RU2008150623A - Способ выделения и определения вирусной нагрузки в образце панкреатина - Google Patents

Abstract

1. Способ выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина, заключающийся в том, что: ! а) приготавливают жидкий опытный образец панкреатина, пригодный для центрифугирования, из образца панкреатина, не изменяя его вирусной нагрузки; ! б) подвергают по меньшей мере одну определенную часть опытного образца панкреатина, полученного на стадии а) способа, по меньшей мере одному низкоскоростному центрифугированию в условиях, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥ 120 S, еще не образуют дебрис; ! в) отбрасывают все твердые отложения, которые необязательно образуются на стадии б) способа во время низкоскоростного центрифугирования и сохраняются в супернатанте опытного образца панкреатина; ! г) подвергают по меньшей мере одну определенную часть супернатанта опытного образца панкреатина, полученного на стадии в) способа, ультрацентрифугированию в среде со ступенчатым градиентом, где продолжительность ультрацентрифугирования и относительную центробежную силу для центрифугирования выбирают таким образом, чтобы вирусная нагрузка количественно транспортировалась из супернатанта опытного образца панкреатина в целевую фракцию, находящуюся выше пограничного слоя или в пограничном слое между расположенным сверху компонентом градиента с наименьшей концентрацией и расположенным снизу компонентом градиента со следующей более высокой концентрацией; и ! д) количественно выделяют целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку из супернатанта опытного образца панкреатина. ! 2. Способ по п.1, в котором в дополнение к стадии д) способа осуществляют дополнительную стадию е) способа, которая заключа

Claims (19)

1. Способ выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина, заключающийся в том, что:

а) приготавливают жидкий опытный образец панкреатина, пригодный для центрифугирования, из образца панкреатина, не изменяя его вирусной нагрузки;

б) подвергают по меньшей мере одну определенную часть опытного образца панкреатина, полученного на стадии а) способа, по меньшей мере одному низкоскоростному центрифугированию в условиях, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥ 120 S, еще не образуют дебрис;

в) отбрасывают все твердые отложения, которые необязательно образуются на стадии б) способа во время низкоскоростного центрифугирования и сохраняются в супернатанте опытного образца панкреатина;

г) подвергают по меньшей мере одну определенную часть супернатанта опытного образца панкреатина, полученного на стадии в) способа, ультрацентрифугированию в среде со ступенчатым градиентом, где продолжительность ультрацентрифугирования и относительную центробежную силу для центрифугирования выбирают таким образом, чтобы вирусная нагрузка количественно транспортировалась из супернатанта опытного образца панкреатина в целевую фракцию, находящуюся выше пограничного слоя или в пограничном слое между расположенным сверху компонентом градиента с наименьшей концентрацией и расположенным снизу компонентом градиента со следующей более высокой концентрацией; и

д) количественно выделяют целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку из супернатанта опытного образца панкреатина.

2. Способ по п.1, в котором в дополнение к стадии д) способа осуществляют дополнительную стадию е) способа, которая заключается в том, что количественно определяют вирусную нагрузку в образце панкреатина путем определения титра вирусной инфекции в содержащей вирусную нагрузку целевой фракции.

3. Способ по п.2, в котором разведенную или неразведенную целевую фракцию фильтруют через микрофильтр перед осуществлением количественного определения вирусной нагрузки.

4. Способ по п.1, в котором на стадии а) способа приготавливают опытный образец панкреатина в виде суспензии опытного образца панкреатина путем объединения образца панкреатина со средой для культивирования клеток, которая пригодна для линии клеток, используемой для культивирования подлежащего исследованию типа вируса, и с одним или несколькими антибиотиками.

5. Способ по п.4, в котором приготовление опытного образца панкреатина осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С.

6. Способ по п.1, в котором низкоскоростные центрифугирования на стадии б) способа в каждом случае осуществляют при относительной центробежной силе менее 10000·g.

7. Способ по п.1, в котором низкоскоростные центрифугирования на стадии б) способа в каждом случае осуществляют при относительной центробежной силе 1500-5000·g.

8. Способ по п.1, в котором низкоскоростные центрифугирования на стадии б) способа осуществляют в течение по меньшей мере 5 мин.

9. Способ по п.1, в котором ультрацентрифугирование на стадии г) способа осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч при относительной центробежной силе, составляющей по меньшей мере 100000·g.

10. Способ по п.9, в котором ультрацентрифугирование на стадии г) способа осуществляют в течение 2-8 ч и относительная центробежная сила составляет 200000-350000·g.

11. Способ по п.1, в котором низкоскоростные центрифугирования на стадии б) способа и ультрацентрифугирование на стадии г) способа в каждом случае осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С.

12. Способ по п.1, в котором среда со ступенчатым градиентом, используемая на стадии г) способа, представляет собой двухфазный ступенчатый градиент сахарозы.

13. Способ по п.12, в котором среда со ступенчатым градиентом представляет собой градиент, полученный с использованием 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы.

14. Способ по п.1, в котором образец панкреатина представляет собой образец панкреатина свиньи.

15. Способ по п.1, в котором вирусная нагрузка в опытном образце панкреатина представляет собой ротавирус А коров, вирус энцефаломиокардита, цирковирус свиней, парвовирус свиней, ротавирус А свиней, тешовирус свиней и/или вирус заболевания свиней с везикулярным синдромом.

16. Суспензия опытного образца панкреатина, которую можно приготавливать с помощью стадии а) способа по п.4, где опытный образец панкреатина приготавливают в виде суспензии опытного образца панкреатина путем объединения образца панкреатина со средой для культивирования клеток, которая пригодна для линии клеток, используемой для культивирования подлежащего исследованию типа вируса, и с одним или несколькими антибиотиками.

17. Супернатант опытного образца панкреатина, который можно приготавливать с помощью стадий а)-в) способа по п.1, где на стадии а) способа опытный образец панкреатина приготавливают в виде суспензии опытного образца панкреатина путем объединения образца панкреатина со средой для культивирования клеток, которая пригодна для линии клеток, используемой для культивирования подлежащего исследованию типа вируса, и с одним или несколькими антибиотиками.

18. Выделенная целевая фракция, которую можно получать с помощью способа по п.1.

19. Выделенная целевая фракция по п.18, где на стадии а) способа опытный образец панкреатина приготавливают в виде суспензии опытного образца панкреатина путем объединения образца панкреатина со средой для культивирования клеток, которая пригодна для линии клеток, используемой для культивирования подлежащего исследованию типа вируса, и с одним или несколькими антибиотиками.