CN101821389B - 用于分离和测定胰酶样品中病毒载量的新方法 - Google Patents

Abstract

本文中描述了用于从胰酶样品中分离病毒载量的方法以及用于以高灵敏度定量测定胰酶样品中的病毒载量的方法。

Description

用于分离和测定胰酶样品中病毒载量的新方法

技术领域

本发明涉及用于从胰酶样品基本定量分离病毒载量的方法，以及用于以高灵敏度定量测定这种胰酶样品的病毒载量的方法。

背景技术

胰酶(pancreatin)是长时间已知的得自哺乳动物胰腺的多种生理学活性组分的混合物。胰酶的主要组分是消化酶，特别是胰脂肪酶，但是也包含淀粉酶和蛋白酶。由于其有价值的治疗性质和在应用中的高的安全水平，胰酶长久以来在酶替代疗法中被非常成功地用作药物制剂。其中胰脂肪酶具有最大的重要性，但是淀粉酶和蛋白酶也对胰酶的治疗利益有重要贡献。用于治疗目的的胰酶通常得自牛(“牛胰酶”)或猪(“猪胰酶”)，猪胰酶在数量方面具有最大的重要性。制备用于治疗目的的胰酶的方法本身是已知的，例如来自公开文本EP 0 115023 A的方法。

由于动物衍生的胰酶的性质，原料可能典型地带有不期望的生物学组分，诸如细菌或病毒污染物。然而，在包含胰酶的药用产品的超过100年的商业化过程中，没有报道过其中患者受到被病毒污染的胰酶影响的案例。然而，产生衍生自生物学组织和/或体液的药用产品的公司受到越来越多的来自管理机构的压力，该压力要求通过将所有污染物减少到可能的最低水平来提高所述产品的安全性水平，而不管任何所关心的污染物是否是人的病原体。因此，对于胰酶在药理学产品中的应用，期望得到用于检测和量化这种生物学污染物的可靠的分析方法。

直到最近，尚未开发出用于定量地检测或分离胰酶样品中的病毒污染物的可靠方法。这可能是由于胰酶的酶促活性组分与典型地用于使用本领域技术人员已知的技术来繁殖病毒的细胞系不相容，因此使得更难以甚至不可能测定胰酶样品中的病毒滴度。

仅在最近，开发了允许分离和检测胰酶样品中的病毒载量的方法，参见未公布的专利申请PCT/EP2007/054880。然而，因为衍生自动物的制备物(如胰酶)的病毒载量非常低，越来越需要提供用于分离和测定药物制剂(特别是用于药用的胰酶制备物)中病毒载量的具有高灵敏度的方法。

发明内容

因此，本发明的目的是提供从胰酶样品基本上定量分离病毒载量的高灵敏度的方法以及用于定量测定这种胰酶样品的病毒载量的方法。具体地，本发明的目的是提供从胰酶样品基本上定量分离感染性病毒载量的方法以及用于定量测定这种胰酶样品的感染性病毒载量的方法。

现在令人惊讶地发现，如果首先在多级离心过程中将病毒载量与胰酶样品分离、然后使用本身已知的病毒学方法定量地测定经过分离的病毒载量，则可以高灵敏度基本上定量地测定胰酶样品的病毒载量(特别是感染性病毒载量)。

公开文本JP 12856990已经公开了通过低速离心和超速离心的非特定组合来浓缩或分离肝炎病毒的方法。

在第一实施方案中，本发明涉及从胰酶样品中分离病毒载量的方法，包括以下方法步骤：

a)在不改变胰酶样品的病毒载量情况下，从胰酶样品产生适合于离心的液体胰酶试验样品，

b)使得自方法步骤a)的胰酶试验样品的至少一规定的部分经受至少一次低速离心，离心条件使得沉降常数≥120S的病毒不形成粒状沉淀，

c)将在方法步骤b)中在低速离心过程中任选地产生的固体沉积物弃去，并保留胰酶试验样品上清液，

d)在方法步骤c)中得到的胰酶试验样品上清液的至少一规定的部分经受在不连续梯度介质中的第一次超速离心，其中对第一次超速离心进行的持续时间和第一次超速离心的相对离心力进行选择，使得病毒载量定量地从胰酶试验样品上清液中转移到第一目标级分中，所述第一目标级分位于位于上面的最低浓度梯度组分与在下面的第二最高浓度梯度组分之间的边界层上方或边界层之中，并且将第一目标级分与胰酶试验样品上清液定量分离，所述第一目标级分任选包括在离心后得到的包含病毒载量的任何粒状沉淀；

e)在步骤d)中得到的第一目标级分经受第二次超速离心，由此所述第二次超速离心在与第一次超速离心所使用的相同类型的梯度介质上、在比第一次超速离心的相对离心力更高的相对离心力条件下进行，由此所述梯度介质是浓度比第一目标级分的最低浓度梯度组分的浓度更高的梯度介质，并且

f)如下得到包含病毒载量的第二目标级分：将与第一目标级分相对应的上层的上部75％体积/体积或更多的液体弃去，并得到下部级分和不包括任选地在离心后出现的任何粒状沉淀的更高浓度梯度介质的整个层，所述下部级分对应于上层的下部25％体积/体积或更少的液体。

在第二实施方案中，本发明涉及定量地测定胰酶样品的病毒载量(特别是胰酶样品的感染性病毒载量)的方法。例如，在第二实施方案中，除了第一实施方案的方法之外，在方法步骤f)之后进行的另外的方法步骤g)中，通过测定包含病毒载量的目标级分中的病毒感染滴度进行胰酶样品的病毒载量的定量测定，允许确定试验样品中的感染性病毒载量。

除非本文中另有说明，以下说明的任何技术和科学术语在各种情况下都具有相同的含义，如本领域技术人员所通常理解的那样。下文引用的温度范围，例如“0-15℃”的格式，表示从0℃到15℃的温度范围，并在每种情况下都包括范围边界。例如“30-120分钟”的格式的下文引用的时间范围是指从30分钟到120分钟的时间范围，在每种情况下都包括范围边界。例如“2-8小时”的格式的下文引用的时间范围是指从2小时到8小时的时间范围，在每种情况下都包括范围边界。例如“1,500-5,000xg”的格式的下文引用的相对离心力的范围是指从1,500xg到5,000xg的相对离心力范围，并在每种情况下都包括范围边界。例如“10-15ml”的格式的下文引用的体积范围是指从10毫升到15毫升的体积范围，在每种情况下都包括范围边界。例如“80-100mm”的格式的下文引用的长度范围度量是指从80毫米到100毫米的长度范围，在每种情况下都包括范围边界。

本发明的方法适合于所有类型的动物来源的胰酶并且可以特别地对常规的商用猪胰酶和对牛胰酶实施。优选对猪胰酶样品实施所述方法。

本文中所述的方法通常适合于从胰酶样品分离病毒载量并随后定量地测定胰酶样品的病毒载量。特别地，所述方法适合于分离和定量地测定胰酶样品的病毒载量，其中所述病毒载量包括牛轮状病毒A、脑心肌炎病毒(＝EMCV)、猪环状病毒(＝PCV)、猪细小病毒(＝PPV)、猪轮状病毒A、猪捷申病毒(teschovirus)和/或猪水泡病病毒(＝SVDV)。由于具有非常相似的性质，可以将人柯萨奇病毒B 5/1用作模型来验证根据本发明的方法对于分离和/或定量地测定SVDV的适用性。由于具有非常相似的性质，可以将牛轮状病毒A(例如，病毒株B 223)用作模型来验证根据本发明的方法对于分离和/或定量地测定猪轮状病毒A的适用性。本文中所述的方法还适合于如下测定胰酶样品的戊型肝炎病毒(＝HEV)的病毒载量：如所述将病毒载量分离，随后使用已知的技术(例如，聚合酶链式反应(＝“PCR”)等)进行进一步分析。

在本文中所述的方法的方法步骤a)中，在不改变或改动病毒载量(特别是其感染性病毒载量)的情况下从胰酶样品产生适合于离心的液体胰酶试验样品。这可以例如通过从胰酶样品产生胰酶试验样品悬浮液来进行。例如，通过将胰酶样品与适合于用于培养病毒种类细胞系的细胞培养基合并，并与一种或多种适合于这种目的的抗生素合并而产生胰酶试验样品悬浮液。在另一个实施方案中，通过将胰酶样品与盐水溶液(特别是磷酸缓冲盐水溶液(＝“PBS”，pH 7.2))合并而产生胰酶试验样品悬浮液。通常，所有的抗生素都适合于产生任选地用于方法步骤a)的抗生素溶液。通常使用广谱抗菌素或这种广谱抗菌素的混合物。适合的抗生素可以选自例如β-内酰胺抗生素，如青霉素、头孢菌素(包括氧头孢烯类和碳头孢烯类)、碳青霉烯和单环内酰胺；链霉素(包括硫酸链霉素)；新霉素(包括新霉素A、新霉素B和巴龙霉素)；卡拉霉素(包括卡拉霉素、庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素)；大观霉素；四环素(包括四环素、土霉素、多西环素和米诺环素)；大环内酯类抗生素(包括红霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素、交沙霉素和螺旋霉素)；回旋酶抑制剂(包括萘啶酸、西诺沙星、吡哌酸、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星和氟罗沙星)；叶酸拮抗药(包括磺酰胺抗生素、二氨基苄基嘧啶和它们的组合物)；氯霉素；林可酰胺类；糖肽抗生素(包括万古霉素和替考拉宁)；磷霉素；多肽抗生素(包括多黏菌素B、多黏菌素E、杆菌肽和短杆菌素(tyrothicin))和莫匹罗星。优选的抗生素是硫酸链霉素和青霉素以及硫酸链霉素与青霉素的混合物，例如作为抗生素“鸡尾酒”。可以将一种或多种抗生素用于例如在各自情况下适合于所述一种或多种抗生素的溶剂的溶液中，即作为抗生素溶液。

通常在冷却到0-15℃的温度下，制备胰酶试验样品悬浮液，例如冷却到4-10℃的温度。通常在冰冷却下，搅拌用于产生胰酶试验样品悬浮液的组分，持续时间为至少30分钟，例如30-120分钟，优选45-90分钟，特别是50分钟或60分钟。冷却胰酶试验样品悬浮液以及在所有另外的方法步骤中进行冷却的目的在每种情况下都是为了避免或至少显著减少任何不期望的病毒载量被胰酶样品的酶促活性组分减活化。

在使用细胞培养基来制备胰酶试验样品悬浮液的情况下，由根据本发明的方法分离和/或定量测定的病毒种类来决定都在各自情况下用于在方法步骤a)中产生胰酶试验样品悬浮液的细胞培养基。将其中所研究的病毒种类可能引发细胞致病作用(＝CPE)的允许细胞培养物用于培养和检测特定的病毒种类。CPE是可通过光学显微镜检查识别的病毒感染的细胞的变体。如果病毒种类在没有CPE的情况下在培养物细胞中繁殖，则这种繁殖一般说来仍然可以通过本身已知的间接的检测方法来鉴定。

例如，如果要分离和/或定量地测定的是牛轮状病毒A，则可以将例如胎猴肾脏细胞(＝MA-104细胞)用于病毒培养。在这种情况下，例如本身已知的Dulbecco′改进的Eagle培养基(＝Dulbecco培养基)适合作为细胞培养基。如果要分离和/或定量地测定的是EMCV，则可以将猪肾脏细胞(＝PK-15细胞)或胚胎的猪肾脏细胞(＝SPEV细胞)用于病毒培养。在PK-15细胞的情况下，例如本身已知的最低必需培养基(＝MEM)适合作为细胞培养基。在SPEV细胞的情况下，例如Dulbecco培养基适合用作细胞培养基。例如，如果要分离和/或定量测定PCV，则可以将例如PK-15细胞用于病毒培养。例如，如果要分离和/或定量测定PPV，则可以将例如猪肾脏细胞(SK-6细胞)用于病毒培养。在这种情况下，例如Dulbecco培养基适合用作细胞培养基。例如，如果要分离和/或定量测定猪轮状病毒A，则可以将例如MA-104细胞用于病毒培养。例如，如果要分离和/或定量测定猪捷申病毒(teschovirus)，则可以将例如PK-15细胞用于病毒培养。例如，如果要分离和/或定量测定SVDV，则可以将例如SPEV细胞用于病毒培养。本领域技术人员知道用于培养特定病毒种类的适合的细胞系并且知道相应的适合的细胞培养基。根据本发明可用的病毒种类以及相应的细胞系可以得自适当的来源，例如得自“American Type CultureCollection”，Manassas，USA(＝ATCC)；“Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH”，Braunschweig，Germany(＝DSMZ)；“Friedrich-

-Institut”，Federal ResearchInstitute for Animal Health，Insel Riems，Germany(＝FLI)；或“Department of Agriculture and Rural Development”的“VeterinaryService Division”，Belfast，United Kingdom(＝DARD)。

在方法步骤b)中，可以使用在方法步骤a)中得到的胰酶试验样品的全部，或者可以使用该胰酶试验样品的规定部分，特别是这个胰酶试验样品的规定体积。优选将在方法步骤a)得到的胰酶试验样品以其整体使用。

在方法步骤b)中，在低速离心的情况下，可以建立离心条件，使得沉降常数≥120S的病毒(特别是沉降常数≥120S到5,000S的病毒)不形成粒状沉淀。通常，沉降常数≥120S的病毒(特别是沉降常数≥120S到5,000S的病毒)在每种情况下在低于15,000xg的相对离心力(优选在每种情况下在8,000-15,000xg的相对离心力、特别优选在每种情况下在10,000-13,500xg的相对离心力，例如在每种情况下在10,800xg的相对离心力)进行低速离心时不形成粒状沉淀。低速离心步骤的持续时间通常最少为5分钟，通常为5-60分钟，特别是10-45分钟，优选10-30分钟，例如15分钟。在方法步骤b)的优选实施方案中，在冷却到0-15℃的温度，例如冷却到4-10℃的温度，优选在冷冻离心机中的情况下进行低速离心步骤。

在方法步骤b)中的低速离心步骤的目的主要是从胰酶悬浮液除掉对于分离和/或定量测定胰酶样品的病毒载量有破坏性的诸如不溶性颗粒等的那些胰酶组分，以便获得适合于进一步处理的胰酶试验样品上清液。因此，通常在方法步骤c)中将在低速离心步骤中任选地得到的固体沉积物弃去，而将上清液用于随后的方法步骤d)。通常重复进行低速离心步骤和随后弃去任选地得到的固体沉积物，直到不再观察到形成固体沉积物。通常，在低速离心步骤并随后弃去任选地得到的固体沉积物的1-3次重复之后就不再需要进一步重复，特别是在仅一个重复之后就不再需要进一步重复。在本发明的实施方案中，在方法步骤b)中得到的固体沉积物可以是沉降物或粒状沉淀。

在本发明的一个实施方案中，将在低速离心步骤中得到的沉积物在弃去之前用适合的冲洗液洗涤一次或多次，例如洗涤1-3次。适合的冲洗液是例如在低速离心后得到的胰酶试验样品上清液本身，然后可以将其用于方法步骤d)。如果使用不同于胰酶试验样品上清液本身的冲洗液，在完成沉积物的洗涤之后将所述冲洗液与胰酶试验样品上清液合并，然后用于方法步骤d)。如果胰酶样品的病毒载量包括EMCV，特别有利的是，在用于方法步骤d)之前以上述方式洗涤沉积物。

在特定的实施方案中，本发明还包括可以根据上述的方法步骤a)-c)制备的胰酶试验样品上清液。

通常将不连续的双相蔗糖梯度用作方法步骤d中的不连续梯度介质。不连续梯度介质优选包括从50％(重量/体积)的缓冲蔗糖溶液和20％(重量/体积)的缓冲蔗糖溶液制备的梯度。例如可以将中性缓冲液(即，pH值约为7的缓冲液)用作蔗糖溶液的缓冲液。优选使用PBS缓冲液。通常使用无菌的梯度介质。上述类型的双相不连续蔗糖梯度提供特别适合的沉降，并因此提供可能发现病毒的分离条件。不连续的蔗糖梯度，特别是如上所述从50％(重量/体积)任选地经过缓冲的蔗糖溶液和20％(重量/体积)的缓冲蔗糖溶液制备的梯度另外表现出适合的渗透性状态，以便不会将任何任选地存在的病毒载量减活化。根据方法步骤d)的超速离心确保了例如来源于胰酶样品的病毒载量基本上定量地从胰酶试验样品上清液转移到不连续梯度介质中。此处的基本上定量是指预先添加到试验样品中的病毒载量被完全回收，使得所添加的病毒载量与已经进行超速离心后回收的病毒载量之间的滴度差小于或等于病毒滴度的半个以10为底的对数步长(＝0.5个对数步长)。根据方法步骤d)的第一次超速离心另外保证了病毒载量转移到充分远离胰酶试验样品的第一目标级分中，以允许从胰酶试验样品机械分离病毒载量而没有可能出现对分离为破坏性的各相的任何再混合。

方法步骤d)通常如下进行：将一定体积的最高浓度梯度介质引入到超速离心管中，在其上方为分层的一定体积的邻近的较低浓度梯度介质。根据需要重复这个过程多次，得到多相梯度介质，最终的(顶部)层是要从中分离病毒载量的适合于离心的一定体积的液体胰酶试验样品。在双相梯度介质的情况下，邻近的较低浓度梯度介质的体积然后立即由一定体积的适合于离心的液体胰酶试验样品或胰酶试验样品悬浮液(胰酶试验样品体积)覆盖。在其双相梯度介质的情况下，这样得到了在超速离心管中的各相的序列，从上到下为包括胰酶试验样品体积(顶层)的第一层，然后是一定体积的最低浓度梯度介质(中间层；例如20％(重量/体积)的缓冲蔗糖溶液)，最后是一定体积的最高浓度梯度介质(底层，覆盖超速离心管的底部；例如50％(重量/体积)的缓冲蔗糖溶液)。在覆盖单独的体积时，必须小心操作以保证在相应的边界不会出现湍流或相互混合。

方法步骤d)中的第一目标级分典型地包括(i)与胰酶试验样品体积相距充分远并且远离胰酶试验样品体积的一部分最低浓度梯度介质和(ii)邻近的较高浓度梯度介质的整个体积。在双相梯度介质的情况下，目标级分包括例如与胰酶试验样品体积距离充分远并远离胰酶试验样品体积的一部分最低浓度梯度介质和向下延伸到超速离心管底部任选地与所述管的底部粒状沉淀在一起的最高浓度梯度介质的整个体积。

在计算与胰酶试验样品体积充分远离的第一或第二目标级分的位置以允许后续分离时，必须记住，粒子位置的计算值(即，与胰酶样品分开的病毒粒子的位置)通常表示高斯分布的顶点。因而，粒子会在其计算位置的上下都有分布。因此，在测定目标级分距离胰酶试验样品体积的期望距离时，由于粒子位置的高斯分布，需要包括另外的余量。如果沉降常数≥120S(特别是≥120S到5,000S)的粒子从胰酶试验样品体积由于超速离心而移动至少10mm，例如至少15mm、至少20mm、至少25mm或至少30mm到最低浓度梯度介质中，则病毒载量通常被转移到用于后续分离的与胰酶试验样品体积充分远离的目标级分中。在前述双相梯度介质的情况下，最低浓度梯度介质是20％(重量/体积)的缓冲蔗糖溶液。在超速离心步骤的一个变体中，沉降常数≥120S(特别是≥120S到5,000S)的基本上所有粒子完全地通过最低浓度梯度介质并且集中在与邻近的更高浓度梯度介质之间的边界层(即，在“蔗糖垫层”上)。本领域技术人员知道用于计算和实施超速离心的相应条件的适合的方法。可以基于要从胰酶样品分离的病毒的特征(例如密度和沉降常数)来决定适合的超速离心条件，当适合时采用本身已知的简化(参见例如，Lebowitz等人，“Modern analyticalultracentrifugation in protein science：A tutorial review”，ProteinScience 11(2002)2067-2079)。

假如使用常规的体积比并在不连续梯度介质中(优选在双相的不连续蔗糖梯度中)进行第一次超速离心，如果实施第一次超速离心进行的持续时间为至少1小时、通常至少4小时(如至少9小时，例如持续时间为9-20小时，特别是持续时间为12-18小时)，则病毒载量通常转移到适合于随后通过第二次超速离心分离的第一目标级分中。用于本文中所述的第一次超速离心的适合的相对离心力为至少50,000xg和/或低于150,000xg。在第一次超速离心步骤的一个实施方案中，以持续时间为12-18小时，相对离心力为50,000-150,000xg，采用进行超速离心的常规的体积比，并且在从50％(重量/体积)经过缓冲的蔗糖溶液和20％(重量/体积)经过缓冲的蔗糖溶液制备的梯度中进行所述步骤。在第一次超速离心步骤的另一个实施方案中，以持续时间为15-17小时，相对离心力为70,000-120,000xg，采用进行超速离心的常规的体积比，并且在从50％(重量/体积)经过缓冲的蔗糖溶液和20％(重量/体积)经过缓冲的蔗糖溶液制备的梯度中进行所述步骤。例如，如果使用常规的超速离心管，则得到用于实施超速离心的常规的体积比。常规的超速离心管在此处是指体积为10-50ml、特别是25-50ml的那些。假如在方法步骤d)中使用常规的超速离心管，则最高浓度梯度介质(例如，50％(重量/体积)的缓冲蔗糖溶液)的体积可为例如2ml，邻近的较低浓度梯度介质(例如，20％(重量/体积)的缓冲蔗糖溶液)的体积可以为例如14ml，胰酶试验样品体积可以为例如17ml。

在步骤e)中，使用在步骤d)中得到的第一目标级分并将所述第一目标级分置于梯度介质垫层上进行第二次超速离心。所述梯度介质垫层由例如与用于第一次超速离心相同类型的梯度介质组成，其中所述梯度介质是浓度比第一目标级分的最低浓度梯度组分的浓度更高的梯度介质。例如，在第一次超速离心是使用上述的20％重量/体积的缓冲蔗糖溶液和50％重量/体积的缓冲蔗糖溶液的系统进行的不连续梯度离心的情况下，所得到的第一目标级分是包含浓度高于20％重量/体积且低于50％重量/体积的缓冲蔗糖溶液的系统。在这种情况下，所述蔗糖垫层可以是50％重量/体积的缓冲蔗糖溶液。用于步骤d)的第一目标级分通常还任选包括在第一次离心后出现的任何粒状沉淀。

第二次超速离心进行的持续时间为至少1小时、通常为至少2小时，例如持续时间为2-8小时，特别是3-6小时。用于本文中所述的第二次超速离心的适合的相对离心力为至少100,000xg，例如大于150,000xg，如150,000-350,000xg。在第二次超速离心步骤的一个实施方案中，以持续时间为3-6小时，相对离心力为200,000-350,000xg，用于实施超速离心的常规的体积比进行所述步骤。在第二次超速离心步骤的另一个实施方案中，以持续时间为4.5-5.5小时，相对离心力为250,000-300,000xg，用于实施超速离心的常规的体积比进行所述步骤。例如，如果使用常规的超速离心管，则得到用于实施超速离心的常规的体积比。此处的常规的超速离心管为体积为例如10-15ml、特别是12-13ml；内半径为6-8mm、特别是7mm；并且高度为80-100mm、特别是85-95mm的那些。假如在方法步骤d)中使用常规的超速离心管，则梯度垫层(例如，50％(重量/体积)的经过缓冲蔗糖溶液)的体积可以为例如0.5ml，而第一目标级分体积可以为例如10ml。

本发明允许检测到至多每克用作原料的胰酶样品的一个感染单位的检测极限。

在方法步骤d)和e)的实施方案的优选变体中，与其它选定条件无关，超速离心在0-15℃温度的冷却下进行，优选冷却到4-10℃的温度。

可用于这个方法步骤的常规的冷冻离心是本领域技术人员已知的。通常在方法步骤d)和e)中使用常规的商用超速离心机，诸如具有浮桶式转子的可冷却超速离心机，例如得自

的具有型号“TH-641”浮桶式转子的超速离心机。

本发明关于低速离心步骤和超速离心步骤的上文描述可以由本领域技术人员按照比例扩大或减小到任何期望的程度，特别是在本发明的说明书中说明的另外的技术信息的帮助下。

在方法步骤d)和f)中，在每种情况下，将包含病毒载量的第一或第二目标级分与胰酶试验样品上清液和第一目标级分定量地分离。分离通常如下进行：在超速离心管上在预先确定的目标级分边界高度处进行标记。然后将这个边界上方的整个体积与其余的体积分离，例如通过吸出进行分离。可以例如使用常规的蠕动泵、方便地预先灭菌的管子和毛细管进行吸出。适合的泵送速度是例如2毫升/分钟。在吸出过程中，应该小心以保证蠕动泵毛细管总是位于液体的上部边缘处。然后可以通过本身已知的方式用常规的单通道移液吸管(优选具有无菌的尖端)将保留在超速离心管中的目标级分从超速离心管中取出。同时通过例如用单通道移液吸管重复地拉起并再悬浮除去可能仍保留在超速离心管中的任何沉降物。

在一个实施方案中，本发明还提供可以根据方法步骤a)～f)产生的经过分离的第二目标级分。

如果要实施用于定量测定胰酶样品的病毒载量的方法，在方法步骤f)之后进行方法步骤g)。在方法步骤g)中，通过测定包含病毒载量的目标级分中的病毒感染滴度而定量地测定胰酶样品的病毒载量。此处目标级分的病毒感染滴度的定量测定可以根据病毒学中本身已知的工作方法进行，例如根据本身已知的病毒感染滴度测定(＝VITD)原理进行。

可以将例如第二目标级分用适合的细胞培养基或盐水溶液(例如，PBS)以适合的比例稀释，以便得到病毒测定试验样品。适合的细胞培养基是上述可用的那些，在每种情况下与所研究的病毒种类有关。在本发明的实施方案中，为了排除病毒感染的假阳性命中，可以在方法步骤g)中进行病毒载量的定量测定之前，将经过稀释或未稀释的目标级分过滤通过微量过滤器。

可以通过例如用细胞培养基或盐水溶液将目标级分稀释到用于方法步骤d)中的胰酶试验样品上清液的原始体积而实现适合的稀释。然后，在第一步骤中，可以首先以本身已知的方式产生病毒测定试验样品的系列稀释物，例如以1∶2、1∶5或1∶10的稀释步骤或以这些稀释步骤的组合进行稀释，以便进行定量的VITD。然后，在第二步骤中，可以以本身已知的方式用得自系列稀释物的不同浓度的病毒测定试验样品接种适合的细胞悬浮液，由此使得能够在不同浓度的病毒测定试验样品上形成细胞层。为了排除可能由于微生物(诸如惰性的细菌或菌质)的存在所引起的病毒感染的假阳性命中，然后通常有利的是将病毒测定试验样品过滤，之后将它们接种到检测细胞上。为此，可以将病毒测定试验样品或稀释的病毒测定试验样品过滤通过适当孔径的过滤器，诸如微量过滤器，例如孔径(即孔直径)为0.1～10μm(包括范围边界；＝微量过滤)，优选0.1～0.45μm，通常为孔径(即，孔直径)0.1μm的微量过滤器。然后可以将滤液用作试验样品用于进一步的研究。然后，在第三步骤中，根据显示所接种的试验样品感染的方式，读取该试验样品的感染程度。其中，例如，可以将CPE用作细胞层感染的指标，在大约4-7天之后，以本身已知的方式读取CPE。此处病毒测定试验样品的滴定(终点稀释)允许定量测定最初存在的感染剂量。通常以10倍稀释进行，即根据以10为底的对数进行滴定。在实践中，通常计算50％感染剂量(＝ID₅₀)。在平行测定多个批料的情况下，鉴定的ID₅₀数值则对应于可在刚好一半批料中可检测到CPE的病毒测定试验样品的最高(倒数的)稀释物的ID₅₀值。所述结果可以任选地另外以本身已知的方式计算性校正或内推。用于病毒滴度计算的最常用方法是根据Spearman和

的那些(参见，C.Spearman，Br.J.Psychol.2(1908)227-242和G.

Arch.Exp.Path.Pharmak.162(1931)480-483；以及Bundesanzeiger[Federal gazette]no.84，May 41994)或Reed和Muench的那些(参见，Reed，L.J.，Muench，H.Am.J.Hyg.27-(1938)493-497)。

还可以使用细胞层感染的其它指标，例如病毒抗原诱导或噬斑诱导。本领域技术人员熟知这些方法以及它们在本发明中的应用，例如从病毒学教科书诸如H.W.Doerr和W.H.Gerlich的“MedizinischeVirologie”，Georg Thieme Verlag Stuttgart，New York，第一版，2002年或其最近的版本得知。

本发明的方法对于分析较大量的作为原料的胰酶样品时特别有用。使用大量的原料通常允许以更高的灵敏度测定病毒载量，也就是说，测定更低的每克感染单位。因此，根据本发明的方法对于至少5g，例如8g、10g或12g的原料特别有用。

具体实施方式

在以下实施例中所述的所有任务都在无菌工作台上在无菌条件下进行。必须遵守病毒学实验室的常规程序，例如安全程序。尤其使用了以下材料：

1.抗生素溶液，将1.0g的硫酸链霉素和1.2g的青霉素溶解于20ml的二次蒸馏水并过滤通过0.2μm过滤器。然后将滤液分成1ml等分样品并任选地在-20℃储存备用；

2.Dulbecco培养基，用于SK 6细胞、SPEV细胞和MA 104细胞的细胞培养基；

3.单通道移液吸管，带有无菌的吸头；

4.FCS，胎牛血清(例如得自Bio Whittaker；＝血清)。

5.组织培养烧瓶，无菌的，在各自情况下烧瓶底部面积为25、75或175cm²；

6.MEM，用于PK-15细胞的细胞培养基，含1.5g/l的碳酸氢钠和1mM的丙酮酸盐；

7.微量滴定板，无菌的96孔微量滴定板，带盖；

8.PAN悬浮液，10％胰酶悬浮液；将8.0g的猪胰酶(除非另有说明)在无菌条件下称量到烧杯中，与8ml的抗生素溶液和(除非另有说明)64.0ml的特定的对应的细胞培养基或PBS混合并(除非另有说明)在搅拌下在60分钟内在冰浴中悬浮；

9.Pardee缓冲液，Pardee’二氧化碳缓冲液；

10.PBS，无菌的“磷酸盐缓冲盐水”溶液(pH 7.2)；

11.移液吸管，无菌的；

12.移液吸管吸头，无菌的，在无菌托盘中；

13.塑料小袋，带有封口，不渗透CO₂(“

”，得自Merck)；

14.多克隆抗-PPV抗体，荧光素异硫氰酸酯(＝FITC)缀合物，得自NatuTec GmbH；

15.管，无菌的，15和50ml；

16.蔗糖溶液，20％，PBS-缓冲的无菌溶液，以本身已知的方式借助常规的折射计调节浓度；

17.蔗糖溶液，50％，PBS-缓冲的无菌溶液，以本身已知的方式借助常规的折射计调节浓度；

18.有螺旋盖的管，无菌的；

19.胰蛋白酶溶液，“TrypL

”，得自INVITROGEN；

20.蠕动泵，得自“ismaTec”，泵送速度最高为5.8毫升/分钟；

21.冷冻的超速离心机，带有“TH-641”转子的“

Pro80”；

22.超速离心管，无菌的，容量11ml，尺寸为9×90mm

23.稀释模块，96孔，每个为1.0ml；

24.MA-104细胞：由FLI供应；

25.PK-15细胞：由DARD供应；

26.SK-6细胞：由FLI供应；

27.SPEV细胞：由FLI供应；

28.被测试的SK 6、SPEV和PK-15细胞的细胞悬浮液，以200,000细胞/毫升，在含10％FCS的细胞培养基中；

29.无菌的Falcon微量管，容量15ml

实施例1：胰酶对不同细胞系的有害作用的研究

为了使用细胞培养物检测材料试验样品中的病毒，应该确定被研究的胰酶样品对细胞的有害作用，以便能够在评价CPE时排除假阴性结果。因此，如下所述，对不同的细胞系进行了确定胰酶试验样品悬浮液的有害作用的研究。

取得如上制备的PAN悬浮液的0.5ml部分用于测试有害作用，并将其命名为“胰酶悬浮液试验样品”。

低速离心：将剩余的PAN悬浮液在常规的冷冻离心机(22R Heraeus

，带有固定角转子no.3745)中，在10,000rpm(10,800xg)和4℃离心15分钟。然后将低速离心后的上清液在10,000rpm和4℃离心另外的15分钟，并命名为“低速离心后的上清液”，用于病毒滴定和超速离心。将在每种情况下在低速离心后得到的两种沉降物合并(共1ml)，再悬浮于9ml的各自适合的细胞培养基中，并命名为“沉降物”或粒状沉淀。

第一次超速离心：使试验样品“低速离心后的上清液”在超速离心机中进行第一次超速离心。为此，借助于移液吸管将2ml的50％(重量/体积)的蔗糖溶液引入到实施试验所需的数个超速离心管中。将超速离心管保持为偏斜角，将14ml的20％蔗糖溶液小心地置于50％蔗糖层的顶端，在两种溶液之间具有可分别的分割层。然后再将如上所述取得到的“低速离心后的上清液”试验样品的17ml层小心地并在避免湍流和相互混合的情况下放置在20％(重量/体积)蔗糖溶液上。然后将超速离心管悬浮在超速离心机转子中。为此，在每种情况下，将处于转子的相对侧面的两个超速离心管用PBS平衡、插入到相应的支架中并用所附的盖子紧密地密封。一旦将支架插入转子，将试验样品在10℃和22,000rpm(87,000xg)离心16小时。在超速离心后，在无菌工作台上将超速离心管从支架取出，并在从超速离心管底部开始测量的5cm高度处提供标记。使用蠕动泵、预先经过灭菌的管子和毛细管，以2毫升/分钟的泵送速度将标记上方的液体从超速离心管吸出，毛细管总是位于液体的上部边缘。将用这种方式得到的这个第一级分命名为“第一次超速离心后的上部级分”。在每种情况下，借助单通道移液吸管将保留在超速离心管中的“第一次超速离心后的下部级分”(1.5ml)从超速离心管中取出。通过用单通道移液吸管重复地抽吸，将可能仍保留在超速离心管底部的任何沉降物再悬浮，并同样地取出。将所有管的“第一次超速离心后的下部级分”合并，并直接用于第二次超速离心。在进行进一步处理之前，将得到的级分储存在4℃，或在长期储存的情况下储存在-20℃。

第二次离心在两个11ml管中，在4℃和272,000xg进行5小时。首先将50％(重量/体积)蔗糖溶液的梯度介质垫层引入到管中(0.5ml)。然后，使5ml的第一目标级分在梯度垫层上形成层，并如所述进行超速离心。在将上部级分弃去之后，从每个管的底部取出1.5ml的体积，不包括粒状沉淀。

然后测试试验样品“胰酶悬浮液试验样品”、“低速离心后的上清液”、“(低速离心后的)沉降物”、“第一次超速离心后的上部级分”和“(在补足到5.0ml之后的)第一次超速离心后的下部级分”以及“第二次超速离心后的上部级分”和“第二次超速离心后的下部级分”对不同细胞系的有害作用。为此，在每种情况下，制备被测试的试验样品的系列稀释物。所有被测试的试验样品从1∶5的稀释开始，用各自适合的细胞培养基进一步两倍稀释。在微量滴定板中，向在8个平行孔的每个孔中包括PK-15、SPEV或SK 6细胞的细胞悬浮液的100μl部分中添加100μl的试验样品稀释物，在所有情况下在100μl的新制备的细胞悬浮液中制备所述试验样品稀释物。在测试MA 104细胞时，使用具有经过24小时的细胞层的微量滴定板。为此，在每种情况下从孔中将细胞培养基取出，并替换为100μl的不合血清的新鲜细胞培养基，如此得到1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160等的最终的试验样品稀释物。作为对照，将100μl的细胞培养基代替100μl的系列稀释物引入到每个微量滴定板的八个孔中。将成对的板以及包含4ml Pardee缓冲液和滤纸的管一起置于气密的小袋中并用密封夹子紧密地密封。然后将所述板在36±1℃保温直到7天。在保温期间，每天用显微镜检查所述板的CPE程度，即细胞溶解和/或细胞退化和由于胰酶的有害作用导致不形成细胞层。在七天之后，进行最终评价。如果在最终读板时在对照中已经出现细胞退化，则重复进行滴定。

对不同的试验样品测试其对不同细胞系的有害作用的试验的结果显示，衍生自胰酶的“第二次超速离心后的下部级分”对不同细胞系没有有害作用。

结果证明，在分别已经经受根据本发明的第一次或第一次和第二次超速离心步骤，并且其中病毒载量已经浓缩的“第一次超速离心后的下部级分”和“第二次超速离心后的下部级分”中，与所研究的所有其它试验样品相比，对所研究的细胞系的有害作用显著减小。

实施例2：不同胰酶添加量对病毒载量的试验

将如上所述的本发明的两步超速离心方法应用到来自不同负载胰酶粉末的悬浮液的分离病毒。从胰酶分离病毒是通过在易感细胞系上进行滴定而检测低病毒载量的前提：

-将8g的药物物质与8ml的抗生素溶液(每20ml无菌PBS中含1.0g硫酸链霉素和1.2g青霉素G)和64ml的PBS混合并在冰水浴中搅拌60分钟

-将得到的悬浮液在4℃和10,800xg离心15分钟

-将第一次离心后的上清液再次在4℃和10,800xg离心15分钟

将得到的低速离心后的上清液用于第一次超速离心。使用不连续的蔗糖梯度(将包含2ml的50％(重量/体积)蔗糖和14ml的20％(重量/体积)蔗糖的四个离心管用17ml低速离心后的上清液覆盖)进行第一次超速离心。这种技术允许以相应的条件从胰酶悬浮液的主要部分分离病毒颗粒。在适当的离心条件下，来自病毒/胰酶悬浮液混合物的病毒浓集在50％(重量/体积)和20％(重量/体积)蔗糖之间的边缘层中。可溶性胰酶组分在离心后保持在病毒层上方的上清液中。通过分级分离的吸出蔗糖梯度，将病毒级分与胰酶层分离。再次将得到的病毒级分超速离心，以便使病毒进一步浓集在50％(重量/体积)蔗糖垫层上。

在四个36ml管中，在4℃和87,000xg进行第一次离心16小时。在离心后，从每个管的底部取出5ml的体积。

随后在两个11ml管中，在4℃和272,000xg进行第二次离心5小时。从每个管的底部取出1.5ml的体积。这样得到由8g胰酶粉末产生的3ml病毒浓缩物。将样品在-20℃储存。

感染性试验

感染性试验是基于如下的假设：可以通过使样品通过易感细胞系进行三次连续的传代而使样品的低病毒载量变得可见。所包含的病毒可以感染新的细胞并且在这些传代过程中扩增，导致病毒滴度升高。与大容量平板接种技术组合，通过在第三次传代之后在细胞菌苔上形成大约1000个噬斑，在三次细胞传代过程中，甚至有可能检测扩增率为10的低扩增率的单个感染性病毒。

因此，将从胰酶样品中提取的病毒级分应用于在SK 6细胞上的三个连续的传代，用于检测感染性猪细小病毒。

第一次传代(1ml病毒级分＝2,66g胰酶)

将每个单独的病毒浓缩物的三分之一(3ml中的1ml)接种在75cm²组织培养烧瓶中，所述烧瓶包含30ml的含5％FCS的细胞培养基以及经过24小时的SK 6细胞的亚汇合细胞菌苔。将细胞培养烧瓶在37±1℃保温6天。

在保温过程中以及在保温时间结束时，借助倒置显微镜检验细胞致病作用(噬斑)的形成。通过将全部组织培养烧瓶内容物经过两个冻融循环产生病毒/细胞裂解产物，完成传代。对病毒细胞裂解产物进行低速离心(2,800xg，15分钟)，以产生不含细胞的上清液。将这个低速离心后的上清液(每批30ml)过滤通过0.1μm孔径的过滤器，作为减少裂解产物被类菌质体可能污染的安全步骤。

第二次传代

准备用于每个批料的第二次传代的75cm²组织培养烧瓶，所述烧瓶包含22.5ml的含5％FCS的细胞培养基和SK 6细胞的经过24小时的细胞菌苔。添加7.5ml的得自第一次传代的细胞培养物上清液(＝25％)。将烧瓶在37±1℃保温6天，并借助倒置显微镜检查细胞致病作用。

如对于第一次传代所述，获得病毒/细胞培养物裂解产物(每批30ml)。

第三次传代

如上所述，为每个批料准备75cm²的组织培养烧瓶。向每个烧瓶中添加7.5ml的得自第二次传代的病毒/细胞培养物裂解产物(＝25％)和22.5ml的含5％FCS的细胞培养基。将烧瓶在37±1℃保温6天，并借助倒置显微镜检查细胞致病作用。

如对于第一次和第二次传代所述，获得病毒/细胞培养物裂解产物(每批30ml)。

4.用FITC缀合的抗-PPV抗体通过免疫染色检测猪细小病毒 (PPV)

准备96孔微量滴定板和经过24小时的SK 6细胞的细胞菌苔。将30个孔用100μl的得自第三次传代的每种病毒/细胞培养物裂解产物(＝10％)并在37±1℃保温24小时。

在保温之后，将细胞培养物上清液与细胞分开，并用80％丙酮和20％甲醇的冰冷混合物将细胞菌苔固定。每个孔添加100μl的FITC缀合的抗-PPV抗体溶液并将板在37±1℃保温45分钟。在去掉抗体溶液之后，将细胞菌苔用PBS洗涤3次，并用含15％甘油的PBS覆盖。在紫外光下，借助倒置显微镜检测被细小病毒感染的细胞。

与胰酶样品平行，在相同的微量滴定板上滴定具有已知滴定度的猪细小病毒NADL-2，作为阳性对照。

如所述，与阳性对照平行，在SK 6细胞上进行所有的试验项目。这样，有可能比较猪细小病毒典型的在胰酶样品和阳性对照之间的噬斑形成/细胞致病作用。

培养的结果显示在表1中。

表1：在细胞组织培养烧瓶中对SK 6细胞进行的试验项目的结果

在三个试验项目的第一次传代，在感染后6天没有检测到CPE。

在样品0436的三次传代过程中，没有检测到CPE。仅在样品0436的第三次传代中发现轻微的细胞退化，但是与样品0437和0438中观察到的细胞致病作用不一致。

在感染后四天，在样品0437的第二次传代过程中，在细胞菌苔中观察到单个的噬斑。感染后6天，烧瓶中细胞菌苔的大约20％表现出CPE。在样品的第三次传代之后，细胞菌苔的约30％表现出细胞致病作用/噬斑。

在样品0438的第二次传代过程中，在感染后3天观察到单个的噬斑。在进一步的传代过程中，继续发生噬斑形成，并产生接近汇合的CPE。

在第三次传代中，在感染后2天检测到明显的CPE。在感染后4天结束保温，具有汇合的CPE。

在组织培养烧瓶中的第三次传代之后，将得自第三次传代的病毒/细胞培养物裂解产物转移到具有SK 6细胞菌苔的微量滴定板中：

将每批为30份的100μl分入两个平行试验的30个孔中。在相同板上滴定猪细小病毒NADL-2的阳性对照。

将板在37±1℃保温，第一个板用于观察细胞致病作用，第二个板用于通过免疫染色检测猪细小病毒。

将第一个板保温6天。在保温结束时，样品0437和0438表现出与阳性对照PPV NADL-2相同的细胞致病作用。样品0436未显示任何CPE。

在开始保温之后24小时，将得自第二个微量滴定板的培养物上清液取出。短的保温时间应该降低检测到细胞被从初级感染的细胞释放的细小病毒二次感染的能力。将细胞菌苔固定并用FITC-缀合的抗-PPV-抗体染色，在紫外光下借助倒置显微镜检查被感染的细胞。这与噬斑滴定法一致，并且有可能检测第三次传代裂解产物的病毒滴定度。

得到了以下结果：

在用得自样品0436的第三次传代的不含细胞的病毒裂解产物感染的30个孔中没有一个包含明显的荧光细胞。

除了所试验的3ml(＝10％)之外，另外将30x100μtl不含细胞的病毒裂解产物转移到具有SK 6细胞菌苔的微量滴定板中，在在37±1℃保温24小时，固定并用抗-PPV抗体染色。在这30个另外的孔中没有发现被感染的细胞。

这个结果与样品0436在组织培养烧瓶中传代和在微量滴定板中的第三次传代之后用于检测细胞致病作用的结果相关联。

在样品0437和0438的情况下，用抗-PCV抗体染色的所有的30个孔包含明显的荧光细胞，诸如阳性对照PPV NADL-2。

如上所证明的，本发明的方法允许鉴定一个感染单位/1g胰酶，因此提供了用于从胰酶样品分离和测定病毒载量的高灵敏度的方法。另外，与基于分子生物学如基于扩增方法(如，PCR)检测核酸分子的方法相反，本发明的方法允许测定感染单位。因此，有可能在感染性病毒载量和非感染性病毒载量或通过分子生物学技术测定的总病毒载量之间加以区分。

在另外的实施方案中，传代和检测可以逐步(如上所述)或以平行的方式进行。平行的方式意味着，在进行一个传代的同时，可以已经测定了前一代的病毒载量。使用这种方法，可以从所有的传代获得结果，并且如果从第一次传代得到了结果，可以在比逐步方法更早的时间点得到结果。这对于例如提高时间效率和/或例如对于制备过程的质量保证来说具有重大意义，因为可以在较早的时间点得到相应的样品或产品。

Claims (14)

1.从胰酶样品中分离病毒载量的方法，包括以下方法步骤：

a)在不改变胰酶样品的病毒载量的情况下，由该胰酶样品制备适合于离心的液体胰酶试验样品，

b)使方法步骤a)的胰酶试验样品的至少一规定部分经受至少一次低速离心，离心条件使得沉降常数≥120S的病毒还不形成粒状沉淀，

c)将在方法步骤b)中在低速离心过程中产生的任何固体沉积物弃去，并保留胰酶试验样品上清液，

d)使在方法步骤c)中得到的胰酶试验样品上清液的至少一规定的部分经受在不连续梯度介质中的第一次超速离心，其中该第一次超速离心进行至少9小时，并且该第一次超速离心的相对离心力小于150,000xg，使得病毒载量定量地从胰酶试验样品上清液中转出到第一目标级分中，所述第一目标级分位于上面的最低浓度梯度组分与在下面的其次较高浓度梯度组分之间的边界层上方或其中，并且将第一目标级分与胰酶试验样品上清液定量分离，所述第一目标级分包括在离心后存在的包含病毒载量的任何粒状沉淀；

e)使在步骤d)中得到的第一目标级分经受第二次超速离心，由此在与第一次超速离心所使用的相同类型的梯度介质上、在相对离心力大于150,000xg的相对离心力条件下，进行所述第二次超速离心至少2小时，由此所述梯度介质是浓度比第一目标级分的最低浓度梯度组分的浓度更高的梯度介质，并且

f)如下得到包含病毒载量的第二目标级分：将与第一目标级分相对应的上层的上部至少75％体积/体积的液体弃去，并得到下部级分和不包括在离心后存在的任何粒状沉淀的更高浓度梯度介质的整个层，所述下部级分对应于上层的下部至多25％体积/体积的液体。

2.权利要求1中要求保护的方法，其中在方法步骤f)之后另外进行的方法步骤g)中，通过测定包含病毒载量的第二目标级分中的病毒感染滴度，进行胰酶样品病毒载量的定量测定。

3.权利要求2中要求保护的方法，其中在进行病毒载量的定量测定之前，将经过稀释或未稀释的第二目标级分过滤通过微量过滤器。

4.权利要求1中要求保护的方法，其中在方法步骤a)中，通过将胰酶样品与适合于用于培养被研究的病毒类型的细胞系的细胞培养基合并或与盐水溶液合并，并与一种或多种抗生素合并，将胰酶试验样品制备成胰酶试验样品悬浮液。

5.权利要求4中要求保护的方法，其中步骤a)到f)中的至少一个步骤在冷却至0～15℃的温度下进行。

6.权利要求1中要求保护的方法，其中在每种情况下，方法步骤b)中的低速离心以小于15,000xg的相对离心力进行。

7.权利要求1中要求保护的方法，其中在每种情况下，方法步骤b)中的低速离心以8,000～15,000xg的相对离心力进行。

8.权利要求1中要求保护的方法，其中方法步骤b)中的低速离心进行的持续时间为至少5分钟。

9.权利要求1中要求保护的方法，其中在方法步骤d)中引入的不连续梯度介质是不连续的双相蔗糖梯度。

10.权利要求9中要求保护的方法，其中所述不连续梯度介质是包括50％重量/体积的缓冲蔗糖溶液和20％重量/体积的缓冲蔗糖溶液的梯度。

11.权利要求1中要求保护的方法，其中在方法步骤e)中的较高浓度梯度介质是50％重量/体积的缓冲蔗糖溶液的梯度介质。

12.权利要求1中要求保护的方法，其中所述胰酶样品是猪胰酶样品。

13.权利要求1中要求保护的方法，其中所述胰酶试验样品的病毒载量包括牛轮状病毒A、脑心肌炎病毒、猪环状病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒A、猪捷申病毒、猪戊型肝炎病毒和/或猪水泡病病毒。

14.根据权利要求1～13中任一项的方法，其中用作原料的胰酶样品包括至少5g胰酶。