KR101393008B1 - 관중 추출물 유래 화합물을 포함하는 항균활성 및 방부활성을 갖는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 관중(Dryopteris crassirhizoma)을 초임계 추출법을 통해 추출한 추출물과 상기 추출물에서 분리한 큐놀린계(Quinoid) 화합물 및 이를 함유하는 피부 외용 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 기존의 파라벤류와 같은 화학방부제 대신 관중 초임계 추출물에서 유래한 큐놀린계(Quinoid) 화합물를 사용함으로써, 피부안전성과 자극성 등의 문제점을 해결하면서도 기존의 화학방부제보다 우수한 방부력을 갖는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

관중 추출물 유래 화합물을 포함하는 항균활성 및 방부활성을 갖는 피부 외용제 조성물{Skin external application containing compounds from extract of Dryopteris crassirhizoma with anti bacterial activity}
본 발명은 관중 추출물 유래 화합물, 특히 큐놀린계(Quinoid) 화합물을 유효 성분으로 포함하고 항균활성 및 방부활성을 갖는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 큐놀린계(Quinoid) 화합물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 종래의 화학 방부제 대신에 큐놀린계(Quinoid) 화합물을 함유함으로써 화학 방부제로 인한 자극감을 없애 주어 피부안전성이 우수하면서도 방부력은 그대로 유지하도록 제조한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 피부 외용제 조성물은 제조과정 중 발생한 미생물에 의한 오염, 사용 중의 손가락 등의 피부 접촉에 의해 그 표면에 있는 균에 의한 오염, 혹은 사용 중 물에 의한 오염을 피할 수 없다. 그 때문에 외용제 조성물 속에는 통상 제품 내 미생물의 증식을 억제하고 장기간 보존하기 위한 목적으로 파라옥시안식향산에스테르류(일명 파라벤류) 또는 이미다졸리디닐우레아, 페녹시에탄올 및 클로로페네신 등의 방부제가 배합되어 있다. 이러한 방부제는 피부 외용제 조성물에서 사용하는 방부수단으로서는 효과 및 안정성이 우수하지만 독성, 피부자극, 자극감 및 알러지 유발 등의 단점이 있어 한층 피부 안전성이 높은 방부제가 필요하게 되었다. 물론, 파라벤류 또는 페녹시에탄올 등의 방부제를 배합하지 않은 피부 외용제 조성물을 제조하는 것도 가능하기는 하지만, 이 경우에는 방부력을 확보하기 위해 무균 제조하거나, 내용량이나 사용기간을 한하거나 또는 조금씩 나눠 담은 용기나 리필이 되지 않는 용기(백레스튜브, 스펜서가 달린 용기 등)를 채용하는 등 복잡한 수단이 필요하여 경제적 범용성이 결여된다. 한편, 일부 식물 추출물이나 식물 정유류의 항균력이 알려져 있지만 사용감 문제, 피부 자극 등 안전성의 문제 및 향취 문제 등으로 화장료 등 외용제의 보존용도로의 범용적인 사용은 미미한 상황이다.
한국공개특허 제2008-0008819호에는 관중으로부터 분리한 플로르글루시놀계화합물에 대한 암 및 비만 예방과 치료효과에 대한 조성물이 기재되어 있으면서, 헥산과 에틸아세트 분획에서 플로르글루시놀계 화합물 10종을 분리 동정하였다. 또한 한국공개특허 제2008-0028391호에서는 관중 추출물, 연잎, 적양, 계피추출물 군중에서 1종 이상의 혼합 추출물을 혼합하여 천연 항균 및 방부 활성을 가지는 화장료 조성물에 대해 개시되어 있다. 또한 한국공개특허 제2010-0130885호에 의하면 관중으로부터 추출하여 에틸아세트 층에서 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 효과 있는 플로르글루시놀계 화합물이 개시되어 있다.
하지만, 상기 특허에서는 관중의 조 추출물의 단순한 항균활성 또는 방부력에 대한 언급이 있을 뿐, 큐놀린계(Quinoid) 화합물에 대한 기능 및 효능에 대해서는 밝히지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 화학방부제들이 갖고 있는 피부안전성, 자극성등의 문제점을 발생하지 않으면서 우수한 방부제에 대한 연구를 진행한 결과, 관중 추출물에서 분리한 큐놀린계(Quinoid) 화합물에서 우수한 방부효과를 확인하고, 이를 피부 외용제에 적용함으로써 화학방부제를 사용하지 않아도 방부력이 우수함을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 상기와 같은 본 발명의 목적은 관중 추출물에서 얻어지고, 항균활성 및 방부활성을 나타내는 큐놀린계 화합물을 포함하는 피부 외용제 조성물에 의해 달성된다.
또한, 바람직하게는, 상기 관중 추출물은 관중의 전초를 초임계 추출하여 얻는 것을 특징으로 한다.
또한, 바람직하게는, 상기 큐놀린계(Quinoid) 화합물은 상기 조성물의 전체 중량에 대하여 0.00001 ~ 50.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다.
또한, 바람직하게는, 상기 큐놀린계 화합물은 하기 화학식 1 내지 6의 구조를 갖는 큐놀린계 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종이다.
[화학식 1]
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[화학식 2]
Figure 112012072175133-pat00002
[화학식 3]
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[화학식 4]
Figure 112012072175133-pat00004
[화학식 5]
Figure 112012072175133-pat00005
[화학식 6]
Figure 112012072175133-pat00006
또한, 바람직하게는, 상기 관중 추출물은 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용한 용매 추출법, (b) 초임계 추출법, (c) 초음파 추출법 또는 (d) 미생물로부터의 발효나 자연발효대사를 이용하여 추출하여 1차 추출하는 단계; 상기 1차 추출 이후에 정제과정을 통해 정유, 사포닌, 강심배당체, 폴리테르펜류, 염료를 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 바람직하게는, 상기 화합물은 전체 조성물 중량 대비 0.00001 ~ 50.0 중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 바람직하게는, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 큐놀린계(Quinoid) 화합물을 포함하는 피부 외용제 조성물은 항균 효과와 방부효과를 갖고 및 피부 자극을 유발하지 않는 효과를 갖는다.
이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 관중 추출물 유래 큐놀린계 화합물을 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 유효 성분으로 사용되는 큐놀린계(Quinoid) 화합물(화학식 1~6)은 관중(Dryopteris crassirhiza)의 전초 또는 뿌리에서 추출 후 분리하였다. 본 발명에서 사용된 관중은 고사리과 식물의 전초로 우리나라 각처의 산지에서 나는 숙근성 양치류이다. 생육환경은 습기가 많고 토양이 거름진 곳에서 자란다. 키는 50~100cm이고, 잎은 길이가 약 1m 내외, 폭은 약 25cm 정도이며 뿌리에서 나온다. 줄기에는 광택이 많이 나고 황갈색 혹은 흑갈색의 비늘과 같은 것이 있다. 포자낭군은 핑 윗부분 가운데 가까이에 2줄로 붙어 있다. 뿌리를 포함한 전초는 약용으로 쓰인다(네이버 지식백과). 또한 봄에 잎이 아직 피지 않은 것을 삶아서 나물로 먹거나 국의 재료로 쓰고, 뿌리줄기에서 녹말을 채취하기도 한다. 한방에서는 어린순을 약재로 쓰는데, 위와 장에 있는 열독을 풀어 주고 가벼운 이뇨 작용이 있는 것으로 알려지고 있으며 북반구의 온대 자방과 한 대 지방에 널리 분포하는 자원이 풍부한 식물이다(한국공개특허 제10-2008-0008819호).
본 발명에 따른 큐놀린계 화합물은, 관중(Dryopteris crassirhiza)의 전초 또는 뿌리에서 추출하여 분리된 것으로서, 하기 화학식 1 내지 화학식 6의 구조를 갖는 화합물인 것을 특징으로 한다.
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본 발명에 있어서, 관중 추출물은 관중의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 종자 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 가장 바람직하게는 뿌리를 제외한 전초로부터 얻은 추출물을 의미한다.
또한, 본 발명의 관중 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다. 보다 바람직하게는, 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법을 이용할 수 있다.
본 발명에서 관중 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있다.
한편, 본 발명의 관중 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
또한, 본 발명의 관중 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결 건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205).
이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다.
지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다.
본 발명의 초임계 추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다.
이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.
추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.
상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법이다. 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다.
초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 관중 추출물은 발효과정을 거친 추출물도 포함하는데, 관중의 발효 추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 관중을 100~500메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모균주 또는 유산균 등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다.
상기 추출방법에 의해 추출된 추출물을 1차 조 추출물이라고 한다. 1차 조 추출물에 10 배량의 증류수(70~90℃)를 가하여 교반한다. 이후 24h 동안 상온에서 숙성시킨다. 이후 원심분리기에서 10,000rpm, 20 min, 25℃의 조건으로 상등액과 하등액을 분리한다. 이후 상등액 와트만 여과지를 이용하여 제거한다. 이 후 하등액을 동결건조한다. 위와 같은 정제단계를 거쳐 추출물에 함유되어 있는 불순물(사포닌, 강심배당체, 폴리테르펜류, 염료등)를 제거하였다.
상기 정제된 추출물을 에탄올 용액에 녹이고, n- 헥산(n-hexane), 메틸렌글라이콜(CH2CH2), 에틸아세테이트(EA), 부탄올(n-BuOH), 물 층으로 분획을 실시한다. 분획하여 얻은 노르말헥산 층을 실리카가 충진된 컬럼관에 로드하고 전개 용매로서 메틸렌글라이콜과 메탄올을 30:1에서 1:10 구배로 흘러주면서 분획한다. 얇은 막 크로마토그래피로 정성 분석하여 Rf=0.35-0.8까지의 분획을 농축하며, 이 분획물을 세파덱스(sepadex) LH- 20이 충진된 컬럼에 CHCl3:MeOH (1:1)로 분획하였다. 이후 MPLC(Medium pressure Liquid chromatograhpy)를 이용하여 다시 분리하였으며, 이후 에틸아세테이트와 메탄올로 재결정하여 본 발명의 큐놀린계 화합물인 화학식 1 내지 6의 화합물을 얻는다.
상기 화학식 1 내지 6의 화합물은 전체 피부 외용제 조성물에 대하여 0.00001 내지 50.0 중량%로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10.0 중량%로 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.001 내지 5.0 중량%로 포함될 수 있다.
화학식 1 내지 6의 화합물의 함량이 0.000001 중량% 미만일 경우에는 상술한 바와 같은 방부 효과 등의 효과가 미미하여 피부 외용제 조성물을 외부의 균으로부터 보호할 수 없으며, 상기 화학식 1 내지 6의 화합물의 함량이 50.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효능의 증가를 보이지 않아 경제성이 떨어질 수 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 유효 성분인 화학식 1 내지 6의 화합물 이외에 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화합물을 의약품에 적용할 경우에는, 본 발명에 따른 큐놀린계 화합물을 유효성분으로 하고, 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제롤 제제화할 수 있다.
경구 투여를 위한 제제로서는 정제, 환제, 과립제, 연질 캡슐제, 경질 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 필렛제 등을 들 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스르페이, 현탁액, 유제, 좌제 등을 들 수가 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존제, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용화하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 바람직하게는 화장료 조성물의 형태로 제조되는데, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용된다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 클렌징, 특히, 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 구체적인 제조예를 통하여 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 제조예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 제조예로 한정되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
제조예 1: 관중 전초의 초임계 추출물 제조
음건한 관중(Dryopteris crassirhiza)의 전초 약 1.0 Kg을 내부용적 1.5L의 초임계 추출조에 넣고 밀봉 후 이산화탄소를 공급하여 113㎏／㎠~540kg/㎠으로 압력을 맞춘 다음 온도를 높여 40℃로 조절하여 초임계유체의 밀도가 0.7~1.0이 되도록 조절한 후 10시간 동안 추출을 실시하였다. 약 42.3g의 추출물을 얻었다.
제조예 2: 관중 전초의 용매 추출물 제조
세절하여 음건한 관중의 전초 약 1.0 Kg을 70% (V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #2 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50 ℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하였다. 약 83.5g의 추출물을 얻었다.
제조예 3: 관중 뿌리의 용매 추출물 제조
세절하여 음건한 관중의 뿌리 약 1.0 Kg을 70% (V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #2 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50 ℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하였다. 약 77.3g의 추출물을 얻었다.
제조예 4: 관중 전초의 초음파 추출물 제조
세절하여 음건한 관중의 전초 약 1.0 Kg을 초음파(슈퍼노닉 초음파기기를 이용하여 25KHz의 강도로 30℃에서 약 2시간 동안 추출)를 이용한 추출을 통해 추출물을 얻었다. 공용매로서70% 에탄올을 정제수로 사용하였다. 약 85.3g의 추출물을 얻었다.
제조예 5. 관중 뿌리 추출물의 초임계 추출
음건한 관중(Dryopteris crassirhiza)의 뿌리 약 1.0 Kg을 내부용적 1.5L의 초임계 추출조에 넣고 밀봉 후 이산화탄소를 공급하여 113㎏／㎠~540kg/㎠으로 압력을 맞춘 다음 온도를 높여 40℃로 조절하여 초임계유체의 밀도가 0.7~1.0이 되도록 조절한 후 10시간 동안 추출을 실시하였다. 약 23.4g의 추출물을 얻었다.
제조예 6~10 관중 추출물의 정제
상기 1차 조 추출물(제조예 1~5의 추출물) 약 20g에 10배량(2.0L)의 증류수(70~90℃)를 가하여 교반한다. 이후 24 h 상온에서 숙성시킨다. 이후 원심분리기에서 10,000rpm, 20 min, 25℃의 조건으로 상등액과 하등액을 분리한다. 이후 상등액 와트만 여과지를 이용하여 제거한다. 이후 하등액을 동결건조 한다. 위와 같은 정제단계를 거쳐 추출물에 함유되어 있는 불순물(사포닌, 강심배당체, 폴리테르펜류, 염료등)를 제거하여 정제된 추출물을 각각 17.8g(제조예 6), 3.5g(제조예 7), 2.9g(제조예 8), 5.1g(제조예 9), 3.6g(제조예 10)을 얻었다.
실험예 1. 화합물의 분리 동정
제조예 6의 정제된 관중 전초 추출물을 실리카 230-400 메쉬가 충진된 컬럼관에 로드하고 전개 용매로서 메틸렌글라이콜과 메탄올을 30:1에서 1:10 구배로 흘러주면서 50 ㎖씩을 분획하였다.
얇은 막 크로마트그래프로 정성 분석하여 Rf=0.35-0.8까지의 분획을 농축하였으며, 이 분획물을 세파덱스(sepadex) LH-20이 충진된 컬럼에 CHCl3:MeOH (1:1)로 분획하였다. 이후 MPLC(Medium pressure Liquid chromatogrphy)를 이용하여 C18 컬럼에 CH3CN: D-W(1:1-->10:1)의 조건으로 분리하였다. 이후 에틸아세테이트(EA)와 메탄올(MeOH)로 재결정하여 상기 화학식 1~6을 얻었다. 상기의 분획에 의하여 NMR (및 mass)를 이용하여 구조를 분석하였다.
[화학식 1의 화합물]
2,5-사이클로헥사디엔-1-완, 2,2'-(메틸렌비스(2,4,6-트리하이드록시-5-(1-옥소브틸)-1,3-페닐렌)메틸렌)비스(6-아세틸-3,5-디하이드록시)
2,5-cyclohexadien-1-one, 2,2'-(methylenebis(2,4,6-trihydroxy-5-(1-oxobutyl)-1,3-phenylene)methylene)bis(6-acetyl-3,5-dihydroxy),(이명 : Dryocrassin)
ESI-MS M＋=820, m/z=612, 417, 404, 268, 196, 193, 153, 70
1H NMR (400mHz, CDCl3) δ 0.92(10H, m), 1.43-1.55(12H), 2.76(6H, s), 3.17(4H, m), 3.56(4H, s), 3.85(2H, s)
[화학식 1]
Figure 112012072175133-pat00013

[화학식 2의 화합물]
2,5-사이클로헥사디엔-1-완, 2,2'-(2,4,6-트리하이드록시-5-(1-옥소브틸)-1,3-페닐렌)비스(메틸렌)비스(3,5-디하이드록시-4,4-디메틸-6-(1-옥소브틸)
2,5-cyclohexadien-1-one, 2,2'-(2,4,6-trihydroxy-5-(1-oxobutyl)-1,3-phenylene)bis(methylene)bis(3,5-dihydroxy-4,4-dimethyl-6-(1-oxobutyl), (이명 : Filincin)
ESI-MS m/z: 639 [M H]+, 662[M + Na]+ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 1.05 (3H, t), 1.26 (3H, t), 1.43 (6H, br), 1.62 (6H, br), 1.73 (4H, m), 2.82 (3H, br), 3.28 (4H, m), 3.61 and 3.65 (each 2H, br)
[화학식 2]
Figure 112012072175133-pat00014

[화학식 3의 화합물]
2,5-사이클로헥사디엔-1-온,2-[[3-[(5-아세틸-2,4-디히드록시-3,3-
디메틸-6-옥소-1,4-사이클로헥사디엔-1-일)메틸]-2,4,6-트리히드록시-5-(1-옥소부틸)페닐]메틸]-3,5-디히드록시-4,4-디메틸-6-(1-옥소프로필)-(9Cl) 2,5-Cyclohexadien-1-one,2-[[3-[(5-acetyl-2,4-dihydroxy-3,3-
dimethyl-6-oxo-1,4-cyclohexadien-1-yl)methyl]-2,4,6-trihydroxy-5-(1-oxobutyl)phenyl]methyl]-3,5-dihydroxy-4,4-dimethyl-6-(1-oxopropyl)-(9Cl) (이명: filixic acid ABP):
ESI-MS m/z: 625 [M H]+, 649[M + Na]+
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 1.05 (3H, t), 1.26 (3H, t), 1.43 (6H, br ), 1.62 (6H, br), 1.74 (2H, m), 2.82 (3H, br), 3.28 (4H, m), 3.61 and 3.65 (each 2H, br)
[화학식 3]
Figure 112012072175133-pat00015

[화학식 4의 화합물]
2-에탄오닐-4-[(5-프로판오닐)-2,6-디하이드록시-3,3-디메틸-4-옥소-사이클로헥사-1,5-다이엔-1-일)메틸]-3,5-디하이드록시-6,6-디메틸-사이클로헥사-2,4-다이엔-1-완
2-ethanoyl-4-[(5-propanoyl)-2,6-dihydroxy-3,3-dimethyl-4-oxo-cyclohexa-1,5-diene-1-yl)methyl]-3,5-dihydroxy-6,6-dimethyl-cyclohexa-2,4-diene-1-one, (이명; albaspidin AP):
ESI-MS m/z: 417 [M H]+, 441 [M + Na]+
1H-NMR (400 MHz,CDCl3) : 1.06 (3H, t), 1.44 (6H, s), 1.64 (6H, s), 2.82 (3H,s), 3.26 (2H), 3.58 (2H, br)
[화학식 4]
Figure 112012072175133-pat00016

[화학식 5의 화합물]
2-프로판오닐-4-[(5-브탄오닐)-2,6-디하이드록시-3,3-디메틸-4-옥소-사이클로헥사-1,5-다이엔-1-일)메틸]-3,5-디하이드록시-6,6-디메틸-사이클로헥사-2,4-다이엔-1-완
2-propanoyl-4-[(5-butanoyl)-2,6-dihydroxy-3,3-dimethyl-4-oxo-cyclohexa-1,5-diene-1-yl)methyl]-3,5-dihydroxy-6,6-dimethyl-cyclohexa-2,4-diene-1-one (이명; albaspidin PB):
ESI-MS m/z: 445 [M H]+, 469 [M + Na]+ 1HNMR
(400 MHz, CDCl3) : 1.05 (3H, t), 1.27 (3H, t), 1.43 and 1.49 (each 3H, s), 1.63 and 1.69 (each 3H, s), 1.74 (2H, m), 3.27 (2H, m),
3.32 (2H, m), 3.55 (2H, br)
[화학식 5]
Figure 112012072175133-pat00017

[화학식 6의 화합물]
2-프로판오닐-4-[(5-프로판오닐)-2,6-디하이드록시-3,3-디메틸-4-옥소-사이클로헥사-1,5-다이엔-1-일)메틸]-3,5-디하이드록시-6,6-디메틸-사이클로헥사-2,4-다이엔-1-완
2-propanoyl-4-[(5-propanoyl)-2,6-dihydroxy-3,3-dimethyl-4-oxo-cyclohexa-1,5-diene-1-yl)methyl]-3,5-dihydroxy-6,6-dimethyl-cyclohexa-2,4-diene-1-one, (이명; albaspidin PP):
ESI-MS m/z: 431 [M H]+, 455 [M + Na]+
1HNMR (400 MHz, CDCl3) : 1.10 (6H, t), 1.48 (6H, s), 1.55 (6H, s), 3.28 (4H, m), 3.62 (2H, br)
[화학식 6]
Figure 112012072175133-pat00018

실험예 2: 화학식 1 내지 6의 화합물들의 정량
제조예 1~10로 제조된 관중 추출물을 고성능액체크로마토 그래피법(HPLC)으로 정량하여 함유량을 확인하였다. 컬럼으로는 C18이 충진된 30cm의 컬럼을 이용하였으며, 온도는 30℃로 설정하였다. 디텍터로는 PDA를 사용하였으며 이동상으로는 아세토니트릴과 증류수를 (3:7-->95:5)의 조건으로 흘려주면서 측정하였다. 각각의 화합물의 적정농도를 희석하여 표준폼으로 하여 검량선으로 설정하였다.
화합물1 화합물2 화합물3 화합물4 화합물5 화합물6
제조예1 2.33% 3.11% 2.81% 1.52% 1.67% 1.93%
제조예2 1.00% 2.27% 1.15% 0.81% 0.05% 1.23%
제조예3 0.001% 0.005% 0.002% 0.001% 0.001% 0.002%
제조예4 1.50% 2.27% 1.15% 0.71% 0.05% 1.23%
제조예5 0.002% 0.01% 0.02% 0.01% 0.001% 0.003%
제조예6 2.74% 3.66% 3.31% 1.79% 1.96% 2.27%
제조예7 1.11% 2.53% 1.27% 0.90% 0.06% 1.35%
제조예8 0.01% 0.008% 0.004% 0.002% 0.003% 0.004%
제조예9 1.66% 2.51% 1.23% 0.78% 0.065% 1.33%
제조예10 0.004% 0.01% 0.03% 0.015% 0.0013% 0.0032%
상기 표 1의 결과에 알 수 있는 것처럼, 관중의 뿌리 추출물보다 관중의 전초 추출물이 큐놀린계 화합물인 화학식 1 내지 6의 화합물 함량이 높게 나타났다. 특히 제조예 1의 초임계 추출법으로 추출한 경우, 상기 화합물의 함량이 가장 많이 높은 것을 알 수 있었다. 또한 추출물을 정제한 제조예 6~10에서 정제 전보다 상기 화합물의 더 높은 함량을 얻었다.
실험예 3: 항균력 측정
상기 추출된 화합물 1~6 및 제조예 1~5로 제조된 관중 추출물에 대한 항균 활성을 측정하기 위하여 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis KCTC 1914), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli KCTC 1924), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC 1916,KCTC 1928, EML 5757779) 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonsa aeruginosa KCTC 2513)등의 세균과 칸디다 알비칸스(Candida albicans ; ATCC10231) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger ; ATCC16404) 등의 곰팡이를 대상으로 페이퍼 디스크(paper disc)법으로 가시화 실험을 수행하였다.
상기 추출된 화합물 1~6과 제조예 1~5로 제조된 추출물을 50% 에탄올에 녹인 후 50㎍씩 페이퍼 디스크(Whatman NO.1, 8mm diameter)에 점적한 후, 건조 시켰다. 이후 상기 균주가 0.1ml 도말된 한천 플레이트 위에 올려놓고 24시간 동안 완전히 건조하였다. 이후, 저해구역(inhibitory zone)의 크기를 측정하여 항균 활성을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 2 에 나타내었다.
균주 저해 구역(inhibitory zone)의 크기(mm)
E.coli P.aeruginosa B.subtilis S.aureus A.niger C.albicans
제조예 1 20 22 25 28 26 21
제조예 2 15 16 20 22 21 15
제조예 3 13 14 16 19 18 13
제조예 4 18 18 23 26 23 18
제조예 5 10 12 14 16 15 11
제조예 6 23 25 26 30 27 23
제조예 7 15 16 21 22 23 16
제조예 8 12 14 17 19 19 13
제조예 9 17 19 24 26 23 18
제조예 10 11 11 15 16 16 10
화합물 1 22 20 24 26 24 21
화합물 2 23 21 24 24 25 20
화합물 3 18 18 20 20 22 16
화합물 4 16 16 19 18 20 14
화합물 5 17 18 20 21 19 15
화합물 6 15 15 21 19 17 13
상기 실험을 통하여 화합물 1~6의 항균 활성을 확인할 수 있었으며, 특히 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스, 스타필로코커스 아우레우스에서 그람 음성균인 에스케리키아 콜리, 슈도모나스 애루기노사에 비하여 상대적으로 우수한 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 화합물 1, 2가 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(Methicillin resistant Staphylococcus aureus MRSA)에 해당하는 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1928 균주에 대하여도 매우 우수한 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 화합물이 다양한 균주에 대하여 우수한 항균 활성을 가짐을 알 수 있었다. 또한 제조예1과 제조예 6의 추출물들이 강한 활성을 가짐을 알 수 있었으며 전초부분이 뿌리 추출물보다 강한 활성을 갖는 것을 알 수 있었다.
제형예 1 :관중 추출물을 함유하는 피부외용제의 제조
관중 추출물을 포함하는 제형예는 제조예 1~5의 관중 추출물을 각각 포함하는 제형예 1~5와 제조예 1의 추출물에서 분리한 큐놀린계 화합물 1~6를 함유하는 제형예 11~16를 제조하였으며, 방부 효능의 비교를 위해 활성성분 대신에 파라벤을 포함하는 조성물(비교제형예 1)과 아무것도 사용하지 않은 조성물(비교제형예 2)을 하기 표 3에 나타내었다.
구분 성분 제형예 1~10 제형예 11~16 비교제형예 1 비교제형예 2
A 관중 추출물
(제조예 1~10)		 2.0 - - -
관중 추출물
(화합물 1~6)		 - 0.1 - -
메틸파라벤
(P_M)		 - - 0.5 -
글리세린 5.0 5.0
1,3부틸렌글리콜 - - 5.0 -
솔비톨 - - - 5.0
EDTA-2Na 0.02 0.02 0.02 0.02
정제수 to 100 to 100 to 100 to 100
B 세토스테아릴알코올 2.0 2.0 2.0 2.0
글리세릴스테아레이트 1.5 1.5 1.5 1.5
마이크로크리스탈린 0.7 0.7 0.7 0.7
스쿠알 5.0 5.0 5.0 5.0
유동파라핀 3.0 3.0 3.0 3.0
트리옥타노인 5.0 5.0 5.0 5.0
폴리솔베이트 1.2 1.2 1.2 1.2
솔비탄스테아레이트 0.5 0.5 0.5 0.5
토코페릴아세테이트 0.2 0.2 0.2 0.2
사이클로메치콘 3.0 3.0 3.0 3.0
BHT 0.05 0.05 0.05 0.05
C 향 적량 적량 적량 적량
실험예 4: 관중 추출물의 피부 1차 자극 시험( Human patch Test )
본 발명의 관중 추출물과 관중 추출물 유래 큐놀린계 화합물을 함유하는 조성물의 피부 안전성을 알아보기 위하여, 건강한 성인 남,여 30명을 대상으로 등에 5 × 20 ㎝ 부위에 제형예 1~16 및 비교제형예 1~2를 약 0.1g 씩을 24시간 동안 첩포한다. 이를 제거하고 1시간 및 24시간이 경과한 다음, 하기의 판정 기준에 의하여 육안으로 피부 상태 변화를 판독하였고, 자극율(%)은 다음 수학식 1에 따라 계산하였다. 실험 결과는 하기의 표 4에 나타나 있다.
판정기준
- : 홍반이나 특이한 현상 없음
+- : 주위보다 약간 붉어짐
+ : 주위보다 현저히 붉어짐
++ : 주위보다 심하게 붉어지고 부풀음
Figure 112012072175133-pat00019
시료 판정결과 자극율
(%)
++ + +- -
제형예1 - - - 30 0
제형예2 - - - 30 0
제형예3 - - 5 25 5.5
제형예4 - - - 30 0
제형예5 - - 5 25 5.5
제형예6 - - - 30 0
제형예7 - - - 30 0
제형예8 - - 4 25 4.4
제형예9 - - - 30 0
제형예10 - - 6 25 6.6
제형예11 - - - 30 0
제형예12 - - - 30 0
제형예13 - - - 30 0
제형예14 - - - 30 0
제형예15 - - - 30 0
제형예16 - - - 30 0
비교제형예 1 - 2 5 23 10.0
비교제형예 2 - - 3 27 3.3
상기 표 4의 피부 1차 자극성 실험 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 관중 추출물을 함유하는 조성물에서는 특이한 피부안전성이 발생하지 않았다. 또한 전초에서 추출한 관중이 뿌리에서 추출한 추출물보다 피부안전성이 더 우수한 것을 알 수 있었다. 화합물 1~6을 함유한 제형예 11~16에서도 특이한 피부 안전성의 문제점이 발견되지 않았다. 하지만 파라벤을 함유한 비교제형예 1은 피부 자극이 심각하게 나타났으며, 방부제를 함유하지 않은 비교제형예 2도 약간의 자극이 발생하였다. 이상의 결과를 종합해보면 관중의 전초 추출물과 화학식 1~6의 화합물들이 피부자극을 유발하지 않으면서 오히려 피부자극을 감소시키는 것을 확인하였다.
실험예 5: 관중 추출물의 방부 효과
관중 추출물의 방부 효과를 알아보기 위해, 하기 표 3의 조성으로 제조한 상기 제형예 1~16 및 비교제형예 1~2의 조성물을 이용하여 박테리아 및 곰팡이에 대한 항균 효과를 측정하였다,
먼저, 박테리아의 경우 상기 제형예 1-16 및 비교제형예 1, 2의 화장료 20-30 g에 대장균(Escherichia coli ; ATCC 8739), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa ; ATCC9027) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus ; ATCC6538)의 혼합 균액을 시료당 초기 농도가 107 cfu/g 되도록 첨가 혼합하였다. 이들을 30-32℃ 항온조에서 4주간 배양하면서 1, 7, 14, 21 및 28일 간격으로 각 화장료를 1 g씩 취하여 생균수를 측정하였다. 측정결과는 하기의 표 5에 나타내었다.
다음으로 곰팡이의 경우에는, 칸디다 알비칸스(Candida albicans ; ATCC10231), 페니실리움 씨트리눔(Penicillium citrinum ; KCTC2123) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger ; ATCC16404)의 혼합균액을 시료당 106cfu/g이 되도록 첨가 혼합한 후 25℃ 항온조에서 배양하면서 7일 간격으로 변취 유무와 시료표면의 균사 및 포자발생 유무를 관찰하여, 그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.
화장료 박테리아(cfu/g) 곰팡이*
초기균수 1일차 7일차 14일차 21일차 28일차
제형예 1 1x107 10000 1500 <100 <100 <100 -
제형예 2 1x107 350000 5000 1000 500 <200 -
제형예 3 1x107 410000 6100 1300 700 <200 -
제형예 4 1x107 280000 3000 700 230 <100 -
제형예 5 1x107 480000 6500 1500 750 <200 -
제형예 6 1x107 10000 1000 <100 <100 <100 -
제형예 7 1x107 350000 5000 1000 500 <200 -
제형예 8 1x107 410000 6100 1300 700 <200 -
제형예 9 1x107 280000 3000 700 230 <100 -
제형예 10 1x107 480000 6500 1500 750 <200 -
제형예 11 1x107 120000 1000 600 <100 <100 -
제형예 12 1x107 110000 1000 500 <100 <100 -
제형예 13 1x107 210000 3100 750 300 <100 -
제형예 14 1x107 540000 7000 750 350 <100 -
제형예 15 1x107 290000 3800 600 250 <100 -
제형예 16 1x107 490000 6000 650 300 <100 -
비교제형예 1 1x107 9800000 5500000 >1x106 >1x106 >1x106 +++
비교제형예 2 1x107 60000 500 <100 <100 <100 -
- : 8주간 변취 및 균사와 포자 발생이 없고 양호
+ :４주 이내에 기벽이나 뚜껑에 곰팡이 발생
++ :４주 이내에 변취 및 표면 일부에 곰팡이 발생
+++ :　4주 이내에 변취 및 표면 전체에 곰팡이 발생
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 방부제를 사용하지 않은 비교예 2의 조성물은 4주 이내에 변취 및 표면 전체에 곰팡이가 발생하고, 1일만 지나도 박테리아 균이 현저하게 증가하는 것을 알 수 있다. 그러나, 본 발명의 관중 추출물을 함유하는 제형예 1 내지 제형예 16의 화장료 조성물은 박테리아 및 곰팡이에 대해 농도-의존적으로 항균효과를 나타내었으며, 약 28일이 경과한 후에는 방부제인 메틸파라벤를 사용한 비교제형예 1와 유사하거나 더 우수한 방부력이 확보되었다.
이런 결과를 종합하여 보면, 관중의 전초를 초임계 추출법으로 추출한 추출물과 여기서 분리한 큐놀린계 화합물 1 내지 6은 강력한 항균기능을 갖고 있어 좋은 피부 외용제 조성물, 특히 화장료 조성물에서 천연 방부제가 될 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 관중 추출물에서 얻어지고, 항균활성 및 방부활성을 나타내고, 하기 화학식 1 내지 6의 구조를 갖는 큐놀린계 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 피부 외용제 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112013116426604-pat00020

    [화학식 2]
    Figure 112013116426604-pat00021

    [화학식 3]
    Figure 112013116426604-pat00022

    [화학식 4]
    Figure 112013116426604-pat00023

    [화학식 5]
    Figure 112013116426604-pat00024

    [화학식 6]
    Figure 112013116426604-pat00025
  2. 청구항 1항에 있어서, 상기 관중 추출물은 관중의 전초를 초임계 추출하여 얻는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 관중 추출물은 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용한 용매 추출법, (b) 초임계 추출법, (c) 초음파 추출법 또는 (d) 미생물로부터의 발효나 자연발효대사를 이용하여 추출하여 1차 추출하는 단계;
    상기 1차 추출 이후에 정제과정을 통해 정유, 사포닌, 강심배당체, 폴리테르펜류, 염료를 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 전체 조성물 중량 대비 0.00001 ~ 50.0 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
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