KR101397220B1

KR101397220B1 - 3,4,5-트리카페오일퀸산을 유효성분으로 포함하는 접촉성 피부염의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101397220B1
Application number: KR1020120058591A
Authority: KR
Inventors: 이민원; 임종순; 이상근; 김많흔
Original assignee: 대전대학교 산학협력단; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2014-05-21
Also published as: KR20130134805A

Abstract

본 발명은 3,4,5-트리카페오일퀸산을 유효성분으로 포함하는 접촉성 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 3,4,5-트리카페오일퀸산은 골수유래 대식세포에 LPS 및 ATP 처리에 의해 유도되는 IL-1β의 분비량을 확연히 감소시키며 접촉성 피부염의 동물모델에서 피부염 부위에서의 피부 두께를 감소시키는 접촉성 피부염의 치료 활성을 나타내고, 천연물로부터 추출된 것으로서 인체에 부작용이 거의 없으므로, 접촉성 피부염의 치료 또는 개선 용도의 의약 또는 화장품의 활성물질로 개발될 수 있다.

Description

3,4,5-트리카페오일퀸산을 유효성분으로 포함하는 접촉성 피부염의 치료용 조성물{Composition for Treating Contact Dermatitis Comprising 3,4,5-Tricaffeoylquinic Acid As Active Ingredient}

본 발명은 3,4,5-트리카페오일퀸산을 유효성분으로 포함하는 접촉성 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

먼나무(Ilex rotunda. Thunb)는 감탕나무과(Aquifoliaceae) 식물로 아시아권에서는 일본, 중국 및 우리나라 제주도, 남부지방 다도해 섬지방(1), 남부 해안 지방에서 주로 서식하며, 이국적인 수형 때문에 남부지방의 가로수와 공원수로 사용되어지고 있다. 전통적으로 한방에서 수피와 뿌리를‘구필응(救必應)’이라 하여, 열을 다스리고 통증을 멈추게 하는 용도로써, 해독제, 관절염, 위장염 등과 같은 염증 치료약으로 달여 먹었으며, 이외 화상 치료에 달여 놓은 액체를 환부에 바르거나 고약을 만들어 바르는 용도로 사용하였다고 한다(2). 먼나무에 관한 성분 연구로는 테르페노이드(Terpenoid) 배당체, 사포닌(Saponin) 계열 등의 물질이 대부분이며, 이외 1-카페오일퀸산(1-caffeoylquinic acid), 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 등과 같은 페닐프로파노이드(phenylpropanoid)계열의 물질도 보고되었다(3-5). 한편, 페닐프로파노이드계 성분은 항산화, 항염 등을 통해 각종 면역 이상 질환에 효과가 있고, 항암 효과도 있는 있음이 다양한 연구 분야에서 보고된 바 있다(6-9). 특히 감탕나무속 식물에서 분리된 페닐프로파노이드 물질인 카페오일퀸산(caffeoylquinic acid)은 면역질환 관련 인 비트로 실험도 보고됨으로써(10) 면역과 관련된 다양한 이상 질환 치료제 개발 가능성을 보여 주었다.

근래에는 물질문명의 발달로 환경오염 및 새로운 물질들이 대량 생산되고 그 종류도 다양해져서 전에 비해 접촉성 피부염의 발생빈도가 증가하는 추세에 있다. 일생을 통해서 누구나 최소한 몇 차례의 접촉성 피부염을 경험하게 되며, 그 원인 또한 매우 다양해서 자연물질, 공업산물, 심지어는 치료 약제에 의해서도 접촉성 피부염이 생길 수 있다. 접촉성피부염은 반복적으로 알러젠(allergen)이 피부에 침투함으로써 접촉된 부위에 습진성 피부 질환이 발생하는 것이다(11-12). 이러한 접촉피부염의 발병은 T 림프구와 대식세포 등에 의해서 발생되는 세포 매개형 과민반응으로, 항원과 접촉 시 수 시간사이에 비교적 늦게 염증 반응이 시작되기 때문에 지연형 과민반응(delayed type hypersensitivity)이라고 부른다(13). 면역세포들에서 분비되는 염증성물질은 인체 방어 시스템에서 초기에 분비 및 발현되는 중요한 단백질로, 이러한 반응에 관여하는 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IFN-γ 등이 있으며 이들은 활성화된 면역세포에서 분비되는 대표적 염증 유발 물질이다(14). 이러한 염증 유발물질은 각질형성세포의 성장을 자극하여 상피과형성과 과립성 대식세포의 자극 물질 분비 촉진, 랑게르한스 세포수의 증가, 각질형성세포의 증식 등을 촉진하는 역할을 하게 된다. 접촉성 피부염의 기전은 이러하다. 피부가 외부의 항원에 노출되면 표피의 각질 형성 세포와 부착되어 있던 랑게르한스 세포가 표피의 기저막을 통해 진피로 이동하여 주위의 림프관을 통해 주위 림프절로 이동하게 된다. 이때 랑게르한스 세포가 진피로 이동하는데 관여하는 사이토카인으로는 TNF-α와 IL-1β가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(15). 이러한 사이토카인의 발현은 피부에 홍반, 부종 등을 동반한 습진 양 병변이 발생하게 되는데, 특히, IL-1β의 활성은 TNF-α 활성의 범위와 유사하여 염증반응과 내피세포에 백혈구의 부착 때 등에 중요한 역할을 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 접촉성 피부염을 치료할 수 있는 활성물질을 천연물로부터 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 먼나무(Ilex rotunda)의 가지 추출물로부터 분리한 카페오일 유도체 화합물 중 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoylquinic acid)이 접촉성 피부염의 치료 활성이 있음을 인 비트로 및 동물실험을 통해 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 3,4,5-트리카페오일퀸산을 유효성분으로 포함하는 접촉성 피부염 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoylquinic acid)을 유효성분으로 포함하는 접촉성 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 활성성분은 하기 화학식 1로 표시되는 3,4,5-트리카페오일퀸산이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 3,4,5-트리카페오일퀸산은 먼나무(Ilex rotunda) 추출물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명에서 먼나무 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명에서 먼나무 추출물은 먼나무 식물의 모든 부분으로부터 얻은 추출물을 포함하며, 바람직하게는 잎, 줄기 또는 뿌리의 추출물이며, 가장 바람직하게는 먼나무의 줄기의 추출물이다.

본 발명의 먼나무 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 둘 이상의 서로 다른 용매를 순차적으로 사용하여 추출할 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 추출용매는 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올), 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 클로로포름, 헥산(Hexane) 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 메탄올, n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 또는 물이며, 가장 바람직하게는 메탄올이다.

본 발명에서 먼나무 추출물로부터 3,4,5-트리카페오일퀸산의 분리는 추출물로부터 단일 화합물을 분리 및 정제하는 통상적인 방법에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 실리카겔 또는 셀라이트(celite)겔 컬럼을 이용한 여과(filtration), 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화(affinity) 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 이용하여 분리 정제할 수 있다.

천연물 추출물로부터 분리된 단일 화합물은 MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectroscopy), EI MS (Electron Ionization Mass Spectroscopy), CI (Chemical Ionization Mass Spectroscopy), FABI (Fast Atom Bombardment Ionization), ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry)와 같은 질량분석법과, 적외선 분광법(IR Sectrum), 핵자기공명법(NMR, Nuclear Magnetic Resonance), CD (Circular Dichroism) 등의 방법을 이용하여 동정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 3,4,5-트리카페오일퀸산은 조성물중에 0.05 - 30 중량％의 함량으로 포함되며, 보다 바람직하게는 0.1 - 20 중량％, 보다 더 바람직하게는 0.5 - 10 중량％의 범위로 포함된다.

하기 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 3,4,5-트리카페오일퀸산은 골수유래 대식세포에 LPS 및 ATP 처리에 의해 유도되는 IL-1β의 분비량을 확연히 감소시키는 활성을 보여주고, 접촉성 피부염의 동물모델을 대상으로 한 실험에서 접촉성 피부염에서의 피부 두께를 감소시키는 치료 활성을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 3,4,5-트리카페오일퀸산은 접촉성 피부염의 치료, 예방 또는 개선 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에서의 치료 대상 질환 “접촉성 피부염(contact dermatitis)”은 외부물질과의 접촉에 의하여 생기는 모든 피부염을 의미하며, 접촉물질 자체의 자극에 의하여 생기는 원발성 접촉피부염과 접촉물질에 대한 알러지 반응이 있는 사람에게만 생기는 알러지성 접촉피부염을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001 - 100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 접촉성 피부염의 치료 또는 예방을 위해 적용되므로, 조성물의 투여는 피부에 국소적으로 도포 되어 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형이다.

본 발명의 조성물은 화장품학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림, 로션, 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명은 3,4,5-트리카페오일퀸산을 유효성분으로 포함하는 접촉성 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 3,4,5-트리카페오일퀸산은 골수유래 대식세포에 LPS 및 ATP 처리에 의해 유도되는 IL-1β의 분비량을 확연히 감소시키며 접촉성 피부염의 동물모델에서 피부염증 부위에서의 피부 두께를 감소시키는 접촉성 피부염의 치료 활성을 나타내었고, 천연물로부터 추출된 것으로서 인체에 부작용이 거의 없으므로, 접촉성 피부염의 치료 또는 개선 용도의 의약 또는 화장품의 활성물질로 개발될 수 있다.

도 1은 먼나무(Ilex Rotunda) 가지 추출물로부터 염증조절복합체 저해 활성를 갖는 추출물, 분획물 및 유효성분 화합물을 분리하는 과정을 도표로 보여주는 도면이다.
도 2는 먼나무(Ilex Rotunda) 가지 추출물 및 분획물에 대해 TLC (Thin Layer Chromatography) 분석한 결과를 보여주는 실험결과 사진이다.
도 3a는 먼나무(Ilex Rotunda) 가지 추출물로부터 분리한 화합물 1의 ¹HNMR 스펙트럼(600 MHz, MeOH-d4+D2O)이고, 도 3b는 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼(150 MHz, MeOH-d4+D2O)이고, 도 3c는 화합물 1의 Negative FAB MS 스펙트럼이다.
도 4는 골수유래 대식세포에서 LPS와 ATP의 자극에 의한 IL-1β의 분비를 3,4,5-트리카페오일퀸산이 억제하는 효과를 보여주는 실험결과이다.
도 5는 Balb/C 마우스와 DNFB(2,4-Dinitrofluorobenzene)을 사용하여 제작한 접촉성 피부염 동물모델에서 3,4,5-트리카페오일퀸산이 접촉성 피부염에 의한 피부두께 증가를 억제하는 효과를 보여주는 실험결과이다.
도 6은 Balb/C 마우스와 DNFB(2,4-Dinitrofluorobenzene)을 사용하여 제작한 접촉성 피부염 동물모델에서 3,4,5-트리카페오일퀸산이 접촉성 피부염에 의한 피부두께 증가를 억제하는 결과를 그래프로 보여주는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 활성성분의 분리

(1) 실험재료

본 실험에 사용한 먼나무(Ilex rotunda)의 가지는 제주한라수목원에서 2010년 01월에 채취한 1 kg을 분양받아 사용하였다.

(2) 시약 및 기구

본 실험에 사용한 시약 및 기구는 다음과 같다: ① 1H-NMR spectrometer: VNS 600 MHz (Varian, Palo Alto, USA); ② 13C-NMR spectrometer : VNS 150 MHz (Varian, Palo Alto, USA); ③ FAB MS spectrometer : JMS-600W Agilent 6890 Series (Jeol, Tokyo,Japan); ④ TLC : Adsorbent : Kieselgel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Germany); Solvent(v/v): ⓐ Benzene : Ethyl Formate : Formic acid = 1 : 7 : 1; Detection : ⓐ Ethanolic-FeCl3 solution ⓑ 10％-H2SO4 in H2O(heating) ⓒ UV-lamp (254 nm); ⑤ Chromatographic gels: Sephadex LH 20, 75-230μm mesh (Pharmacia, Uppsala, Sweden) MCI-gel CHP-20P, 75-150μm (Mitsubishi, Tokyo, Japan).

(3) 활성성분의 추출 및 분리

먼나무 가지 1Kg을 80％ 식용 MeOH으로 실온에서 2회 추출하였다. 추출액은 여과한 후 감압 농축하여 추출물(120g)을 얻었다. 농축한 추출물은 여과하여 여과층(filter layer)(76g)와 비-여과층(non-filter layer)(16g)를 얻었다. 그 중 여과층(76g)을 Sephadex LH-20 column chromatography (40→100％ MeOH, gradient system)를 실시하여 5 개의 분획(Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5)으로 각각 나누었다. 그 중 우수한 활성을 나타낸 분획 Fr-5(6.02g)에 대해 MCI-gel CHP-20P (30→100％ MeOH, gradient system)을 실시하여 3개의 분획으로 나누었으며, 그 중 Fr5-2(4.2g)을 Sephadex LH-20 column chromatography (60→100％ MeOH, gradient system)를 실시하여 화합물 1 (212mg)을 확보할 수 있었다(도 1 참조).

(4) TLC 테스트

먼나무 가지 추출물의 구성 성분을 추정하기 위하여 TLC를 통한 분석을 실시하였다. 먼저 먼나무 가지를 80％ MeOH으로 추출하여 먼나무 가지의 추출물을 얻었고, 이어서 농축한 추출물은 여과하여 여과층(filter layer)와 비여과층(non-filter layer)을 얻었다. 그 중 여과층을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 MeOH 용매를 40-100％ 까지 농도를 높여 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5로 분획하여 TLC(Thin Layer Chromatography) 테스트를 실시하였다.

전개용매는 Benzene : Ethyl Formate : Formic acid = 1 : 7 : 1를 사용하였으며, 전개 시킨 뒤에는 염화철 분무, 아니스-알데하이드(Anis-Aldehyde) 및 10％ 황산을 분무한 후 열판에 가열하는 방법을 이용하여 발색시켰다. TLC 결과 각 분획이 효율적으로 나누어졌음을 알 수 있었으며, 먼나무(Ilex rotunda) 가지 추출물로부터 분획한 분획 Fr4로부터 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoylquinic acid)으로 추정되는 성분이 있음을 확인하였다(도 2 참조).

(5) 화합물 1의 구조 확인

화합물 1은 갈색 분말로 TLC 테스트에서 FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10％ H₂SO₄을 분무하고 가열하였을 때는 진한 갈색으로 발색하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 3개의 ABX-type에 의한 시그날이 δ 7.069, 7.028, 6.995(d, H-2), 6.947, 6.933/6.917, 6.930/6.846, 6.846(d, H-5) 6.783, 6.762, 6.714(dd, H-6)에서 나타낸 시그날이 각각 H-5와 H-6이 메타 커플링(meta coupling) 및 오르토 커플링(ortho coupling)이 나타나며, 이들 사이에 양쪽으로 알켄기가 동일한 J 밸류 값을 가지면서 시그날이 δ 6.334, 6.228, 6.220/7.615, 7.551, 7.526(d, H-7, 8)이 나타남으로써 트랜스 형태의 2개의 알켄임을 확인하였다. 또한, 5.761(m), 5.330, 5.672 에서 3개의 OH가 연결된 메틴(methine)과 2.307(4H, m)에서 4개의 수소에 해당하는 2개의 메틸렌(methylene)에 의한 시그날을 확인하여 퀸산(quinic acid)이 존재함을 알 수 있었다. 이로써 화합물 1은 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoyl quinic acid)으로 추정하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서도 카페오일기를 뺀 7개의 탄소의 시그날은 각각 δ 174.2은 COOH, δ 73.2, 68.6, 71.2, 67.5는 OH가 있는 메탄(methane), δ 37.1, 35.2은 2개의 메틸렌(methylene)으로 퀸산(quinic acid)임을 알 수 있었으며, 또한 Negative FAB MS 스펙트럼에서 m/z 677 [M-H]-를 확인하였으며, 문헌의 데이터와 비교를 통해 화합물 1을 3,4,5-트리카페오일퀸산으로 최종 동정하였다(16). 갈색무정형 분말(brown amorphous powder); Negative FAB MS: m/z677 [M-H]-; ¹H-NMR(600 MHz, MeOH-d4+D2O 아래 표 1 참조); ¹³C-NMR(150MHz, MeOH-d4+D2O, 아래 표 1 참조).

실시예 2 : 골수유래 대식세포에서의 IL-1β 분비 억제 활성 측정

(1) 골수 유래 대식 세포( bone - marrow derived macrophage )의 분화

실험동물은 6-7 주령의 Balb/C 마우스를 오리엔트바이오(성남, 대한민국)에서 공급받아 사용하였다. 실험동물은 22-24℃, 습도 50％에서 사료와 물을 충분히 공급해 주며 사육하였다. 모든 세포의 배양은 5％ 이산화탄소가 공급되는 37℃ 배양기에서 수행하였다. 골수 세포는 마우스의 대퇴골을 분리한 뒤 1 ml 주사기를 사용하여 인산 완충 용액을 골수에 흘려주어 분리하였다. 분리한 골수 세포에 ACK 용액 10 ml을 첨가하여 상온에서 5 분간 반응시켜 적혈구를 제거하였다. 원심 분리하여 얻은 세포에 M-CSF(5 ng/ml)을 포함하는 10 ml의 10％ FBS DMEM으로 재현탁 한 뒤 100mm 플레이트에서 18시간 배양하였다. 배양 용기의 표면에 붙지 않은 세포(non-adherent cell)을 원심분리하여 수득한 뒤, M-CSF(30 ng/ml)을 포함하는 10 ml의 10％ FBS DMEM으로 재현탁하였다. 이 세포를 1 X 10⁵세포/웰의 농도로 96웰 플레이트에 분주한 뒤 5-7일 간 분화시켰다.

(2) 골수유래 대식세포의 자극

분화를 마친 골수유래 대식세포에 500 ng/ml의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하고 3시간 배양한 뒤, 3,4,5-트리카페오일퀸산(TCQ)을 각각 30, 20, 10, 5 μM/㎖의 농도로 처리하여, 1시간 동안 추가 배양하였다. 이후, 5 mM/㎖의 농도로 ATP를 처리하고 6-9 시간 동안 배양한 뒤, 상층액을 수득하여 IL-1β의 양을 측정하였다.

(3) ELISA 를 이용한 IL -1β의 측정

배양액에 유리된 IL-1β양은 eBioscience (San Diego, CA, USA)사의 Mouse IL-1 beta ELISA Ready-SET-Go！™을 사용하여 제조사의 가이드라인에 따라 측정하였다. 간략하게 설명하면, ELISA용 플레이트에 1X 포획용 항체를 50 ㎕씩 분주한 뒤 4℃에서 16시간 반응시켰다. 코팅된 각 웰을 세척용 완충액으로 3회 세척하고 블로킹(blocking) 용액을 50 ㎕씩 분주한 뒤 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 다시 세척용 완충액으로 3회 세척하고 배양액을 50 ㎕씩 분주한 뒤 상온에서 2-3시간 반응시켰다. 세척 후 1X 검출용 항체를 50 ㎕씩 분주한 뒤 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 1X 아비딘(avidin)-HRP 항체를 50 ㎕씩 분주한 뒤 상온에서 30분간 동안 반응시켰다. 세척 후 기질 반응 용액을 50 ㎕씩 분주한 뒤, 암소에서 보관하며 충분한 발색이 이루어진 뒤에 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 발색 반응 정지 후 eMAX ELISA 판독기(Molecular devices, CA, USA)를 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 분비된 IL-1β의 양은 표준 곡선을 사용하여 정량화하였다.

(4) 3,4,5- 트리카페오일퀸산(TCQ)의 IL -1β 분비 억제능 효과

골수유래 대식세포를 LPS와 ATP으로 자극하였을 경우, IL-1β의 분비가 1,800pg/㎖ 이상 분비되는 것을 확인하였다. 그러나 3,4,5-트리카페오일퀸산(TCQ)을 30μM, 20μM 및 10μM 처리한 실험군에서는 ED₅₀ 값 이하의 양으로 IL-1β의 분비량이 확연히 감소되는 것이 확인되었다. 또한, 3,4,5-트리카페오일퀸산(TCQ)를 5μM의 농도로 처리한 경우에서도 IL-1β의 분비량이 30％ 이상 억제되는 것이 확인되었다(도 4).

실시예 3: 접촉성 피부염 동물 모델에서의 활성 측정 실험

(1) 접촉성 피부염 동물모델

접촉성 피부염 동물모델은 Balb/C 마우스와 DNFB(2,4-Dinitrofluorobenzene)를 사용하여 제작하였다. DNFB를 아세톤(acetone): 올리브오일(olive oil) (AOO) 용액에 0.5％ 농도가 되도록 희석한 후, 마우스의 복부에 30 ㎕씩 도포하여 감작(sensitize)시키고, 5일 후에 0.3％ DNFB 25 ㎕를 귀에 도포하였다. 도포 후 5％의 3,4,5-트리카페오일퀸산(TCQ) 크림을 10 mg씩 각각 1, 5, 12 시간 째 발라 준 뒤, 24 시간 후에 귀 조직을 채취하여 피부 변화를 H&E 염색을 통해 조직의 변화를 관찰하였다.

(2) 조직 염색

실험을 마친 각 실험군(n=5)에서 채취한 귀 조직은 10％ 포르말린으로 12시간 이상 고정한 뒤 수세하여 포르말린을 제거하였다. 조직은 탈수 과정을 거친 뒤 파라핀에 포매하고 Microtome(Leica, Germany)을 사용하여 13 ㎛ 두께의 박편 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드는 크실렌(xylene)과 에탄올을 이용하여 파라핀을 제거하고 헤마톡실린(hematoxilin) 용액에서 10분간 반응시키고, 0.1％ HCl에서 3분간 반응시켰다. 물로 세척한 후에 0.1％ 암모늄 용액에서 반응시킨 후 수세하였으며, 에오신(eosin) 용액에 반응시킨 뒤, 크실렌과 에탄올을 이용하여 슬라이드를 탈수시켰다. 슬라이드는 마운팅 용액(mounting solution)을 처리하고 커버 슬라이드를 덮고 현미경으로 관찰하였다.

(3) 3,4,5- 트리카페오일퀸산에 의한 접촉성 피부염의 억제 효과

5％의 3,4,5-트리카페오일퀸산(TCQ) 크림을 1일 3회 피부에 도포하고, 24 시간 뒤의 조직두께의 변화를 살펴본 결과, 음성대조군(vehicle)은 양성대조군[PC:DNFB-dinitrofluorobenzene]에 비해 두께가 170％ 이상 증가하였다. 그러나, 3,4,5-트리카페오일퀸산(TCQ)를 도포한 실험군에서는 120％ 증가에 그쳐, 70％ 이상의 피부 두께 증가를 억제하는 효과가 확인되었다(도 5). 상기 피부 두께 증가 억제 실험 결과는 120/170 X 100으로 환산하여 그래프로도 나타내었다(도 6).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoylquinic acid)을 유효성분으로 포함하는 접촉성 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물로서, 상기 3,4,5-트리카페오일퀸산이 IL-1β분비 억제 효능을 갖는, 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 3,4,5-트리카페오일퀸산은 먼나무(Ilex rotunda) 추출물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 3,4,5-트리카페오일퀸산은 0.05 - 30 중량％의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 접촉성 피부염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 피부 외용 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 피부 외용 제형은 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 접촉성 피부염의 개선용 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.