KR101562682B1 - 판크레아틴 샘플내의 바이러스 로드의 분리 및 정량을 위한 신규방법 - Google Patents

판크레아틴 샘플내의 바이러스 로드의 분리 및 정량을 위한 신규방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 판크레아틴 샘플로부터 바이러스 로드를 분리하는 방법 및 판크레아틴 샘플 내의 상기 바이러스 로드의 고감도 정량적 결정방법들을 제공한다.

Description

판크레아틴 샘플내의 바이러스 로드의 분리 및 정량을 위한 신규방법{NOVEL PROCESS FOR SEPARATING AND DETERMINING THE VIRAL LOAD IN A PANCREATIN SAMPLE}
본 발명은 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드를 실질적으로 정량적으로 분리하기 위한 방법 및 이 판크레아틴 표본의 바이러스 로드를 고감도로 정량하기 위한 방법에 관한 것이다.
판크레아틴은 포유동물의 췌장 선들(glands)로부터 수득된 각종 생리학적 활성 성분들의 오랫동안 알려진 혼합물이다. 판크레아틴의 주성분들은 소화 효소들, 특히 췌장 리파제이지만, 아밀라제들 및 프로테아제들도 존재한다. 사용에 있어서 그의 값진 치료적 성질들 및 높은 수준의 안전성으로 인해, 판크레아틴은 효소 대체 치료법에서 약학 제제로서 오랫동안 매우 성공적으로 사용되어 왔다. 췌장 리파제는 이러한 점에서 가장 중요하지만, 아밀라제들 및 프로테아제들 또한 판크레아틴의 치료 이익에 상당히 기여한다. 치료 목적을 위한 판크레아틴은 대개 소류("소 판크레아틴") 또는 돼지류("돼지 판크레아틴")로부터 수득되지만, 양적인 면에서는 돼지의 판크레아틴이 더 현저하다. 치료 목적의 판크레아틴의 생산방법은 예로서 공보 EP O 115 023A로부터, 본질적으로 알려져 있다.
판크레아틴의 동물 유래 성질로 인하여, 출발물질들은 전형적으로 박테리아 또는 바이러스성 오염물질들과 같은, 원하지 않는 생물학적 성분들을 수반할 수 있다. 그러나, 100년이 넘는 판크레아틴 포함 약학 제품들의 상업화 동안, 환자들이 바이러스로 오염된 판크레아틴에 의해 영향을 받은 경우는 보고된 바가 없다. 그럼에도 불구하고, 생물학적 조직들 및/또는 신체 분비액들로부터 유래된 약학 제품들을 생산하는 회사들은, 어떤 고려되는 오염물질이 인간 병원균인지 아닌지의 여부에 관계없이, 모든 오염물질들을 가능한 한 최저 수준으로 감소시켜 그 제품들의 안전 수준을 높이라는 규제 당국들로부터의 증가된 압력을 받고 있다. 약물학적 제품들에 판크레아틴을 적용하는 경우, 그러한 생물학적 오염물질들을 검출 및 정량하기 위한 신뢰성있는 분석방법들을 갖는 것이 바람직하다.
최근까지, 판크레아틴 샘플에서 바이러스성 오염물질들을 정량적으로 검출 또는 분리하기 위한 신뢰성있는 방법들은 개발되지 않았다. 이는 판크레아틴의 효소적 활성 성분들이 당업자에게 알려진 기술들을 사용하여 바이러스들을 증식시키는데 전형적으로 사용된 세포주들(cell lines)과 상용가능하지 않다는 사실로 인한 것일 수 있으며, 이로 인해 판크레아틴 샘플 내에서 바이러스 역가를 결정하는 것은 더욱 어렵거나 또는 심지어는 불가능하게 된다.
최근에서야, 판크레아틴 샘플 내에서 바이러스 로드의 분리 및 검출을 가능하게 하는 방법이 개발되었다. 미공개된 특허출원 PCT/EP2007/054880호 참조. 그러나, 판크레아틴과 같이, 동물들로부터 유래된 제제들의 바이러스 로드는 매우 낮기 때문에, 약학 제제들 내에서, 특히 약학 용도의 판크레아틴 제제들 내에서 바이러스 로드의 분리 및 정량을 위한 고감도의 방법들의 제공에 대한 계속적인 필요가 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드를 실질적으로 정량적으로 분리하기 위한 고감도의 방법 및 그 판크레아틴 표본의 바이러스 로드를 정량하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 판크레아틴 표본으로부터 감염성 바이러스 로드를 실질적으로 정량적으로 분리하는 방법 및 그 판크레아틴 표본의 감염성 바이러스 로드를 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
판크레아틴 표본의 바이러스 로드, 특히, 감염성 바이러스 로드는, 바이러스 로드가 다단계 원심분리 공정에서 판크레아틴 표본으로부터 먼저 분리되고, 그 후 분리된 바이러스 로드가 알려진 바이러스학적 방법들을 사용하여 정량된다면, 고감도로 실질적으로 정량될 수 있다는 것이 놀랍게도 이제 발견되었다.
공보 JP 12856990호는 저속 원심분리 및 초원심분리의 비특이적 조합에 의한 간염 바이러스들의 농축 또는 분리 방법들을 이미 개시하였다.
첫번째 구체예에서, 본 발명은 다음의 공정 단계들을 포함하는, 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드를 분리하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 생산 과정 동안 판크레아틴 표본의 바이러스 로드를 변화시키지 않으면서, 판크레아틴 표본으로부터 원심분리에 적합한 액체 판크레아틴 시험 샘플을 생산하는 단계,
b) 침강 상수 ≥120S를 갖는 바이러스들이 펠렛을 형성하지 못하는 조건 하에서, 상기 단계 a)로부터의 판크레아틴 시험 샘플의 적어도 하나의 한정된 부분을 적어도 한번 저속 원심분리시키는 단계,
c) 상기 공정 단계 b)에서 저속 원심분리 동안에 임의로 생성되는 임의의 고체 퇴적물은 버리고, 판크레아틴 시험 샘플 상등액은 보유하는 단계,
d) 상기 공정 단계 c)에서 수득된 판크레아틴 시험 샘플 상등액의 적어도 하나의 한정된 부분을 불연속적 구배(gradient) 매질 내에서 첫번째 초원심분리(ultracentrifugation)시키고, 여기에서 상기 첫번째 초원심분리 기간 및 상기 첫번째 초원심분리를 위한 상대 원심력은, 바이러스 로드가 판크레아틴 시험 샘플 상등액으로부터 나와서, 위에 놓인(overlying) 최저 농도 구배 성분과 밑에 놓인(underlying) 그 다음으로 높은 농도 구배 성분 사이의 경계층 위 또는 그 경계층 내에 위치한 제 1의 타겟(target) 분획내로 이동되도록 선택되며, 그리고 판크레아틴 시험 샘플 상등액으로부터의 바이러스 로드를 포함하고, 임의로 원심분리 후 존재하는 임의의 펠렛을 포함하는 상기 제 1의 타겟 분획을 정량적으로 분리하는 단계,
e) 상기 단계 d)에서 수득된 제 1의 타겟 분획을 두번째로 초원심 분리시키는 단계, 여기에서 상기 두번째 초원심분리는 첫번째 초원심 분리에서 사용된 바와 같은 동일한 유형의 구배 매질 상에서 첫번째 초원심분리의 상대 원심력보다 더 높은 상대 원심력으로 실시되고, 상기 구배 매질은 제 1의 타겟 분획 내의 최저 농도 구배 성분의 농도 보다 높은 농도 구배 매질이다, 및
f) 제 1의 타겟 분획에 상응하는 상부층에 있어서의 상부의 75부피% 이상의 액체를 버리고, 상기 상부층에 있어서의 하부의 25부피% 이하의 액체에 상응하는 하부 분획 및 원심분리 후 임의로 존재하는 임의의 펠렛을 제외한 높은 농도 구배 매질의 전체 층을 얻음으로써 바이러스 로드를 포함하는 제 2의 타겟 분획을 수득하는 단계.
두번째 구체예에서, 본 발명은 판크레아틴 표본의 바이러스 로드, 특히 판크레아틴 표본의 감염성 바이러스 로드의 정량적 결정방법에 관한 것이다. 예로서, 두번째 구체예에서는, 첫번째 구체예에 따른 방법에 추가하여, 상기 공정 단계 f) 후에 실시될 수 있는 또 다른 공정 단계 g)에서, 판크레아틴 표본의 바이러스 로드의 정량적인 결정이, 바이러스 로드를 포함하는 상기 타겟 분획에서 바이러스 감염 역가를 결정함에 의해 실시되어, 시험 샘플 내의 감염성 바이러스 로드 결정이 가능하게 된다.
여기에서 달리 언급되지 않은 한, 하기에 언급된 어떤 기술적 및 과학적인 용어들은, 각각의 경우에서, 본 특정 기술 분야에서의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가질 수 있다. 예로서, 이하에서 "0~15℃"의 형식으로 언급된 온도 범위들은 각각의 경우에서 범위 한계 값들을 포함하여 0℃ 내지 15℃의 온도 범위를 지칭한다. 예로서, 이하에서 "30~120분"의 형식으로 언급된 시간 범위들은 각각의 경우에서 범위 한계 값들을 포함하여 30분 내지 120분의 시간 범위를 지칭한다. 예로서, 이하에서 "2~8시간"의 형식으로 언급된 시간 범위는 각각의 경우에서 범위 한계 값들을 포함하여 2시간 내지 8시간의 시간 범위를 지칭한다. 예로서, 이하에서 "1,500~5,000×g"의 형식으로 언급된 상대 원심력의 범위들은 각각의 경우에서 범위 한계 값들을 포함하여 1,500×g 내지 5,000×g 범위의 상대 원심력을 지칭한다. 예로서, 이하에서 "10~15㎖"의 형식으로 언급된 볼륨(volume) 범위들은 각각의 경우에서 범위 한계 값들을 포함하여 10㎖ 내지 15㎖의 볼륨 범위를 지칭한다. 예로서, 이하에서 "80~100mm"의 형식으로 언급된 길이 범위들의 측정은 각각의 경우에서 범위 한계 값들을 포함하여 80mm 내지 100mm의 길이 범위의 척도를 지칭한다.
본 발명에 따른 방법은 동물 기원의 모든 판크레아틴 유형에 적합하고, 특히 통상적인 상업용 돼지 판크레아틴들 및 소 판크레아틴들에 대해 실시될 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 돼지 판크레아틴 표본들에 대해 실시된다.
여기에서 설명된 방법은 일반적으로 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드를 분리하고, 이어서 판크레아틴 표본의 바이러스 로드를 정량하는데 적합하다. 특히, 본 방법은 판크레아틴 표본들의 바이러스 로드를 분리하고, 정량하는데 적합하며, 여기에서 상기 바이러스 로드는 소 로타바이러스 A, 뇌척수심근염 바이러스 (encephalomyocarditis virus=EMCV), 돼지 써코바이러스(porcine circovirus=PCV), 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus=PPV), 돼지 로타바이러스 A, 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus) 및/또는 돼지 수포병 바이러스(swine vesicular disease virus=SVDV)를 포함한다. 그의 매우 유사한 성질들로 인해, 인간 콕사키바이러스 B(coxsackievirus B) 5/1이, 본 발명에 따른 방법의 SVDV의 분리 및/또는 정량적 결정에 대한 적합성을 입증하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 그의 가장 유사한 성질로 인하여, 소 로타바이러스 A(예로서, B223 균주)가 본 발명에 따른 방법의 돼지 로타바이러스 A의 분리 및/또는 정량적 결정에 대한 적합성을 입증하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 여기에 기재된 방법은, 설명된 바와 같이 바이러스 로드를 분리시키고, 이어서 알려진 기술들, 예로서 중합효소 연쇄반응(="PCR") 등을 사용하는 추가의 분석을 사용하여 판크레아틴 표본 중의 간염 E 바이러스(=HEV)를 갖는 바이러스 로드를 결정하는데도 적합하다.
여기에서 설명된 상기 방법의 공정 단계 a)에서, 원심분리에 적합한 액체 판크레아틴 시험 샘플은, 판크레아틴 표본으로부터 생산되며, 생산 중에 바이러스 로드, 특히 그의 감염성 바이러스 로드를 변화 또는 변경시키지 않으면서 생산된다. 이는, 예로서 판크레아틴 표본으로부터의 판크레아틴 시험 샘플 현탁액 생산에 의해 진행될 수 있다. 예로서, 판크레아틴 시험 샘플 현탁액은, 판크레아틴 표본을 조사될 바이러스 종들을 배양하기 위해 사용된 세포주에 적합한 하나의 세포배양 배지 및 이러한 목적에 적합한 하나 이상의 항생물질(들)과 함께 조합시킴에 의해 생산된다. 다른 구체예에서, 판크레아틴 시험 샘플 현탁액은, 판크레아틴 표본을, 염 용액, 특히 인산염-완충 염 용액(="PBS", pH=2)과 함께 조합시킴에 의해 생산된다. 일반적으로, 모든 항생물질들은 공정 단계 a)에서 임의로 사용된 항생제 용액의 생산에 적합하다. 대체로, 폭넓은 효능의(broad-spectrum) 항생물질들 또는 이러한 폭넓은 효능의 항생물질들의 혼합물들이 사용된다. 적합한 항생물질들은 예로서, 페니실린, 세팔로스포린(cephalosporins)(옥사세펨들(oxacephems) 및 카르바세펨들(carbacephems)을 포함), 카르바페넴스(carbapenems) 및 모노박탐들(monobactams)과 같은 베타-락탐 항생물질들; 스트렙토마이신(스트렙토마이신 술페이트 포함); 네오마이신들(네오마이신 A, 네오마이신 B 및 파로모마이신(paromomycin)을 포함); 카나마이신들(카나마이신, 젠타마이신, 아미카신(amikacin) 및 토브라마이신 포함); 스펙티노마이신(spectinomycin); 테트라사이클린들(테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 독시사이클린 및 미노사이클린 포함); 마크롤리드(macrolide) 항생물들질(에리트로마이신, 클라리트로마이신(clarithromycin), 록시트로마이신(roxithromycin), 아지트로마이신(azithromycin), 조사마이신(josamycin) 및 스피라마이신(spiramycin) 포함); 자이라제(gyrase) 억제제들(날리딕신산(nalidixic acid), 시노삭신(cinoxacin), 피페미딕산(pipemidic acid), 노르플록사신(norfloxacin), 페플록사신(pefloxacin), 사이프로플록사신(ciprofloxacin), 오플록사신(ofloxacin) 및 플레록사신(fleroxacin) 포함); 엽산 길항물질들(antagonists)(술폰아미드 항생물질들, 디아미노 벤질 피리미딘들 및 그들의 조합물들 포함); 클로람페니콜; 린코사미드들(lincosamides); 글리코펩티드 항생물질들(반코마이신(vancomycin) 및 테이코플라닌(teicoplanin) 포함); 포스포마이신(fosfomycin); 폴리펩티드 항생물질들(폴리믹신 B(polymixin B), 콜리스틴(colistin), 바시트라신(bacitracin) 및 타이로티신(tyrothicin) 포함) 및 무피로신(mupirocin)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 항생물질들은 스트렙토마이신 술페이트 및 페니실린, 및 예로서 항생물질 "칵테일"로서 스트렙토마이신 술페이트와 페니실린의 혼합물들이다. 하나 이상의 항생물질(들)은, 예로서 각각의 경우에서 하나 이상의 항생물질(들)에 적합한 용매의 용액 중에서 사용될 수 있으며, 즉 항생물질 용액으로서 사용될 수 있다.
판크레아틴 시험 샘플 현탁액은 통상적으로 0~15℃, 예로서, 4~10℃의 온도로 냉각시키면서 생산된다. 판크레아틴 시험 샘플 현탁액을 생산하기 위한 구성성분들을 빙냉하면서 적어도 30분, 예로서 30~120분, 바람직하게는 45~90분 동안, 특히 50분 또는 60분 동안 통상적으로 교반한다. 판크레아틴 시험 샘플 현탁액을 냉각하는 목적 및 모든 추가의 공정 단계들에서의 냉각의 목적은 각 경우에서, 판크레아틴 표본의 효소적 활성성분들에 의한 바이러스 로드의 임의의 원하지않은 불활성화를 피하거나 또는 적어도 실질적으로 감소시키고자 하는 것이다.
판크레아틴 시험 샘플 현탁액의 제조를 위하여 세포배양 배지를 사용하는 경우, 상기 세포배양 배지들은 각 경우에서 공정 단계 a)에서 판크레아틴 시험 샘플 현탁액을 생산하는데 사용되고, 그에 의해 본 발명에 따른 방법에 의하여 분리 및/또는 정량될 바이러스 종이 결정된다. 연구된 바이러스 종들이 가능한 경우 그 안에서 세포변성효과(cytopathic effect=CPE)를 개시하는 수용(permissive) 세포배양물들이 특정 바이러스종들의 배양 및 검출에 사용된다. CPE는 광 현미경관찰에 의해 알 수 있는 바이러스-감염된 세포들의 변형이다. 만일 바이러스 종들이 CPE없이 배양 세포 내에서 증식하더라도, 그러한 증식은 일반적으로 알려진 간접적인 검출 방법들에 의해 확인될 수 있다.
예로서, 소 로타바이러스 A가 분리 및/또는 정량되어야 하는 경우, 태아 원숭이 신장 세포들(=MA-104 세포들)이, 예로서 이들의 배양을 위해 사용될 수 있다. 이 경우, 예로서 알려진 Dulbecco 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium=둘베코 배지)가 세포배양 배지로서 적합하다. EMCV가 분리 및/또는 정량되어야 하는 경우, 돼지 신장 세포들(=PK-15 세포들) 또는 태아 돼지 신장 세포들(=SPEV 세포들)이 그의 배양을 위해 사용될 수 있다. PK-15 세포들의 경우, 예로서 알려진 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium=MEM)가 세포배양 배지로서 적합하다. SPEV 세포들의 경우, 예로서 Dulbecco 배지가 세포배양 배지로서 적합하다. 예로서, PCV가 분리 및/또는 정량되어야 하는 경우, 예로서 PK-15 세포들이 그의 배양에 사용될 수 있다. 예로서, PPV가 분리 및/또는 정량되어야 하는 경우, 예로서 돼지 신장 세포들(SK-6 세포들)이 그의 배양에 사용될 수 있다. 이 경우에, 예로서 Dulbecco 배지가 세포배양 배지로서 적합하다. 예로서, 돼지 로타바이러스 A가 분리 및/또는 정량되어야 하는 경우, 예로서 MA-104 세포들이 그의 배양에 사용될 수 있다. 예로서, 돼지 테스코바이러스가 분리 및/또는 정량되어야 하는 경우, 예로서 PK-15 세포들이 그의 배양에 사용될 수 있다. 예로서, SVDV가 분리 및/또는 정량되어야 하는 경우, 예로서 SPEV 세포들이 그의 배양에 사용될 수 있다. 당업자는 특정 바이러스 종들의 배양에 적합한 세포주들 및 대응하는 적합한 세포배양 배지를 알고 있을 것이다. 본 발명에 따른 사용가능한 바이러스 종들 및 이에 대응하는 세포주들은 적절한 공급원들(sources), 예로서 Manassas, USA 소재의 "American Type Culture Collection"(=ATCC: 미국표준균주협회), Braunschweig, Germany 소재의 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH"(=DSMZ), Insel Riems, Germany 소재의 "Friebrich-Loffler-Institut"(=FLI) (Federal Research Institute for Animal Health:동물 보건 연방 연구소), 또는 Belfast, United Kingdom 소재의 "Departmant of Agriculture and Rural Development"(=DARD)의 "Veterinary Service Division"으로부터 입수할 수 있다.
상기 공정 단계 b)에서, 상기 공정 단계 a)에서 수득된 판크레아틴 시험 샘플은 그 전체로 사용될 수 있거나, 또는 판크레아틴 시험 샘플의 한정된 부분, 특히 이 판크레아틴 시험 샘플의 한정된 볼륨이 사용될 수 있다. 공정 단계 a)에서 수득된 판크레아틴 시험 샘플은 바람직하게는 그 전체로서 사용된다.
상기 공정 단계 b)에서, 저속 원심분리의 경우, 조건들은 침강상수 ≥ 120S, 특히, 120S 내지 5,000S를 갖는 바이러스들이 펠렛을 아직 형성하지 않는 조건 하에서 수립될 수 있다. 대개, 침강상수 ≥ 120S, 특히 침강상수 120S 내지 5,000S를 갖는 바이러스들은, 저속 원심분리가 각 경우에서 15,000×g 미만, 바람직하게는 각 경우에서 8,000~15,000×g, 특히 바람직하게는 각 경우에서 10,000~13,500×g, 예로서 각 경우에서 10,800×g의 상대 원심력으로 실시될 때, 펠렛을 형성하지 않는다. 저속 원심분리 단계의 지속시간은 통상적으로 적어도 5분, 대개 5~60분, 특히 10~45분, 바람직하게는 10~30분, 예로서 15분에 이른다. 공정 단계 b)의 바람직한 구체예에서, 저속 원심분리 단계들은 0~15℃의 온도로, 예로서 4~10℃의 온도로, 바람직하게는 냉장 원심분리 온도로 냉각하며 실시된다.
공정 단계 b)에서 저속 원심분리 단계들의 목적은, 추가의 공정에 적당한 판크레아틴 시험 샘플 상등액을 수득하기 위하여 판크레아틴 표본의 바이러스 로드의 분리 및/또는 정량적 결정시 분열되는 불용성 입자 등과 같은 판크레아틴 구성 성분들을 판크레아틴 현탁액으로부터 우선적으로 제거하기 위한 것이다. 따라서 저속 원심분리 단계들에서 임의로 수득된 고체 퇴적물들은 공정 단계 c)에서 버려지는 것이 일반적인 반면, 상등액은 다음의 공정 단계 d)에 사용된다. 저속 원심분리 단계들과, 이어서 임의로 수득된 고체 퇴적물들을 폐기하는 과정은 고체 퇴적물들이 더이상 형성되지 않는 것으로 관찰될 때까지 통상적으로 반복된다. 대개, 1~3회 반복 실시 후에는, 특히 저속 원심분리 단계와 그 후의 임의로 수득된 고체 퇴적물들의 폐기 과정의 단지 한 차례의 반복 후에는, 더 이상의 반복이 필요치 않을 것이다. 본 발명의 구체예에서, 공정 단계 b)에서 수득된 고체 퇴적물은 침전물 또는 펠렛일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 저속 원심분리 단계에서 수득된 퇴적물은 폐기 전에 적당한 세척액으로, 1회 이상, 예로서 1~3회 세척된다. 적당한 세척액은, 예로서 저속 원심분리 후에 수득된 판크레아틴 시험 샘플 상등액 그 자체이며, 이는 그 후 공정 단계 d)에서 사용될 수 있다. 판크레아틴 시험 샘플 상등액 그 자체 외의 다른 세척액이 사용되는 경우, 퇴적물의 세척이 일단 완료되면, 상기 세척액은 판크레아틴 시험 샘플 상등액과 조합된 후 공정 단계 d)에서 사용된다. 판크레아틴 표본의 바이러스 로드가 EMCV를 포함하는 경우, 공정 단계 d)에서의 사용 전에 상기 방법으로 퇴적물을 세척하는 것이 특히 유리하다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 나타낸 바와 같은 공정 단계 a)~c)에 따라서 생산될 수 있는, 판크레아틴 시험 샘플 상등액도 포함한다.
불연속성 2상(two-phase)의 수크로오스 구배가 공정 단계 d)에서의 불연속 구배 매질로서 통상적으로 사용된다. 불연속성 구배 매질은 바람직하게는 50%(중량/부피:w/v) 완충 수크로오스 용액 및 20%(w/v) 완충 수크로오스 용액으로부터 제조된 구배를 포함한다. 예로서, 중성 완충액들(즉, pH=7 주변의 완충액)이 수크로오스 용액들용 완충액으로서 사용가능하다. PBS 완충액이 바람직하게 사용된다. 살균 구배 매질이 일반적으로 사용된다. 상기 언급된 종류의 2상 불연속성 수크로오스 구배가 특히 적당한 침전을 제공하고, 그에 따라 발견될 수 있는 바이러스들에 대한 분리조건들을 제공한다. 불연속성 수크로오스 구배들, 특히 임의의 50%(w/v) 완충 수크로오스 용액과 20%(w/v) 완충 수크로오스로부터 제조된 상기 기재된 바와 같은 구배는 어떤 임의로 존재하는 바이러스 로드를 불활성화하지 않기 위하여 적합한 삼투 조건들을 나타낸다. 예로서, 공정 단계 d)에 따른 초원심분리는, 판크레아틴 표본으로부터 기원된 바이러스 로드가 판크레아틴 시험 샘플 상등액으로부터 불연속성 구배 매질 내로 실질적으로 정량적으로 이전되는 것을 보장한다. 여기에서 실질적으로 정량적이라는 표현은 시험 샘플에 미리 첨가된 바이러스 로드가 완전히 회수되어서, 첨가된 바이러스 로드에서의 역가와 초원심분리가 실시된 후 회수된 것에서의 역가의 차이가 바이러스 역가의 밑수 10인 로그의 1/2 단계(=0.5 로그 단계들) 이하라는 것을 나타낸다. 공정 단계 d)에 따른 첫번째 초원심분리는 바이러스 로드가 제 1의 타겟 분획 내로 이동되는 것을 더욱 보장하며, 상기 제 1의 타겟 분획은 판크레아틴 시험 샘플로부터 충분히 멀어서, 분리에 따라 분열가능한 상들의 어떤 재혼합이 일어나지 않도록 하면서 판크레아틴 시험 샘플로부터 그의 기계적 분리를 허용한다.
공정 단계 d)는 일정 볼륨의 최고 농도 구배 매질을 초원심분리 튜브 내로 도입시킴에 의해 통상적으로 실시되며, 그 위에 일정 볼륨의 그 다음의 낮은 농도 구배 매질이 적층된다. 이 공정은 바이러스 로드가 분리되어질 원심분리에 적당한 일정 볼륨의 액체 판크레아틴 시험 샘플인 최종(최상부) 층을 갖는 다중상(multi-phase)의 구배 매질을 얻기 위하여 원하는 만큼 많은 회수로 반복된다. 2상 구배 매질의 경우에서는, 일정 볼륨의 그 다음의 낮은 농도 구배 매질 위에 원심분리에 적합한 액체 판크레아틴 시험 샘플 또는 판크레아틴 시험 샘플 현탁액(판크레아틴 시험 샘플 볼륨)이 즉시 오버레이된다(overalyed). 2상 구배 매질의 경우, 이는 초원심분리 튜브 내에서 위에서부터 아래로, 판크레아틴 시험 샘플 볼륨(최상부)을 포함하는 첫번째 층, 그 다음으로 최저 농도 구배 매질 볼륨(중간부; 예로서 20%(w/v) 완충 수크로오스 용액) 및 마지막으로 최고 농도 구배 매질 볼륨(바닥부; 초원심분리 튜브의 바닥부를 덮고 있음; 예로서 50%(w/v) 완충 수크로오스 용액)의, 일련의 상들을 발생시킨다. 개별적인 볼륨들을 오버레이하는 경우, 각각의 경계상에서 교란 또는 혼합이 일어나지 않도록 보장하기 위해 주의를 요한다.
공정 단계 d)에서 제 1의 타겟 분획은, 전형적으로 (i) 판크레아틴 시험 샘플 볼륨으로부터 충분히 멀리 떨어진 최저 농도 구배 매질의 일부, 및 (ii) 그 다음의 높은 농도 구배 매질의 완전한 볼륨을 포함한다. 2상 구배 매질의 경우에, 타겟 분획은 예로서 판크레아틴 시험 샘플 볼륨으로부터 충분히 멀리 떨어진 최저 농도 구배 매질의 일부 및 상기 튜브의 바닥의 펠렛을 임의로 갖는 초원심분리 튜브의 바닥을 향해 아래방향으로 뻗어있는 최고 농도 구배 매질의 완전한 볼륨을 포함한다.
판크레아틴 시험 샘플 볼륨으로부터 충분히 멀리 떨어져서 이후의 분리를 허용하는 상기 제 1 또는 제 2의 타겟 분획의 위치를 계산시, 입자들의 위치에 대한 계산치들(즉, 판크레아틴 샘플로부터 분리된 바이러스 입자들의 위치)은 일반적으로 가우스 분포의 최고점을 나타낸다는 것을 염두에 두어야 한다. 그와 같이, 입자들은 그들의 계산된 위치의 위와 아래 양쪽 모두에 분포될 것이다. 따라서, 판크레아틴 시험 샘플 볼륨으로부터의 타겟 분획의 원하는 거리를 결정시에는, 입자 위치들의 가우스 분포를 고려하여 추가적인 마진(margin)을 포함시키는 것이 필요하다. 침강 상수가 ≥ 120S, 특히 ≥ 120S 내지 5000S인 입자들이 초원심분리로 인하여 판크레아틴 시험 샘플 볼륨으로부터 최저 농도 구배 매질 내로 적어도 10mm, 예로서 적어도 15mm, 적어도 20mm, 적어도 25mm 또는 적어도 30mm 이동한다면, 바이러스 로드는 통상적으로, 이후의 분리를 위해 판크레아틴 시험 샘플 볼륨으로부터 충분히 먼 타겟 분획 내로 이동된다. 상기 기재된 2상 구배 매질의 경우, 최저 농도 구배 매질은 20%(w/v) 완충 수크로오스 용액이다. 하나의 변형된 초원심분리 단계에서, ≥120S, 특히 ≥120S 내지 5,000S의 침강상수를 갖는 입자들은 실질적으로 모두 최저 농도 구배 매질을 완전히 통과하고, 그 다음의 높은 농도 구배 매질에 대한 경계층에서 농축된다(즉, "수크로오스 쿠션(sucrose cushion)" 상에서). 당업자는 초원심분리를 위한 대응 조건들을 계산하고 수행하는 적당한 방법들을 알고 있다. 적당한 초원심분리 조건들은 판크레아틴 샘플로부터 분리될 바이러스(들)의 특성들(예로서, 밀도 및 침강상수)에 따라 결정될 수 있고, 적용가능한 경우 본질적으로 알려진 단순화방법들을 취할 수 있다(예로서, Lebowitz 등, "Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review"; Protein Science 11(2002) 2067~2079 참조).
첫번째 초원심분리가 통상적인 볼륨 비율을 사용하고, 비연속적 구배 매질, 바람직하게는 2상의 비연속적 수크로오스 구배 중에서 실시되었다고 가정하면, 상기 첫번째 초원심분리가 적어도 1시간, 일반적으로 적어도 4시간, 적어도 9시간의 기간동안, 예로서 9~20시간, 특히 12~18시간의 기간 동안 실시되는 경우, 그 바이러스 로드는 두번째 초원심분리에 의한 이후의 분리에 적당한 제 1의 타겟 분획 내로 통상적으로 이동된다. 여기에 기재된 첫번째 초원심분리를 위한 적당한 상대 원심력은 적어도 50,000×g 및/또는 150,000×g 이하이다. 첫번째 초원심분리 단계의 한 구체예에서, 상기 단계는 초원심분리를 실시하는데 통상적인 볼륨 비율에서 50,000×g~150,000×g의 상대 원심력으로, 12~18시간의 기간 동안, 50%(w/v) 완충 수크로오스 용액 및 20%(w/v) 완충 수크로오스 용액으로부터 제조된 구배 내에서 실시된다. 상기 첫번째 초원심분리 단계의 또다른 구체예에서, 상기 단계는 초원심분리를 실시하는데 통상적인 볼륨 비율에서 70,000×g~120,000×g의 상대 원심력으로, 15~17시간의 기간 동안, 50%(w/v) 완충 수크로오스 용액 및 20%(w/v) 완충 수크로오스 용액으로부터 제조된 구배 내에서 실시된다. 초원심분리를 실시하는데 통상적인 볼륨 비율들은, 예로서 통상적인 초원심분리 튜브가 사용되는 경우, 구하여진다. 여기에서 통상적인 초원심분리 튜브들은, 예로서 10~50ml, 특히 25~50ml의 볼륨을 갖는 것으로 여겨진다. 통상적인 초원심분리 튜브가 공정 단계 d)에 사용된다면, 최고 농도 구배 매질(예로서, 50%(w/v) 완충 수크로오스 용액)의 볼륨은, 예로서 2ml의 양일 수 있고, 그 다음의 낮은 농도 구배 매질(예로서, 20%(w/v) 완충 수크로오스 용액)은 예로서 14ml의 양일 수 있고, 판크레아틴 시험 샘플 볼륨은 예로서 17ml의 양일 수 있다.
두번째 초원심분리는 공정 단계 d)에서 수득된 제 1의 타겟 분획을 사용하고, 상기 제 1의 타겟 분획을 구배 매질 쿠션 상에 위치시켜 단계 e)에서 실시된다. 상기 구배 매질 쿠션은, 예로서 첫번째 초원심분리에서 사용된 바와 동일한 유형의 구배 매질로 구성되고, 그에 의해 상기 구배 매질은 제 1의 타겟 분획의 최저 농도 구배 성분의 농도보다 높은 농도 구배 매질이다. 예로서, 첫번째 초원심분리가 상기 기재된 20%w/v 완충 수크로오스 용액과 50%w/v 완충 수크로오스 용액의 시스템을 사용하는 불연속적 구배 원심분리인 경우, 그 결과로 얻은 제 1의 타겟 분획은 20%w/v보다 높은 농도 및 50%w/v보다 낮은 농도의 완충 수크로오스 용액을 포함하는 시스템이다. 이 경우, 상기 수크로오스 쿠션은 50%w/v 완충 수크로오스 용액일 수 있다. 공정 단계 d)에서 사용된 제 1의 타겟 분획은 대개 첫번째 원심분리 후에 임의로 존재하는 임의의 펠렛도 포함한다.
두번째 초원심분리는 적어도 1시간, 통상적으로 적어도 2시간동안, 예로서 2~8시간 동안, 특히 3~6시간동안 실시된다. 여기에 기재된 두번째 초원심분리에 적합한 상대 원심력은 적어도 100,000×g, 예로서 150,000×g 이상, 150,000~350,000×g이다. 두번째 초원심분리 단계의 한 구체예에서, 상기 단계는 3~6시간 동안, 200,000~350,000×g의 상대 원심력으로, 초원심분리의 실시에 통상적인 볼륨 비율로 실시된다. 두번째 초원심분리 단계의 다른 구체예에서, 상기 단계는 4.5~5.5시간 동안, 250,000~300,000×g의 상대 원심력으로, 초원심분리의 실시에 통상적인 볼륨 비율로 실시된다. 예로서, 통상적인 초원심분리 튜브들이 사용되는 경우, 초원심분리의 실시에 통상적인 볼륨비가 수득된다. 통상적인 초원심분리 튜브들은 예로서, 여기에서 10~15㎖, 특히 12~13㎖의 볼륨; 내부 반경 6~8㎜, 특히 7㎜; 및 높이 80~100㎜, 특히 85~85㎜를 갖는 것들로 여겨진다. 통상적인 초원심분리 튜브가 공정 단계 d)에서 사용된다면, 구배 쿠션(예로서 50%(w/v) 완충 수크로오스 용액)의 볼륨은 예로서 0.5㎖의 양일 수 있고, 제 1의 타겟 분획 볼륨은 예로서, 10㎖의 양일 수 있다.
본 발명은 출발물질로서 사용된 판크레아틴 표본 g당 1 감염 단위(infectious unit)의 검출한계에 달하는 검출을 가능하게 한다.
공정 단계 d)와 e)의 구체예들의 한 바람직한 변형예에서, 달리 선택된 조건들에 관계없이, 초원심분리는 0~15℃, 바람직하게는 4~10℃의 온도로 냉각되면서 실시된다.
이 공정 단계에 사용가능한 통상적인 냉장 원심분리들은 당업자에게는 공지이다. 통상적인 상업적인 초원심분리기, 예컨대 스윙잉 버킷 로터(swining bucket rotor)를 갖는 냉각가능한 초원심분리기, 예로서 모델 "TH-641" 스윙잉 버킷 로터를 갖는 Sorvall®의 초원심분리기가 공정 단계들 d)와 e)에서 통상적으로 사용된다.
본 발명에 따른 저속 원심분리 단계들 및 초원심분리 단계들의 상기 설명은 당업자에 의해, 특히 본 발명의 설명에서 언급된 기술적인 정보의 도움으로, 임의의 원하는 정도로 일정비율로 증대 또는 감소될 수 있다.
공정 단계 d)와 f)에서 바이러스 로드를 포함하는 제 1 또는 제 2의 타겟 분획은 각각 판크레아틴 시험 샘플 상등액 및 제 1의 타겟 분획으로부터 정량적으로 분리된다. 분리는 통상적으로 타겟 분획의 미리 결정된 경계선의 높이에서 초원심분리 튜브 상에 표시함에 의해 진행된다. 이 경계선 위의 볼륨 전체는, 그 후 예로서 흡인(aspiration)에 의하여 잔여 볼륨으로부터 분리된다. 흡인은 예로서, 통상적인 연동펌프로 진행되고, 그의 관(tubing) 및 모세관들은 통상적으로 미리 살균된다. 적당한 펌핑 속도는 예로서 2m/분이다. 흡인동안, 연동펌프 모세관이 항상 액체의 상부 경계에 위치하도록 주의하여야 한다. 초원심분리 튜브내에 잔류하는 타겟 분획은 그 후 통상적인 단일 채널 피펫, 바람직하게는 살균 팁(tip)을 이용하여 공지된 방법으로 초원심분리 튜브로부터 제거될 수 있다. 초원심분리 튜브내에 여전히 잔류할 수 있는 임의의 침전물은, 예로서 단일 채널 피펫을 이용하여 반복적으로 끌어올렸다(drawn up) 재현탁했다함에 의해 동시에 제거될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 공정 단계들 a)~f)에 따라 생성될 수 있는 분리된 제 2의 타겟 분획도 제공한다.
판크레아틴 표본의 바이러스 로드를 정량하기 위한 방법이 실시되어야 하는 경우, 공정 단계 f)에 뒤이어 공정 단계 g)를 진행한다. 공정 단계 g)에서, 판크레아틴 표본의 바이러스 로드는, 바이러스 로드를 포함하는 타겟 분획내에서 바이러스 감염 역가를 결정함에 의해 정량된다. 타겟 분획 내에서의 바이러스 감염 역가의 정량적 결정은, 바이러스학 분야에서 알려진 작업 방법들에 따라, 예로서 바이러스 감염 역가 결정법(=VITD)의 공지된 원리에 따라 여기에서 진행될 수 있다.
제 2의 타겟 분획은 예로서, 바이러스 결정 시험 샘플을 얻기 위하여, 적당한 세포배양 배지 또는 염 용액, 예로서 PBS를 이용하여 적당한 비율로 희석될 수 있다. 적당한 세포배양 배지는, 각 경우에서 조사된 바이러스 종들의 함수로서, 사용가능한 것으로 상기 언급된 것들이다. 바이러스 감염에 대한 잘못된 양성 히트(hit)를 배제하기 위한 본 발명의 구체예에서, 희석된 또는 희석되지 않은 타겟 분획은, 바이러스 로드의 정량이 공정 단계 g)에서 실시되기 전에 마이크로필터를 통해 여과될 수 있다.
적당한 희석은 예로서, 세포배양 배지 또는 염용액을 이용하여, 공정 단계 d)에서 사용된 판크레아틴 시험 샘플 상등액의 원래 볼륨으로 타겟 분획을 희석시킴에 의해 달성할 수 있다. 그 후, 첫번째 단계에서, 정량적 VITD를 실시하기 위하여, 바이러스 결정 시험 샘플들의 희석 시리즈들(dilution series)을, 공지된 방법으로, 예로서 1:2, 1:5 또는 1:10의 희석 단계들 또는 이들 희석 단계들의 조합으로 먼저 생성될 수 있다. 그 후, 두번째 단계에서, 상기 희석 시리즈들과 상이한 농도의 바이러스 결정 시험 샘플들을 이용하여, 적당한 세포 현탁액을 공지된 방법으로 접종할 수 있고, 그 결과 상이한 농도들의 바이러스 결정 시험 샘플들 상에 세포층이 형성될 수 있다. 비활성박테리아 또는 미코플라즘(mycoplasm)과 같은 미생물들의 존재에 의해 발생될 수 있는 바이러스 감염에 대한 잘못된 양성 히트들을 배제하기 위하여, 검출기 세포들 상에 접종하기 전에 바이러스 결정시험 샘플들을 여과하는 것이 일반적으로 유리하다. 이를 위하여, 바이러스 결정 시험 샘플 또는 희석된 바이러스 결정 시험 샘플은, 마이크로필터, 예로서 기공 크기(즉, 기공 직경)가 0.1~10㎛(범위의 한계값 포함됨; =마이크로여과), 바람직하게는 0.1~0.45㎛인 마이크로필터, 대개 기공 크기(즉, 기공 직경)가 0.1㎛인 마이크로필터와 같은, 적당한 기공 크기의 필터를 통해 여과될 수 있다. 여과액은 그 후 추가의 연구조사를 위한 시험용 샘플로서 사용될 수 있다. 그 후, 세번째 단계에서, 접종된 시험 샘플들은 그의 감염 정도에 대해 판독되며, 이는 그의 감염이 표시되는 방식에 따라 달라진다. 예로서 CPE가 세포층의 감염의 지시약으로서 사용된 경우, CPE는 약 4~7일 후에 공지된 방법으로 판독된다. 여기에서 바이러스 결정 시험 샘플들의 적정(종말점 희석)은 원래 존재하는 감염 도스(dose)의 정량을 가능하게 한다. 적정은 통상적으로 10의 인자(factor)에 의한, 즉 밑수 10인 로그를 기초로 한 희석에 의해 진행된다. 실시에서, 50% 감염 도스(=ID50)가 일반적으로 계산된다. 병렬의 다수의 배치(batch)들의 경우에, 확인된 ID50 값은, CPE가 배치들의 정확히 반에서 감지가능한, 바이러스 결정 시험 샘플의 최고(반비례) 희석 값에 상응한다. 결과들은 공지된 방법에 따라서 임의적으로 추가적으로 계산적으로 수정 또는 내삽될(interpolated) 수 있다. 바이러스 역가 계산을 위해 가장 통상적으로 사용되는 방법들은 Spearman과 Karber에 따른 방법들(C, Spearman, Br. J. Psychol. 2 (1908) 227~242 및 G. Karber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162 (1931) 480~483; 또한 Bundesanzeiger[연방 관보] 제 84호, 1944년 5월 4일, 참조), 또는 Reed와 Muench에 따른 방법들(L.J, Muench, H. Am. J. Hyg. 27 (1938) 493~497, 참조)이다.
세포층의 감염의 다른 지시약들, 예로서 바이러스 항원 유도 또는 플라크(plaque) 유도도 사용될 수 있다. 본 경우에서, 당업자는 예로서 "Medizinishe Virologie" H.W. Doerr와 W.H. Gerlich, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 제 1판, 2002, 또는 각각 이들의 가장 최근 간행본과 같은 바이러스학 교재들로부터, 이들 방법들과 이들의 적용들을 잘 알 것이다.
본 발명에 따른 방법은 출발물질로서 대량의 판크레아틴 표본들의 분석에 특히 유용하다. 대량의 출발물질을 사용하는 것은 일반적으로 더욱 높은 감도로 바이러스 로드를 결정하는 것을 가능하게 하며, 즉 g당 더 낮은 감염 단위들을 결정하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 적어도 5g, 예로서 8g, 10g 또는 12g의 출발물질들에 대해 특히 유용하다.
실시예들
하기 실시예들에서 언급된 모든 작업들은 살균 조건하에서, 살균 워크벤치(workbench)에서 실시되었다. 바이러스학 실험실에서 통상적인 절차들, 예로서 안전 절차들을 준수하였다. 특히 하기 물질들이 사용되었다:
1. 항생물질 용액, 스트렙토마이신 술페이트 1.0g 및 페니실린 1.2g을 2차-증류수 20㎖ 중에 용해시키고, 0.2㎛ 필터를 통해 여과하였다. 이 여과액들을 1㎖분량으로 나누고, 사용시까지 -20℃에서 임의로 저장하였다;
2. Dulbecco 배지, SK6 세포들, SPEV 세포들 및 MA104 세포들용 세포배양 배지;
3. 단일 채널 피펫, 살균 팁 사용;
4. FCS, 태아 송아지 혈청(예로서, Bio Whittaker사제; =혈청);
5. 조직 배양 플라스크들, 살균됨, 플라스크 바닥의 면적은 각각의 경우 25, 75 또는 175㎠임;
6. MEM, 1.5g/l 중탄산나트륨 및 1mM 피루베이트를 이용한 PK-15 세포들용 세포배양 배지;
7. 미세역가(microtiter) 플레이트들, 96 웰(wells) 및 뚜껑과 함께 살균됨;
8. PAN 현탁액, 10% 판크레아틴 현탁액; 살균 조건하에서 비이커 내로 돼지 판크레아틴 8.0g(달리 언급되지 않는 경우)을 칭량하여 넣고, 항생물질 용액 8㎖ 및 (달리 언급되지 않는 경우) 특정 대응 세포배양 배지 또는 PBS 64.0㎖와 조합하고, 그리고 (달리 언급되지 않는 경우) 얼음조 내에서 60분 이내로 교반하며 현탁시킴;
9. Pardee 완충액, Pardee 이산화탄소 완충액;
10. PBS, 살균된 "인산염 완충 염" 용액 (pH 7.2);
11. 살균 피펫들;
12. 살균 트레이들에서 살균된 피펫 팁들;
13. 밀봉시 CO2-불침투성인 플라스틱 주머니들(Merck사의 "Anaerocult®");
14. NatuTec GmbH로부터의, 폴리클로날 항-PPV 항체, 형광성 이소시아네이트(=FITC) 접합물;
15. 살균 튜브들, 15㎖와 50㎖;
16. 수크로오스 용액, 20%, PBS-완충, 살균; 농도는 통상적인 굴절계를 이용하여 알려진 방법으로 조절됨;
17. 수크로오스 용액, 50%, PBS-완충, 살균; 농도는 통상적인 굴절계를 이용하여 알려진 방법으로 조절됨;
18. 나사 뚜껑(screw-top)을 갖는 튜브들, 살균;
19. 트립신 용액, INVITROGEN사로부터의 "TrypL Express®";
20. "isma Tec"으로부터의 연동펌프, 5.8㎖/분에 이르는 펌핑 속도;
21. 냉장 초원심분리기, "TH-641" 로터를 갖는 "Sorvall® Pro 80";
22. 살균 초원심분리 튜브들, 용량 11㎖, 크기 9×90㎜;
23. 희석용 블록들, 각각 1.0㎖의 96 웰;
24. MA-104 세포들: FLI에 의해 공급됨;
25. PK-15 세포들: DARD에 의해 공급됨;
26. SK-6 세포들: FLI에 의해 공급됨;
27. SPEV 세포들: FLI에 의해 공급됨;
28. 10% FCS를 갖는 세포배양 배지 중에 200,000세포/㎖를 갖는, 시험될 SK6, SPEV 및 PK-15 세포들의 세포현탁액들;
29. 살균 Falcon 마이크로튜브들, 용량 15㎖.
실시예 1: 각종 세포주들에 대한 판크레아틴의 해로운 효과의 연구
세포배양액들을 사용하여, 물질 시험 샘플들에서 바이러스들을 검출하기 위해서는, CPE들을 평가시에 잘못된 음성 결과들을 배제가능하도록 하기 위하여, 연구될 판크레아틴 표본의 세포들에 대한 해로운 효과를 확인하여야만 한다. 따라서 하기 언급된 바와 같이, 판크레아틴 시험 샘플 현탁액의 해로운 효과를 확인하기 위한 연구들이 각종 세포주들 상에서 실시되었다.
상기와 같이 생성된 PAN 현탁액의 0.5㎖ 분량을 해로운 효과를 시험하기위해 취하고, 이를 "판크레아틴 현탁액 시험 샘플"로 명명하였다.
저속 원심분리: 잔류하는 PAN 현탁액을 통상적인 냉장 원심분리기(고정-각 로터 번호 3745호를 갖는 Biofuge® 22R Heraeus SEPATECH®) 내에서 4℃에서 10,000rpm(10,800×g)으로 15분 동안 원심분리하였다. 저속 원심분리 후의 상등액을 그 후 10,000rpm으로 4℃에서 15분간 더 원심분리하고, 결과물을 "저속 원심분리 후 상등액"이라 명명하고, 이는 바이러스 적정 및 초원심분리에 사용하였다. 저속 원심분리 후 각 경우에서 수득된 두 개의 침전물들을 조합하여(합하여 1㎖), 각각 적당한 세포배양 배지 9㎖ 내에 재현탁시키고, 이를 "침전물" 또는 펠렛으로 명명하였다.
첫번째 초원심분리: 상기 "저속 원심분리 후 상등액" 시험 샘플을 초원심분리기 내에서 첫번째 원심분리 처리하였다. 이를 위하여, 50%(w/v) 수크로오스 용액 2㎖를 시험을 실시하는데 필요한 갯수의 초원심분리 튜브들 내로, 피펫을 사용하여 넣었다. 초원심분리 튜브를 비스듬한 각도로 유지시키면서, 20% 수크로오스 용액 14㎖를 50% 수크로오스 층의 최상부에 주의하여 위치시키고, 그 결과 두 용액들 사이에서 분할 층이 구별가능하였다. 그 후, 상기 언급된 바와 같이 취해진 "저속 원심분리후 상등액" 시험 샘플의 17㎖ 층을 20%(w/v) 수크로오스 용액 위에 교란 및 혼합되지 않도록 다시 주의하면서 위치시켰다. 초원심분리 튜브들을 그 후 초원심분리기 로터내에 현탁시켰다. 이를 위하여, 로터의 반대쪽에 있는 두 개의 초원심분리 튜브들은 각 경우에서 PBS를 이용하여 서로 평형을 맞추고, 대응 홀더들(holders) 내에 삽입하고, 연결된 뚜껑으로 단단히 밀봉하였다. 홀더들이 로터내에 일단 삽입된 후, 시험 샘플들을 10℃에서 22,000rpm(87,000×g)으로 16시간 동안 원심분리하였다. 초원심분리 후, 초원심분리 튜브들을 살균 워크벤치 상에서 홀더들로부터 제거하여, 초원심분리 튜브의 바닥에서부터 측정하여 5cm 높이에 표시하였다. 관 및 모세관들이 미리 살균처리된 연동펌프를 사용하여, 표시 위의 액체는 2㎖/분의 펌핑속도로 초원심분리 튜브로부터 흡인하였으며, 상기 모세관은 항상 상기 액체의 상부 경계에 위치되었다. 이러한 방법으로 수득된 첫번째 분획은 "첫번째 초원심분리 후의 상부 분획"으로 명명되었다. 초원심분리 튜브 내에 잔류하는 "첫번째 초원심분리 후의 하부 분획"(1.5㎖)을, 각 경우에서 단일 채널 피펫을 이용하여 초원심분리 튜브로부터 제거하였다. 초원심분리 튜브의 바닥에 잔류할 수 있는 임의의 침전물을 단일 채널 피펫을 사용하여 반복적으로 끌어올림에 의해 재현탁시키고, 이와 유사한 방식으로 제거하였다. 모든 튜브들에 대한 "첫번째 초원심분리 후의 하부 분획"을 조합하여, 두번째 초원심분리에 즉시 사용하였다. 추가의 처리까지, 결과의 분획들을 4℃에서 저장하거나, 또는 연장된 저장의 경우에는 -20℃에서 저장하였다.
두번째 원심분리는 4℃에서 272,000×g으로 5시간 동안 두 개의 11㎖ 튜브들내에서 실시하였다. 먼저, 50%(w/v) 수크로오스 용액의 구배 매질 쿠션을 상기 튜브들 내로 도입시켰다(0.5㎖). 그 후, 구배 쿠션 위에 제 1의 타겟 분획 5㎖를 적층하고, 초원심분리를 나타낸 바와 같이 수행하였다. 상부 분획을 폐기한 후, 펠렛을 제외한 1.5㎖ 볼륨을 각 튜브의 바닥으로부터 제거하였다.
"판크레아틴 현탁액 시험 샘플", "저속 원심분리 후의 상등액", "침전물"(저속 원심분리 후), "첫번째 초원심분리 후의 상부 분획" 및 "첫번째 초원심분리 후의 하부 분획"(5.0㎖로 만든 후) 시험 샘플들 및 "두번째 초원심분리 후의 상부 분획" 및 "두번째 초원심분리 후의 하부 분획" 시험 샘플들은 각종 세포주들에 대한 그의 해로운 효과에 대하여 그 후 시험되었다. 이를 위하여, 시험될 각종 시험 샘플들의 일련의 희석물들을 각각 제조하였다. 시험될 모든 시험 샘플들은, 각각 적당한 세포배양 배지를 이용하여 1:5의 희석으로부터 2배씩 더 희석되었다. 미세역가 플레이트들에서, 8열로 웰 당 PK-15, SPEV 또는 SK6 세포들을 포함하는 새로이 제조된 세포 현탁액 100㎕ 분량 각각에, 제조된 시험 샘플 희석액 100㎕를 각각 첨가하였다. MA104 세포들을 시험하는 경우, 24시간 지난 세포층을 지닌 미세역가 플레이트가 사용되었다. 이를 위하여, 세포배양 배지를 각 경우에서 웰로부터 제거하고, 신선한 무혈청 세포배양 배지 100㎕로 대체하여, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 등의 최종 시험 샘플 희석액들로 하였다. 대조군으로서 일련의 100㎕의 희석물들 대신, 세포배양 배지 100㎕를 각각의 미세역가 플레이트의 8웰들 내로 도입하였다. Pardee 완충액 4㎖를 포함하는 튜브 및 여과지와 함께 플레이트들의 쌍들을 기밀 파우치들(air-tight pouchs)에 넣고, 밀봉용 클립으로 단단히 밀봉하였다. 그 후 플레이트들을 36±1℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 경과 후, 상기 플레이트들을 CPE의 양에 대하여, 즉, 세포 용해 및/또는 세포들의 분해 및 판크레아틴의 해로운 효과의 결과로서 세포층 형성의 부재에 대해 현미경으로 매일 검사하였다. 최종 평가는 7일 후 실시하였다. 최종 판독시에 대조군들에서 세포 분해가 이미 발생된 경우, 적정을 반복하였다.
각종 세포주들에 대한 해로운 효과에 대해 상이한 시험 샘플들을 시험한 결과들은, "두번째 초원심분리 후의 하부 분획"은 판크레아틴으로부터 유래된 각종 세포주들에 대한 해로운 효과가 전혀 없는 것으로 밝혀졌다.
상기 결과들은, 본 발명에 따른 첫번째 초원심분리 단계, 또는 첫번째 및 두번째 초원심분리 단계 각각으로 처리되고, 그 안에서 바이러스 로드가 농축된, "첫번째 초원심분리 후의 하부 분획"과 "두번째 초원심분리 후의 하부 분획"에서, 조사된 모든 다른 시험 샘플들에 비하여 조사된 세포주들에 대한 해로운 효과에서의 상당한 감소가 있음을 증명하였다.
실시예 2: 바이러스 로드에 대한 상이한 판크레아틴 함량들의 시험
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 상기 2단계 초원심분리 절차를, 상이한 함량의 판크레아틴 분말 현탁액들로부터 바이러스들을 분리하는데 적용하였다. 판크레아틴으로부터 바이러스들의 분리는 민감한 세포주들에 대한 적정에 의한 낮은 바이러스 로드의 검출을 위한 예비필요조건이었다:
- 의약 물질 8g을 항생물질 용액 8㎖(살균 PBS 20㎖ 당, 스트렙토마이신 술페이트 1.0g과 페니실린 G 1.2g) 및 PBS 64㎖와 혼합하고, 빙수조내에서 60분 동안 교반하였다.
- 결과의 현탁액을 10,800×g에서 15분 동안, 4℃에서 원심분리하였다.
- 첫번째 원심분리 후의 상등액을 10,800×g에서 15분 동안 4℃에서 다시 원심분리하였다.
저속 원심분리 후, 결과로 얻은 상등액을 첫번째 초원심분리에 사용하였다. 첫번째 초원심분리는 불연속성 수크로오스 구배를 이용하여 수행하였다(50%(w/v) 수크로오스 2㎖와 20%(w/v) 수크로오스 14㎖가 있는 4개의 원심분리 튜브들을 저속 원심분리 후의 상등액 17㎖로 커버하였다). 이러한 기술은 대응 조건들에서 판크레아틴 현탁액의 주요부분으로부터 바이러스 입자들의 분리를 가능하게 한다. 바이러스/판크레아틴 현탁액 혼합물들로부터의 바이러스들은 적절한 원심분리 조건들에서 50%(w/v) 수크로오스 및 20%(w/v) 수크로오스 사이의 경계층에서 농축된다. 가용성 판크레아틴 성분들은 원심분리 후에 바이러스층 위 상등액내에 잔류한다. 바이러스 분획은 수크로오스 구배의 분별화된 흡수(sucking)에 의해 판크레아틴층들로부터 분리되었다. 결과의 바이러스 분획은 50%(w/v) 수크로오스 쿠션상에서의 바이러스들의 추가 농축을 위해 다시 초원심분리하였다.
첫번째 원심분리는 87,000×g로 4℃에서 16시간 동안 4개의 36㎖ 튜브들 내에서 실시하였다. 원심분리 후, 5㎖의 볼륨을 각 튜브의 바닥으로부터 제거하였다.
이어서 두번째 원심분리를 272,000×g로 4℃에서 5시간 동안 두개의 11㎖ 튜브들 내에서 실시하였다. 1.5㎖의 볼륨을 각 튜브의 바닥으로부터 제거하였다. 이로 인하여 판크레아틴 분말 8g으로부터 수득된 바이러스 농축물 3㎖를 결과로서 얻었다. 샘플들을 -20℃에 보관하였다.
감염성 분석
감염성 분석은, 민감한 세포주들을 통해 샘플의 3회의 연속적인 계대배양(passage)에 의해 샘플의 낮은 바이러스 로드가 가시화될 수 있다는 가정에 바탕을 둔 것이다. 포함된 바이러스들은 새로운 세포들을 감염시킬 수 있고, 이들 계대배양들 동안 증폭될 수 있어서, 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다. 거대 부피 플레이팅 기술과 조합시, 3번째 계대배양 후의 세포 론(lawn) 상에서 약 1000 플라크들의 형성에 의하여, 3번의 세포 계대배양 동안 10이라는 낮은 증폭율(6일간의 인큐베이션 동안 하나의 감염성 바이러스 당 10 개의 바이러스)로 단 하나의 감염성 바이러스도 검출하는 것이 가능하다.
따라서, 판크레아틴 샘플들로부터 추출된 바이러스 분획들을, 감염성 돼지 파보바이러스들의 검출을 위해 SK6 세포들 상에서의 3회의 연속 계대배양에 적용하였다.
1. 계대배양 (1㎖ 바이러스 분획=2.66g 판크레아틴)
각각의 개별적인 바이러스 농축물의 3분의 1(3㎖ 중 1㎖)을, 5%의 FCS 및 24시간된 서브컨플루언트(subconfluent) 상태의 SK6 세포들의 세포 론을 갖는 30㎖의 세포배양 배지를 포함하는 75㎠의 조직배양 플라스크내에 접종하였다. 세포배양 플라스크들을 37±1℃에서 6일 동안 인큐베이션하였다.
세포병리학적 효과들의 형성(플라크: plagues)은, 도립형(inverse) 현미경을 이용하여, 인큐베이션 동안 및 인큐베이션 종료시에 확인하였다. 전체 조직배양 플라스크 내용물의 2회 동결-해빙 사이클들에 의한 바이러스/세포 용해물의 생성시, 계대배양은 완료되었다. 상기 바이러스 세포 용해물을 저속 원심분리(2,800×g로 15분간)에 적용하여 세포 유리 상등액을 만들었다. 저속 원심분리 후, 이 상등액(30㎖/로트(lot))을 안전성 단계로서 0.1㎛ 기공 크기의 필터를 통해서 여과시켜서, 용해물의 가능한 미코플라즈마 오염을 감소시켰다.
2. 계대배양
5% FCS 및 24시간된 SK6 세포들의 세포 론을 갖는 세포배양 배지 22.5㎖를 포함하는 75㎠의 조직배양 플라스크를 각 로트의 두번째 계대배양을 위해 준비하였다. 첫번째 계대배양(=25%)으로부터의 세포배양 상등액 7.5㎖를 첨가하였다. 플라스크들을 37±1℃에서 6일 동안 인큐베이션하고, 도립형 현미경을 이용하여 세포병리학적 효과들을 확인하였다.
바이러스/세포배양 용해물(30㎖/로트)을 첫번째 계대배양에 대해 설명한 것과 같이 달성하였다.
3. 계대배양
75㎠ 조직배양 플라스크들을 상기 설명된 것과 같이 각 로트에 대해 제조하였다. 플라스크 하나 당 상기 2. 계대배양(=25%)으로부터의 바이러스/세포배양 용해물 7.5㎖ 및 5% FCS가 있는 22.5㎖의 세포배양 배지를 첨가하였다. 플라스크들을 37±1℃에서 6일 동안 인큐베이션하고, 도립형 현미경을 이용하여 세포병리학적 효과들을 검사하였다.
바이러스/세포배양 용해물(30㎖/로트)을 상기 1. 계대배양 및 2. 계대배양에 대해 설명된 것과 같이 달성하였다.
4. FITC-접합된 항-PPV 항체들로 면역-염색함에 의한 돼지 파보바이러스(PPV)의 검출
96웰 및 24시간된 SK6 세포들의 세포 론을 갖는 미세역가 플레이트들을 준비하였다. 상기 3. 계대배양(=10%)으로부터의 바이러스/세포배양 용해물 각각 100㎕로 30개 구멍들(caviaties)을 감염시키고, 37±1℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 세포배양 상등액을 세포들로부터 제거하고, 세포 론을 80% 아세톤과 20% 메탄올의 빙냉 혼합물에 의해 고정시켰다. 구멍 당 FITC-접합된 항-PPV 항체 용액 100㎕를 첨가하고, 그 플레이트들을 37±1℃에서 45분동안 인큐베이션하였다. 항체 용액을 제거한 후, 세포 론을 PBS로 3회 세척하고, PBS 중의 15%글리세롤로 커버하였다. 파보바이러스에 의해 감염된 세포들의 검출은 UV-광 내에서 도립 현미경을 이용하여 실시하였다.
판크레아틴 샘플들과 동시에, 역가가 공지된 돼지 파보바이러스 NADL-2를 동일한 미세역가 플레이트 상에서 양성 대조군으로서 적정하였다.
모든 시험 아이템(item)들을, 상기 설명된 것과 같이, 양성 대조군들과 동시에 SK6 세포들 상으로 계대배양하였다. 이 방법에 의하여, 판크레아틴 샘플들과 양성 대조군들 사이에서 돼지 파보바이러스에 대해 전형적인 플라크들/세포병리학적 효과들의 생성을 비교하는 것이 가능하였다.
배양 결과들을 하기 표 1에 나타내었다.
세포 조직배양 플라스크들 내에서 SK6 세포들상에서의 시험 아이템들의 계대배양 결과들
판크레아틴 분말의 로트 번호 세포병리학적 효과들에 대한 검사를 수반한, 조직배양 플라스크들 내에서 SK6 세포들 상에서의 판크레아틴 샘플들의 바이러스 분획들의 계대배양
1. 계대배양 2. 계대배양 3. 계대배양
0436 CPE 검출되지 않음 CPE 검출되지 않음 전형적인 CPE는 검출되지 않았으나, 감염후 6일에 약간의 세포 변질 있음
0437 CPE 검출되지 않음 감염 후 4일에 세포 론에서 단일 플라크들, 감염 6일 후 CPE 컨플루언트상태 아님 감염 후 6일에 30%의 세포 론이 플라크를 가짐
0438 CPE 검출되지 않음 감염 후 4일에 80%의 세포 론이 플라크 가짐, 감염 후 6일에 CPE 컨플루언트 상태 감염 후 2일에 가시적인 플라크 형성; 감염 후 4일에 CPE 컨플루언트 상태
3가지 시험 아이템들의 첫번째 계대배양에서는 감염 후 6일에 CPE가 전혀 검출되지 않았다.
샘플 0436의 3회 계대배양 동안 CPE는 전혀 검출되지 않았다. 단지, 샘플 0436의 세번째 계대배양에서만, 샘플 0437과 샘플 0438의 관찰된 세포병리학적 효과들과는 동일하지는 않은, 약간의 세포 변질이 발견되었다.
감염 후 4일째에 샘플 0437의 두번째 계대배양 동안, 세포 론 내에 단일 플라크들이 관찰되었다. 감염 후 6일째에 플라스크 내의 세포 론의 약 20%가 CPE를 나타내었다. 샘플의 세번째 계대배양 후에, 세포 론의 약 30%가 세포병리학적 효과들/플라크들을 나타내었다.
샘플 0438의 두번째 계대배양동안, 단일 플라크들이 감염후 3일째에 관찰되었다. 추가의 계대배양동안, 플라크 생성은 계속되어, CPE는 거의 컨플루언트(confluent) 상태가 되었다.
세번째 계대배양에서 확실한 CPE가 감염 후 2일째 검출되었다. 인큐베이션은 CPE가 컨플루언트되면서 감염 후 4일에 완료되었다.
조직배양 플라스크들 내에서의 세번째 계대배양에 이어, 세번째 계대배양으로부터의 바이러스/세포배양 용해물을 SK6 세포 론과 함께 미세역가 플레이트들로 이동시켰다:
두개의 병렬의 30개 웰들 내로, 로트 당 100㎕ 30회. 돼지 파보바이러스 NADL-2의 양성 대조군을 동일한 플레이트들 상에서 적정하였다.
면역 염색법에 의하여 세포 병리학적 효과들을 관찰하기 위한 첫번째 플레이트 및 돼지 파보바이러스의 검출을 위한 두번째 플레이트를 37±1℃에서 인큐베이션하였다.
첫번째 플레이트를 6일동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료시, 샘플들 0437 및 0438은 양성 대조군 PPV와 동일한 세포 병리학적 효과를 나타내었다.
NADL-2. 샘플 0436은 어떠한 CPE도 나타내지 않았다.
두번째 미세역가 플레이트로부터의 배양 상등액을 인큐베이션을 시작한지 24시간 후에 제거하였다. 짧은 인큐베이션 시간으로, 일차 감염된 세포들로부터 방출된 파보바이러스들에 의해 2차 감염된 세포들의 검출 능력을 감소시켜야만 한다. 세포 론을 FITC-접합된 항-PPV 항체로 고정 및 염색하고, UV광 중에서 도립형 현미경을 사용하여 감염된 세포들을 확인하였다. 이는 플라크 적정과 일치하고, 세번째 계대배양 용해물의 바이러스 역가를 검출할 수 있는 가능성을 제공한다.
다음의 결과들이 수득되었다:
샘플 0436의 세번째 계대배양으로부터의 세포 유리(cell free) 바이러스 용해물로 감염된 30 구멍들 중 어떤 것도 분명한 형광성 세포들을 포함하지 않았다.
시험된 3㎖(=10%)에 추가적으로, 세포 유리 바이러스 용해물 30×100㎕를 SK6 세포 론을 가진 미세역가 플레이트로 옮기고, 37±1℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 항-PPV 항체로 고정 및 염색하였다. 이들 30개의 추가적인 구멍들 내에서 감염된 세포들은 전혀 발견되지 않았다.
이러한 결과는 조직배양 플라스크들내에서 시료 0436을 계대배양시키고, 세포병리학적 효과들의 검출을 위한 미세역가 플레이트들 내에서의 세번째 계대배양 후의 결과들과 상관된다.
샘플들 0437과 0438의 경우에서, 항-PCV 항체로 염색된 30개의 모든 구멍들은 양성 대조군 PPV NADL-2와 같은 분명한 형광성 세포들을 포함하였다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 판크레아틴 1g 당 1 감염 단위의 동정을 가능하게 하고, 따라서 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드를 분리 및 정량하는 고감도의 방법을 제공한다. 또한, PCR같은 증폭방법들을 기초로 한 핵산 분자들의 검출과 같은 분자 생물학적 방법들에 근거한 방법들과 대조적으로, 본 발명에 따른 방법은 감염 단위들의 정량을 가능하게 한다. 따라서, 분자생물학적인 기술들에 의해 결정된 감염성 및 비감염성 바이러스-하중 또는 전체 바이러스 로드간의 구분도 가능하다.
추가의 구체예에서, 계대배양들 및 검출은 단계적으로(상기 설명된 바와 같이) 또는 병행(parallel) 접근방법으로 실시될 수 있다. 병행 접근방법은 하나의 계대배양이 수행되는 동안, 이전의 계대배양의 바이러스 로드가 이미 결정될 수 있음을 의미한다. 이러한 접근방법을 사용하여, 모든 계대배양들로부터 결과를 수득할 수 있고, 그 결과가 첫번째 계대배양으로부터 수득되는 경우, 단계적인 접근방식을 사용함에 따라 결과는 더 이른 시점에서 이루어진다. 이는, 예로서 시간 효율의 증가 및/또는 개별적인 샘플 또는 생성물이 더 이른 시점에서 방출될 수 있기 때문에 제조 공정들에서 품질 보증을 위해 중요할 수 있다.

Claims (21)

  1. 다음의 공정 단계들을 포함하는, 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법:
    a) 생산 과정 동안 액체 판크레아틴 표본의 바이러스 로드를 변화시키지 않으면서, 판크레아틴 표본으로부터 원심분리에 적합한 액체 판크레아틴 시험 샘플을 생산하는 단계,
    b) 침강 상수 ≥120S를 갖는 바이러스들이 펠렛을 형성하지 못하도록 상대 원심력 8,000~15,000×g, 지속시간 5~60분의 조건 하에서, 상기 단계 a)로부터의 판크레아틴 시험 샘플의 적어도 일부를 적어도 한번 저속 원심분리시키는 단계,
    c) 상기 공정 단계 b)에서 저속 원심분리 동안에 임의로 발생되는 임의의 고체 퇴적물은 버리고, 판크레아틴 시험 샘플 상등액은 보유하는 단계,
    d) 상기 공정 단계 c)에서 수득된 판크레아틴 시험 샘플 상등액의 적어도 일부를 불연속적 구배 매질 내에서 첫번째 초원심분리시키고, 여기에서 상기 첫번째 초원심분리 기간 및 상기 첫번째 초원심분리를 위한 상대 원심력은, 바이러스 로드가 판크레아틴 시험 샘플 상등액으로부터 나와서, 위에 놓인 최저 농도 구배 성분과 밑에 놓인 그 다음으로 높은 농도 구배 성분 사이의 경계층 위 또는 그 경계층 내에 위치한 제 1의 타겟 분획내로 이동되도록 상대 원심력 50,000~150,000×g, 지속시간 9~20시간으로 선택되며, 그리고 판크레아틴 시험 샘플 상등액으로부터의 바이러스 로드를 포함하고, 임의로 원심분리 후 존재하는 임의의 펠렛을 포함하는 상기 제 1의 타겟 분획을 분리하는 단계,
    e) 상기 단계 d)에서 수득된 제 1의 타겟 분획을 두번째로 초원심 분리시키는 단계, 여기에서 상기 두번째 초원심분리는 첫번째 초원심 분리에서 사용된 바와 동일한 유형의 구배 매질 상에서 첫번째 초원심분리의 상대 원심력보다 더 높은 150,000~300,000×g의 상대 원심력에서 지속시간 2~8시간의 조건으로 실시되고, 상기 구배 매질은 제 1의 타겟 분획 내의 최저 농도 구배 성분의 농도 보다 높은 농도 구배 매질이다, 및
    f) 상기 단계 e)에서 제 1의 타겟 분획의 두번째 초원심분리에 의해 얻어진 상부층에서의 상부의 75부피% 이상의 액체를 버리고, 상기 상부층에서의 하부의 25부피% 이하의 액체에 상응하는 하부 분획 및 원심분리 후 임의로 존재하는 임의의 펠렛을 제외한 높은 농도 구배 매질의 전체 층을 얻음으로써 바이러스 로드를 포함하는 제 2의 타겟 분획을 수득하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 공정 단계 f) 이후에 추가의 공정 단계 g)에서, 판크레아틴 표본의 바이러스 로드의 정량적 결정은 바이러스 로드를 포함하는 제 2의 타겟 분획에서 바이러스 감염 역가를 결정함에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 바이러스 로드의 정량적 결정을 실시하기 전에 희석된 또는 희석되지 않은 상기 제 2의 타겟 분획을 마이크로필터를 통해 여과하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 공정 단계 a)에서의 상기 판크레아틴 시험 샘플은, 판크레아틴 표본을 조사될 바이러스 유형의 배양에 사용된 세포주에 적합한 세포배양 배지 또는 염 용액과 함께 조합하고, 그리고 하나 이상의 항생물질들과 조합함에 의해 판크레아틴 시험 샘플 현탁액으로서 제조되는 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 공정 단계들 a)~f) 중 적어도 하나의 단계는 0~15℃의 온도로 냉각되며 실시되는 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 1항에 있어서, 상기 공정 단계 d)에 도입된 불연속적 구배 매질은 불연속성 2-상(two-phase) 수크로오스 구배인 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 불연속적 구배 매질은 50%w/v 완충 수크로오스 용액 및 20%w/v 완충 수크로오스 용액을 포함하는 구배인 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 공정 단계 e)에서 높은 농도 구배 매질은 50%w/v 완충 수크로오스 용액의 구배 매질인 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 판크레아틴 표본은 돼지 판크레아틴 표본인 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 판크레아틴 시험 샘플의 바이러스 로드는 소 로타바이러스 A, 뇌척수심근염 바이러스, 돼지 써코바이러스, 돼지 파보바이러스, 돼지 로타바이러스 A, 돼지 테스코바이러스, 돼지 간염 E 바이러스 및 돼지 수포병 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
  18. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항 또는 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 출발물질로서 사용된 상기 판크레아틴 표본은 적어도 5g의 판크레아틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴 표본으로부터 바이러스 로드의 분리 방법.
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