KR101402921B1 - 비만 또는 제 2형 당뇨의 치료를 위한 레스베라톨 유도체의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비만 또는 제 2형 당뇨 치료를 위해 레스베라톨 유도체의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 또는 프테로스틸벤(pterostilbene)은 TREM-2 억제제로 작용할 수 있으며, 이에 의해 비만 또는 제 2형 당뇨의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다. 또한 TREM-2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2)를 억제함으로써 인슐린 대사와 관련된 유전자 및 지방세포 분화와 관련된 유전자의 발현조절을 제어할 수 있어 효과적으로 비만 또는 제 2형 당뇨를 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.

Description

비만 또는 제 2형 당뇨의 치료를 위한 레스베라톨 유도체의 이용{Use of resveratol derivatives for treating obesity or type 2 diabetes}

본 발명은 비만 또는 제 2형 당뇨의 치료를 위한 레스베라톨 유도체의 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게는 레스베라톨 유도체인 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 또는 프테로스틸벤(pterostilbene)을 이용한 인간 이외의 동물에서의 TREM-2 억제 방법, 인간 이외의 동물에서의 TREM-2 유전자의 과발현에 의한 비만 또는 제 2형 당뇨의 치료 방법, 및 TREM-2 형질전환 마우스에서의 비만 또는 당뇨 관련 유전자들의 발현 조절 방법에 관한 것이다.

21세기에 들어서면서 식생활은 경제 성장과 더불어 과거 어느 때보다 풍요로워지고, 고령화 시대에 접어들면서 건강장수에 큰 비중을 두고 있다. 경제성장과 더불어 나타난 고지방식이 등의 식습관의 변화로 생체의 균형이 무너지고, 남녀노소에 관계없이 비만당뇨 합병증 환자가 크게 늘어나고 있다(Food Engineering Progress.9(2):88-96, 2005).

비만은 고혈압, 당뇨병, 심장순환계질환 및 각종 암 등을 유발시키는 원인이 되며, 비만관련 질병치료에 소요되는 의료비는 날로 증가하고 있어 체지방 감소효과를 가지는 물질의 규명 및 이의 효과를 입증하는 노력은 전 세계적으로 큰 관심사가 되고 있다.

우리나라의 경우 인슐린 비의존형의 2형 당뇨환자가 전체 당뇨환자의 90 내지 95%를 차지하고 있으며 대부분 약물요법으로 혈당을 조절하고 있으나 시간이 경과함에 따라 점점 많은 양의 약물 복용이 요구되므로 부작용이 많기 때문에 이를 예방하기 위해 당뇨 개선 기능을 가진 활성 물질의 발굴과 제품 개발의 중요성이 강조되고 있다(성인형 당뇨병 환자의 예방과 치료를 위한 운동요법. 경남대학교 교육문제 연구소 12(2): 325-333, 2002).

또한, 생활환경의 변화에 의해 현대인들의 내장지방형 비만이 증가하면서 당뇨병, 고혈압, 지질대사이상, 인슐린저항성 등을 수반하는 대사증후군(metabolic syndrome)의 발병이 급증하고 있으며, 이들 질환은 상호간의 발생위험을 증가시키며, 노화, 스트레스 및 면역기능저하 등의 다원적인 생체대사변화와 관련이 있는 공통 질환이다. 기존의 대표적인 비만치료제로서, 오리스타트(Orlistat)가 주원료인 제니칼은 지방변, 장내가스발생, 복부팽만감 등의 부작용이 있고, 리덕틸은 두통, 구갈, 식욕부진, 불면, 변비 등의 부작용이 알려져 있다. 또한 오리스타트는 비타민 E와 비타민 D의 흡수를 억제하고, 펜터민(phentermine)과 시부트라민(sibutramine)은 심박수 증가/심계항진을 초래하며, 현기증을 초래하는 부작용이 있다. 따라서, 합성의약품의 부작용과 만성질환의 극복에 서양의학이 한계를 보임에 따라 천연물신약에 대한 가치가 새롭게 부각되고 있다.

비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, 이하 NAFLD)은 음주와 관계없이 간내에 중성지방이 축적되는 질환을 의미하고, 여기에는 단순 지방간 (steatosis)와 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)을 포함한다. NASH는 1980년 Ludwig 등에 의하여 처음으로 명명되었고 지방간과 함께 염증 혹은 섬유화를 동반하는 것이 특징이다. 한편, 단순 지방간은 임상적으로 예후가 양호한 양성 질환으로 생각되고 있으나 NASH는 진행성 간질환으로 간경변이나 간암을 유발하는 전구 질환으로 인지되고 있다. 비알코올성 지방간의 위험인자로 크게 비만, 당뇨병, 고지혈증이 대표적이고 이외에 단백질-칼로리 결핍, 몸무게를 갑자기 감량하는 경우나 정맥주사로 전체영양을 취하는 경우에도 올 수 있다고 알려져 있다. 이러한 지방간은 비알코올성 지방간염이나 간경변으로 진행될 수 있어 앞으로 점차 심각한 간질환으로 생각되고 있다.

비알콜성 지방간의 발병원인은 두 가지 기전으로 설명될 수 있다. 첫 번째 단계는 건강한 간이 지방간이 되는 것으로 말초에서 인슐린저항성으로 인해 지방조직에서 간으로의 지방산의 유입이 증가하면서 일어나는 것이고, 두 번째 단계는 지방이 축적된 간세포에 지방의 과산화, 염증 세포의 침윤, 산소 자유래디칼(oxygen free radical) 및 FAS 리간드의 활성화가 일어나는 과정이다. 즉, 지방산의 증가는 CYP2E1(cytochromeperoxidase 2E1)의 발현을 증가시키고, 활성산소종을 생성하여 간세포막의 지질과산화를 유도하며, LPS와 산화적 스트레스의 증가는 TNF-α를 증가시켜 간세포의 아팝토시스(apoptosis)를 유도하고 간손상을 진행시킨다.

비알콜성 지방간환자의 69 내지 100%는 비만환자이고, 비만환자의 20 내지 40%는 비알콜성 지방간을 동반하며, 특히, 남성 비만환자의 간질환 유병율이 여성비만자에 비해 더 높게 나타난다. 서구사회에서는 비만환자뿐만 아니라 정상체중 성인의 3% 내지 30%가 비알콜성 지방간병변을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 우리와 식생활이 유사한 일본의 비알콜성 지방간 유병율은 약 20%로 추정되며, 이중 1%가 NASH로 추정된다. 비알콜성 지방간은 성인 뿐 아니라 비만아동에서도 문제가 되는데, 10 내지 19세 한국 청소년의 3%가 비알콜성 지방간의 주요지표인 ALT수치가 높게 나타나고 있으며, 일본 아동(4~12세)의 경우 비알콜성 지방간의 유병율이 2.6%에 달한다. 비만아동(유럽, 미국 및 아시아 거주)의 10 내지 77%가 비알콜성 지방간 병변을 보였는데, 이는 비알콜성 간질환의 가장 중요한 위험인 자가 비만이기 때문이다.

한편, TREM-2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2; Genbank Accession No. AK039477)는 DAP12라는 어댑터 단백질을 통해 신호전달을 수행하는 수용체로서 골수 세포(myeloid cell) 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다. 미생물로부터 생산이 유도된 TREM-2는 시험관 내(in vitro) 실험에서 사이토카인의 발현을 억제하여 염증반응을 억제하는 것으로 나타나, TREM-2가 면역조절에 관여하는 것이 보고된 바 있다. 또한, TREM-2는 일본공개특허 제2004-073182호에 TREM-2에 대한 인슐린 저항성 저해제 및 당뇨병의 예방치료제에 대하여 보고 된 바 있으나 비만에 대하여 생체 내(in vivo) 실험을 통해 TREM-2가 비만에서 어떠한 역할을 하는지는 정확히 밝혀진 바 없다.

한편, 레스베라톨(resveratol)은 포도, 자두, 땅콩 등 다양한 종류의 식물에서 발견되는 파이토알렉신(외부의 독성에 대하여 식물조직이 산출하는 항독성 물질)으로, 항산화 작용, 항염증 작용, 심장보호 활성, 항암활성 등을 갖는 것으로 보고된 바 있으나(kundu 및 Surh, 2008; Pirola 및 Frojdo, 2008; Athar 등 2007), 이들의 유도체 역시 비만 또는 제 2형 당뇨의 치료효능에 대해서는 지금까지 보고된 바 없다.

일본공개특허공보 제2004-073182호 (2004.03.11 공개)

이에 본 발명자들은 TREM-2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2) 유전자로 형질전환된 형질전환 동물 모델을 제조하고, 이를 이용하여 비만의 예방 또는 치료에 대한 원인 규명에 대한 연구를 지속하던 중 TREM-2를 억제함으로써 효과적으로 비만 또는 제 2형 당뇨를 억제하는 레스베라톨의 유도체를 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TREM-2를 억제함으로써 효과적으로 비만 또는 제 2형 당뇨를 억제하는 TREM-2 억제제 및 레스베라톨(resveratol)의 유도체를 제공하고자 한다.

구체적으로 본 발명의 일 목적은 레스베라톨(resveratol)의 유도체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에서의 TREM-2 억제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 레스베라톨(resveratol)의 유도체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 동물의 TREM-2 유전자의 과발현에 의한 비만 또는 제 2형 당뇨의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 레스베라톨의 유도체를 투여하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨 관련 유전자들의 발현 조절 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에서의 TREM-2 억제방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 동물의 TREM-2 유전자의 과발현에 의한 비만 또는 제 2형 당뇨의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, TREM-2 형질전환 마우스에서의 렙틴(leptin) 및 종양괴사인자(TNFa) 유전자의 발현 억제, 및 아디포넥틴(adiponectin) 유전자의 발현 증가 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, TREM-2 형질전환 마우스에서의 인슐린 수용체(InsR), 인슐린 기질 복합체(IRS 1, 및 IRS) 유전자의 발현 증가 방법을 제공한다.

아울러 본 발명은 TREM-2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2)를 억제함으로써 인슐린 대사와 관련된 유전자 및 지방세포 분화와 관련된 유전자의 발현조절을 제어할 수 있는 TREM-2 억제제 및 레스베라톨(resveratol)의 유도체를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 TREM-2 억제제를 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공하며, 상기 레스베라톨의 유도체를 유효성분으로 하는 비만 또는 제 2형 당뇨의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 "비만(obesity)"이란 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미하며, 지방간은 간의 지방대사 장애로 지방이 간세포에 과도한 양으로 축적된 상태를 의미한다. 이는 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화 및 췌장염 등과 같은 다양한 질병의 원인이 된다.

본 발명의 일 양상은 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에서의 TREM-2 억제방법에 관한 것이다.

또한 본 발명의 다른 양상은 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 동물의 TREM-2 유전자의 과발현에 의한 비만 또는 제 2형 당뇨의 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 일실시예에서 본 발명의 유효성분인 피세아타놀, 피세이드 및 프테로스틸벤을 각각 TREM-2 유전자가 형질전환된 마우스의 비만 또는 내장지방의 감소 효과 등을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9 참조).

본 발명의 또 다른 양상은 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, TREM-2 형질전환 마우스에서의 렙틴(leptin) 및 종양괴사인자(TNFa) 유전자의 발현 억제, 및 아디포넥틴(adiponectin) 유전자의 발현 증가 방법에 관한 것이며, 또한 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, TREM-2 형질전환 마우스에서의 인슐린 수용체(InsR), 인슐린 기질 복합체(IRS 1, 및 IRS) 유전자의 발현 증가 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, Leptin과 TNFa는 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의해 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 Adiponectin의 경우 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의해 현저히 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 11 참조). 또한 당뇨 관련 유전자들인 슐린 수용체(InsR)와 인슐린 기질 복합체(IRS 1, IRS 2)의 유전자의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 12 참조).

본 발명은 TREM-2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2) 억제제를 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 비만 예방 또는 치료용 조성물은 지방세포 분화를 감소시키는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직한 구현의 예에 따르면, 본 발명의 조성물은 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 인슐린 수용체(Insulin reptor),및 종양괴사인자(TNFα)로부터 선택되는 어느 1종 또는 2종 이상이 유전자의 발현의 조절함으로써 지방 조직의 지방량을 감소시키는 효과를 나타내었다.

본 발명의 조성물은 비만 뿐 아니라 간 지방, 보다 바람직하게는 간의 중성지방, 콜레스테롤 또는 유리지방산을 유의하게 감소시켜 지방간 예방 또는 치료활성을 나타낸다.

본 발명의 비만 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 TREM-2 억제제는 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 화합물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 TREM-2의 억제제는 기존에 인슐린 저항성에 대해 보고된 바 있지만 비만에 대한 연구가 전무하였던 TREM-2의 억제제로서 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 제공하고, 상기 화합물이 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 인슐린 수용체(Insulin reptor), 및 종양괴사인자(TNFα)의 발현을 조절함으로써 궁극적으로 항비만 등의 효능을 발휘한다.

본 발명의 "제2형 당뇨병(Type 2 diabetes)"이란 포도당의 생성 및 이용에서의 대사 장애로 인하여 몸의 적절한 혈당 수준 유지가 실패되어 고혈당(hyperglycemia)이 유발되는 질환 또는 상태로서, 포도당 이용을 조절하는 인슐린 결핍이 그 원인인 제1형 당뇨병과 구별되는 인슐린 수준은 정상이나 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 않기 때문에 발병되는 제2형 당뇨병을 의미한다. 본 발명의 조성물은 인슐린 저항성을 개선하여 당뇨, 고지혈, 고혈압, 동맥경화, 심혈관계질환 등의 대사성 질환을 예방 또는 개선할 수 있다.

본 발명의 조성물은 인간뿐만 아니라 비만 또는 당뇨병이 발생될 수 있는 개, 소, 돼지, 말, 양, 염소, 낙타, 영양 등의 가축에게 사용될 수 있다.

본 발명은 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 하는 비만 또는 제 2형 당뇨의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 기존에 비만 및 제 2형 당뇨에 대해 보고된 바 없는 레스베라톨의 유도체 즉, 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)이 레스베라톨과 유사하게 식이효율(food efficiency ratio)은 무처리군에 비해 유의하게 감소하여 체중저하 효과를 나타내었다.

본 발명의 상기 비만 또는 제 2형 당뇨의 예방 또는 치료용 조성물은 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 인슐린 수용체(Insulin reptor),및 종양괴사인자(TNFα)로부터 선택되는 어느 1종 또는 2종 이상이 유전자의 발현의 조절에 기인하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 화합물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식품학적 조성물이다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 화합물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 TREM-2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2)를 억제함으로써 인슐린 대사와 관련된 유전자 및 지방세포 분화와 관련된 유전자의 발현조절을 제어할 수 있어 효과적으로 비만 또는 제 2형 당뇨를 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다. 특히 본 발명의 유효성분인 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 또는 프테로스틸벤(pterostilbene)은 인간 이외의 동물에서 TREM-2를 억제함으로써, 비만 또는 당뇨 관련 유전자의 발현을 조절할 수 있고, 이에 따라 비만 또는 당뇨의 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 pcDNA3.1/TREM-2 플라스미드의 구조를 나타낸 도면이고,
도 2는 본 발명에 따른 TREM-2 유전자로 형질전환된 형질전환 마우스의 지방조직에서 TREM-2 단백질의 발현 유무 확인한 결과를 보여주는 사진이며,
도 3은 A는 고지방 사료를 식이하였을 때 마우스의 몸무게 증가량을 대조군과 비교한 결과이며, B는 고지방 사료의 식이량을 대조군과 비교한 결과이고,
도 4는 TREM-2 유전자가 형질전환된 형질전환 마우스가 대조군에 비해 비만이 유도가 되어 지방조직의 분포가 증가되어 있음을 보여주는 사진이며,
도 5는 도 4에서 보여 진 마우스에서 분리한 지방 조직과 간 조직의 무게를 비교한 결과이고,
도 6은 TREM-2 유전자가 형질전환된 형질전환 마우스에서 고지방 사료를 식이하였을 때 간 조직의 양상을 보여주는 사진이며,
도 7은 TREM-2 유전자가 형질전환된 형질전환 마우스에서 고지방 사료를 식이하였을 때 분리한 지방조직에서의 비만 관련 유전자의 발현 변화를 보여주는 결과이고,
도 8은 TREM-2 유전자가 형질전환된 형질전환 마우스에서 일반사료(None Fat Diet, NFD)와 고지방 사료를 식이하면서 레스베라톨(resveratrol), 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)을 일정량 식이하였을 때 마우스의 비만 억제 현상을 보여주는 결과이며,
도 9는 도 8에서 보여 진 마우스를 대상으로 비만여부와 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)의 내장지방(화살표 표시)의 분포도 감소의 효과를 보여주는 결과이고,
도 10은 도 8에서 보여진 마우스로부터 분리한 내장지방 무게를 측정하여 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)의 내장지방 감소 효과를 보여주는 결과이며,
도 11은 도 8에서 보여진 마우스로부터 분리한 내장지방에서 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의한 비만 관련 유전자의 변화를 보여주는 결과이고,
도 12는 도 8에서 보여진 마우스로부터 분리한 내장지방에서 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의한 당뇨 관련 유전자의 변화를 보여주는 결과이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1] 재조합 TREM-2 유전자의 제조

C57BL/6 마우스로부터 자연살해세포의 전구세포(pre natural killer cells)를 직접 분리한 후 RNA를 추출하여 TREM-2 특이적 프라이머[센스 프라이머: 5'-GAATTCGCCCTTGGCTGGCTGCTGGCA-3'(서열번호 1) 및 안티센스 프라이머: 5'-GTACGTGAGAGAATTC-3'(서열번호 2)]를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 TREM-2 cDNA를 증폭하였다. PCR의 조건은 94 ℃에서 1 분간 변성, 55 ℃에서 1 분간 어닐링 및 72 ℃에서 1분간 연장하는 주기를 30회 반복하여 수행하였다.

PCR 증폭 산물을 pGEM-T 벡터[프로메가(Promega)]에 클로닝하고, ECoRⅠ으로 절단한 후 pcDNA3.1 벡터[인비트로젠(Invitrogen)]에 삽입하여 도 1의 pcDNA3.1/TREM-2 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터로부터 TREM-2 유전자를 순수 분리하기 위하여 박테리아에서 기원한 유전자 부위를 절단하여 제거하고, 진핵세포 발현 부위만을 수확하여 물에 녹여 사용하였다.

[실시예 2] TREM-2 형질전환 마우스의 제작

상기 실시예 1에서 얻은 순수 분리된 재조합 TREM-2 유전자를 C57BL/6 마우스의 수정란에 미세주입하였다. 상기 유전자가 주입된 수정란을 대리모 마우스의 난관에 이식하여 새끼를 생산하였다.

[ 실시예 3] 야생형 마우스와 TREM -2 형질전환 마우스의 지방 조직에서 TREM -2의 발현 확인

상기 실시예 2에서 생산된 새끼의 꼬리를 절단하여 Genomic DNA를 분리한 후, TREM-2 재조합 유전자에 특이적인 프라이머[센스 프라이머: 5'-CCAAGTCTCCACCCCATTGAC-3'(서열번호 3) 및 안티센스 프라이머: 5'-GTACGTGAGAGAATTC-3'(서열번호 4)]를 이용하여 RT-PCR를 수행하였다. PCR의 조건은 94 ℃에서 1 분간 변성, 55 ℃에서 1분간 어닐링 및 72 ℃에서 1 분간 연장하는 주기를 35회 반복하여 형질전환 마우스에 TREM-2 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 TREM-2 형질전환된 마우스의 지방 조직을 분리하여 단백질을 분리한 후, 마우스 TREM-2 단백질에 특이적인 항체(R&D)를 사용하여 TREM-2 단백질 발현양상을 확인하였다.

그 결과 도 2에서도 확인할 수 있듯이, 야생형 마우스에 비해 TREM-2 형질전환 마우스의 지방 조직에서 TREM-2의 단백질이 더 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] 야생형 마우스와 TREM-2 형질전환 마우스의 고지방 사료 식이에 따른 비만 유도 측정

생후 8주령 23 내지 24 g의 야생형 C57BL/6 마우스와 TREM-2 형질전환 마우스 웅성을 이용하여 8주 동안 고지방 사료(Bioserv, USA)를 자유식이하면서 물을 충분히 공급하고, 실온 24±2℃를 유지하여 실험에 사용하였다. 고지방 사료의 kg당 조성의 내용과 분량은 하기 표 1과 같다. 자유식이 후 체중은 4일 간격으로 0.1g 단위까지 측정하였고, 사료 식이량은 7일 간격으로 측정하였다.

그 결과를 도 3에서도 확인할 수 있듯이, TREM-2 형질전환 마우스에서 사료 식이량에 관계없이 비만이 유도됨을 확인할 수 있었고, 또한 마우스의 비만 유도 정도가 눈으로 확인할 수 있을 정도임을 도 4에서 확인하였고, 지방 조직과 간의 크기와 무게도 증가되어 있음을 도 5에서 확인할 수 있었다.

[ 실시예 5] 야생형 마우스와 TREM -2 형질전환 마우스의 일반 사료와 고지방 사료 식이에 따른 간 조직의 변화 확인

생후 8주령 23 내지 24 g의 야생형 C57BL/6 마우스와 TREM-2 형질전환 마우스 웅성을 이용하여 8주 동안 일반 사료와 고지방 사료(Bioserv, USA)를 자유식이하면서 물을 충분히 공급하고, 실온 24±2℃를 유지하여 실험에 사용하였다. 고지방 사료를 식이한 TREM-2 형질전환 마우스가 45 내지 48 g이 되었을 때 각각의 마우스의 간 조직을 분리하여 각각의 간 조직을 확인하였다.

그 결과, 도 6에서도 확인할 수 있듯이 TREM-2 형질전환 마우스의 간 조직에 지방이 많이 분포되어 있음을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 6] TREM -2 형질전환 마우스의 지방 조직에서 TREM -2의 발현과 비만 관련 유전자들의 발현 측정

고지방 사료를 8주간 자유 식이한 TREM-2 형질전환 마우스와 야생형 마우스로부터 지방조직을 분리하여 지방세포 분화에 중추적인 역할을 담당하고 있는 유전자가 조직 특이적으로 TREM-2 유전자에 의해 발현이 조절되는지를 확인하였다.

이를 위하여, 상기 TREM-2 형질전환 마우스의 지방 조직을 분리하여 비만 관련 유전자의 특이적인 프라이머; Leptin[센스 프라이머: 5'-CACCAGGCTCCCAAGAATCATGTA-3'(서열번호 5) 및 안티센스 프라이머: 5'-GGGATGGCTCTTATCTCTACTTGCT-3'(서열번호 6)], Adiponectin[센스 프라이머: 5'-CCTGGAGAGAAGGGAGAGAAA-3'(서열번호 7) 및 안티센스 프라이머: 5'-CGAATGGGTACATTGGGAAC-3'(서열번호 8)], Insulin receptor[센스 프라이머: 5'-AGGAGCTGGAGGAGTCCTCGTTCA-3'(서열번호 9) 및 안티센스 프라이머: 5'-CATTCCCCACGTCACCAAGGGCTC-3'(서열번호 10)], IRS-1[센스 프라이머: 5'-GCAGCCCCACCTGCCTCGAAAGGTAGACAC-3'(서열번호 11) 및 안티센스 프라이머: 5'-CAGCAATGCCTGTCCGCATGTCAGCATAGC-3'(서열번호 12)], IRS-2[센스 프라이머: 5'-GAAGACAGTGGGTACATGCGAATG-3'(서열번호 13) 및 안티센스 프라이머: 5'-CCTCATGGAGGAAGGCACTGCTG-3'(서열번호 14)], TNFa[센스 프라이머: 5'-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3'(서열번호 15) 및 안티센스 프라이머: 5'-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3'(서열번호 16)] 를 이용하여 Real-time-PCR을 수행하였다. PCR의 조건은 95 ℃에서 15 초간 변성, 60 ℃에서 20 초간 어닐링 및 72 ℃에서 30 초간 연장하는 주기를 45회 반복하여 수행하였다.

그 결과 도 7에서 확인할 수 있듯이, TREM-2 형질전환 마우스의 지방 조직에서는 야생형 마우스의 지방 조직에 비해 지방세포 분화에 중추적인 역할을 담당하고 있는 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 인슐린 수용체(Insulin reptor),및 종양괴사인자(TNFα) 유전자의 발현이 조직 특이적으로 조절되는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터 기존에 인슐린 저항성에 대해 보고된 바 있지만 비만에 대한 연구가 전무하였던 TREM-2의 억제제가 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 인슐린 수용체(Insulin reptor), 및 종양괴사인자(TNFα)의 발현을 조절함으로써 궁극적으로 비만 및 제 2형 당뇨를 예방 또는 치료활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 7] TREM -2 형질전환 마우스의 고지방 사료 식이에 따른 비만 유도 후 레스베라톨( resveratol ) 유도체의 비만 억제 효과 측정

생후 8주령 23 내지 24 g의 TREM-2 형질전환 마우스 웅성을 이용하여 8주 동안 고지방 사료(Bioserv, USA)를 자유식이하면서 물을 충분히 공급하고 실온 24±2℃를 유지하여 실험에 사용하였다. 레스베라톨(resveratol)과 레스베라톨의 유도체 즉, 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)을 0.01% DMSO에 녹여 20±2 mg/kg 격일마다 식이하였다. 자유식이 후 체중은 4일 간격으로 0.1 g 단위까지 측정하였다.

(1) 마우스의 무게비교

그 결과 도 8에서도 확인할 수 있듯이, 고지방 사료 식이 시 일반사료 마우스에 비해 몸무게가 73% 증가하였고 이에 비해, 레스베라톨(resveratrol), 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene) 식이한 마우스의 경우 각각, 60%, 45%, 32%, 35% 가 증가한 결과를 확인할 수 있었다.

또한, 아직 비만 및 제 2형 당뇨에 대해 보고된 바 없는 레스베라톨의 유도체 즉, 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)이 기존에 알려진 레스베라톨(resveratrol) 보다 탁월한 비만 억제 효과를 보였으며, 특히 피세이드(piceid)와 프테로스틸벤(pterostilbene)의 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터 본 발명의 레스베라톨의 유도체는 체중저하 더 나아가 기존의 레스베라톨 보다 탁월한 비만 억제효과가 있음을 확인할 수 있었고, 상기 체중감소는 식욕억제에 기인한 것이 아님을 확인할 수 있었다.

(2) 마우스의 외형 및 내장지방 관찰

상기 (1)의 식이 마우스를 대상으로 마우스의 외형 및 내장지방의 분포도를 확인한 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이 비만이 유도된 마우스에 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)을 식이한 마우스에서 비만이 감소됨을 확인할 수 있었다.

또한, 내장지방의 분포도의 경우에 있어서도 레스베라톨(resveratrol)을 포함한 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)을 식이한 마우스에서 내장지방의 감소 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 특히, 피세이드(piceid)와 프테로스틸벤(pterostilbene)에서 내장지방 억제효과가 탁월함을 확인할 수 있었다.

보다 정확한 결과를 확인하고자 상기 관찰된 내장지방의 감소에 대하여, 내장지방 및 간을 분리 후, 무게를 측정하였다.

그 결과 도 10에서 확인할 수 있듯이, 레스베라톨(resveratrol)을 포함한 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)을 식이한 마우스의 경우 내장지방의 크기가 확연히 감소한 것을 알 수 있었다.

또한, 분리된 지방 및 간의 무게를 측정하여 수치화 한 결과로, 옆구리 및 복부의 내장지방(Epididymal adipose tissue, Retroperitoneal adipose tissue)의 무게는 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의해 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다. 간의 경우 역시, 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의해 무게가 2배 이상 탁월하게 감소한 바, 본 발명의 레스베라톨의 유도체들이 지방간 예방에도 뛰어난 효과를 보임을 확인할 수 있었다.

(3) 비만 관련 유전자들의 변화

상기 분리한 내장지방에서 식욕 조절에 영향을 미치는 Leptin과 비만 유도시 증가한다고 알려져 있는 TNFa, 인체 내분비와 대사 조절에 중요한 역할을 하며 비만 유도시 감소된다고 알려진 Adiponectin의 유전자를 대상으로 발현 변화를 조사하였다.

그 결과 도 11에서 확인할 수 있듯이, Leptin과 TNFa는 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의해 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Adiponectin의 경우 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의해 현저히 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 본 발명의 레스베라톨의 유도체에 대한 Leptin, TNFa 그리고 Adiponectin의 유전자 발현의 변화를 통하여 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)이 탁월한 비만억제 효과와 상관성이 있음을 확인할 수 있었다.

(4) 당뇨 관련 유전자들의 변화

상기 분리한 내장지방에서 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)에 의한 당뇨 관련 유전자 즉, 비만 유도시 인슐린 수용체(InsR)와 인슐린 기질 복합체(IRS 1, IRS 2)의 발현 변화를 조사하였다.

상기 인슐린 수용체(InsR)와 인슐린 기질 복합체(IRS 1, IRS 2)의 유전자 발현의 감소는 내분비와 대사조절을 저해하여 인체의 인슐린저항성을 가지게 하며, 제2형 당뇨의 원인이 된다고 보고되어져 있다.

도 12에서 확인할 수 있듯이, 고지방사료를 식이한 비만 마우스의 경우 레스베라톨의 유도체에 의해 감소되어 있던 당뇨 관련 유전자들의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 상기의 결과로부터 본 발명의 피세아타놀(piceatannol), 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)이 탁월한 항당뇨 효과를 보임을 확인할 수 있었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

1. 피세이드(piceid), 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에서의 TREM-2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2) 억제방법.
2. 피세이드(piceid), 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 동물의 TREM-2 유전자의 과발현에 의한 비만 또는 제 2형 당뇨의 치료방법.
3. 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, TREM-2 형질전환 마우스에서의 렙틴(leptin) 및 종양괴사인자(TNFα) 유전자의 발현 억제, 및 아디포넥틴(adiponectin) 유전자의 발현 증가 방법.
4. 피세이드(piceid) 및 프테로스틸벤(pterostilbene)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는, TREM-2 형질전환 마우스에서의 인슐린 수용체(InsR), 인슐린 기질 복합체(IRS 1, 및 IRS) 유전자의 발현 증가 방법.
   

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