KR101426098B1 - 판크레아틴 샘플내 바이러스 로드의 분리 및 측정방법 - Google Patents

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Abstract

판크레아틴 샘플로부터 바이러스 로드를 분리하고, 판크레아틴 샘플내의 바이러스 로드를 정량적으로 측정하는 방법이 명세서에 개시된다.
판크레아틴 샘플, 바이러스 로드

Description

판크레아틴 샘플내 바이러스 로드의 분리 및 측정방법{PROCESS FOR SEPARATING AND DETERMINING THE VIRAL LOAD IN A PANCREATIN SAMPLE}
본 발명은 판크레아틴 시료로부터 바이러스 로드(virus load)를 실질적으로 정량적으로 분리하기 위한 방법 및 판크레아틴 시료의 바이러스 로드를 정량적으로 측정하는 방법에 관한 것이다.
판크레아틴(pancreatin)은 포유류의 췌장샘으로부터 얻어지는 생리학적으로 활성인 다양한 성분들의 혼합물로서 오랜기간 동안 알려져 있다. 판크레아틴의 주요 성분들은 특히 췌장 리파아제뿐만 아니라, 아밀라아제 및 프로테아제와 같은 소화효소들이다. 그것들의 효과적인 치료 특성 및 사용시에 고도의 안정성으로 인하여, 판크레아틴은 효소 대체 치료법에 있어서 약학적 제제로서 오랫동안 매우 성공적으로 사용되어 왔다. 여기에서, 췌장 리파아제가 가장 중요한 의미를 가지나, 아밀라아제 및 프로테아제 또한 판크레아틴의 치료 효과에 큰 공헌을 한다. 치료목적을 위한 판크레아틴은 통상적으로 소(소의 판크레아틴) 또는 돼지(돼지의 판크레아틴)로부터 얻어지고, 돼지 판크레아틴은 양적인 면에 있어서 가장 큰 의미를 갖는다. 치료목적용 판크레아틴의 제조방법은, 예를 들면, EP 0 115 023 A에 개시되어 있다.
동물로부터 유래된 판크레아틴의 특성 때문에, 출발 물질들은 통상적으로 박테리아성 또는 바이러스성 오염물질과 같은 원치 않는 생물학적 성분들이 수반될 수 있다. 그러나, 판크레아틴을 포함하는 의약품들이 상품화된 백년 이상의 기간 동안, 환자들이 바이러스-오염된 판크레아틴에 의해 영향을 받은 사례는 없었다. 그럼에도 불구하고, 생물학적 조직 및/또는 체액으로부터 유래되는 의약품들을 제조하는 회사들은, 어떠한 염려되는 오염물질이 인간 병원균으로 작용하는지 않는지와는 별개로, 모든 오염물들을 가능한 낮은 수준으로 감소시킴으로써 그들의 제조품들의 안정도를 증가시키도록 규제기관으로부터의 압력이 심화되는 것을 경험하고 있다. 따라서, 의약품들에 판크레아틴을 적용하는 경우에, 이와 같은 생물학적 오염물들을 검출하고 정량하기 위한 믿을 수 있는 분석 방법을 갖는 것이 바람직하다.
지금까지는, 판크레아틴 샘플내의 바이러스성 오염물들을 정량적으로 검출하거나 또는 분리하기 위해 개발된 신뢰성 있는 방법들이 전혀 없었다. 이는, 판크레아틴의 효소적 활성 성분들은 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기술들을 이용하여 바이러스를 증식시키기 위해 통상적으로 사용되는 세포주(cell line)들과 공존할 수 없기 때문에, 판크레아틴 샘플내의 바이러스 역가(titer)를 측정하는 것은 매우 어렵거나 또는 심지어 불가능하다는 사실에 기인한다.
본 발명의 목적은 판크레아틴 시료로부터 바이러스 로드를 실질적으로 정량적으로 분리하기 위한 방법 및 이러한 판크레아틴 시료의 바이러스 로드를 정량적으로 측정하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은, 판크레아틴 시료로부터 감염성 바이러스 로드를 실질적으로 정량적으로 분리하기 위한 방법 및 이러한 판크레아틴 시료의 감염성 바이러스 로드를 정량적으로 측정하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하여, 먼저 다단계 원심분리 공정으로 판크레아틴 시료로부터 바이러스 로드를 분리하고, 그런 다음 상기 분리된 바이러스 로드를 공지된 바이러스학적인 방법들을 사용하여 정량적으로 측정하면, 판크레아틴 시료의 바이러스 로드, 특히 감염성 바이러스 로드는 실질적으로 정량적인 측정이 가능하다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
일본 특허공보 JP 12856990에서는 저속 원심분리와 초원심분리를 비특이적으로 조합시켜서 간염 바이러스를 농축하거나 또는 분리하기 위한 방법이 이미 개시되어 있다.
첫번째 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 판크레아틴 시료로부터 바이러스 로드를 분리하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 판크레아틴 시료의 바이러스 로드를 변화시키지 않으면서, 판크레아틴 시료로부터 원심분리에 적합한 액체 판크레아틴 테스트 샘플을 제조하는 단계,
b) 단계 a)에서 얻어진 판크레아틴 테스트 샘플의 적어도 일정 부분을, ≥120S의 침강계수를 갖는 바이러스가 펠렛을 형성하지 않는 조건하에서, 적어도 하나의 저속 원심분리에 적용시키는 단계;
c) 저속 원심분리를 하는 동안, 단계 b)에서 임의적으로 생기는 고체 침전물은 버리고, 판크레아틴 테스트 샘플의 상등액을 얻는 단계;
d) 단계 c)에서 얻어진 판크레아틴 테스트 샘플 상등액의 적어도 일정 부분을, 불연속 구배 매질내에서 초원심분리에 적용하는 단계, 여기에서 상기 초원심분리의 지속시간 및 초원심분리를 위한 상대적 원심력은 상기 판크레아틴 테스트 샘플 상등액으로부터, 상부의 최저 농도 구배 성분과 하부의 다음으로 높은 농도 구배 성분 사이의 경계층 위 또는 경계층내에 위치해 있는 표적 분획내로 바이러스 로드가 정량적으로 이동되도록 선택된다; 및
e) 상기 판크레아틴 테스트 샘플 상등액으로부터의 바이러스 로드를 포함하는 표적 분획을 정량적으로 분리하는 단계.
두번째 구체예에서, 본 발명은 판크레아틴 시료의 바이러스 로드, 특히 판크레아틴 시료의 감염성 바이러스 로드를 정량적으로 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 두번째 구체예에서는, 첫번째 구체예에 따른 방법에 추가하여, e) 단계 후에 추가적인 f) 단계인, 판크레아틴 시료의 바이러스 로드의 정량적 측정이 바이러스 로드를 포함하는 표적 분획내의 바이러스 감염 역가를 측정하므로써 수행되는 단계를 더 포함한다.
본 명세서에서 특별히 언급하지 않는 한, 하기에서 언급되는 모든 기술 및 과학적 용어들은, 각각의 경우에서 당 분야의 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 이하 인용되는 온도 범위, 예를 들면, "0~15℃" 는 각각의 경우에 범위 한계값을 포함하여 0℃에서 15℃까지의 온도 범위를 나타낸다. 이하 인용되는 시간범위, 예를 들면, "30~120분"은 각각의 경우에 범위 한계값을 포함하여 30분에서 120분까지의 시간 범위를 나타낸다. 이하 인용된 시간 범위, 예를 들면, "2~8시간"은 각각의 경우에 범위 한계값을 포함하여 2시간에서 8시간까지의 시간 범위를 나타낸다. 본 명세서에서 인용된 상대적 원심력의 범위, 예를 들면 "1,500~5,000×g"는 각각의 경우에 범위 한계값을 포함하여 1,500×g에서 5,000×g까지의 범위를 나타낸다. 이하 인용된 부피 범위, 예를 들면 "10~15ml"는 각각의 경우에 범위 한계값을 포함하여 10ml에서 15ml까지의 부피 범위를 나타낸다. 이하 인용된 길이 범위, 예를 들면 "80~100mm"는 각각의 경우에 범위 한계값을 포함하여 80mm에서 100mm까지의 길이 범위의 측정치를 나타낸다.
본 발명에 따른 방법은 동물 기원의 모든 타입의 판크레아틴에 적합하고, 특히 종래의 상업적인 돼지 판크레아틴 및 소 판크레아틴에 대해 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 돼지 판크레아틴 샘플에 대해서 수행하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 본 발명에 따른 방법은 판크레아틴 시료로부터 바이러스 로드를 분리하고, 이어서 판크레아틴 시료의 바이러스 로드를 정량적으로 측정하는데 적합하다. 특히, 상기 방법은 판크레아틴 시료들의 소 로타바이러스 A, 돼지 뇌심근염 바이러스(= EMCV), 돼지 써코바이러스(= PCV), 돼지 파보바이러스(= PPV), 돼지 로타바이러스 A, 돼지 테스코바이러스 및/또는 돼지 수포병바이러스(= SVDV)를 포함하는 바이러스 로드를 분리하고, 정량하는데에 적합하다. 인간 콕사키바이러스 B 5/1는 SVDV와 매우 유사한 특성들을 갖기 때문에, SVDV를 분리하고, 그리고/또는 정량하기 위한 본 발명에 따른 상기 방법들의 적합성을 검증하기 위한 모델로서 인간 콕사키바이러스 B 5/1가 사용될 수 있다. 소 로타바이러스 A는 돼지 로타바이러스 A와 매우 유사한 특성들을 갖기 때문에, 돼지 로타바이러스 A를 분리하고, 그리고/또는 정량하기 위한 본 발명에 따른 상기 방법들의 적합성을 검증하기 위한 모델로서 소 로타바이러스 A(예를 들면 변종(strain) B 223)가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 방법의 단계 a)에서, 원심분리에 적합한 액체 판크레아틴 테스트 샘플은, 바이러스 로드, 특히 감염성 바이러스 로드의 변화 또는 변형없이 판크레아틴 시료로부터 제조된다. 예를 들면, 이것은 판크레아틴 시료로부터 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액을 제조함으로써 진행될 수 있다. 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액은, 조사되는 바이러스 종들을 배양하기 위해 사용되는 세포주에 적합한 세포 배양 배지 및 상기 목적에 적합한 하나 이상의 항생물질(들)과 함께 판크레아틴 시료를 혼합하여 제조된다. 일반적으로, 모든 항생물질들은 단계 a)에서 임의적으로 사용되는 항생물질 용액을 제조하는데 적합하다. 일반적으로, 광범위-항생물질들(broad-spectrum antibiotics) 또는 상기 광범위-항생물질들의 혼합물들이 사용된다. 적합한 항생물질들은, 예를 들면, 페니실린, 세팔로스포린(옥사세펨 및 카르바세펨을 포함), 카르바페넴 및 모노박탐과 같은 β-락탐계 항생물질; 스트렙토마이신(스트렙토마이신 설페이트를 포함); 네오마이신(네오마이신 A, 네오마이신 B 및 파로모마이신을 포함); 카나마이신류(카나마이신, 젠타마이신, 아미카신 및 토브라마이신을 포함); 스펙티노마이신; 테트라사이클린류(테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 독시사이클린 및 미노사이클린을 포함); 마크로라이드계 항생물질(에리스로마이신, 클라리스로마이신, 록시스로마이신, 아지스로마이신, 조사마이신 및 스피라마이신을 포함); 자이라아제 억제제(날리딕신산, 시녹사신, 피페미드산, 노르플록사신, 페플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신 및 플레록사신을 포함); 엽산 길항제(술폰아미드계 항생물질, 디아미노 벤질피리미딘 및 이들의 조합물); 클로람페니콜; 린코사미드; 글리코펩티드계 항생물질(반코마이신 및 테이코플래닌); 포스포마이신; 폴리펩티드계 항생물질(폴리믹신 B, 콜리스틴, 바시트라신 및 타이로티신); 및 무피로신을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 항생물질로는 스트렙토마이신 설페이트, 페니실린, 및 예를 들면, 항생물질 "칵테일"로서 스트렙토마이신 설페이트와 페니실린의 혼합물이다. 상기 하나 이상의 항생물질(들)은 항생물질 용액으로서 예를 들면, 각각의 경우에 하나 이상의 항생물질(들)에 적합한 용매의 용액으로서 사용될 수 있다.
상기 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액은 통상적으로 0~15℃의 온도, 예를 들면 4~10℃의 온도로 냉각시키면서 제조된다. 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액을 제조하기 위한 구성성분들은 적어도 30분, 예를 들면 30~120분, 바람직하게는 45~90분, 특히 50분 또는 60분 동안 얼음으로 냉각시키면서 교반된다. 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액을 냉각시키는 목적과 모든 나머지 공정 단계들에서 냉각시키는 목적은, 판크레아틴 시료의 효소적으로 활성인 구성성분들에 의해 바이러스 로드의 원치 않는 비활성화를 피하거나 또는 적어도 실질적으로 감소시키기 위한 것이다. 또한, 하나의 구체예에서, 본 발명은 단계 a)에 따라 제조될 수 있는 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액을 제공하는 것이다.
단계 a)에서 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액을 제조함에 있어서 각각의 경우에 어떤 세포 배양 배지를 사용하는지는, 본 발명에 따른 방법에 의해 어떤 바이러스 종들이 분리되고, 그리고/또는 정량되는지에 따라 결정된다. 조사되는 바이러스 종들이 세포병변 효과(=CPE)를 개시할 수 있는 증식허용 세포배양이 특정한 바이러스 종들을 배양하고 검출하는데 사용된다. CPE는 광학현미경에 의해 식별가능한 바이러스-감염 세포들의 변형이다. 만약, 바이러스 종들이 CPE 없이 배양세포에서 증식한다하더라도, 일반적으로 이러한 증식은 공지된 간접적인 검출 방법들에 의해 확인될 수 있다.
예를 들면, 소 로타바이러스 A가 분리되고, 그리고/또는 정량적으로 측정된다면, 예를 들면, 태아(fetal) 원숭이 신장 세포(= MA-104 세포)가 그들의 배양에 사용될 수 있다. 이런 경우, 예를 들면 공지된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(= Dulbecco 배지)이, 세포 배양 배지로서 적합하다. 만약, EMCV가 분리되고, 그리고/또는 정량적으로 측정된다면, 돼지 신장 세포(= PK-15 세포) 또는 배아 돼지 신장 세포(=SPEV 세포)가 그들의 배양을 위해 사용될 수 있다. PK-15 세포의 경우, 예를 들면 공지된 최소 배양 배지(MEM: Minimal Essential Medium)가 세포 배양 배지로서 적합하다. SPEV 세포의 경우, 예를 들면 Dulbecco 배지가 세포 배양 배지로서 적합하다. 만약, 예를 들어 PCV가 분리되고, 그리고/또는 정량적으로 측정된다면, 예를 들면, PK-15 세포가 그들의 배양을 위해 사용될 수 있다. 만약, 예를 들면, PPV가 분리되고, 그리고/또는 정량적으로 측정된다면, 예를 들어, 돼지 신장 세포(SK-6 세포)가 그들의 배양을 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, 예를 들면, Dulbecco 배지가 상기 세포 배양 배지로서 적합하다. 만약, 예를 들어, 돼지 로타바이러스 A가 분리되고, 그리고/또는 정량적으로 측정된다면, 예를 들어, MA-104 세포가 그들의 배양에 사용될 수 있다. 만약, 예를 들어, 돼지 테스코바이러스가 분리되고, 그리고/또는 정량적으로 측정된다면, 예를 들어, PK-15 세포가 그들의 배양을 위하여 사용될 수 있다. 만약, 예를 들어, SVDV가 분리되고, 그리고/또는 정량적으로 측정된다면, 예를 들어, SPEV 세포가 그들의 배양을 위해 사용될 수 있다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자는 특별한 바이러스 종들을 배양하기 위한 적합한 세포주들 및 그에 상응하는 적합한 세포 배양 배지들을 알고 있다. 본 발명에 따라 사용가능한 바이러스 종들 및 그에 상응하는 세포주들은 적절한 공급처들, 예를 들면, "American Type Culture Collection", Manassas, USA(= ATCC)", "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Braunschweig, Germany(= DSMZ), "Friedrich-Loffler-Institut", Federal Research Institute for Animal Health, Insel Riems, Germany(= FLI) 또는 "Department of Agriculture and Rural Development"의 "Veterinary Service Division", Belfast, United Kingdom(= DARD)으로부터 얻을 수 있다.
단계 b)에서, 단계 a)에서 얻어진 판크레아틴 테스트 샘플은 전체로 사용될 수 있거나, 또는 판크레아틴 테스트 샘플의 일정 부분, 특히 상기 판크레아틴 테스트 샘플의 일정 부피로 사용될 수 있다. 단계 a)에서 얻어진 상기 판크레아틴 테스트 샘플이 전체로 사용되는 것이 바람직하다.
단계 b)에서, 저속 원심분리들의 경우, 침강계수 ≥120S, 특히 ≥120~5,000S인 바이러스가 펠렛을 형성하지 않는 조건이 수립될 수 있다. 저속 원심분리들이 각각의 경우에 10,000×g 미만, 바람직하게는 각각의 경우에 1,500~5,000×g, 특히 바람직하게는 각각의 경우에 2,000~3,500×g, 예를 들면, 각각의 경우에 2,700×g의 상대적 원심력으로 수행될 때에, 침강계수가 ≥120S, 특히 ≥120~5,000S인 바이러스들은 여전히 펠렛을 형성하지 않는다. 통상적으로, 저속 원심분리 단계의 시간은 적어도 5분, 일반적으로 5~60분, 특히 10~45분, 바람직하게는 10~30분, 예를 들면, 15분이다. 단계 b)의 바람직한 구체예에서, 저속 원심분리 단계들은 0~15℃, 예를 들면 4~10℃로, 바람직하게는 냉각된 원심분리기에서 냉각시키면서 수행된다.
단계 b)에서 저속 원심분리 단계의 목적은, 다음 단계에 적합한 판크레아틴 테스트 샘플 상등액을 얻기 위하여 판크레아틴 시료의 바이러스 로드를 분리하고, 그리고/또는 정량함에 따라 파괴되는 불용성 입자와 같은 판크레아틴 구성성분들을 판크레아틴 현탁액으로부터 일차적으로 제거하기 위한 것이다. 저속 원심분리 단계에서 임의적으로 얻어진 고체 침전물들은, 일반적으로 단계 c)에서 버려지는 반면에, 상기 상등액은 다음 단계 d)에서 사용된다. 저속 원심분리 단계와 그에 이어지는 임의적으로 얻어진 고체 침전물들의 폐기는, 고체 침전물들의 형성이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 통상적으로 반복한다. 통상적으로 저속 원심분리를 1~3회 반복 후, 특히 1회 반복 후에는, 저속 원심분리 단계와 그에 이어지는 임의적으로 얻어진 고체 침전물들의 폐기는 더 이상 반복할 필요가 없을 것이다. 본 발명의 구체예에서, 단계 b)에서 얻어지는 바와 같은 고체 침전물은 침강물일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 저속 원심분리 단계에서 얻어진 상기 침전물은, 버리기 전에 적합한 세척액으로 한번 이상, 예를 들면 1~3회 세척한다. 적합한 세척액의 예로는, 저속 원심분리 후에 얻어지는 상기 판크레아틴 테스트 샘플 상등액 자체이고, 이 상등액은 그 후 단계 d)에서 사용될 수 있다. 상기 판크레아틴 테스트 샘플 상등액 자체 이외의 다른 세척액이 사용된다면, 상기 침전물의 세척이 완료되면 상기 세척액은 상기 판크레아틴 테스트 샘플 상등액과 혼합되어, 다음 단계 d)에서 사용된다. 판크레아틴 시료의 바이러스 로드가 EMCV를 포함한다면, 단계 d)에서 사용되기 전에, 상기에서 언급된 방법으로 상기 침전물을 세척하는 것이 특히 바람직하다.
또한, 특정한 구체예로서, 본 발명은 상기에서 언급된 단계 a)~c)에 따라 제조될 수 있는 판크레아틴 테스트 샘플 상등액을 포함한다.
통상적으로 불연속 2상(two-phase) 수크로오스 구배가 단계 d)의 불연속 구배 매질로서 사용된다. 불연속 구배 매질은 바람직하게는 50%(wt./vol.) 수크로오스 완충액 및 20%(wt./vol.) 수크로오스 완충액으로부터 제조되는 구배를 포함한다. 예를 들면, 중성 완충액(즉, pH가 약 7인 완충액)은 수크로오스 용액에 대한 완충액으로서 사용될 수 있다. PBS 완충액(="phosphate buffered salin 완충액", pH 7.2)이 바람직하게 사용된다. 통상적으로 살균된 구배 매질이 사용된다. 상기 언급된 종류의 2상 불연속 수크로오스 구배는, 발견될 수 있는 상기 바이러스들에 대해 특히 적합한 침강 및 분리 조건들을 제공한다. 나아가, 불연속 수크로오스 구배, 특히 임의의 50%(wt./vol.) 수크로오스 완충액 및 임의의 20%(wt./vol.) 수크로오스 완충액으로부터 제조되는 상기에서 기술된 바와 같은 구배는, 임의적으로 존재하는 바이러스 로드를 불활성시키지 않기에 적합한 삼투조건을 나타낸다. 예를 들면, 단계 d)에 따른 초원심분리는, 판크레아틴 시료로부터 유래하는 바이러스 로드가 실질적으로 정량적으로 판크레아틴 테스트 샘플 상등액으로부터 불연속 구배 매질로 이동되는 것을 확실하게 해준다. 본 명세서에서 '실질적으로 정량적인'의 의미는, 테스트 샘플에 미리 첨가된 바이러스 로드가 완전히 회수되므로써, 첨가된 바이러스 로드의 역가와 초원심분리 후 회수된 역가의 차이가 바이러스 역가의 밑수가 10인 상용로그의 1/2스텝(= 0.5 log steps) 미만이거나 또는 그와 동일함을 의미한다. 나아가, 단계 d)에 따른 초원심분리는, 분리가 일어난 후 붕괴된 상들의 재혼합의 가능성이 없이 판크레아틴 테스트 샘플로부터 바이러스 로드를 기계적으로 분리하는 것이 가능하도록, 바이러스 로드가 판크레아틴 테스트 샘플로부터 충분히 멀리 떨어져 있는 표적 분획으로 이동되는 것을 확실하게 해준다.
통상적으로 단계 d)는 최고 농도 구배 매질의 일정부피를 초원심분리기 튜브내로 도입시키고, 그 위에 다음으로 낮은 농도의 구배 매질의 일정부피를 층상으로 도입하므로써 실시된다. 상기 공정은, 상기 바이러스 로드가 분리되어지는 원심분리에 적합한 일정부피의 액체 판크레아틴 테스트 샘플을 최종(최상)층으로 갖는 복수상(multiple-phase) 구배 매질을 얻기 위해 필요한 만큼 수회 반복한다. 2상 구배 매질의 경우에, 일정부피의 상기 다음으로 낮은 농도의 구배 매질 위를 원심분리에 적합한 일정부피의 액체 판크레아틴 테스트 샘플 또는 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액(판크레아틴 테스트 샘플 부피)으로 즉시 덮는다. 2상 구배 매질의 경우에 있어서, 상기와 같이 실시하므로써, 원심분리 튜브내의 상의 순서는 위에서 아래로, 판크레아틴 테스트 샘플 부피를 포함하는 첫번째층(최상층), 그 다음, 일정부피의 최저 농도 구배 매질(중간층; 예를 들면 20%(wt./vol.) 수크로오스 완충액), 및 마지막으로, 일정부피의 최고 농도 구배 매질(원심분리기 튜브의 바닥을 커버하는 바닥층; 예를 들면 50%(wt./vol.) 수크로오스 완충액)로 이루어지게 된다. 각각의 일정부피들을 적층시킬 때, 각각의 경계면에서 교류 또는 혼합이 일어나지 않도록 주의하여야만 한다.
단계 d)에서 표적 분획은, (i) 판크레아틴 테스트 샘플 부피로부터 충분히 멀리 떨어진 최저 농도 구배 매질의 일부분 및 (ii) 그 다음의 높은 농도 구배 매질의 전체 부분을 전형적으로 포함한다. 2상 구배 매질의 경우에 있어서, 상기 표적 분획은, 예를 들면, 판크레아틴 테스트 샘플 부피로부터 충분히 멀리 떨어져 있는 최저 농도 구배 매질의 일부분 및 원심분리기 튜브의 바닥까지 하향으로 연장되는 최고 농도 구배 매질의 전체 부분을 포함한다.
판크레아틴 테스트 샘플 부피로부터 충분히 멀어서, 이후의 분리를 가능하게 하는 표적 분획의 위치를 계산할 때, 입자들의 위치(즉, 판크레아틴 샘플로부터 분리된 바이러스 입자들의 위치)에 대해 계산된 값들은 통상적으로 가우스 분포의 최고점들을 나타낸다는 것을 명심해야 한다. 따라서, 상기 입자들은 그들의 계산된 위치의 상부와 하부에 분포될 것이다. 따라서, 판크레아틴 테스트 샘플 부피로부터 표적 분획의 원하는 거리를 측정할 때, 상기 입자 위치들의 가우스 분포를 고려하여 추가적인 마진을 포함시킬 필요가 있다. 침강계수가 ≥120S, 특히 ≥120~5,000인 입자들이, 초원심분리에 의하여 판크레아틴 테스트 샘플 부피로부터 최저 농도 구배 매질내로 적어도 10mm, 예를 들면 적어도 15mm, 적어도 20mm, 적어도 25mm 또는 적어도 30mm를 이동하면, 통상적으로 상기 바이러스 로드는 다음 분리를 위해 판크레아틴 테스트 샘플 부피로부터 충분히 먼 거리의 표적 분획으로 이동된다. 상기에서 설명된 2상 구배 매질의 경우에, 최소 농도 구배 매질은 20%(wt./vol.) 수크로오스 완충액이다. 초원심분리 단계의 하나의 변형예에 있어서, 침강계수 ≥120S, 특히 ≥120~5,000S인 모든 입자들은 최소 농도 구배 매질을 완전히 통과하여, 다음으로 높은 농도 구배 매질에 대한 경계층(예를 들면, "수크로오스 쿠션")에 농축된다. 당업자는 초원심분리를 위한 상응하는 조건들을 계산하고 실행하는 적절한 방법을 알고 있다. 적절한 초원심분리 조건들은 판크레아틴 샘플로부터 분리되어질 상기 바이러스(들)의 특성들(예를 들어, 밀도 및 침강계수)을 근거로 하여 결정될 수 있고, 이는 공지된 간소화 방법들(예를 들어, Lebowitz 등, "Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review"; Protein Science 11 (2002) 2067-2079 참고)을 적용할 수 있다.
초원심분리가 통상의 부피비를 사용하여 불연속 구배 매질, 바람직하게는 2상 불연속 수크로오스 구배에서 수행되는 조건에서, 초원심분리가 적어도 1시간, 일반적으로 적어도 2시간, 예를 들면, 2~8시간, 특히 3~6시간 동안 수행된다면, 바이러스 로드는 이어서 일어나는 분리에 적합한 표적 분획으로 일반적으로 이동된다. 본 발명에 따른 초원심분리에 있어서 적절한 상대적 원심력은 적어도 100,000×g, 예를 들면, 200,000~350,000×g이다. 초원심분리 단계의 하나의 구체예에서, 상기 단계는, 초원심분리를 수행하기 위한 통상적인 부피비 및 50% (wt./vol.) 수크로오스 완충액 및 20%(wt./vol.) 수크로오스 완충액으로부터 준비된 구배에서 200,000~350,000×g의 상대적 원심력으로 3~6시간 지속하여 수행된다. 상기 초원심분리 단계의 또 다른 구체예에서, 상기 단계는, 초원심분리를 수행하기 위한 통상적인 부피비 및 50% (wt./vol.) 수크로오스 완충액 및 20%(wt./vol.) 수크로오스 완충액으로부터 준비된 구배에서 250,000~300,000×g의 상대적 원심력으로 3.5~4.5시간 지속하여 수행된다. 초원심분리를 수행하기 위한 통상적인 부피비는, 예를 들면, 통상의 초원심분리기 튜브를 사용할 경우에 얻어진다. 여기에서, 통상의 초원심분리기 튜브는 10~15ml의 부피, 특히 12~13ml의 부피; 내경은 6~8mm, 특히 7mm; 및 높이는 80~100mm, 특히 85~95mm를 취하고 있다. 통상의 초원심분리기 튜브가 단계 d)에서 사용된다면, 최고 농도 구배 매질(예를 들면, 50%(wt./vol.) 수크로오스 완충액)의 부피는, 예를 들어 0.5ml가 될 수 있고, 다음으로 낮은 농도 구배 매질(예를 들면, 20%(wt./vol.) 수크로오스 완충액)의 부피는 예를 들어 4.5ml가 될 수 있으며, 그리고 판크레아틴 테스트 샘플 부피는, 예를 들어 5ml가 될 수 있다.
단계 d)의 구체예의 하나의 바람직한 변형예에 있어서, 다른 경우의 선택된 조건들에 상관없이, 초원심분리는 0~15℃, 바람직하게는 4~10℃로 냉각시켜서 수행된다.
상기 단계에서 사용될 수 있는 통상의 냉각 원심분리기들은 당업자에게 공지되어 있다. 스윙버킷 로터(swinging bucket rotor)를 구비한 냉각가능한 초원심분리기, 예를 들면, 모델 "TH-641" 스윙버킷 로터를 구비한 등록상표 Sorvall®의 초원심분리기와 같은 종래의 상업적으로 입수가능한 초원심분리기가 단계 d)에서 일반적으로 사용된다.
본 발명에 따른 저속 원심분리 단계 및 초원심분리 단계의 상기 서술된 설명은 당업자들에 의해, 특히 본 발명의 상세한 설명에 언급된 기술적인 정보의 도움으로, 원하는 수준으로 스케일 업 또는 다운될 수 있다.
단계 e)에서, 바이러스 로드를 포함하는 표적 분획은 판크레아틴 테스트 샘플 상등액으로부터 정량적으로 분리된다. 일반적으로 분리는 표적 분획의 미리 측정된 경계의 높이에 있는 초원심분리기 튜브상에 표시를 함으로써 진행된다. 그런 다음, 상기 경계면 위의 전체 부피는 나머지 부피로부터, 예를 들어 흡입에 의해 분리된다. 흡입은, 예를 들어 편의상 미리 살균되어 있는 통상적인 연동펌프(peristaltic pump), 튜빙(tubing) 및 모세관으로 진행될 수 있다. 적합한 펌핑 속도는, 예를 들면, 2ml/분이다. 흡입하는 동안에, 연동펌프 모세관은 항상 액체의 경계면의 상부에 위치하도록 주의를 요한다. 초원심분리기 튜브내에 남아있는 표적 분획은 일반적인 단일 채널 피펫, 바람직하게는 살균된 팁을 이용하는 공지된 방법으로 초원심분리기 튜브로부터 제거될 수 있다. 초원심분리기 튜브에 여전히 남아있을 수 있는 침전물은, 예를 들면 흡입을 반복하고, 단일 채널 피펫으로 재현탁을 시키면서 동시에 제거될 수 있다.
또한, 하나의 구체예에서, 본 발명은 단계 a)~e)에 따라 제조될 수 있는 분리된 표적 분획을 제공한다.
상기 판크레아틴 시료의 바이러스 로드를 정량적으로 측정하기 위한 방법이 실시되면, 단계 f)가 단계 e) 다음으로 수행된다. 단계 f)에서, 판크레아틴 시료의 바이러스 로드는 바이러스 로드를 포함하는 표적 분획내의 바이러스 감염 역가를 측정함으로써 정량적으로 결정된다. 표적 분획내에서의 바이러스 감염 역가의 정량은 공지된 바이러스학 연구 과정, 예를 들면, 공지된 바이러스 감염 역가 측정원리(= VITD)에 따라 진행할 수 있다.
상기 표적 분획은 바이러스 정량 테스트 샘플을 얻기 위하여, 예를 들면, 적합한 세포 배양 배지로 적절한 비율로 희석될 수 있다. 적합한 세포 배양 배지는 연구된 바이러스 종들의 기능에 따라 각각의 경우에 사용될 수 있는 것으로 상기에서 언급된 것들이다. 바이러스 감염에 대한 가양성의 히트(false positive hits)를 배제하기 위한 본 발명의 구체예에서, 희석되거나 또는 희석되지 않은 표적 분획은, 단계 f)에서 바이러스 로드의 정량적인 측정이 수행되기 전에, 마이크로필터를 통해 여과될 수 있다.
예를 들면, 적합한 희석은, 표적 분획을, 단계 d)에서 사용된 판크레아틴 테스트 샘플 상등액의 원래 부피까지, 세포 배양 배지로 희석시킴으로써 달성될 수 있다. 그런 다음, 첫번째 단계에서, 정량적인 VITD를 실시하기 위해서, 상기 바이러스 측정 테스트 샘플들의 희석물 시리즈들이 공지된 방법, 예를 들면 1:2, 1:5 또는 1:10의 희석 단계 또는 이들 희석 단계들의 조합에 의해 제조될 수 있다. 이후, 두번째 단계에서, 적합한 세포 현탁액이 상기 희석물 시리즈들로부터의 상이한 농도들의 바이러스 측정 테스트 샘플들에 공지된 방법으로 접종될 수 있고, 그 결과로 상기 상이한 농도들의 바이러스 측정 테스트 샘플들상에 세포층이 형성될 수 있다. 불활성 박테리아 또는 마이코플라즘(mycoplasm)과 같은 미생물들의 존재에 의해 야기될 수 있는 바이러스 감염에 대한 가양성 히트를 배제하기 위해, 바이러스 측정 테스트 샘플들을 검출 세포상에 접종하기 전에 그것들을 여과하는 것이 통상적으로 유리하다. 이후, 바이러스 측정 테스트 샘플 또는 희석된 바이러스 측정 테스트 샘플은, 예를 들면 0.1~10㎛(상한과 하한이 포함됨; =마이크로필터레이션), 통상적으로는 1㎛의 포어 사이즈의 마이크로필터와 같은 적합한 포어 사이즈의 필터를 통해 여과될 수 있다. 그런 다음, 여과물은 다음의 연구를 위해 테스트 샘플로서 사용될 수 있다. 이후, 세번째 단계에서, 상기 접종된 테스트 샘플들은 감염성을 나타내는 방식에 따라 감염도가 판독된다. 예를 들면, CPE가 세포층의 감염도를 나타내는 표지(indicator)로 사용될 수 있는 경우, CPE는 약 4~7일 후에 공지된 방법으로 판독된다. 여기에서 바이러스 측정 테스트 샘플의 적정(한계 희석)은 원래 존재하는 감염량의 정량을 가능하게 한다. 적정은, 통상적으로 계수 10, 즉 밑수가 10인 상용로그에 기초한 희석에 의해 진행된다. 실제로, 50% 감염용량(= ID50)이 통상적으로 계산된다. 평행 복수 배취(batch)들의 경우에, 확인된 ID50값은 CPE가 정확하게 절반의 배취에서 검출가능한, 바이러스 측정 테스트 샘플의 가장 높은(역수 (reciprocal)) 희석시의 ID50값에 상응한다. 상기 결과들은, 공지의 방법으로 임의적으로 추가적으로 계산에 의해 교정되거나 또는 수정될 수 있다. 바이러스 역가 계산에 있어서 가장 공통적으로 사용되는 방법들은 Spearman과 Karber(C. Spearman, Br. J. Psychol. 2 (1908) 227-242 및 G. Karber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162 (1931) 480-483; 또한 Bundesanzeiger [Federal gazette] no. 84, May 4 1994) 또는 Reed와 Muench(Reed, L.J., Muench, H. Am. J. Hyg. 27 (1938) 493-497 참고)에 따른 방법들이다.
또한, 상기 세포층의 감염의 다른 표지들로는, 예를 들면, 바이러스 항원 유도 또는 플라크 유도(plaque induction)가 사용될 수 있다. 당업자는, 예를 들면, H.W. Doerr와 W.H. Gerlich, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1st edition 2002에 의한 "Medizinische Virologie"와 같은 바이러스학 교재 또는 그것의 가장 최신판에 개시된 그러한 방법들과 그 방법들을 본 발명에 적용하는 것에 대해 잘 알고 있다.
다음 실시예들에 서술된 모든 작업들은 살균된 작업대에서 살균된 조건하에서 수행되었다. 바이러스학 실험실의 통상적인 과정들, 예를 들면, 안전성에 관련된 과정들은 준수되어져야 한다. 다음의 물질들이 특별히 사용되었다;
1. 항생물질 용액, 1.0g의 스트렙토마이신 설페이트 및 1.2g의 페니실린을 두번 증류된 20ml의 물에 용해시키고, 0.2㎛ 필터를 통해 여과하였다. 그런 다음, 상기 여과물들을 1ml의 분취량들로 나누고, 사용되기 전까지 -20℃에서 임의적으로 저장하였다.
2. Dulbecco 배지, SK 6세포, SPEV 세포 및 MA 104 세포용 세포 배양 배지;
3. 살균된 팁이 있는 단일 채널 피펫;
4. FCS, 바이오 휘태커(Bio Whittaker)사 제의 소태아혈청(= 혈청).
5. 플라스크 바닥의 면적이 각각 25, 75 또는 175㎠인 살균된 조직 배양 플라스크;
6. MEM, 1.5g/l 소듐 바이카보네이트 및 1mM 피루베이트가 함유된, PK-15세포용 세포 배양 배지;
7. 96 웰 및 뚜껑이 있는 살균된 마이크로타이터 플레이트들(microtiter plates);
8. 10% 판크레아틴 현탁액인 PAN 현탁액; 1.0g의 돼지 판크레아틴(달리 언급이 없으면)을 살균된 조건하에서 비이커내에 계량하고, 1ml의 항생물질 용액 및 (달리 언급이 없으면) 특정의 상응하는 8.0ml의 세포 배양 배지를 혼합하고, (달리 언급이 없으면) 냉각배스(ice bath)에서 60분 동안 교반하면서 현탁시킨다;
9. 파디 완충액(Pardee buffer), 파디 이산화탄소 완충액(Pardee's carbon dioxide buffer);
10. PBS, 살균된 "인산 완충염(phosphate buffered saline)" 용액(pH 7.2);
11. 살균된 피펫;
12. 살균된 트레이내의 살균된 피펫팁;
13. 밀봉되어 CO2-불침투성인 플라스틱팩("Anaerocult®", 머크사 제);
14. NatuTec GmbH사 제의 형광성(fluorescein) 이소티오시아네이트(= FITC) 콘쥬게이트된 다클론성 항-PPV 항체;
15. 살균된 15ml 및 50ml의 튜브;
16. 살균된 수크로오스 용액, 20%, PBS-완충액; 농도는 통상적인 굴절계를 이용하여 공지된 방법으로 적용된다;
17. 살균된 수크로오스 용액, 50%, PBS-완충액; 농도는 통상적인 굴절계를 이용하여 공지된 방법으로 조절된다;
18. 살균된 스크류탑 튜브(screw-top tubes);
19. 트립신 용액, "TrypL Express®", INVITROGEN사 제;
20. "ismaTec"사 제의, 최고 5.8ml/분의 펌프 속도를 나타내는 연동펌프;
21. 냉각 초원심분리기 "TH-641" 로터를 구비한 "Sorvall® Pro 80";
22. 살균된 초원심분리기 튜브, 9×90mm의 크기 및 11ml의 용량;
23. 희석 블록(Dilution blocks), 각각 1.0ml의 96웰;
24. FLI에 의해 공급되는 MA-104 세포;
25. DARD에 의해 공급되는 PK-15 세포;
26. FLI에 의해 공급되는 SK-6 세포;
27. FLI에 의해 공급되는 SPEV 세포;
28. 10% FCS를 포함하는 세포 배양 배지내에서 200,000세포들/ml로 테스트되기 위한 SK 6, SPEV 및 PK-15 세포의 세포 현탁액;
29. 15ml 용량의 살균된 팰콘 마이크로튜브(Falcon Microtubes)
실시예 1: 다양한 세포주들에 대한 판크레아틴의 유해효과의 조사
세포 배양을 이용하여 물질의 테스트 샘플들내의 바이러스를 검출하기 위하여, 세포에 대한 조사되는 판크레아틴 시료의 유해한 효과는, CPEs가 평가될 때 가음성(false negative) 결과를 배제할 수 있도록 확인하여야 한다. 하기 설명된 바와 같이, 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액의 유해한 효과를 확인하기 위한 연구들을 다양한 세포주들에 대해 수행하였다.
유해효과를 테스트하기 위해, 상기와 같이 제조된 PAN 현탁액의 0.5ml 분액을 취하였고, "판크레아틴 현탁액 테스트 샘플"이라고 표시하였다.
저속 원심분리: 나머지 상기 PAN 현탁액은 통상적인 냉각 원심분리기에서 4,000rpm(2700×g)으로 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다(스윙버킷 로터 no. 2704가 구비된 Megafuge® 1.0R Heraeus SEPATECH®). 저속 원심분리 후의 상등액을 냉각 원심분리기에서 4,000rpm(2700×g)으로 4℃에서 15분 동안 원심분리하고, "저속 원심분리 후의 상등액"이라고 표시하고, 바이러스 적정 및 초원심분리를 위해 사용하였다. 저속 원심분리 후, 각각의 경우에서 얻어지는 두개의 침전물을 혼합하고(각각 1ml), 각각 9ml의 적합한 세포 배양 배지내에 재현탁하고, "침전물"이라고 표시하였다.
초원심분리: 테스트 샘플인 "저속 원심분리 후의 상등액"으로부터 5.0ml를 취하여, 초원심분리기내에서 초원심분리 처리하였다. 이를 위하여, 테스트를 수행하기 위해 0.5ml의 50% 수크로오스 용액을 피펫을 이용하여 필요한 수의 초원심분리기의 튜브들에 주입하였다. 기울어진 각도로 유지된 초원심분리기 튜브들내에 상기 층 상에 4.5ml의 20% 수크로오스 용액을 조심스럽게 올리면, 상기 두 용액 사이가 분리된 층으로 구분되었다. 그런 다음, 상기와 같이 취한 "저속 원심분리 후의 상등액" 테스트 샘플 5.0ml의 층을 20% 수크로오스 용액상에, 요동쳐서 혼합되는 것을 피하면서, 다시 조심스럽게 올려 놓았다. 그런 다음, 초원심분리기 튜브들을 초원심분리 로터에 매달았다. 그런 다음, 로터의 반대편에 서로 위치한 두개의 초원심분리기 튜브들을, PBS로 균형을 맞추었고, 상응하는 홀더들에 끼워놓고, 연결된 뚜껑으로 단단히 밀봉하였다. 상기 홀더들을 로터에 끼워넣고 난 후, 상기 테스트 샘플들을 10℃에서 40,000rpm (273,799×g)으로 4시간 동안 원심분리하였다. 초원심분리 후, 상기 초원심분리기 튜브들을 살균된 작업대에서 홀더들로부터 제거하고, 초원심분리기 튜브의 바닥으로부터 측정한 1.5cm 높이에 마크를 표시해 두었다. 미리 살균된 튜빙과 모세관들이 있는 연동 펌프를 사용하여, 상기 마크 상부의 액체를 2ml/min의 펌프 속도로 초원심분리기 튜브로부터 흡입하였고, 이 때 상기 모세관은 항상 상기 액체의 상부 경계면에 위치해 있다. 상기 방법으로 얻어진 첫번째 분획을 "초원심분리 후의 상부 분획"이라고 표시하였다. 초원심분리기 튜브에 잔재하는 "초원심분리 후의 하부 분획"(1.5ml)은 각각 단일 채널 피펫을 이용하여 초원심분리기 튜브로부터 제거하였다. 초원심분리기 튜브의 바닥에 남아있을 가능성이 있는 모든 침전물은 단일 채널 피펫으로 반복적으로 끌어올려 재현탁시켰고, 상기와 같이 제거하였다. 상기 "초원심분리 후의 하부 분획"을, 각각 적합한 세포 배양 배지가 있는 살균된 계량 튜브(graduated tube)내에서, 원래 사용된 바이러스-포함 테스트 샘플 부피에 상응하는 부피인 5.0ml로 만들었다. 다음 공정시까지, 결과의 두개의 분획들을 4℃에서 보관하거나, 또는 각각의 경우에 연장보관하는 경우에는 -20℃에서 보관하였다.
그런 다음, 테스트 샘플들인 "판크레아틴 현탁액 테스트 샘플", "저속 원심분리 후의 상등액", (저속 원심분리 후의) "침전물", "초원심분리 후의 상부 분획" 및 (5.0ml로 구성된 후의) "초원심분리 후의 하부 분획"을 다양한 세포주들에 대하여 그들의 유해한 효과를 테스트하였다. 이를 위하여, 테스트될 테스트 샘플들의 희석물 시리즈들을 각각 제조하였다. 모든 테스트 샘플들을 각각 적합한 세포 배양 배지로 1:5의 희석물로부터 2배수씩 더 희석시켰다. 마이크로 플레이트내에서, 8평행렬로 배열된 웰 당 각각 PK-15 세포, SPEV 세포 또는 SK 6 세포를 포함하는 각각의 100㎕의 새롭게 제조된 세포 현탁액 분액에 상기에서 제조된 100㎕의 테스트 샘플 희석액들을 각각 첨가하였다. MA 104 세포를 테스트할 경우, 24시간 지난 세포층이 있는 마이크로 플레이트들을 사용하였다. 이를 위하여, 상기 세포 배지들을 각각 웰들로부터 제거하고, 혈청이 없는 100㎕의 새로운 세포 배양 배지로 대체하였고, 이로써 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 등으로 증가되는 희석율로 희석된 최종 테스트 샘플 희석액들을 만들었다. 대조구로서, 100㎕의 희석물 시리즈들 대신에 100㎕의 세포 배양 배지를 각각의 마이크로 플레이트의 8개의 웰들내에 도입하였다. 4ml의 파디 완충액을 포함하는 튜브 및 여과지를 함께 갖춘 플레이트들의 쌍들을 기밀용 파우치에 넣고, 밀봉 클립으로 단단히 밀봉하였다. 그런 다음, 상기 플레이트들을 7일 동안 36±1℃에서 배양시켰다. 배양처리 기간 동안, CPE의 정도, 즉, 판크레아틴의 유해한 효과의 결과로서 세포 파쇄 및/또는 세포들의 분해, 그리고 세포층의 변형의 부재에 대해서 현미경으로 매일 관찰하였다. 최종 평가는 7일 후에 실시하였다. 최종 판독시에 대조구들에서 이미 세포 분해가 일어났다면, 상기 적정을 반복하였다.
하기 표 1은 다양한 세포주들에 대한 다양한 테스트 샘플들의 유해한 효과를 테스트한 결과를 나타낸다. 만약 테스트 샘플이, 예를 들면 희석율 1:640까지의 최종 희석물에서는 유해하였으나, 희석율 1:1280의 희석물에서는 더 이상 유해하지 않았다면, 하기 표에서 이 샘플에 대하여 언급된 결과는 "테스트 샘플의 유해효과≥1:640, ＜1:1280"이다.
표 1
판크레아틴 현탁액들 및 그들의 하부 분획들의, 다양한 세포주들에 대한 유해효과 테스트 결과
세포주 PK-15 MA-104 SK 6 SPEV
테스트 샘플 희석율에 따른 테스트 샘플들의 유해효과
판크레아틴 현탁액 테스트 샘플 ≥1:640
< 1:1280		 ≥1:160
< 1:320		 ≥1:320
< 1:640		 ≥1:320
< 1:640
저속 원심분리 후의 상등액 ≥1:640
< 1:1280		 ≥1:160
< 1:320		 ≥1:320
< 1:640		 ≥1:320
< 1:640
침전물 ≥1:160
< 1:320		 ≥1:80
< 1:160		 ≥1:80
< 1:160		 ≥1:40
< 1:80
초원심분리 후의 상부 분획 ≥1:320
< 1:640		 ≥1:160
< 1:320		 ≥1:320
< 1:640		 ≥1:320
< 1:640
초원심분리 후의 하부 분획 ≥1:40
< 1:80		 ≥1:20
< 1:40		 ≥1:20
< 1:40		 ≥1:20
< 1:40
표 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 초원심분리 단계에서 처리되고, 바이러스 로드가 농축된 "초원심분리 후의 하부 분획"은, 상기 모든 다른 조사된 테스트 샘플들과 비교시 상기 연구된 세포주들에 대한 유해한 효과가 상당히 감소하는 것으로 명확하게 나타나 있다.
상기 비처리된 판크레아틴 현탁액의 테스트 샘플의 유해한 효과를 초원심분리 후의 하부 분획들의 효과와 비교한다면, MA-104 세포에 대한 상기 개시된 테스트에서 8 배수 희석에 의해 유해한 효과를 감소시킬 수 있었고, 그리고 다른 세개의 테스트된 세포들에 대한 각각의 테스트에서 16배수 희석에 의해 유해한 효과를 감소시킬 수 있었다. 상기 상등액은 판크레아틴 현탁액 테스트 샘플을 저속 원심분리로 2회 처리한 후에도 여전히 약간 불투명하였다. 초원심분리하는 동안에, 그들 불용성 입자들은 초원심분리기 튜브의 바닥에 얇은 침전물로서 가라앉았다. 또한, 상기 침전물은 재현탁되어, "초원심분리 후의 하부 분획"의 성분이 되었다. 따라서, 상기 침전물이 "초원심분리 후의 하부 분획"의 나머지 유해한 효과를 제공할 것으로 여겨지므로, 상기 침전물을 분리하여, 상기 침전물을 더 이상 재현탁시키지 않으므로써 상기 침전물로 인한 나머지 유해한 효과를 더 감소시킬 수 있다고 추정할 수 있다.
실시예 2: 높은 바이러스 역가가 부가된 판크레아틴 시료들의 조사
높은 바이러스 역가가 부가된 판크레아틴 시료들의 조사(= "고-스파이크 테스트") 목적은, 특히 본 발명에 따른 공정이, 살아있는 세포에 유해할 수 있는 판크레아틴 시료 및 그의 구성성분들로부터 바이러스 로드를 정량적으로 분리하기에 적합하다는 것을 보여주기 위한 것이다. 이를 위하여, 연구조사될 바이러스 각각의 고-역가 "스파이크 바이러스(spiked virus) 제조물들"은 공지된 방법으로 제조되었다. 여기에서, 고-역가는, 특히 (사용된 바이러스 종들의 기능으로서) 각각의 경우에 조사된 테스트 샘플의 ml 당 최대 "조직 배양 감염 용량(Tissue Culture Infectious Dose)"의 반값(= TCID50/ml)의 적어도 4스텝의 상용로그(=log)의 스파이크 바이러스 제조물의 역가를 의미하는 것으로 받아들여질 수 있다. PCV의 고-역가 스파이크 바이러스 제조물들은, 예를 들면, D-(+)-글루코사민 용액으로 배양하기 위해 사용되는 PK-15 세포를 사전처리함으로써 I. Tischer 등, Arch. Virol. 96 (1987) 39-57의 방법에 따라 얻어질 수 있다.
a. EMCV(변종 LC 75)의 고-스파이크 테스트
EMCV(변종 LC 75)의 고-역가(7.70±0.10 log TCID50/ml) 스파이크 바이러스 제조물 0.75ml 및 항생물질 용액 0.75ml를 PAN 현탁액(Dulbecco 배지 4.5ml에 판크레아틴 0.75g을 첨가하고, 얼음으로 냉각시키면서 50분 동안 교반함으로써 제조됨)에 첨가하였고, 결과의 현탁액을 10분 동안 더 교반하였다. 상기 현탁액 0.5ml를 바이러스 적정을 위하여 취하였고, 적정할 때까지 4℃에서 저장하였다(= "EMCV 고(high)-분획 1"). 잔여 현탁액을 4,000rpm(= 2,700×g) 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후의 상등액을 4℃ 및 4,000rpm으로 15분 동안 새로운 원심분리기 튜브에서 재원심분리하였다. 두번때 원심분리 후에 상등액을 살균된 튜브에 정량적으로 옮겼다(= "EMCV 고-분획 2"). 저속 원심분리 후에 두가지의 침전물을 총 6.5ml의 Dulbecco 배지에 재현탁하였고, 이들을 혼합하고, 4,000rpm 및 4℃에서 15분 동안 재원심분리하였다. 결과의 상등액을 살균된 튜브로 옮겼다. 침전물의 세척을 각각 6.5ml의 새로운 Dulbecco 배지로 2회 이상 반복하였다. 세가지의 세척액들을 혼합하였고, 바이러스 적정을 위하여 사용하였다(= "EMCV 고-분획 3"). 세 번의 세척 후에, 침전물을 6.5ml의 Dulbecco 배지에 재현탁하였고, 그런 다음 적정하였다(= "EMCV 고-분획 4").
5.0ml의 EMCV 고-분획 2를 상기에 개시된 실시예 1과 같이 불연속 수크로오 스 구배에서 초원심분리를 적용하였다. 초원심분리 후, 상부 분획(= "EMCV 고-분획 5") 및 하부 분획(= "EMCV 고-분획 6")을 각각 얻었고, 적정하였다.
희석율 3배수씩의 바이러스 희석물 시리즈들을 제조하였고, 이들 각각을 SPEW 세포 현탁액이 있는 마이크로 플레이트상에 12 평행렬로 12단계의 희석액들로 옮겼다. 스파이크 바이러스 - 10-3 희석액으로 적정; EMCV 고-분획 1 - 10-2 희석액으로 적정; EMCV 고-분획 2 - 10-2 희석액으로 적정; EMCV 고-분획 4 - 10-1 희석액으로 적정; EMCV 고-분획 3 - 10-2 희석액으로 적정; EMCV 고-분획 5 - 희석되지 않은 테스트 샘플로 적정; EMCV 고-분획 6 - 10-3 희석액으로 3회 적정.
상기 마이크로 플레이트들을 약 5% CO2 대기하에서 36±1℃에서 배양하였고, 6~7일 후, 웰들에서 CPE의 성장을 현미경으로 관찰하였다. 역가는, Spearman-Karber 방법에 따라 테스트 샘플들내에서 계산되었다. EMCV의 고-스파이크 테스트의 결과들을 하기 표 2에 나타내었다.
표 2 : 판크레아틴 현탁액들내에서의 EMCV에 대한 고-스파이크 테스트 결과
테스트 샘플 역가 로그 TCID 50 /ml 1) 테스트 샘플 부피 [ml] 바이러스 로드[log TCID 50 /ml + log 부피] 2)
스파이크 바이러스 (EMCV) 7.70±0.10 0.75 7.58±0.20
EMCV 고-분획 1 7.14±0.10 7.5 8.02±0.20
EMCV 고-분획 2 7.38±0.09 5 8.08±0.18
EMCV 고-분획 4 3.32±0.08 7.5 4.20±0.16
EMCV 고-분획 3 5.67±0.10 19.5 6.96±0.20
EMCV 고-분획 5 4.71±0.10 8.5 5.64±0.20
EMCV 고-분획 6 (1) 6.99±0.11 5 7.69±0.22
EMCV 고-분획 6 (2) 7.07±0.10 5 7.77±0.20
EMCV 고-분획 6 (3) 6.99±0.10 5 7.69±0.20
EMCV 고-분획 6에 대한 3개의 분획들의 평균값3) 7.02±0.053) 5 7.72±0.10
1) 수치는 개별 적정의 표준 편차이다; 2) 수치는 95%의 신뢰구간이다; 3) 수치는 3개의 측정값들의 표준 편차이다.
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 방법을 수행할 경우, 비처리된 스파이크 테스트 샘플(EMCV 고-분획 1 및 2)들의 바이러스 로드는, 일반적으로 허용되는 0.5로그 스텝의 변수의 범위를 고려하여, 초원심분리 후의 하부 분획(EMCV 고-분획 6)에서 적어도 대략 정량적으로 회수되었다. 또한 테스트 결과들로부터, 판크레아틴 시료 자체는 EMCV에 대해 억제작용 또는 비활성화 작용을 갖지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.
b. 돼지 파보바이러스의 고-스파이크 테스트
돼지 파보바이러스(PPV)는 성장하는 SK 6 세포내에서 배양될 수 있다. 상기 바이러스 수율이 너무 낮으면, 상기 바이러스를 배양 후에 농축한다.
PPV의 고-역가(4.75±0.06 log TCID50/ml) 스파이크 바이러스 제조물 1.0ml를 PAN 현탁액(7.0ml의 Dulbecco 배지를 첨가하고, 50분 동안 얼음 냉각시키면서 교반하므로써 제조됨)에 첨가하였고, 결과의 현탁액을 추가로 10분 동안 더 교반하였다. 0.5ml의 상기 현탁액을 바이러스 적정을 위하여 취하였고, 적정할때까지 4℃에서 저장하였다(="PPV 고-분획 1"). 나머지 현탁액을 4,000rpm(= 2,700×g) 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에 상등액을 4℃ 및 4000rpm에서 15분 동안 새로운 원심분리기 튜브에서 재원심분리하였다. 두번째 원심분리 후에 상등액을 살균된 튜브에 정량적으로 옮겼다(="PPV 고-분획 2"). 저속 원심분리 후에 두가지의 침전물을 총 9ml의 Dulbecco 배지로 재현탁하였고, 이들을 혼합하고, 4,000rpm 및 4℃에서 15분 동안 재원심분리하였다. 결과의 상등액을 살균된 튜브에 옮겼다. 침전물의 세척을, 각각 새로운 Dulbecco 배지 9ml로 2회 이상 반복하였다. 그런 다음 세가지의 세척 용액들을 혼합하였고, 바이러스 적정을 위하여 사용하였다(="PPV 고-분획 3"). 세번의 세척 후에, 침전물을 9ml의 Dulbecco 배지에 재현탁하였고, 그런 다음 적정하였다(="PPV 고-분획 4").
상기 실시예 1에 개시된 바와 같이, 5.0ml의 PPV 고-분획 2를 불연속 수크로오스 구배에서 초원심분리 처리하였다. 초원심분리 후에, 상부 분획(="PPV 고-분획 5") 및 하부 분획(="PPV 고-분획 6")들을 각각 얻어서 적정하였다.
희석율 3배수씩의 바이러스 희석물 시리즈들을 제조하였고, 이들 각각을 SK 6 세포 현탁액이 있는 마이크로 플레이트 상에 12 평행렬로 12단계의 희석액들로 옮겼다. 마이크로 플레이트들을 약 5% CO2 대기하에서 36±1℃에서 배양하였고, 6~7일의 기간 동안 웰들내의 CPE의 성장을 현미경으로 관찰하였다. 상기 배양과정 후 에, 상기 플레이트들에 얼음 냉각된 아세톤/메탄올 혼합물을 첨가하여 고정하였고, 불특정된 CPE가 있는 웰들을 FITC-표지 항-PPV 항체를 이용하여 추가적으로 최종 역가 측정을 위해 배양하였고, 그런 다음 UV 광현미경하에서 관찰하였다. 역가는 Spearman-Karber 방법에 따라 테스트 샘플들에서 계산된다.
표 3 : 판크레아틴 현탁액들의 PPV를 이용한 고-스파이크 테스트 결과
테스트 샘플 역가 로그 TCID 50 /ml 1) 테스트 샘플 부피 [ml] 바이러스 로드[log TCID 50 /ml + log 부피] 2)
스파이크 바이러스 (PPV) 4. 95±0.15 1 4.95±0.30
PPV 고-분획 1 3.56±0.08 10 4.56±0.16
PPV 고-분획 2 4.47±0.08 5 5.17±0.16
PPV 고-분획 4 2.08±0.11 10 3.08±0.22
PPV 고-분획 3 2.38±0.09 27 3.81±0.18
PPV 고-분획 5 < 3.15 8.5 < 4.08
PPV 고-분획 6 (1) 4.67±0 5 5.37±0
PPV 고-분획 6 (2) 4.43±0.08 5 5.13±0.16
PPV 고-분획 6 (3) 4.47±0.08 5 5.17±0.16
PPV 고-분획 6에 대한 3개의 분획들의 평균값3) 4.52±0.13 3) 5 5.22±0.26
1) 수치는 개별 적정의 표준 편차이다; 2) 수치는 95%의 신뢰구간이다; 3) 수치는 3개의 측정값들의 표준 편차이다.
표 3에서 알 수 있듯이, EMCV 고 스파이크 실험에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제조방법을 성공적으로 수행하면, 비처리된 스파이크 테스트 샘플들(PPV 고-분획들 1 및 2)의 바이러스 로드는, 일반적으로 허용되는 0.5 로그 스텝의 변수의 범위를 고려하여, 초원심분리 후의 하부 분획(PPV 고-분획 6)에서 적어도 대략 정량적으로 회수되었다. PPV 고-분획 1에서는, 즉, 불용성 입자들의 존재하에서는, PPV 고-분획 2에서 보다 1 로그-스텝만큼 더 낮은 역가가 측정된다. 따라서, 불용성 성분들의 존재는 적정을 분명히 방해한다. 또한, 판크레아틴 시료 자 체는 PPV에 대한 억제작용 또는 비활성화 작용을 갖지 않는다는 것을 상기 테스트 결과들로부터 결론지을 수 있다.
실시예 2: 낮은 바이러스 역가가 부가된 판크레아틴 샘플들의 조사
낮은 바이러스 역가가 부가된 판크레아틴 샘플들의 조사(="저-스파이크 테스트") 목적은, 특히, 각각의 경우에 사용된 바이러스에 대한 본 발명에 따른 공정의 검출한계를 확인하기 위한 것이다. 만약, 원래 첨가된 스파이크 바이러스 제조물의 바이러스 역가가, 일반적으로 허용되는 0.5 로그 스텝들의 변수의 범위를 고려하여, 초원심분리 후의 하부 분획들내에서 적어도 대략 정량적으로 회수된다면, 낮은 바이러스 역가를 갖는 각각의 테스트 샘플들내의 바이러스 로드의 정량적 검출은 성공적인 것으로 간주된다.
a. EMCV를 이용한 저-스파이크 테스트
(2.5g의 돼지 판크레아틴, 2.5ml의 항생물질 용액, 20ml의 Dulbecco 배지로 된) PAN 현탁액을 제조하였다. 그런 다음, 저-스파이크 테스트를 서로 독립적인 테스트로 2회 실시하였다:
첫번째 테스트에서, 하기에서 언급된 배취들은 PAN 현탁액 및 EMCV 스파이크 바이러스 용액으로부터 제조되었다:
1) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-3 희석액 0.5ml; 결과적으로 10-4 희석액;
2) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-4 희석액 0.5ml; 결과적으로 10-5 희석액;
3) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-5 희석액 0.5ml; 등
4) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-6 희석액 0.5ml;
5) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-7 희석액 0.5ml;
6) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-8 희석액 0.5ml.
모든 배취들을 실온에서 1시간 동안 배양하였고, 그런 다음, 4℃ 및 4,000rpm(2,700×g)에서 15분 동안 저속 원심분리 처리하였다. 저속 원심분리 후에 상등액들을 각각 새로운 원심분리기 튜브들로 옮기고, 같은 조건하에서 추가로 저속 원심분리 처리하였다. 필요하다면, 저속 원심분리들 후의 상등액들을 세포 배양 배지를 이용하여 5.0ml의 부피로 증가시키고, 저속 원심분리들 후의 각각의 상등액들 5.0ml를, 상기에 개시된 실시예 1과 같이 불연속 수크로오스 구배에서 초원심분리 처리하였다. 초원심분리 후에, 상부 분획들(="EMCV 저-분획 2"; 초원심분리기 튜브의 하향 1.5cm까지)을 각각 연동펌프로 펌핑하여 배출하였고, 각각의 하부 분획들(= "EMCV 저-분획 3")을 피펫으로 초원심분리기 튜브로부터 제거하였다. 초원심분리 후의 상기 하부 분획들을 MEM을 이용하여 5.0ml로 각각 만들고, 그런 다음 적정하거나 또는 조직 배양 플라스크에서 배양하기 위해 사용하였다.
그런 다음, 상기 언급된 배취들 1)~3)의 각각으로부터 희석율 3배수씩의 바 이러스 희석물 시리즈들을 제조하였고, 이들 각각을 SPEV 세포 현탁액이 있는 마이크로 플레이트 상에 12 평행렬로 12단계의 희석액들로 옮겼다(웰 당, 200,000세포들/ml인 새롭게 제조된 SPEV 세포의 세포 현탁액 100㎕). 모든 배취들의 EMCV 저-분획 3의 테스트 샘플들을 바닥면적이 25㎠이고, 200,000세포들/ml인 새롭게 제조된 SPEV 세포의 세포 현탁액 10ml가 각각 들어있는 세포 배양 플라스크들내로 추가적으로 옮겼다. 그런 다음, 각각의 테스트 샘플에 대하여 6개의 조직 배양 플라스크들을, 0.2ml의 테스트 샘플 EMCV 저-분획 3으로 감염시켰다. 동시에, 대조구는 어떤 첨가 없이 하나의 조직 배양 플라스크에 제공되었다. 모든 적정 플레이트들 및 조직 배양 플라스크들을 36±1℃에서 배양시키고, 6~7일의 기간 동안, 웰들내 또는 조직 배양 플라스크들내에서의 CPE의 성장에 대해서 현미경으로 관찰하였다. 역가는 Spearman-Karber 방법에 따라 적정된 테스트 샘플들에서 계산된다.
7일 후, CPE가 배취의 6개의 조직 배양 플라스크 중 어느 것에서도 발견되지 않으면, 그들 플라스크들을 -70℃에서 냉동시키고, 다시 해동시키는 것을 3회 반복하였다. 모든 조직 배양 플라스크들의 내용물들을 혼합하고, 0.1㎛(포어 사이즈) 필터를 통하여 여과하였다. 결과의 여과액은 SPEV 세포 현탁액에 대한 두번째 패스(pass)를 위해 사용되었다: 각각 10ml의 새로운 SPEV 세포 현탁액을 포함하는 2개의 조직 배양 플라스크들을 첫번째 패스로부터 얻어진 2ml의 현탁액으로 감염시켰고, 또한 7일 동안 36±1℃에서 배양하였고, CPE의 성장을 관찰하였다. 만약, CPE가 두번째 패스에서도 관찰되지 않으면, 세번째 패스를 추가적으로 실시하였다. 만약, 음성 결과가 세번째 패스에서 발견된다면, 원래 테스트 샘플을 EMCV가 없는 것으로 추정될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 사용된 판크레아틴 시료 1.0g 당 하나의 감염 단위의 EMCV의 검출 한계는 EMCV의 점진적 희석액들을 사용한 상기 언급된 저-스파이크 테스트들에서 확인하였다.
b. PPV를 이용한 저-스파이크 테스트
(2.5g의 돼지 판크레아틴, 2.5ml의 항생물질 용액, 20ml의 Dulbecco 배지로 된) PAN 현탁액을 제조하였다. 그런 다음, 저-스파이크 테스트를 서로 독립적인 테스트로 2회 실시하였다:
이를 위하여, 하기에 언급된 배취들을 PAN 현탁액 및 PPV 스파이크 바이러스 용액으로부터 제조하였다:
1) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-1 현탁액 0.5ml;
2) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-2 현탁액 0.5ml;
3) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-3 현탁액 0.5ml;
4) 4.5ml의 판크레아틴 현탁액 + 스파이크 바이러스의 10-4 현탁액 0.5ml;
모든 배취들을 실온에서 1시간 동안 배양하였고, 그런 다음 4℃ 및 4,000 rpm(2,700×g)에서 15분 동안 저속 원심분리 처리하였다. 저속 원심분리 후에 상등액들을 각각 새로운 원심분리기 튜브들로 옮기고, 같은 조건하에서 추가로 저속 원심분리 처리하였다. 필요하다면, 저속 원심분리들 후에 상등액을 세포 배양 배지를 이용하여 5.0ml의 부피로 증가시키고, 저속 원심분리들 후의 각각의 5.0ml의 상등액들을 상기 언급된 실시예 1과 같이 불연속 수크로오스 구배에서 초원심분리 처리하였다. 초원심분리 후에, 상부 분획들(= "PPV 저-분획 2"; 초원심분리기 튜브의 하향 1.5cm까지)을 각각 연동펌프로 펌핑하여 배출하였고, 각각의 하부 분획들(= "PPV 저-분획 3")을 피펫으로 초원심분리기 튜브로부터 제거하였다. 초원심분리 후의 상기 하부 분획들을 각각 Dulbecco 배지를 이용하여 5.0ml로 만들고, 그런 다음 적정하거나 또는 조직 배양 플라스크들에서 배양하기 위해 사용하였다.
그런 다음, 상기 언급된 배취들 1)~3)의 각각으로부터 희석율 3배수씩의 바이러스 희석물 시리즈들을 제조하였고, 이들 각각을 SK-6 세포 현탁액이 있는 마이크로 플레이트상에 8 평행렬로 12단계의 희석액들로 각각 옮겼다(웰 당, 200,000세포들/ml인 새롭게 제조된 SK-6 세포의 세포 현탁액 100㎕).
각각의 배취들에 대한 6개의 조직 배양 플라스크들을 0.2ml의 PPV 저-분획 3으로 감염시켰다. 동시에, 대조구는 어떤 첨가물의 첨가없이 하나의 조직 배양 플라스크에 의해 제공되었다. 모든 적정 플레이트들 및 조직 배양 플라스크들을 36±1℃에서 배양하였고, 6~7일의 기간 동안, 웰들 내 또는 조직 배양 플라스크들 내에서의 CPE의 성장에 대하여 현미경으로 관찰하였다. 역가는 Spearman-Karer 방법에 따라 적정된 테스트 샘플들내에서 계산된다.
7일 후, CPE가 배취의 6개의 조직 배양 플라스크들 중 어느 것에서도 관찰되지 않는다면, 그들 플라스크들을 -70℃에서 냉동시키고, 다시 해동시키는 것을 3회 반복하였다. 모든 조직 배양 플라스크들의 내용물들을 혼합하고, 0.1㎛(포어 사이 즈) 필터를 통하여 여과하였다. 결과의 여과액은 SK-6세포 현탁액에 대한 두번째 패스(pass)를 위해 사용되었다: 각각 10ml의 새로운 SK-6세포 현탁액을 포함하는 2개의 조직 세포 플라스크들을 첫번째 패스로부터 얻은 2ml의 현탁액으로 감염시켰고, 또한 7일 동안 36±1℃에서 배양시켰고, CPE의 성장을 관찰하였다. 만약, CPE가 두번째 패스에서도 관찰되지 않으면, 세번째 패스를 추가적으로 실시하였다. 세번째 패스에서도 CPE가 발견되지 않으면, 7일 후에 세번째 패스 플라스크들로부터 세포 배양 배지를 제거하였고, 세포층을 얼음 냉각된 아세톤/메탄올(80:20 vol./vol.)로 고정하였다. 이어서, 감염된 세포들을 FITC-표지된 항-PPV 항체에 의해 조직 배양 플라스크들내에서 검출하였다(플라스크 당 1ml의 항체 용액; 37℃에서 60분 동안 배양, 세척완충액으로 세척하고, 이어서 UV광 하에서 현미경에 의해 관찰하였다). 만약, 세번째 패스 플라스크들에서 감염된 세포들이 없다면, 원래 테스트 샘플은 PPV가 없는 것으로 간주하였다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 사용된 1.0g의 판크레아틴 샘플 당 하나의 감염 단위의 PPV의 검출 한계는 PPV의 점진적 희석액들을 이용한 상기 언급된 저-스파이크 테스트들에서 확인하였다.

Claims (19)

  1. 다음의 단계들을 포함하는, 판크레아틴 시료로부터 바이러스 로드를 분리하기 위한 방법:
    a) 판크레아틴 시료의 바이러스 로드를 변화시키지 않으면서, 판크레아틴 시료로부터 원심분리를 위한 액체 판크레아틴 테스트 샘플을 제조하는 단계,
    b) 단계 a)에서 얻어진 판크레아틴 테스트 샘플 또는 그의 일부를, ≥120S의 침강계수를 갖는 바이러스가 펠렛을 형성하지 않는 조건하에서, 저속 원심분리에 적용시키는 단계;
    c) 저속 원심분리를 하는 동안, 단계 b)에서 생기는 고체 침전물은 버리고, 판크레아틴 테스트 샘플의 상등액을 얻는 단계;
    d) 단계 c)에서 얻어진 판크레아틴 테스트 샘플 상등액 또는 그의 일부를, 불연속 구배 매질내에서 초원심분리에 적용하는 단계, 여기에서 상기 초원심분리의 지속시간은 2~8시간이고, 상기 초원심분리를 위한 상대적 원심력은 100,000~350,000×g이다; 및
    e) 상기 판크레아틴 테스트 샘플 상등액으로부터의 바이러스 로드를 포함하는 표적 분획을 정량적으로 분리하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, e) 단계 후, 상기 바이러스 로드를 포함하는 표적 분획내의 바이러스 감염 역가를 측정함으로써 수행되는, 판크레아틴 시료의 바이러스 로드를 정량적으로 측정하는 f) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 희석된 또는 비희석된 표적 분획은, 바이러스 로드의 정량적인 측정이 수행되기 전에 마이크로필터를 통하여 여과되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 단계 a)에서의 판크레아틴 테스트 샘플은, 판크레아틴 시료를 조사되어질 바이러스 타입을 배양하기 위해 사용되는 세포주를 위한 세포 배양 배지 및 하나 이상의 항생물질과 조합하므로써 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액으로서 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 판크레아틴 테스트 샘플 현탁액의 제조는 0~15℃의 온도로 냉각시키면서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 단계 b)에서의 저속 원심분리는 각각의 경우에 1,500~10,000×g의 상대적 원심력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 단계 b)에서의 저속 원심분리는 각각의 경우에 1,500~5,000×g의 상대적 원심력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 단계 b)에서의 저속 원심분리는 5~60분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1항에 있어서, 단계 b)에서의 저속 원심분리 및 단계 d)에서의 초원심분리는 각각 0~15℃의 온도로 냉각시키면서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 단계 d)에서 도입되는 불연속 구배 매질은 불연속 2상 수크로오스 구배인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 불연속 구배 매질은 50%(wt./vol.) 수크로오스 완충액 및 20%(wt./vol.) 수크로오스 완충액으로부터 제조되는 구배인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 판크레아틴 시료는 돼지 판크레아틴 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 판크레아틴 테스트 샘플의 바이러스 로드는 소 로타바이러스 A, 뇌심근염 바이러스, 돼지 써코바이러스, 돼지 파보바이러스, 돼지 로타바이러스 A, 돼지 테스코바이러스 및 돼지 수포병바이러스로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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