JP5101604B2 - パンクレアチン試料中のウィルス負荷の分離及び決定するための方法 - Google Patents
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Description
従って、本発明の課題は、パンクレアチン試験体からウィルス負荷を実質的に定量的に分離するための方法、及び、パンクレアチン試験体のウィルス負荷を定量的に決定するための方法を提供することであった。特に、本発明の課題は、パンクレアチン試験体から感染性ウィルス負荷を実質的に定量的に分離するための方法、及び、パンクレアチン試験体の感染性ウィルス負荷を定量的に決定するための方法を提供することであった。
a)パンクレアチン試験体から、遠心分離に適した液体のパンクレアチン試験試料を、この間にこのウィルス負荷を変更させること無く製造する方法工程、
b)方法工程a)からの前記パンクレアチン試験試料の定義された少なくとも一部を、沈降定数≧120Sを有するウィルスがまだペレットを生じない条件下に、少なくとも1回の低速遠心分離に課す方法工程、
c)方法工程b)において低速遠心分離の間に場合により生じる固形の堆積物を捨て、かつ、パンクレアチン試験試料上清を維持する方法工程、
d)方法工程c)において得られる定義された少なくとも一部のパンクレアチン試験試料上清を、不連続的な勾配媒体中で超遠心に課す方法工程、その際、超遠心分離の期間及び超遠心分離のための相対的遠心分離力を、このウィルス負荷が、パンクレアチン試験試料上清から目標画分中に定量的に輸送されるように選択し、その際目標画分は、この上にある、最低濃度勾配成分と、この下にある、次により高い濃度勾配成分との間の境界層の上または中にある、及び
e)パンクレアチン試験試料上清からウィルス負荷を含有する目標画分を定量的に分離する方法工程
を含有する、パンクレアチン試験体からウィルス負荷を分離するための方法に関する。
以下の実施例において述べられた全ての処理は、滅菌したワークベンチで滅菌条件下で実施された。ウィルス学的研究室において慣用の手順、例えば安全手順が遵守されなくてはならない。以下の材料を特に使用した:
1.抗生物質溶液、1.0gの硫酸ストレプトマイシン及び1.2gのペニシリンを、20mlの2回蒸留した水中に溶解させ、かつ、0.2μmのフィルターを通じて濾過した。この濾過物を、次に1mlのアリコートに分け、かつ、場合により−20℃で使用まで貯蔵した;
2.ダルベッコ培地、SK6細胞、SPEV細胞及びMA104細胞のための細胞培養媒体;
3.単一チャネルピペット、滅菌チップ付き;
4.FCS、胎児ウシ血清、Bio Whittakerから(=血清);
5.組織培養フラスコ、滅菌、このフラスコ底部の領域はそれぞれ、25、75又は175cm2;
6.MEM、PK−15細胞のための細胞培養培地、1.5g/lの重炭酸ナトリウム及び1mMのピルビン酸を有する;
7.マイクロタイタープレート、滅菌、96ウェル及びフタを有する;
8.PAN懸濁体、10%のパンクレアチン懸濁体;1.0gのブタパンクレアチン(他に言及がなければ)を、滅菌条件下で、ビーカー中に秤量し、かつ、1mの抗生物質溶液及び(他に言及がなければ)8.0mlの特定の相応する細胞培養培地と組み合わせ、かつ、(他に言及がなければ)60分間のうちに、氷浴上で、撹拌しながら懸濁した;
9.パーディー緩衝液(Pardee)、パーディーの二酸化炭素緩衝液;
10.PBS、滅菌、「リン酸緩衝化した食塩水」溶液(pH7.2);
11.ピペット、滅菌;
12.ピペットチップ、滅菌して、滅菌トレイ中に;
13.プラスチックパウチ、CO2不透過性、栓あり(Merckからの"Anaerocult(R))";
14.ポリクローナル抗PPV抗体、フルオレセインイソシアナート(=FITC)コンジュゲート、NatuTec GmbHから;
15.管、滅菌、15及び50ml;
16.スクロース溶液、20%、PBS緩衝化、滅菌;濃度を自体公知の様式で、慣用の屈折計を用いて適合する;
17.スクロース溶液、50%、PBS緩衝化、滅菌;濃度を自体公知の様式で、慣用の屈折計を用いて適合する;
18.スクリュートップ管、滅菌;
19.トリプシン溶液、「TrypL Express(R)」、からINVITROGEN;
20.蠕動ポンプ、「ismaTec」から、5.8ml/分までのポンプ速度;
21.冷却超遠心分離機、「Sorvall(R) Pro 80」、「TH-641」ローターを有する;
22.超遠心分離管、滅菌、容量11ml;直径9×90mm;
23.希釈ブロック、96ウェル、それぞれ1.0ml;
24.MA−104細胞、FLIにより供給;
25.PK−15細胞、DARDにより供給;
26.SK−6細胞、FLIにより供給;
27.SPEV細胞、FLIにより供給;
28.試験すべきSK6、SPEV及びPK−15細胞の細胞懸濁体、10%のFCSを有する細胞培養媒体中で200000細胞/mlを有する;
29.滅菌Falconマイクロ管、容量15ml。
細胞培地を用いた材料試験試料中でのウィルスの検出の目的のために、細胞に対する検査すべきパンクレアチン試験体の有害な効果が、CPEsを評価する際に誤った陰性の結果を除外することができるように、確かめられなければならない。後述するとおり、パンクレアチン試験試料懸濁体の有害な効果を確かめるための検査を従って、様々な細胞系列で実施した。
増加したウィルス力価の添加でのパンクレアチン試験体の検査(=「高スパイク試験」)の目的は、とりわけ、本発明による方法が、パンクレアチン試験体及び生細胞に有害であってよいその構成要素からウィルス負荷を定量的に分離するために適していることを示すことである。この終わりに、検査すべきこの各ウィルスの高力価の「スパイク(spiked)ウィルス調製物」を、公知の様式において調製した。
高力価(7.70±0.10 log TCID50/ml)の、EMCV(LC 75株)のスパイクしたウィルス調製物0.75ml及び抗生物質溶液0.75mlを、PAN懸濁液(0.75gのパンクレアチンに対する4.5mlのダルベッコ培地の添加及び50分間の氷冷しながらの撹拌により産生)に添加し、かつ、この生じる懸濁体を、更に10分間撹拌した。0.5mlのこの懸濁液を、ウィルス滴定のために取り出し、かつ、滴定まで4℃で貯蔵した(=「EMCV高画分1」)。この残りの懸濁体を、15分間4000rpm(=2700×g)及び4℃で遠心分離した。遠心分離後のこの上清を、新規の遠心分離管中で、15分間、4℃及び4000rpmで再度遠心分離した。この第2の遠心分離後の上清を、滅菌した管中に定量的に移した(=「EMCV高画分2」)。低速遠心分離後のこの2つの沈殿を、合計で6.5mlのダルベッコ培地で再懸濁し、一緒にし、15分間の、4000rpm及び4℃で再遠心分離した。この生じる上清を、滅菌した管中に移した。この沈殿の洗浄を2回更に繰り返し、それぞれ、6.5mlの新規のダルベッコ媒体で繰り返した。この3回の洗浄溶液を組み合わせ、かつ、ウィルス滴定のために使用した(=「EMCV高画分3」)。3回の洗浄後に、沈殿を、6.5mlのダルベッコ培地中に再懸濁し、次いで滴定した(=「EMCV高画分4」)。
ブタパルボウィルス(PPV)は、成長するSK6細胞中で培養されることができる。このウィルス収量が低すぎる場合には、このウィルスは、培養後に濃縮される。
第3表:パンクレアチン懸濁体中でのPPVを用いた高スパイク試験の結果
減少するウィルス力価の添加でのパンクレアチン試験体の検査(=「低スパイク試験」)の目的は、特に、それぞれの場合に使用されるウィルスについての本発明による方法の検出限度を確かめることであった。減少するウィルス力価を有する個々の試験試料中でのウィルス負荷の定量的な検出は、当初添加されるスパイクしたウィルス調製物のウィルス力価が、0.5ログステップの偏差の一般的に許容可能な範囲を考慮して、少なくともおおよそ、超遠心分離後の下方画分中で定量的に回収されている場合に、成功したとみなされる。
PAN懸濁体を産生した(2.5gのブタパンクレアチン、2.5mlの抗生物質溶液、20mlのダルベッコ培地)。低スパイク試験を次いで、デュプリケイトで、相互に独立した試験において実施した。
1)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-3の希釈のスパイクウィルス;生じる希釈、10-4;
2)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-4の希釈のスパイクウィルス;生じる希釈、10-5;
3)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-5の希釈のスパイクウィルス;その他;
4)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-6の希釈のスパイクウィルス;
5)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-7の希釈のスパイクウィルス;
6)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-8の希釈のスパイクウィルス。
PAN懸濁体を産生した(2.5gのブタパンクレアチン、2.5mlの抗生物質溶液、20mlのダルベッコ培地)。低スパイク試験を次いで、デュプリケイトで、相互に独立した試験において実施した。
1)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-1の希釈のスパイクウィルス;
2)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-2の希釈のスパイクウィルス;
3)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-3の希釈のスパイクウィルス;
4)4.5mlのパンクレアチン懸濁体+0.5mlの10-4の希釈のスパイクウィルス。
Claims (14)
- a)パンクレアチン試験体からの遠心分離に適した液体のパンクレアチン試験試料を、ウィルス負荷を変更させること無く製造する方法工程、
b)方法工程a)からの前記パンクレアチン試験試料の定義された少なくとも一部を、少なくとも1回の低速遠心分離に、沈降定数≧120Sを有するウィルスがペレットをまだ生じない条件下に課す方法工程、
c)方法工程b)において低速遠心分離の間に生じる固形の堆積物を捨て、かつ、パンクレアチン試験試料上清を維持する方法工程、
d)方法工程c)において得られる定義された少なくとも一部のパンクレアチン試験試料上清を、不連続的な勾配媒体中で超遠心に課す方法工程、その際、超遠心分離が、少なくとも1時間実施され、かつ、この相対的遠心分離力が少なくとも100000×gである、及び
e)パンクレアチン試験試料上清からウィルス負荷を含有する目標画分を定量的に分離する方法工程
を含有する、パンクレアチン試験体からウィルス負荷を分離するための方法。 - 方法工程e)の後の方法工程f)において、付加的に、パンクレアチン試験体のウィルス負荷の定量的な決定が、このウィルス負荷を含有する目標画分中のウィルス感染力価の決定により実施される、請求項1記載の方法。
- 希釈したか又は希釈していない目標画分を、このウィルス負荷の定量的な決定が実施される前に、マイクロフィルターを通じて濾過する、請求項2記載の方法。
- 方法工程a)において、パンクレアチン試験試料を、パンクレアチン試験試料懸濁体として、このパンクレアチン試験体と、検査されるべきウィルスタイプを培養するために使用される細胞系列に適した細胞培養培地と、及び、1種以上の抗生物質とを組み合わせることにより製造する、請求項1記載の方法。
- パンクレアチン試験試料懸濁体の製造が、0〜15℃の温度への冷却と共に進行する、請求項4記載の方法。
- 方法工程b)における低速遠心分離が、それぞれの場合において、10000×g未満の相対的遠心分離力でもって実施される、請求項1記載の方法。
- 方法工程b)における低速遠心分離が、それぞれの場合において、1500〜5000×gの相対的遠心分離力でもって実施される、請求項1記載の方法。
- 方法工程b)における低速遠心分離が、少なくとも5分間実施される、請求項1記載の方法。
- 方法工程d)における超遠心分離が、2〜8時間実施され、かつ、この相対的遠心分離力が200000〜350000×gである、請求項1記載の方法。
- 方法工程b)における低速遠心分離及び方法工程d)における超遠心分離が、それぞれの場合において、0〜15℃の温度への冷却とともに実施される、請求項1記載の方法。
- 方法工程d)において導入される不連続的勾配媒体が、不連続的な2相のスクロース勾配である、請求項1記載の方法。
- 不連続的勾配媒体が、50%(wt./vol.)の緩衝化されたスクロース溶液及び20%(wt./vol.)の緩衝化されたスクロース溶液から調製される勾配である、請求項11記載の方法。
- パンクレアチン試験体が、ブタパンクレアチン試験体である、請求項1記載の方法。
- パンクレアチン試験試料のウィルス負荷が、ブタロタウィルスA、脳心筋炎ウィルス、ブタサーコウィルス、ブタパラボウィルス、ブタロタウィルスA、ブタテシオウィルス及び/又はブタ小胞性疾病ウィルスを含む、請求項1記載の方法。
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