KR101408103B1

KR101408103B1 - 고농도 ｇａｂａ의 제조방법

Info

Publication number: KR101408103B1
Application number: KR1020120081810A
Authority: KR
Inventors: 박복준; 김용덕; 김현호; 오재영; 박동철
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2014-06-16
Also published as: KR20140014800A

Abstract

본 발명은 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유하고 있는 미생물 전세포 및 글루타민산 디카르복실라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 생촉매(biocatalyst)에 글루타민산 또는 글루타민산염 기질을 접촉시켜 탈카르복실화 반응을 진행하는 단계를 포함하는 감마아미노부틸산(GABA)의 제조방법에 있어서, 상기 단계에서 NaCl(염화나트륨)이 첨가되는 감마아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 NaCl(염화나트륨)을 PLP 대체제로 이용하는 경우 낮은 생산비용 및 높은 수율로 고농도의 GABA를 제조할 수 있는 장점이 있다.

Description

고농도 ＧＡＢＡ의 제조방법{Methods for Preparing High-Concentrated GABA}

본 발명은 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산염(glutamate)을 기질로 하여 감마아미노부틸산(GABA)을 효소적으로 제조하는 방법에 있어서, 효소전환 시 NaCl(염화나트륨)을 PLP 대체제로 이용하여 고농도 GABA를 제조하는 방법에 관한 것이다.

감마아미노부틸산(GABA, CAS number 56-12-2)은 신경전달물질로서 동물의 경우 주로 뇌, 심장, 폐 및 신장 등에 분포되어 있으며, 혈압 상승을 억제하고 시력증진에 효과가 있으며, 불안감 및 초조감 등을 진정시키는 작용을 하는 것으로 알려진 물질이다. 체내 GABA 농도가 낮을 경우 발작, 경련 증세를 일으키는 것으로 알려져 있어, 이들 증세를 완화 내지는 치료하기 위해 체내 GABA 농도를 높이기 위한 목적의 약제 개발이나 GABA의 위와 같은 약리적인 특성을 이용한 GABA의 함량이 증가된 녹차, 현미 및 고추장 등의 기능성 식품 개발이 활발하다.

감마아미노부틸산은 글루타민산 또는 글루타민산염으로부터 글루타민산 디카르복실라아제(GAD, EC 4.1.1.15)에 의해서 생산된다. 글루타민산 디카르복실라아제를 생산하는 대표적인 미생물로는 아스퍼질러스(Aspergillus oryzae), 클로스트리듐(Clostridium perfingens), 대장균(Escherichia coli), 락토바실러스(Lactobacillus lactis) 및 리스테리아(Listeria monocytogenes) 등이 있으며, 인간의 경우도 글루타민산 디카르복실라아제를 보유하여 신경전달물질로 GABA를 체내에서 생산하고 있다.

GABA의 산업적인 생산은 주로 기능성 식품을 제조하기 위한 것으로 유산균 배양 중의 부산물로서 GABA를 생산하거나 배양액에 직접적으로 글루타민산 디카르복실라아제의 기질인 글루탐산나트륨을 첨가하여 GABA 함량이 증가된 제품을 생산하는 방법이 주류를 이루고 있다. 이들 제품의 GABA 함유량은 6-400 mg/100g 범위로 0.5 중량% 미만 수준이다.

GABA의 또 다른 용도는 나일론-4 생산에 사용되는 피롤리돈을 제조하기 위한 목적으로 사용하는 것이다. 이를 위해서는 GABA의 대량 생산 및 고농도 생산이 필수적이라 할 수 있으나 기존의 GABA 생산 공정은 위와 같은 조건을 만족시키지 못한다. 최근에 반응 속도를 향상시키기 위해 미생물을 파쇄한 뒤 그 파쇄액을 사용하거나 파쇄액에서 글루타민산 디카르복실라아제를 분리 정제하여 GABA 생산 반응을 수행하는 방법이 공개 되었다. 또한 분리 정제된 글루타민산 디카르복실라아제를 고정화 하여 GABA를 생산하는 방법 역시 공개된 바 있으나 이들 모두 촉매를 준비하는데 소요되는 비용이 매우 고가이어서 이러한 방법을 통해 제조된 GABA를 이용하여 피롤리돈을 제조할 경우 석유로부터 생산되는 제품과의 가격경쟁력 측면에서 불리한 점으로 작용하기 때문에 피롤리돈을 생산하기 위한 산업적 용도로는 적합하지 않다는 단점이 있다.

따라서 GABA를 산업적 스케일로 경제적으로(cost-effective) 생산하는 신규한 공정에 대한 당업계의 요구가 대두되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

기존의 GABA의 생산 방법이 GABA의 함유량이 낮고, 생산비용이 고가라는 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 GABA의 반응 수율이 높고, 생산비용이 저렴하며 고농도의 GABA를 제공할 수 있는 신규한 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유한 미생물 전세포 및/또는 글루타민산 디카르복실라아제를 촉매로 하여, 글루탐산 또는 글루탐산염을 기질로 사용하고, GABA 제조 시 NaCl(염화나트륨)을 피리독살 5-인산(PLP) 대체제로 이용하는 경우 낮은 생산비용 및 높은 수율로 고농도의 GABA를 제조할 수 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 고농도 GABA의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 PLP-의존성 감마아미노부틸산(GABA)의 제조를 PLP-비의존성 감마아미노부틸산(GABA)의 제조로 전환시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 GABA 제조에서 PLP 대체용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유하고 있는 미생물 전세포 및 글루타민산 디카르복실라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 생촉매(biocatalyst)에 글루타민산 또는 글루타민산염 기질을 접촉시켜 탈카르복실화 반응을 진행하는 단계를 포함하는 감마아미노부틸산(GABA)의 제조방법에 있어서, 상기 단계에서 NaCl이 첨가되는 것을 특징으로 하는 감마아미노부틸산(GABA)의 제조방법을 제공한다.

기존의 GABA의 생산 방법이 GABA의 함유량이 낮고, 생산비용이 고가라는 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 GABA의 반응 수율이 높고, 생산비용이 저렴하며 고농도의 GABA를 제공할 수 있는 신규한 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유한 미생물 전세포 및/또는 글루타민산 디카르복실라아제를 촉매로 하여, 글루탐산 또는 글루탐산염을 기질로 사용하고, GABA 제조 시 NaCl(염화나트륨)을 PLP 대체제로 이용하는 경우 낮은 생산비용 및 높은 수율로 고농도의 GABA를 제조할 수 있다는 사실을 발견하였다.

본 발명의 고농도 GABA의 제조방법을 상술하면 다음과 같다:

본 발명에 따르면, 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유하고 있는 미생물 전세포 및 글루타민산 디카르복실라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 생촉매(biocatalyst)에 글루타민산 또는 글루타민산염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 단계에서 NaCl이 첨가된다.

본 발명의 가장 큰 특징은 글루타민산 디카르복실라아제를 이용하여 GABA를 제조하는 데 있어서, 종래 필수적으로 첨가되고 있는 피리독살-5-인산(PLP)의 대체제로서 NaCl을 이용하는 것이다.

본 발명에서 이용되는 “NaCl(염화나트륨)”은 당업계의 어떠한 NaCl도 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 NaCl은 PLP을 대체하여 첨가한다.

본 명세서에서 NaCl 및 PLP를 언급하면서 사용되는 용어 “대체”는 GABA 제조를 위한 반응물에서 첨가되는 PLP를 실질적으로 배제하는 것 및 완전히 배제하는 것을 의미한다. 예를 들어, NaCl에 의한 PLP의 대체는 GABA 제조 반응물에서 PLP의 양을 10 μM 이하, 1 μM 이하, 0.1 μM 이하, 0.01 μM 이하 또는 0.001 μM 이하로 포함하면서 NaCl을 이용하는 것을 의미할 수 있다. 바람직하게는, NaCl에 의한 PLP의 대체는 PLP의 필요성을 완전히 배제하는 것 즉 GABA 제조 반응물에서 PLP를 사용하지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 NaCl은 0.01-5.0 중량%으로 이용하고, 보다 바람직하게는 0.01-2.0 중량%로 이용하며, 보다 더 바람직하게는 0.05-1.60 중량%로 이용하고, 보다 더욱 더 바람직하게는 0.08-1.00 중량%로 이용하며, 가장 바람직하게는 0.15-0.70 중량%로 이용한다. 본 명세서에서 NaCl을 언급하면서 사용되는 용어 “중량%”는 상기 GABA의 제조를 위해 사용되는 반응물 전체에 대한 NaCl의 중량 비율이다.

본 발명에서 이용되는 미생물은 글루타민산 디카르복실라아제를 보유하고 있는 어떠한 미생물도 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 미생물은 아스퍼질러스 속, 클로스트리듐 속, 에스체리치어 속, 락토바실러스속, 락토코쿠스 속 또는 리스테리아 속 미생물이고, 보다 바람직하게는 에스체리치어 속, 락토바실러스속 또는 락토코쿠스 속이며, 가장 바람직하게는 에스체리치어 속이다.

상기 아스퍼질러스 속 미생물로는 바람직하게는 아스퍼질러스 아큐리투스( Aspergillus aculeatus ), 아스퍼질러스 카시루스 ( Aspergillus caesiellus ), 아 스퍼질러스 캔디두스 ( Aspergillus candidus ), 아스퍼질러스 카니우스 ( Aspergillus carneus ), 아스퍼질러스 크레바투스 ( Aspergillus clavatus ), 아스퍼질러스 디플렉투스 ( Aspergillus deflectus ), 아스퍼질러스 피셔리아누스( Aspergillus fischerianus), 아스퍼질러스 플라부스 ( Aspergillus flavus ), 아스퍼질러스 오리자에( Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 퍼미가투스 ( Aspergillus fumigatus ), 아스퍼질러스 그라우쿠스( Aspergillus glaucus), 아스퍼질러스 니듈란스 ( Aspergillus nidulans ), 아스퍼질러스 니거 ( Aspergillus niger ) 또는 아스퍼질러스 오크라시우스 ( Aspergillus ochraceus ) 를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 아스퍼질러스 피셔리아누스 ( Aspergillus fischerianus ), 아스퍼질러스 플라부스( Aspergillus flavus) 또는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 사용할 수 있다.

상기 클로스트리듐 속 미생물에는 바람직하게는 클로스트리듐 아세토부틸리큠(C. acetobutylicum ), 클로스트리듐 아세토레란스 (C. aerotolerans ), 클로스트리 듐 바라티 (C. baratii ), 클로스트리듐 베이저린키(C. beijerinckii ), 클로스트리듐 비퍼멘탄스 (C. bifermentans ), 클로스트리듐 퍼프린진스( Clostridium perfingens ), 클로스트리듐 보튤리늄 (C. botulinum ), 클로스트리듐 부틸리큠(C. butyricum), 클로스트리듐 카다베리스 (C. cadaveris ), 클로스트리듐 차우보이 (C. chauvoei ), 클로스트리듐 클로스트리디오폼(C. clostridioforme ), 클로스트리듐 콜리카니스 (C. colicanis ), 클로스트리듐 디피사일(C. difficile ), 클로스트리듐 에스터더티움 (C. estertheticum ), 클로스트리듐 팔락스(C. fallax ) 또는 클로스트리듐 페세리 (C. feseri ) 를 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 클로스트리듐 베이저린키(C. beijerinckii ), 클로스트리듐 비퍼멘탄스 (C. bifermentans ), 클로스트리듐 퍼프린진스( Clostridium perfingens ) 또는 클로스트리듐 보튤리늄(C. botulinum)를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 클로스트리듐 퍼프린진스( Clostridium perfingens )를 사용할 수 있다.

상기 에스체리치어 속 미생물에는 에스케리치어 알베르티 (E. albertii ), 에스케리치어 블라태 (E. blattae ), 에스케리치어 콜라이 (E. coli ), 에스케리치어 페 르구소니 (E. fergusonii ), 에스케리치어 헤르마니(E. hermannii ) 또는 에스케리치어 벌너리스(E. vulneris)를 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 에스케리치어 블라태 (E. blattae ), 에스케리치어 콜라이 (E. coli ) 또는 에스케리치어 페르구소니(E. fergusonii)를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 에스케리치어 콜라이(E. coli)를 사용할 수 있다. 상기 에스케리치어 콜라이(E. coli)는 일반적인 에스케리치어 콜라이(E. coli)를 이용할 수도 있으나, 글루타민산 디카르복실라아제가 대량 생산되도록 유전자 조작이 이루어진 에스케리치어 콜라이(E. coli)를 이용하는 것이 바람직하다.

상기 락토바실러스 속 미생물에는 락토바실러스 앙세토토러란스(L. acetotolerans), 락토바실러스 에시디파리내 (L. acidifarinae ), 락토바실러스 에시디피시스 (L. acidipiscis ), 락토바실러스 에시디필루스(L. acidophilus ), 락토바실러스 아질리스 (L. agilis ), 락토바실러스 알지두스(L. algidus), 락토바실러스 알리멘타리우스 (L. alimentarius ), 락토바실러스 아밀로리티쿠스(L. amylolyticus), 락토바실러스 아밀로필루스 (L. amylophilus ), 락토바실러스 콤포스티(L. composti), 락토바실러스 크루스토룸 (L. crustorum ), 락토바실러스 덱스트리니쿠스(L. dextrinicus), 락토바실러스 디오리보란스 (L. diolivorans ), 락토바실러스 에퀴제네로시(L. equigenerosi), 락토바실러스 퍼멘툼 (L. fermentum ), 락토바실러스 갈리나룸 (L. gallinarum ), 락토바실러스 가넨시스 (L. ghanensis ), 락토바실러스 힐가르디 (L. hilgardii ), 락토바실러스 이너스(L. iners), 락토바실러스 존스니(L. johnsonii ), 락토바실러스 라이츠마니 (L. leichmannii ), 락토바실러스 나젤리 (L. nagelii ), 락토바실러스 헬베티쿠스 (L. helveticus ), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 부츠너리 (L. buchneri ), 락토바실러스 락티스 ( Lactobacillus lactis ), 락토바실러스 카제이 (L. casei ), 락토바실러스 김치(L. kimchii ), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 레우터리 (L. reuteri ), 락토바실러스 센프란사이시스(L. sanfranciscensis) 또는 락토바실러스 사케 (L. sakei ) 를 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 락토바실러스 브레비스 (L. brevis ), 락토바실러스 부츠너리 (L. buchneri ), 락토바실러스 락티스( Lactobacillus lactis ) 또는 락토바실러스 카제이(L. casei)를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis)를 사용할 수 있다.

상기 락토코쿠스 속 미생물에는 락토코쿠스 가비에 (L. garvieae ), 락토코쿠스 락티스 (L. lactis ), 락토코쿠스 피시움 (L. piscium ), 락토코쿠스 플란타룸 (L. plantarum ) 또는 락토코쿠스 라피놀크티스(L. raffinolctis)를 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 락토코쿠스 락티스 (L. lactis ) 또는 락토코쿠스 피시움(L. piscium)를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 락토코쿠스 락티스(L. lactis)를 사용할 수 있다.

상기 리스테리아 속 미생물에는 리스테리아 그레이 (L. grayi ), 리스테리아 이노쿠아(L. innocua ), 리스테리아 이바노비 (L. ivanovii ), 리스테리아 모노사이토진스 (L. monocytogenes ), 리스테리아 시링게리(L. seeligeri ), 리스테리아 무타이 (L. muttayi ) 또는 리스테리아 웰시메리 (L. welshimeri ) 를 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 리스테리아 이바노비 (L. ivanovii ) 또는 리스테리아 모노사이토진스(L. monocytogenes)를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 리스테리아 모노사이토진스(L. monocytogenes)를 사용할 수 있다.

본 명세서 용어 “전세포”는 글루타민산 디카르복실라아제를 보유하고 있는 미생물 세포막의 선택적 투과성을 파괴하기 위하여, 상기 미생물을 유기용매와 교반한 세포를 의미한다. 상기 글루타민산 디카르복실라아제를 보유하고 있는 미생물 전세포 촉매는 본 발명자들의 대한민국 등록특허 제1058491호에 상세하게 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

상기 단계에서 전세포 촉매의 농도는 전세포가 보유하고 있는 글루타민산 디카르복실라아제의 양에 따라 조절한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 대장균의 경우, 인위적인 유전자 조작이 가해지지 않은 균주의 경우 농도는 바람직하게는 1-30 g/L의 균주이고, 보다 바람직하게는 5-20 g/L의 균주이며, 가장 바람직하게는 10-15 g/L의 균주를 사용한다. 또한 글루타민산 디카르복실라아제가 대량 생산되도록 유전자 조작이 이루어진 대장균 균주의 경우 농도는 바람직하게는 1-30 g/L의 균주이고, 보다 바람직하게는 1-10 g/L의 균주이며, 가장 바람직하게는 1-5 g/L의 균주를 사용한다.

본 명세서의 용어 “생촉매”는 반응을 촉진하는 기능을 가진 생체 또는 생체 유래의 물질을 의미한다.

본 발명의 글루타민산염은 글루타민산의 카복시 음이온 또는 염을 의미하며, 보다 바람직하게는 글루타민산의 나트륨염이고 구조식 HOOC(CH₂)₂CH(NH₂)COOH, 분자량은 169.11이다.

본 발명에 이용되는 글루타민산은 20가지 단백질 아미노산 가운데 하나이고, 바람직하게는 L-글루타민산이다. 글루타민산은 글루타민산나트륨에 비하여 가격이 저렴하여 글루타민산을 이용하여 감마아미노부틸산을 제조할 경우 제품의 단가를 낮출 수 있다.

상기 단계에서 전세포 촉매와 반응하는 글루타민산 또는 글루타민산염은 바이오매스로부터 생물학적으로 제조가 되며, 분말 형태 또는 수용액 상태로 전세포 촉매가 포함되어 있는 반응조에 투입될 수 있다. 첨가되는 글루타민산 또는 글루타민산 염의 양은 미생물 현탁액 무게 대비 바람직하게는 25-70 중량%이고, 보다 바람직하게는 30-65 중량%이며, 가장 바람직하게는 35-60 중량%이다. 첨가되는 글루타민산 또는 글루타민산염은 분말 혹은 현탁액 형태로 주입될 수 있으며, 반드시 모든 글루타민산이 용해될 필요는 없다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법에 의하여 생성되는 감마아미노부틸산(GABA)의 양은 30-50 중량%이다. 보다 바람직하게는 35-45 중량%이고, 가장 바람직하게는 37-40 중량%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법에 의하여 기질이 감마아미노부틸산(GABA)으로 전환되는 비율은 최초 기질의 양을 기준으로 95.0-99.5%이고, 더욱 바람직하게는 97.0-99.5%이며, 가장 바람직하게는 98.0-99.0%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법에 의하여 감마아미노부틸산(GABA)의 제조 후 잔류 기질의 비율은 최초 기질의 양을 기준으로 0.1-5.0%이고, 더욱 바람직하게는 0.1-3.5%이며, 더욱 더 바람직하게는 0.1-2.0%이고, 가장 바람직하게는 0.2-1.0%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 30-50 중량%의 감마아미노부틸산(GABA)의 양을 달성하기 위하여 상기 탈카르복실화 반응을 진행시키는 시간은 10-30 시간이고, 보다 바람직하게는 15-30 시간이며, 가장 바람직하게는 20-30 시간이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 95-99.5%의 기질이 감마아미노부틸산(GABA)으로 전환되는 비율을 달성하기 위하여 상기 탈카르복실화 반응을 진행시키는 시간은 10-30 시간이고, 보다 바람직하게는 15-30 시간이며, 가장 바람직하게는 20-30 시간이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 0.1-2.0%의 잔류 기질의 비율을 달성하기 위하여 상기 탈카르복실화 반응을 진행시키는 시간은 10-30 시간이고, 보다 바람직하게는 15-30 시간이며, 가장 바람직하게는 20-30 시간이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 반응 중에 NaCl 및 글루타민산 디카르복실라아제을 첨가하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 첨가하는 글루타민산 디카르복실라아제는 0.5-3.0 g/L이고, 보다 바람직하게는 1.0-2.5 g/L이며, 가장 바람직하게는 1.3-2.0 g/L이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 PLP-의존성 감마아미노부틸산(GABA)의 제조를 PLP-비의존성 감마아미노부틸산(GABA)의 제조로 전환시키는 방법을 제공한다:

(a) (i) 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유하고 있는 미생물 전세포 및 글루타민산 디카르복실라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 생촉매(biocatalyst), (ii) 기질로서의 글루타민산 또는 글루타민산염 및 (iii) NaCl을 포함하는 반응물의 준비 단계; 및

(b) 상기 반응물을 이용하여 탈카르복실화 반응을 진행하여 GABA를 제조하는 단계.

본 명세서의 용어 “PLP-비의존성 GABA의 제조”는 GABA의 제조 과정에 있어, PLP의 존재 유무와 무관하게 기질에서 GABA로의 전환반응이 가능한 것을 의미한다. 바람직하게는, 용어 “PLP-비의존성 GABA의 제조”는 GABA의 제조에 있어 PLP를 실질적으로 이용하지 않는 것(예컨대, 10 μM 이하, 1 μM 이하, 0.1 μM 이하, 0.01 μM 이하 또는 0.001 μM 이하의 PLP)이고, 보다 바람직하게는 PLP를 전혀 이용하지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 반응물의 준비 단계

본 발명에 따르면, 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유하고 있는 미생물 전세포 및 글루타민산 디카르복실라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 생촉매(biocatalyst), 기질로서의 글루타민산 또는 글루타민산염 및 NaCl을 준비한다.

본 발명의 방법은 상술한 GAD를 보유하고 있는 미생물 전세포, GAD, 글루타민산, 글루타민산염 및 NaCl을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

단계 (b): GABA 를 제조하는 단계

본 발명에 따르면, 상기 (a) 단계에서 준비한 반응물을 이용하여 탈카르복실화 반응을 진행하여 GABA를 제조한다.

본 발명의 GABA를 제조하는 탈카르복실화 반응은 하기와 같다.

(반응식 1)

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 NaCl은 PLP을 대체하여 첨가한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 NaCl은 0.01-5.0 중량%으로 이용하고, 보다 바람직하게는 0.01-2.0 중량%로 이용하며, 보다 더 바람직하게는 0.05-1.60 중량%로 이용하고, 보다 더욱 더 바람직하게는 0.08-1.00 중량%로 이용하며, 가장 바람직하게는 0.15-0.70 중량%로 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 첨가하는 NaCl은 0.1-2.0 중량%이고, 보다 바람직하게는 0.1-0.85 중량%이며, 보다 더 바람직하게는 0.1-0.5 중량%이고, 가장 바람직하게는 0.15-0.45 중량%이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 본 발명의 방법에 의해 제조된 GABA를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 NaCl을 포함하는 GABA 제조에서 PLP 대체용 조성물을 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 고농도 GABA 제조방법은 GABA 제조 시 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유하고 있는 미생물 전세포 및 글루타민산 디카르복실라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 생촉매(biocatalyst)를 촉매로 하고, 글루탐산 또는 글루탐산염을 기질로 사용하며, NaCl(염화나트륨)을 PLP 대체제로 이용한다.

(b) 본 발명은 NaCl을 PLP 대체제로 사용하면서 30 중량% 이상의 고농도 GABA를 단시간에 생산할 수 있는 방법을 제공함으로써, GABA의 제조 비용을 획기적으로 줄일 수 있는 장점이 있다.

(c) 또한 글루타민산에서 GABA로의 전환 비율을 높임과 동시에 글루타민산의 잔존 비율을 낮추어 GABA 제조 원가를 획기적으로 개선할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 PLP를 사용하여 글루타민산으로부터 GABA를 제조하는 경우의 pH 변화 및 전환 속도를 나타낸다.
도 2는 PLP 농도에 따른 글루타민산으로부터 전환되는 GABA의 양을 나타낸다.
도 3은 NaCl 농도에 따른 pH가 5.5에 이르는 시기까지 소요되는 시간을 나타낸다. pH는 GABA로의 전환에 의해 상승하므로 일정량의 GABA로 전환되는데 걸리는 시간을 나타낸다.
도 4는 NaCl의 PLP 대체 효과를 나타낸다. 도 4에서 막대 그래프는 전환된 GABA의 중량%를 나타내고, 실선그래프는 잔류 글루타민산(중량%)을 나타낸다.
도 5는 반응 중 글루타민산, NaCl 및 글루타민산 디카르복실라아제(효소액)을 첨가하여 고농도의 GABA로 전환(반응 25시간 후 GABA의 양이 38.9 중량%)됨을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 피리독살-5-인산( PLP ) 농도에 따른 감마아미노부틸산( GABA ) 전환 효과

글루타민산 디카르복실라아제를 보유하고 있는 균체, E. coli BL21(DE3), E. coli JM101, Lactobacillus paracasei 및 Lactobacillus coryniformis(KCTC)를 배양하여 회수한 건조 균체 3 g/L를 멸균수에 현탁한 뒤 반응조에 투입하고, 여기에 40 중량% L-글루타민산(L-Glu, 대상주식회사) 및 피리독살-5-인산(Pyridoxal 5-phosphate:PLP, Sigma Aldrich)를 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응조건은 30℃, 200 rpm 이었다. 여기서 사용된 PLP는 각각 0 μM, 4 μM, 10 μM 및 40 μM이었다. 이후 PLP 농도에 따른 반응초기의 pH 변화 및 감마아미노부틸산의 양(중량%)을 측정하여 PLP 농도에 따른 반응초기의 pH 변화, 반응속도 및 전환되는 감마아미노부틸산 농도 차이를 분석하였다. 실험 결과, 도 1과 같이 글루타민산에서 감마아미노부틸산으로 전환될 때 pH는 점차 상승하며, PLP 농도가 증가함에 따라 pH의 상승속도가 증가하는바 글루타민산에서 감마아미노부틸산으로의 전환 속도 역시 증가함을 알 수 있었다. 이는 글루타민산 디카르복실라아제에 의해 글루타민산이 감마아미노부틸산으로 전환되는 과정에서 수용액의 양성자가 소비되면서 pH가 상승하게 되기 때문이다.

또한, 도 2와 같이 PLP 농도가 0 μM, 4 μM, 10 μM 및 40 μM로 증가함에 따라 전환되는 감마아미노부틸산의 양도 17.96 중량%, 21.19 중량%, 22.23 중량% 및 24.26 중량%로 비례하여 증가하였다.

실시예 2: 첨가하는 NaCl 양에 따른 감마아미노부틸산 전환 효과

글루타민산 디카르복실라아제를 보유하고 있는 균체, E. coli BL21(DE3), E. coli JM101, Lactobacillus paracasei 및 Lactobacillus coryniformis(KCTC)를 배양하여 회수한 건조 균체 3 g/L를 멸균수에 현탁한 뒤 반응조에 투입하고, 여기에 40 중량% 글루타민산 및 NaCl(염화나트륨)을 첨가하여 30℃, 200 rpm에서 반응을 시작하였다. 상기 NaCl의 양을 0.05 중량%, 0.10 중량%, 0.20 중량%, 0.40 중량%, 0.80 중량% 및 1.60 중량%로 하고, pH 5.5 도달 시점을 반응 종료점으로 하여 첨가하는 NaCl 양에 따라 pH 5.5 까지 상승하는데 소요되는 시간을 측정하였다. 그 결과는 도 3에서 나타내는 것과 같이 첨가하는 NaCl의 양은 글루타민산에서 감마아미노부틸산으로 전환되는 시간에 영향을 미치며, NaCl의 양이 0.1-0.8 중량%인 범위에서 14.5 시간-19.0 시간 후 반응 종료점에 도달하여 빠른 전환속도를 보였다.

실시예 3: PLP 의 NaCl 대체에 따른 감마아미노부틸산 전환 효과 비교

글루타민산 디카르복실라아제를 보유하고 있는 균체, E. coli BL21(DE3), E. coli JM101, Lactobacillus paracasei 및 Lactobacillus coryniformis(KCTC)를 배양하여 회수한 건조 균체 3 g/L를 멸균수에 현탁한 뒤 반응조에 투입하고, 여기에 40 μM PLP 또는 0.4 중량% NaCl을 글루타민산과 함께 첨가하여 30℃, 200 rpm의 반응조건에서 반응을 시작하였다. 본 실험에서 다른 조건은 동일하나 PLP 또는 NaCl 어느 것도 첨가하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 반응시작 24시간 후의 감마아미노부틸산의 농도(중량%) 및 잔류 글루타민산의 농도(중량%)를 측정한 결과 도 4에서 보여지는 바와 같이 0.4 중량% NaCl을 첨가한 경우 가장 고농도의 감마아미노부틸산이 생성되는 반면, 잔류 글루타민산은 1 중량% 이하로 감소함을 확인하였다.

실시예 4: NaCl 및 효소액의 추가 첨가에 따른 고농도 감마아미노부틸산 전환 효과

글루타민산 디카르복실라아제를 보유하고 있는 균체, E. coli BL21(DE3), E. coli JM101, Lactobacillus paracasei 및 Lactobacillus coryniformis(KCTC)를 배양하여 회수한 건조 균체기준 3.0 g/L를 멸균수에 현탁한 뒤 0.2 중량% NaCl과 함께 반응조에 투입하여 초기 400L의 반응물을 만든후 이 반응물에 250 kg 글루타민산을 투입하여 30℃, 200 rpm 으로 반응시켰다. 상기 반응물에 의해 생성되는 감마아미노부틸산의 양을 측정하고, 반응 진행 중 100 kg 글루타민산, 0.2 중량% NaCl 및 건조균체 기준 1.6 g/L의 균체를 추가적으로 첨가하여 첨가 이후 생성되는 감마아미노부틸산의 양을 계속적으로 측정하였다. 도 5와 같이 반응 시간에 따라 생성되는 감마아미노부틸산의 양은 증가하는 경향을 보이고, 글루타민산, NaCl 및 효소액을 추가적 첨가에 의해 최종부피는 620L이었다. 반응 25시간 후 생성된 GABA의 농도는 38.9 중량%이며, 몰 전환율은 98.5%로 고농도와 고효율의 GABA를 얻을 수 있었다.

Claims

글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유하고 있는 미생물 전세포 및 글루타민산 디카르복실라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 생촉매(biocatalyst)에 글루타민산 또는 글루타민산염 기질을 접촉시켜 탈카르복실화 반응을 진행하는 단계를 포함하는 감마아미노부틸산(GABA)의 제조방법에 있어서, 상기 단계에서 NaCl이 첨가되는 것을 특징으로 하는 감마아미노부틸산(GABA)의 제조방법.
다음 단계를 포함하는 PLP가 기질에서 GABA로의 전환반응에 필수적인 GABA 제조과정을 PLP의 존재 유무와 무관하게 기질에서 GABA로의 전환반응이 가능한 GABA의 제조 과정으로 전환시키는 방법:
(a) (i) 글루타민산 디카르복실라아제(GAD)를 보유하고 있는 미생물 전세포 및 글루타민산 디카르복실라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 생촉매(biocatalyst), (ii) 기질로서의 글루타민산 또는 글루타민산염 및 (iii) NaCl을 포함하는 반응물의 준비 단계; 및
(b) 상기 반응물을 이용하여 탈카르복실화 반응을 진행하여 GABA를 제조하는 단계.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 NaCl은 피리독살-5-인산(PLP)을 대체하여 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 NaCl은 0.01-5.0 중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법에 의하여 생성되는 감마아미노부틸산(GABA)의 양은 30-50 중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법에 의하여 기질이 감마아미노부틸산(GABA)으로 전환되는 비율이 최초 기질의 양을 기준으로 95-99.5%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법에 의하여 감마아미노부틸산(GABA)의 제조 후 잔류 기질의 비율이 최초 기질의 양을 기준으로 0.1-3%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 30-50 중량%의 감마아미노부틸산(GABA)의 양은 상기 탈카르복실화 반응을 10-30 시간 동안 진행시켜 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
NaCl을 포함하는 GABA 제조에서 PLP 대체용 조성물.