204

    [화학식 XV]
    Figure 112014022593651-pat00205

    [화학식 XVI]
    Figure 112014022593651-pat00206

    [화학식 XVII]
    Figure 112014022593651-pat00207

    [화학식 XVIII]
    Figure 112014022593651-pat00208

    [화학식 XIX]
    Figure 112014022593651-pat00209

    [화학식 XX]
    Figure 112014022593651-pat00210

    [화학식 XXI]
    Figure 112014022593651-pat00211

    [화학식 XXII]
    Figure 112014022593651-pat00212
  37. 제36항에 있어서,
    제1 발광 신호값, 제2 발광 신호값 및 제3 발광 신호값은 시료의 2차원 각 지점에 대응되는 2차원적인 영상값인 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  38. 제36항에 있어서,
    제1광의 파장 범위는 260 ㎚ 내지 300 ㎚ 이고, 제2광의 파장 범위는 300 ㎚ 내지 400 ㎚ 인 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  39. 제36항에 있어서,
    표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 일정한 시간 간격으로 번갈아 조사하고,
    표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값으로부터 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값이 일정한 시간 간격으로 산출되고 축적되어, 시간에 따른 표적 단백질의 위치, 양 또는 둘다의 변화를 확인할 수 있는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  40. 제36항에 있어서,
    시간에 따른 표적 단백질의 변화는 동영상으로 산출되는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  41. 제36항에 있어서,
    표적 단백질의 양 또는 표적 단백질의 활성을 측정하거나, 표적 단백질의 작용기전 또는 이동 경로를 추적하는데 사용되는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  42. 제36항에 있어서,
    상기 iFRET용 탐침과 병용하여 특정 물질을 시료 내에 첨가하고 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 빛을 조사하여 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적하는 제4단계를 더 포함하고,
    특정 물질의 존재 여부에 따라, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 빛을 조사하여 상기 iFRET용 탐침이 발광하는 빛의 변화를 확인하여,
    표적 단백질에 대해 소정의 기능을 갖는 특정 물질을 스크리닝하거나 상기 특정 물질의 표적 단백질에 대한 기능을 확인하는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 특정 물질은 표적 단백질과 관련된 질환을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약물 또는 식품 첨가제인 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는이미지화 방법.
  44. 제36항에 있어서,
    샘플은 표적 단백질 자체, 세포, 조직(tissue), 혈액, 분뇨, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 및 생물체 자체로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  45. 제42항에 있어서,
    표적 단백질의 기능을 확인하거나, 다양한 검체로부터 질병관련 표적 단백질을 검출하는 방법으로 이용하여 질병진단하거나, 식품, 사료, 음료에서 미생물 혹은 미생물 유래 표적 단백질을 검출하는 방법으로 사용되는 것이 특징인 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법.
  46. 제42항에 있어서,
    자동화 워크스테이션에 의해 수행되는 것이 특징인 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법.
KR1020120068249A 2011-06-23 2012-06-25 ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도 KR101429247B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110061404 2011-06-23
KR20110061404 2011-06-23

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140027319A Division KR20140040194A (ko) 2011-06-23 2014-03-07 ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130001178A KR20130001178A (ko) 2013-01-03
KR101429247B1 true KR101429247B1 (ko) 2014-08-12

Family

ID=47423128

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120068249A KR101429247B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도
KR1020140027319A KR20140040194A (ko) 2011-06-23 2014-03-07 ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140027319A KR20140040194A (ko) 2011-06-23 2014-03-07 ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20140242606A1 (ko)
EP (1) EP2725357A4 (ko)
JP (1) JP6182525B2 (ko)
KR (2) KR101429247B1 (ko)
WO (1) WO2012177106A2 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7182496B2 (ja) 2019-03-12 2022-12-02 黒崎播磨株式会社 ノズル及びノズルとストッパーの構造体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6472156B1 (en) 1999-08-30 2002-10-29 The University Of Utah Homogeneous multiplex hybridization analysis by color and Tm
US20080311047A1 (en) 2005-11-16 2008-12-18 Thijs Kaper Multimetric Biosensors and Methods of Using Same

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207831B1 (en) * 1998-12-21 2001-03-27 Novartis Ag Fluorescent dyes (AIDA) for solid phase and solution phase screening
WO2002044720A2 (en) * 2000-11-30 2002-06-06 The Netherlands Cancer Institute Membrane molecule indicator compositions and methods
JP2002286642A (ja) * 2001-03-27 2002-10-03 Eikomu:Kk 生理活性アミンの分析法
JP2007040834A (ja) * 2005-08-03 2007-02-15 Japan Science & Technology Agency 免疫測定用試薬
JP2007217330A (ja) * 2006-02-16 2007-08-30 Dainippon Sumitomo Pharma Co Ltd 新規ペプチド
WO2008115262A2 (en) 2007-03-20 2008-09-25 Curis, Inc. Hsp90 inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2012176977A2 (ko) * 2011-06-23 2012-12-27 한국생명공학연구원 Ifret용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6472156B1 (en) 1999-08-30 2002-10-29 The University Of Utah Homogeneous multiplex hybridization analysis by color and Tm
US20080311047A1 (en) 2005-11-16 2008-12-18 Thijs Kaper Multimetric Biosensors and Methods of Using Same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biosensors and Bioelectronics, 25:112-117 (2009.) *
Biosensors and Bioelectronics, 25:112-117 (2009.)*
Miyawaki et al., Nature, 1997, 388:882-887 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2725357A2 (en) 2014-04-30
JP6182525B2 (ja) 2017-08-16
JP2014522965A (ja) 2014-09-08
WO2012177106A2 (ko) 2012-12-27
EP2725357A4 (en) 2015-04-08
US20140242606A1 (en) 2014-08-28
WO2012177106A3 (ko) 2013-04-11
KR20140040194A (ko) 2014-04-02
KR20130001178A (ko) 2013-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2099807B1 (en) Oxidation resistant indicator molecules
US20020119581A1 (en) Detection of analytes
US9784732B2 (en) Acidic environment-detecting fluorescent probe
Onoe et al. Development of photostabilized asymmetrical cyanine dyes for in vivo photoacoustic imaging of tumors
CN108398409A (zh) 一种荧光比率检测次氯酸根的方法
WO2008145609A1 (en) Method of making covalent conjugates with his-tagged proteins
Féau et al. Synthesis of a coumarin-based europium complex for bioanalyte labeling
KR101429247B1 (ko) ｉＦＲＥＴ용 탐침 및 이의 용도
KR101320097B1 (ko) 고유 형광 공명 에너지 전이용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징방법
CN108329336A (zh) 双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其合成方法和应用
AU3038001A (en) Detection reagent
CN113563298A (zh) 一类含水溶性取代基罗丹明荧光染料其制备方法和应用
US20020094586A1 (en) Detection of analytes
KR101445084B1 (ko) 시아닌계 형광 프로브, 이를 이용한 아연 이온 검출방법, 및 이의 제조방법
CN112341453A (zh) 一种基于香豆素的荧光探针及其制备方法和应用
KR102646848B1 (ko) 세포막에서 칼슘을 표지할 수 있는 이광자 청색 표지자
CN113845458B (zh) 一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶i的荧光探针及其制备方法与应用
US20230333019A1 (en) Two-photon fluorescent probes for simultaneously detecting calcium ions in organelles and lysosomal protons
CN109265440A (zh) 氮杂环类荧光探针的制备方法及在硫化氢检测中的应用
CN115448928B (zh) 一种半花菁罗丹明荧光探针及其制备方法和应用
WO2018092034A1 (en) Novel in-vivo probe for real time longitudinal monitoring of inducible nitric-oxide synthase in living cells and animals
JP2002518413A (ja) 新規な化合物
CN108395372B (zh) 双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其合成方法和应用
KR20230128703A (ko) 세포질 칼슘과 리소좀 내 산성도를 동시에 검출할 수 있는 이광자 형광 프로브
WO2007057428A1 (en) Chromophore containing ligands for characterisation of receptors for binding and activation

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170718

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181205

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181226

Year of fee payment: 18