KR101387985B1 - 전이 종양의 치료 - Google Patents

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Abstract

전이된 종양과 같은 전이 암을 치료하는 방법은 화학식 I의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 혼합물을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 화합물, 호변체, 화합물의 염, 호변체의 염, 또는 혼합물은 전이 암을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용될 수도 있다. 변동 가능한 A는 본원에 정의된 값을 가진다.
Figure 112007061604479-pct00033
다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 전이 종양, 전이 암

Description

전이 종양의 치료{TREATMENT OF METASTASIZED TUMORS}
본 발명은 대상에서 전이 종양을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 일반적으로 포함한다. 더 구체적으로, 본 발명은 전이된 종양의 치료에 및 치료를 위한 약제 제조에 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온과 같은 화합물 그리고 그것의 호변체, 염, 및 혼합물의 사용을 제공한다.
모세혈관은 인체의 거의 모든 조직에 뻗어 있으며 노폐물을 제거할 뿐 아니라 조직에 산소 및 영양소를 공급한다. 전형적인 조건하에, 모세혈관을 구성하는 내피세포는 분할되지 않으며, 따라서, 모세혈관은 정상적으로는 성인에서 수나 크기가 증가하지 않는다. 그러나, 조직이 손상될 때나 월경주기 중 특정 기간 동안과 같이 특정 정상 조건 하에서, 모세혈관은 급속히 증가하게 된다. 이미 존재하는 혈관으로부터 새로운 모세혈관을 형성하는 이러한 과정은 혈관형성(angiogenesis) 또는 혈관신생(neovascularization)으로서 알려져 있다. Folkman, J. Scientific American 275, 150-154 (1996) 참조. 상처를 치료하는 동안의 혈관형성이 성인 일생동안 병리학적 혈관신생의 예이다. 상처를 치료하는 동안, 추가적인 모세혈관은 산소 및 영양소의 공급을 제공하고, 육아조직을 촉진시키고, 그리고 노폐물 제거에 도움을 준다. 치료과정의 종결 후에, 모세혈관은 보통 퇴행한다. Lymboussaki, A. "Vascular Endothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos, Adults, and in Tumors" Academic Dissertation, University of Helsinki, Molecular/Cancer Biology Laboratory and Department of Pathology, Haartman Institute, (1999).
또한 혈관형성은 암세포의 성장에 있어서 중요한 역할을 한다. 암세포의 온상이 일단 특정한 크기, 대략 직경 1 내지 2mm에 이르게 되면, 확산은 암세포에 충분한 산소 및 영양분을 공급하는데 충분치 않을 것이므로 암세포는 종양이 더 크게 자라도록 혈액 공급을 발전시켜야 한다는 것이 알려져 있다.
수용체 티로신 키나아제(RTK)는 발달성 세포 성장 및 분화, 성인 조직의 재형성 및 재상을 조절하는 막투과성 폴리펩티드이다. Mustonen, T. et al., J. Cell Biology 129, 895-898 (1995); van der Geer, P. et al. Ann Rev. Cell Biol. 10, 251-337 (1994). 성장 인자 또는 시토킨으로서 알려진 폴리펩티드 리간드가 RTK를 활성화하는 것으로 알려져 있다. 신호 RTK는 리간드 결합 및 수용체의 외부 도메인에서 입체구조의 이동을 수반하여 그것의 이량체화를 야기한다. Lymboussaki, A. "Vascular Endothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos, Adults, and in Tumors" Academic Dissertation, University of Helsinki, Molecular/Cancer Biology Laboratory and Department of Pathology, Haartman Institute, (1999); Ullrich, A. et al., Cell 61 , 203-212 (1990). 리간드와 RTK의 결합은 특이적 티로신 잔기에서 수용체 트랜스-인산화 및 후속하는 세포질 기질 의 인산화를 위한 촉매 도메인의 활성을 가져온다. 상기 참조.
RTK의 2개의 아과는 혈관 내피에 특이적이다. 이들은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 아과 및 Tie 수용체 아과가 포함된다. 클래스 Ⅴ RTK는 VEGFR1 (FLT-1), VEGFR2(KDR (인간), Flk-1 (마우스)), 및 VEGFR3 (FLT-4)를 포함한다. Shibuya, M. et al., Oncogene 5, 519-525 (1990); Terman, B. et al., Oncogene 6, 1677-1683 (1991); Aprelikova, O. et al., Cancer Res. 52, 746-748 (1992).
암은 종양 세포 증식을 구동하는 복합적인 유전적 결함을 포함하는 질병이다. 그런까닭에, 복합 세포 신호 경로를 동시에 억제하는 전략은 더 유리한 치료 과정을 이끌 수도 있다. RTK 과발현 및/또는 활성 돌연변이는 종종 종양 세포에서 나타나고, 종양 성장에 연관되어 있다. Blume-Jensen, P and Hunter, T., Oncogenic Kinase Signaling," Nature, 411 , pp. 355-65 (2001); Carmeliet, P., "Manipulating Angiogenesis in Medicine," J. Intern. Med., 255, pp. 538-61 (2004). 대부분의 RTK는 리간드 결합과 연관된 세포밖의 도메인 및 자가인산화, 신호 전달 사건의 다단계를 유발하는 다운스트림 신호 분자의 채택을 매개하는 세포내 키나아제 도메인을 포함한다. 암에서 나타나는 30개 이상의 RTK, 예를 들어 타입Ⅲ(PDGFR, CSF-1R, FLT3, 및 c-KIT), 타입Ⅳ(FGFR1-4), 및 타입Ⅴ(VEGFR1-3) RTK가 있다.
악성 B세포 질환인 다발성 골수종(MM)은 골수(BM) 내 클론 혈장 세포의 축적 및 골용해성 뼈 손상을 특징으로 한다. 자가 조직 줄기 세포 이식(ASCT) 및 보조적인 관리의 향상은 질환과 장기간 생존에 상당한 영향을 가졌다. Attal, M. et al., N. Engl. J. Med., 1996; 335:91-97; 및 Barlogie, B. et al., Blood, 1997; 89:789-793. 그러나, 환자는 반드시 재발하며, MM은 여전히 완전한 불치병이다. MM에서의 비무작위 염색체 전위의 확인은 강력한 진단상 도구의 발전 및 신규한 분자 표적의 동정을 야기하였다. MM에 걸린 환자의 거의 절반은 추정상 발암 유전자를 과발현하고, 5개의 재발 면역글로불린 중 (IgH) 전위 중의 하나에 의해 이상조절된다 : 11q13(사이클린 D1), 6p21(사이클린 D3), 4p16(FGFR3 및 MMSET), 16q23 (c-maf) 및 20q11 (mafB). Kuehl, W. M. et al., Nat Rev Cancer, 2002; 2:175-187; 및 Avet-Loiseau, H. et al., Blood, 2002; 99:2185-2191. 이들 전위는 MM의 진행에서 초기 및 가능하게는 생식 사건을 나타낸다. 보다 최근에는, 이들 특이적 IgH 전위는 예후적 의미를 알린다는 것이 분명해졌다. 특히, 환자의 대략 15%에서 발생하는 t(4;14)전위는 MM에 대해 특히 나쁜 예후를 주는 것으로 나타났고, ASCT에 대한 명백한 치료적 이점을 갖지 않는다. Fonseca, R. et al., Blood, 2003; 101 :4569-4575; Keats, J. J. et al., Blood, 2003; 101 :1520-1529; Moreau, P. et al., Blood, 2002; 100:1579-1583; 및 Chang, H. et al., Br. J. Haematol., 2004; 125:64-68. 명백히, 신규한 치료 접근법이 이들 환자를 위해 필요하다.
t(4;14) 전위는 2개의 잠재적 종양유전자, der(4) 상의 MMSET 및 der(14) 상의 FGFR3을 조절곤란한 것으로 보인다는 점에서 일반적이지 않다. Chesi, M. et al., Nat. Genet, 1997; 16:260-265; 및 Chesi, M. et al., Blood, 1998; 92:3025-3034. 이들 유전자 중 하나 또는 둘 모두의 조절이상이 MM 발병에 결정적인지 여부는 알려져 있지 않지만, 몇 가지의 증거가 종양 개시 및 진행에서 FGFR3에 대한 역 할을 지지한다. WT FGFR3, RTK의 활성화는 골수종 세포에서 증식 및 생존을 촉진하고, 조혈 마우스 모델에서 약하게 형질전환할 것이다. Plowright, E. E. et al., Blood, 2000; 95:992-998; Chesi, M. et al., Blood, 2001; 97:729-736; 및 Pollett, J. B. et al., Blood, 2002; 100:3819-3821. 일부 MM에서 FGFR3의 활성화 돌연변이의 후속적 획득은 후기 단계 골수종에 대한 진행과 관련되며, 몇 가지 실험 모델에서 강하게 형질전환 할 것이다. Chesi, M. et al., Blood, 2001; 97:729-736; 및 Li, Z. et al., Blood, 2001 ; 97:2413-2419. 시험관 내 연구는 FGFR3가 화학적 저항성을 줄 수 있음을 제안하며, 임상적 데이타에 의해 지지된 관찰은 통상적인 화합요법에 대한 빈약한 반응 및 t(4;14)MM 환자의 단축된 중앙값 생존을 증명한다. Fonseca, R. et al., Blood, 2003; 101 :4569-4575; Keats, J. J. et al., Blood, 2003; 101 :1520-1529; Moreau, P. et al., Blood, 2002; 100:1579-1583; 및 Chang, H. et al., Br. J. Haematol., 2004; 125:64-68. 이들 발견은 FGFR3의 이소성 발현이 단독으로는 아니지만, 골수종 발암에서, 중요한 역할을 하여 이 RTK를 분자 기재 요법에 대한 표적으로 만들 수도 있음을 제안한다.
t(4;14) MM 셀라인 중 FGFR3의 억제는 이들 세포가 말기 환자로부터 유도된 이들 세포 내 유전적 변형의 복잡성에도 불구하고 FGFR3 신호화에 여전히 의존적임을 증명하는 세포독성 반응을 야기한다. Trudel, S. et al., Blood, 2004; 103:3521-3528; Paterson, J. L. et al., Br. J. Haematol., 2004; 124:595-603; 및 Grand ,E. K. et al., Leukemia, 2004; 18:962-966. 이러한 관찰은 임상적인 성공이 기록된 인간 악성종양의 범위에서 수용체 티로신 비활성의 결과와 일치하고, 이들 나쁜 예후 환자의 치료를 위한 FGFR3 억제제의 임상적인 개발을 장려한다. Druker, B. J. et al., N. Engl. J. Med., 2001; 344:1031-1037; Demetri, G. D. et al., N. Engl. J. Med., 2002; 347:472-480; Slamon, D. J. et al., N. Engl. J. Med. 2001 ; 344:783-792; and Smith, B. D. et al., Blood, 2004; 103:3669-3676.
급성 골수성 백혈병(AML)은 공격적인 암이며 100,000명당 3.9명의 발병률로 전체 성인 급성 백혈병의 90%를 나타내고, 매해 10,500명의 새로운 경우가 추정된다. Redaelli, A. eif al., Exper. Rev. Anticancer. Ther., 3:695-710 (2003). 세포독성 약제(AraC + 안트라시클린)는 AML 환자의 70%까지 완화를 유도할 수 있다. 그러나, 전반적인 부분은 더 효과적인 치료를 위한 필요를 나타내는 것으로 재발한다. Weick, J. K. et al., Blood, 88:2841-2851 (1996); Vogler, W.R. et al., J. Clin. Oncol., 10:1103-1111 (1992). 종양 세포 제노타이핑은 fms-유사 티로신 키나아제(flt3/Flk2/Stk-2) 돌연변이를 운반하는 25 내지 35%의 AML 블라스트를 나타내며, 여기서 전반적인 부분(>70%)은 와일드-타입 FLT3를 나타낸다. Gilliiand, D.G. et al., Cum Opin. Hematol., 9:274-281 (2002); Nakao, M. et al., Leukemia, 10:1911-1918 (1996); Yokota, S. et al., Leukemia, 11 :1605-1609 (1997). FLT3 수용체는 CSF-1 R, c-KIT, PDGFR를 포함하는 클래스 Ⅲ 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 구성요소이며, 증식, 분화, 및 조혈모 세포, 수지상 세포, 자연살해(NK)세포 및 전구 B 세포의 생존에서 중요한 역할을 하는 것으로 기능적으로 알려져있다. McKenna, HJ. et al. Blood, 95:3489-3497 (2000); Mackarehtschian, K. et al., Immunity, 3:147-161 (1995). 다른 RTK와 같이 FLT3는 5개의 IG-유사 세포외 도메인의 특징이 있고, 친수성 키나아제 삽입 도메인을 함유한다. Blume-Jensen, P. et al., Nature, 411 :355-365 (2001). FLT3의 결찰을 따르는 신호전달은 복합의 다운스트림 경로를 조절하고, STAT5(전사 5의 신호 전달자 및 활성자), Ras/MAPK(미토겐-활성화된 단백질 키나아제), 및 PI3K를 포함한다. Hayakawa, F. et al., Oncogene, 19:624-631 (2000); Takahashi, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 316:85-92 (2004); Zhang, S. et al., J. Exp. Med., 192:719-728 (2000); Rosnet, O. et al., Acta Haematol., 95:218-223 (1996). 돌연변이체 FLT3를 갖는 세포에서, 종양발생 신호는 조절곤란한 키나아제 활성 및/또는 자가저해성 도메인 기능의 손실로부터 기인하는 구조 키나아제 활성(FLT3 결찰의 부재에서)과 연결되었다. Stirewalt, D. L. et al., Nat. Rev. Cancer, 3:650-665 (2003); Brown, P. et al., Eur. J. Cancer, 40:707-721 (2004). 이들 FLT3 돌연변이의 분자 특징은 17-34%인 FLT3 ITD 및 대략 7% 점 돌연변이가 있는 FLT3의 막근방(juxtamembrane) 영역에서 내부 탠덤 중복(ITD) 또는 키나아제 도메인(ASP835/836)에서의 점 돌연변이를 나타낸다. Yamamoto, Y. et al., Blood, 97:2434-2439 (2001); Thiede, C, et al., Blood, 99:4326-4335 (2002); Abu-Duhier, F.M. et al., Br. J. Haematol., 113:983-988 (2001). 게다가, AML에서 부정적인 예후로서, 증가된 질환 재발 및 감소된 전반적인 생존과 관련된 FLT3 ITD 돌연변이를 포함하는 상당한 증거가 있다. Thiede, C. et al., Blood, 99:4326-4335 (2002); Schnittger, S. et al., Blood, 100: 59-66 (2002). AML에서 FLT3 돌 연변이의 주어진 관련성, FLT3에 소분자 키나아제 억제제/항체를 이용하는 목표된 접근의 수는 현재 약물 개발의 임상전 또는 초기 단계로 조사된다. Brown, P. et al., Eur. J. Cancer, 40:707-721 (2004); O'Farrell, A.M. et al., Clin. Cancer Res., 9:5464-5476 (2003); Weisberg, E., et al., Cancer Cell, 1:433-443 (2002); Smith, B.D. et al., Blood, (2004); Kelly, L.M. et al., Cancer Cell, 1:421-432 (2002).
전립선 종양에서, VEGFR의 역할에 더하여, 및 혈관신생에서 PDGFR, 몇몇의 섬유아세포 성장인자(FGFs) 및 이들의 수용체(FGFRs)는 인간 전립선의 진행 및 항상성에서 열쇠 기질-상피조직의 전달을 촉진시킨다. Griffioen, A.W. and Molema, G., "Angiogenesis: Potentials for Pharmacologic Intervention in the Treatment of Cancer, Cardiovascular Diseases, and Chronic Inflammation," Pharmacol. Rev., 52, pp. 237-68 (2000); Ferrara, N.. "VEGF: an Update on Biological and Therapeutic Aspects," Curr. Opin. Biotechnol., 11 , pp. 617-24 (2000); Kwabi-Addo, B., Ozen, M., and Ittmann, M., "The Role of Fibroblast Growth Factors and their Receptors in Prostate Cancer," Endocr. Relat. Cancer, 11 , pp. 709-24 (2004); and Gowardhan, B., Douglas, D.A., Mathers, M.E., et al., "Evaluation of the Fibroblast Growth Factor System as a Potential Target for Therapy in Human Prostate Cancer," Br. J. Cancer, 92, pp. 320-7 2005). 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호에서 변화는 전립선 암의 발병과 관련된다. Ozen, M., Giri, D., Ropiquet, F., Mansukhani, A., and Ittmann, M., "Role of Fibroblast Growth Factor Receptor Signaling in Prostate Cancer Cell Survival," J. Natl. Cancer Inst., 93, pp. 1783-90 (2001). 많은 경우에 전립선 암은 뼈에 우선적으로 전이하고, 그러므로 환자들은 골격 합병증, 및/또는 골절의 진행에 대한 높아진 위험을 가지며, 이는 전립선 암이 있는 환자에서 사망률 및 사망의 주요 원인의 하나이다. 전립선 암을 치료하는 방법 및 전립선 암이 있는 환자에서 뼈에 전이를 예방하기 위한 방법에 대한 필요가 있다.
다양한 인돌릴 치환 화합물이 WO 01/29025, WO 01/62251, 및 WO 01/62252에서 최근 개시되었고, 다양한 벤즈이미다졸릴 화합물이 최근 WO 01/28993에 개시되었다. 이들 화합물은 보고되는 바와 같이 수용체-유형 및 비-수용체 티로신 키나아제 모두의 신호 도입을 억제, 조정 및/또는 조절할 수 있다. 일부 개시된 화합물은 인돌릴 또는 벤즈이미다졸릴 기에 결합된 퀴놀론 단편을 함유한다.
4-히드록시 퀴놀론 및 4-히드록시 퀴놀린의 유도체의 합성은 본원에서 충분히 제시한 바와 같은 정도로 모든 목적에 대하여 전체가 참고로 인용되는 수많은 참고문헌들에 개시되어 있다. 예를 들어, Ukrainets et al.은 3-(벤즈이미다졸-2-일)-4-히드록시-2-옥소-1,2-디히드록퀴놀린의 합성을 개시하였다. Ukrainets, I. et al., Tet. Lett. 42, 7747-7748 (1995); Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 2, 239-241(1992). Ukrainets은 또한 경련억제 및 갑상선 억제 활성의 다른 4-히드록시 퀴놀론 및 1H-2-옥소-3-(2-벤트이미다졸릴)-4-히드록시퀴놀린과 같은 다른 티오 유사체의 합성을 개시하였다. Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 1, 105-108 (1993); Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 8, 1105-1108 (1993); Ukrainets, I. et al., Chem. Heterocyclic Comp. 33, 600-604, (1997).
다양한 퀴놀린 유도체의 합성이 WO 97/48694에서 개시된다. 이들 화합물은 핵 호르몬 수용체에 결합할 수 있고, 골아세포 증식 및 뼈 성장을 자극하는데 유용한 것으로 개시된다. 화합물은 또한 핵 호르몬 수용체 과와 연관된 질환의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 개시된다.
퀴놀론의 벤젠 고리가 황 기로 치환된 다양한 퀴놀린 유도체가 WO 92/18483에서 개시된다. 이들 화합물이 약학 조제물에서 유용하며 약제로서 개시된다.
퀴놀론 및 쿠머린 유도체는 약 및 약학 조제물에 관련없는 다양한 용도에서 사용을 갖는 것으로 개시되었다. 광중합 조성물에서 사용하기 위한 또는 발광성 성질을 위한 퀴놀론 유도체의 제조를 기술하는 참고문헌은 : 미국 특허 번호5,801,212 Okamoto et al에 발행됨.; JP 8-29973; JP 7-43896; JP 6-9952; JP 63-258903; EP 797376; 및 DE 23 63459를 포함하며, 본원에서 충분히 제시한 바와 같은 정도로 모든 목적에 대하여 전체가 참고로 포함된다.
혈관형성 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 티로신 키나아제를 억제하고 그리고 4-아미노-5-플루오로-3-[5-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 또는 그것의 호변체를 포함하는 다른 티로신 및 세린/트레오닌 키나아제를 억제하는데 유용한 다양한 퀴놀린 벤즈이미다졸 화합물은 하기 문서에 개시되어 있고, 전체가 참고서서 본원에서 인용된 미국 특허 번호 6,605,617; 미국 특허번호 6,756,383; 미국 특허출원 번호 10/116,117 filed (2003년 2월 6일 US 2003/0028018 A1로서 공개됨); 미국 특허출원 번호 10/644,055 (2004년 5월 13일 공개됨, 미국 특허 출원 번호 2004/0092535); 미국 특허 출원 번호 10/983,174; 미국 특허출원 번호 10/706,328 (2004년 11월 4일 2004/0220196로서 공개됨); 미국 특허출원 번호 10/982,757; 및 미국 특허출원 번호 10/982,543에 개시되어 있다.
종양 및 암의 치료 방법의 최근의 진보에도 불구하고, 암 치료의 새로운 방법 및 전이된 종양과 같은 전이 암을 치료하기 위한 조성물에 대한 중요한 필요가 여전히 존재한다. 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 및 전립선 암을 치료하기 위한 방법이 추가적으로 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 전이암 및 특정 전이 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 전이암을 치료하기 위한 약학 조제물 및 약제의 사용에서 화합물, 그것의 호변체, 그것의 염, 및 그것의 혼합물의 사용을 추가적으로 제공한다.
한가지 측면에서, 본 발명은 인간 암 환자와 같은 대상에서 전이암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 암은 유방암, 간암, 폐암, 또는 전립선암이다. 다른 구체예에서, 전이 종양을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 전이 종양을 갖는 대상을 치료하는 방법이 제공된다. 추가적인 구체예는 혈액 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 구체예는 고체 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 화학식 I의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 혼합물의 유효한 양을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 화학식 I은 하기의 식을 갖는다:
Figure 112007061604479-pct00001
상기식에서,
A는 하기의 구조들 중의 하나를 갖는 기이다:
Figure 112007061604479-pct00002
상기식에서,
R1은 H 또는 1 내지 6 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 다양한 구체예에서, 암 또는 전이 종양의 성장(대상에서)은 투여 후에 억제된다.
일부 구체예에서, R1은 메틸기이고, 그리고 화학식 I의 화합물은 화학식 IA이다.
Figure 112007061604479-pct00003
일부 구체예에서, R1은 수소이고, 그리고 화학식 I의 화합물은 화학식 IB이다.
Figure 112007061604479-pct00004
일부 구체예에서, R1은 메틸기이고, 그리고 화학식 I의 화합물은 화학식 IC이다.
Figure 112007061604479-pct00005
다른 구체예는 전이 종양을 화학식 IA, IB 또는 IC의 화합물과 접촉하는 것 을 포함하는 전이 종양을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 화합물은 전신에 투여된다. 더 구체적으로 화학식 I의 화합물은 경구적 또는 정맥주사로 투여된다.
일부 구체예에서, 두번째 약제가 대상에 투여된다. 더 구체적으로 두번째 약제는 비스포스포네이트와 같은, 골다공증의 치료를 위해서이다. 다른 구체예에서, 두번째 약제는 항암제이다.
일부 구체예에서, 화합물은 화학식 I, IA, IB 또는 IC이고 그리고 화합물의 락트산염의 화합물 또는 호변체가 대상에 투여된다.
일부 구체예에서, 종양은 다발성 골수종이고, 대상은 t(4;14) 염색체 전위가 있는 다발성 골수종 환자이다. 더 구체적으로, 종양은 혈액 종양이다.
일부 구체예에서, 종양은 다발성 골수종이고, 대상은 다발성 골수종 환자이고, 다발성 골수종은 섬유아세포 성장 인자 수용체 3을 발현한다.
일부 구체예에서, 종양은 다발성 골수종이고, 대상은 다발성 골수종 환자이고, 그리고 다발성 골수종은 골수와 같은 환자의 뼈에 전이되어왔다.
일부 구체예에서, 종양은 다발성 골수종이고, 대상은 다발성 골수종 환자이고, 환자는 인간이다.
일부 구체예에서, 종양은 급성 골수성 백혈병(AML)이고, 대상은 급성 골수성 백혈병 환자이다. 일부 이러한 구체예에서, 대상은 포유동물이고, 일부 구체예에서는, 사람이고, 다른 이러한 구체예에서는 개 또는 고양이이다.
일부 구체예에서, 종양 또는 암은 간암, 폐암, 또는 유방암으로부터 선택된 다.
일부 구체예에서, 종양은 전립선 암이며, 대상은 전립선 암 환자이고, 그리고 전립선 암은 환자의 뼈에 전이되어왔다.
일부 구체예에서, 종양은 전립선 암이며, 대상은 전립선 암 환자이고, 그리고 환자는 인간이다.
한 가지 측면에서, 본 발명은 본 발명의 어떤 방법의 어떤 구체예에서 사용을 위한 약 또는 약학 조제물의 제조에 화학식 I, IA, IB 및/또는 IC의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 혼합물의 사용을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 화학식 I, IA, IB 및 IC의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 혼합물을 포함하는 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 전이된 암 또는 종양을 치료하는데 사용을 위한 다른 화합물을 포함할 수도 있다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침이 있는 설명서를 추가적으로 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 설명서는 키트의 용기로부터 분리되는 종이 문서로서 포함될 수도 있으며, 반면에 다른 구체예에서, 설명서는 키트의 용기에 부착된 라벨에 기재되어 있을 수도 있다.
본 발명의 추가적 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 도면으로부터 명백해 질 것이다.
도 1은 KMS-11-luc 세포로 주사되고 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온(20mg/kg/일)으로 처리된 SCID-베이지 마우스가 부형제로 처리된 것보다 유효하게 낮은 평균 광자수를 나타내는 것을 보여주는 그래프이다.
도 2 내지 도 5는 SCID-NOD 마우스 내의 인간 MV4;11 또는 RS4;11의 백혈병 종양 피하의 이종이식 모델에서 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온(화합물 1)의 항종양 활성을 보여주는 그래프이다. (도 2)MV4;11 또는 (도 3)RS4;11 세포를 SCID-NOD 마우스(n= 10 마우스/군)의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하였다. MV4;11 연구에서, 부형제(◇) 또는 화합물 1을 종양이 ~300mm3 이었을 때 1(●), 5(▲), 또는 30(■)mg/kg/일의 투여량에서 15일 동안 경구적으로 투여하였다. RS4;11 연구에서, 부형제(◇) 또는 화합물 1을 종양이 ~300mm3 이었을 때 10(▲), 30(■), 100(◆) 또는 150(●)mg/kg/일의 투여량에서 6일 동안 경구적으로 투여하였다. (도 4)MV4;11 종양의 효능 상에서 화합물 1의 매일의 효과, 간헐적 및 주기적 투여. 화합물 1을 매일(■), 하루/격일(●) 또는 7일 수행/7일 중단(×) 30mg/kg의 투여량으로 경구적으로 투여하였다. (도 5)화합물 1은 전반적인 MV4;11 종양의 퇴화를 유도한다. MV4;11 피하 종양(n=10 마우스/군)은 300(▲), 500(■) 또는 1000(●)mm3로 단계가 나뉜다. 데이터는 평균 종양 부피±SE로서 표현된다(n = 10 마우스/군).
도 6은 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸- 2-일]퀴놀린-2(1H)-온(화합물 1)이 정맥 내 MV4;11 세포를 함유하는 SCID-NOD 마우스의 생존을 연장하는 것을 보여주는 그래프이다. 방사선을 조사한 SCID-NOD 마우스는 MV4;11(1 x 107세포, 정맥주사)로 이식하였고, 23 내지 98일로부터 경구 부형제(◆) 또는 화합물 1의 20mg/kg을 주어진 매일(▲) 또는 계획된 7일 수행/7일 중단(■)으로 구성되는 정맥주사 치료를 23일째 개시하였다. 후지 마비 또는 나쁜 건강 상태의 초기 징후를 나타내는 마우스는 안락사시켰다. 도 6은 Kaplan-Meier 생존 백분율 vs. 시간 플롯을 설명한다(n=10-12 마우스/군).
도 7은 PC-3M-luc 세포로 주사되고, 그 후 부형제, 탁솔, 또는 화합물 1로 처리된 누드마우스의 복부, 머리 및 다리 부분으로부터 발생한 개개의 광자수(로그 스케일 중)를 보여주는 그래프를 포함한다. 그래프는 PC-3M-luc 광자수를 억제하고 뼈로 확산된 PC-3M-luc 세포의 성장을 억제하는 경향이 증명된 화합물 1(154258)을 갖는 치료를 보여준다.
도 8은 종양 부피 대 치료 일수의 그래프이다.
본 발명은 전이 암, 특히 전이된 다발성 골수종 및 전이된 전립선 암과 같은 전이 종양의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 전이암, 특히 고체 종양 또는 혈액 종양을 치료하기 위한 약 또는 약학 조제물의 제조에서 화합물, 호변체, 염, 및 혼합물의 사용을 제공한다.
하기의 약어 및 정의는 본 명세서 전체에서 사용된다:
"AML"은 급성 골수성 백혈병을 나타내는 약어이다.
"ALS"는 근위축성 측색 경화증을 나타내는 약어이다.
"AD"는 알츠하이머 병을 나타내는 약어이다.
"APP"는 아밀로이드 선구 단백질을 나타내는 약어이다.
"ASCT"는 자가 줄기 세포 이식을 나타내는 약어이다.
"BM"은 골수를 나타내는 약어이다.
"bFGF"는 염기성 섬유아세포 성장인자를 나타내는 약어이다.
bFGFR로도 일컫는, "FGFR1"는 섬유아세포 성장 인자 FGF와 상호작용하는 티로신 키나아제를 나타내는 약어이다.
"Cdc 2"는 세포 분열 주기 2를 나타내는 약어이다.
"Cdk 2"는 사이클린 의존성 키나아제 2를 나타내는 약어이다.
"Cdk 4"는 사이클린 의존성 키나아제 4를 나타내는 약어이다.
"Chk 1"은 체크포인트 키나아제 1을 나타내는 약어이다.
"CK1ε"은 카세인 키나아제 1(ε)을 나타내는 세린/트레오닌 키나아제이다.
"c-ABL"은 Abelson 백혈병 바이러스로부터 최초에 분리된 발암 생성물을 나타내는 티로신 키나아제에 대한 약어이다.
"C-Kit"은 또한 줄기 세포 인자 수용체 또는 비만 세포 성장 인자 수용체로서 알려져있다.
"FGF"는 FGFR1과 상호작용하는 섬유아세포 성장 인자에 대한 약어이다.
"FGFR3"는 다발성 골수종-형 암에서 종종 발현되는 티로신 키나아제 섬유아세포 성장 인자 수용체 3을 나타내는 약어이다.
"Flk-1"는 태아 간 티로신 키나아제 1를 나타내는 약어이며, 또한 키나아제-삽입 도메인 티로신 키나아제 또는 KDR(인간)으로서 알려져있고, 또한 혈관내피성장인자 수용체-2 또는 VEGFR2(KDR(인간), Flk-1(마우스))로서 알려져있다.
"FLT-1 "는 fms-유사 티로신 키나아제-1을 나타내는 약어이며, 또한 혈관내피성장인자 수용체-1 또는 VEGFR1로서 알려져있다.
"FLT-3"는 fms-유사 티로신 키나아제-3을 나타내는 약어이며, 줄기 세포 티로신 키나아제Ⅰ(STKⅠ)로서 알려져있다.
"FLT-4"는 fms-유사 티로신 키나아제-4를 나타내는 약어이며, 또한 VEGFR3로서 알려져있다.
"Fyn"은 SRC, FGR, YES와 관련된 FYN 발암유전자 키나아제를 나타내는 약어이다.
"GSK-3"은 글리코겐 합성 키나아제 3을 나타내는 약어이다.
"PAR-1"은 디쉐블드 관련 키나아제(disheveled associated kinase)로서 또한 알려진 키나아제를 나타내며, 또한 HDAK로서 알려져있다.
"Lck"는 림프구 특이적 단백질 티로신 키나아제를 나타내는 약어이다.
"MEK1"은 Raf-MEK1-ERK로 형성되는 모듈 내 MAPK(미토겐 활성화된 단백질 키나아제) 신호 전달 경로에서 세린 트레오닌 키나아제를 나타내는 약어이다. MEK1는 ERK(세포 밖의 조절된 키나아제)를 인산화한다.
"MM"은 다발성 골수종을 나타내는 약어이다.
"NEK-2"는 NIM-A 관련 키나아제를 나타내는 약어이다.
"NIM-A"은 유사분열 내에서 네버 인 미토시스를 나타내는 약어이다.
"PDGF"는 혈소판 유래 성장 인자를 나타내는 약어이다. PDGF는 티로신 키나아제 PDGFRα 및 PDGFRβ와 상호작용한다.
"Rsk2"는 리보솜 S6 키나아제 2를 나타내는 약어이다.
"Raf"는 MAPK 신호전달 경로에서 세린/트레오닌 키나아제이다.
"RTK"는 수용체 티로신 키나아제를 나타내는 약어이다.
"Tie-2"는 Ⅰg 및 EGF 동족 도메인을 갖는 티로신 키나아제를 나타내는 약어이다.
"VEGF"는 혈관 내피 성장 인자를 나타내는 약어이다.
"VEGF-RTK"는 혈관 내피 성장 인자 수용체 티로신 키나아제를 나타내는 약어이다.
문구 "전이"는 종양으로부터 신체의 다른 부분으로 암 세포가 퍼진 것을 나타낸다. 암 세포는 임파계 또는 혈류의 방법으로 일반적으로 전신에 퍼진다.
전이 종양의 성장 억제는 종양 성장의 억제 및/또는 종양으로부터 기원된 암 세포의 전신 억제를 나타내도록 의미된다.
일반적으로, 수소 또는 H와 같은 특정 원소에 대한 언급은 이런 원소의 모든 동위원소를 포함하도록 의미된다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물 상의 기가 누락되어 있거나 H로서 보여진다면, 이는 수소 또는 H, 듀테륨, 트리튬을 포함하도록 정의된다.
문구 "1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기"는 헤테로 원자를 함유하지 않고, 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기를 나타낸다. 또한 문구는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실등과 같은 직쇄 알킬기를 포함한다. 문구는 또한 예로써 제공되는 하기를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 직쇄 알킬기의 분지쇄 이성질체를 포함한다: -CH(CH3)2, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH(CH2CH3)2, -C(CH3)3, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH(CH2CH3)2, -CH2C(CH3)3, -CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2C(CH3)3, -CH(CH3)CH2CH(CH3)2,등. 일부 구체예에서, 알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직선형 및 가지형 사슬 알킬기를 포함한다. 다른 구체예에서, 알킬기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 알킬기는 1 내지 2개의 탄소 원자(메틸 또는 에틸기)를 갖는 직선형 알킬기이다. 또 다른 구체예에서, 알킬기는 오직 1개의 탄소원자를 가지며, 메틸기(-CH3)이다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 무기염기, 유기염기, 무기산, 유기산 또는 염기성 또는 산성 아미노산과의 염을 포함한다. 무기 염기의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 나트륨 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속; 칼슘 및 마그네슘 또는 알루미늄과 같은 알칼리 토금속; 및 암모니아를 포함한다. 유기염기의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 및 트리에탄올아민을 포함한다. 무기산의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 염산, 질산, 황산, 및 인산을 포함한다. 유기산의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 락트산, 시트르산, 숙신산, 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 및 p-톨루엔설폰산을 포함한다. 염기성 아미노산의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 아르기닌, 리신 및 오르니틴을 포함한다. 산성 아미노산은 예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 암 환자와 같은 대상에서 전이암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 암은 유방암, 간암, 폐암, 또는 전립선암이다. 다른 구체예에서, 전이암을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 전이 종양을 갖는 대상을 치료하는 방법이 제공된다. 부가적인 구체예는 혈액 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 구체예는 고체 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유효한 양의 화학식 I의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 혼합물을 필요로하는 대상에 투여하는 것을 포함한다. 화학식 I은 하기의 식을 갖는다:
(화학식 I)
Figure 112007061604479-pct00006
상기식에서,
A는 하기의 구조 중의 하나를 갖는 기이다:
Figure 112007061604479-pct00007
상기식에서,
R1은 H 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기로부터 선택되고,
일부 구체예에서, 암 또는 전이 종양의 성장은 화학식 I의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 혼합물의 투여 후에 억제된다.
일부 구체예에서, R1은 메틸기이고, 그리고 화학식 I의 화합물은 화학식 IA를 갖는다.
(화학식IA)
Figure 112007061604479-pct00008
일부 구체예에서, R1은 수소이고, 그리고 화학식 I의 화합물은 화학식IB를 갖는다.
(화학식IB)
Figure 112007061604479-pct00009
일부 구체예에서, R1은 메틸기이고, 그리고 화학식I의 화합물은 화학식IC를 갖는다.
(화학식IC)
Figure 112007061604479-pct00010
다른 구체예는 화학식 IA, IB 또는 IC의 화합물을 갖는 전이 종양과 접촉하는 것을 포함하는 전이 종양을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 화합물은 전신에 투여된다. 더 구체적으로 화학식 I는 경구적 또는 정맥주사로 투여된다.
일부 구체예에서, 두번째 약제가 대상에 투여된다. 더 구체적으로 두번째 약제는 비스포스포네이트와 같은 골다공증의 치료를 위한 약제이다. 다른 구체예에서 두번째 약제는 항암제이다.
일부 구체예에서, 화합물은 화학식 I, IA, IB 또는 IC의 화합물이며, 그리고 화합물의 락트산염 또는 호변체가 대상에 투여된다.
일부 구체예에서, 화학식 I, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 혼합물의 투여 후에 대상에서 생존률이 연장된다.
다양한 전이 종양은 본 발명에 따라 치료될 수도 있다. 혈액 종양 및 암의 예들은, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 종양은 다발성 골수종이며, 대상은 t(4;14) 염색체 전위가 있는 다발성 골수종 환자이다.
일부 구체예에서, 종양은 다발성 골수종이고, 대상은 다발성 골수종 환자이며, 그리고 다발성 골수종은 섬유아세포 성장인자 수용체 3을 발현한다.
일부 구체예에서, 종양은 다발성 골수종이고, 대상은 다발성 골수종 환자이며, 그리고 다발성 골수종은 환자의 골수와 같은 환자의 뼈에 전이되었다. 본 발명의 화합물이 뼈에 집중되기 때문에, 이들은 전이된 혈액 종양에서 특히 유용하고 효과가 있다.
일부 구체예에서, 종양은 고체 종양이다. 다른 구체예에서, 환자는 유방암, 간암, 폐암 또는 전립선 암을 겪고 있다. 그런까닭에, 일부 구체예에서, 암 또는 종양은 유방암이다. 다른 구체예에서, 암 또는 종양은 간암이다. 또 다른 구체예에서, 암 또는 종양은 폐암이다. 또 다른 구체예에서, 암 또는 종양은 전립선 암이다. 다른 구체예에서, 환자는 위암, 자궁내막암, 타액선암, 부신암, 비소세포폐암, 췌장암, 신암, 난소암, 복막암, 전립선암, 두경부암, 방광암, 직장암, 또는 아교모세포종을 겪고 있다. 본원에 기재된 방법은 어떤 이러한 암의 치료에서 유용하다. 방법들은 환자의 뼈에 전이된 전립선 암을 치료하는 것과 같은 뼈에 전이된 암을 치료하는데 특히 유용하다.
일부 구체예에서, 본 발명은 뼈에 전이된 암이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 암은 혈액 또는 고체 종양일 수도 있다. 일부 구체예에서, 암은 다발성 골수종이고, 그리고 다른 구체예에서는 전립선 암이다.
일부 구체예에서, 종양은 다발성 골수종이고, 대상은 다발성 골수종 환자이며, 그리고 환자는 인간이다.
일부 구체예에서, 종양은 급성 골수성 백혈병(AML)이고, 대상은 급성 골수성 백혈병 환자이다. 일부 구체예에서, 대상은 포유동물이며, 일부 구체예에서, 이는 인간이고, 다른 구체예에서는 개 또는 고양이이다.
일부 구체예에서, 종양은 전립선 암이고, 대상은 전립선 암 환자이며, 전립선 암은 환자의 뼈에 전이되었다.
일부 구체예에서, 종양은 전립선 암이고, 대상은 전립선 암 환자이고, 그리고 환자는 인간이다.
한가지 측면에서, 본 발명은 본 발명의 어떤 방법의 일부 구체예에서 사용을 위한 약 또는 약학 조제물의 제조에서 화학식 I, IA, IB 및/또는 IC의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 혼합물의 사용을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 화학식 I, IA, IB 및/또는 IC의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 혼합물을 포함하는 함유자를 포함하는 키트를 제공한다. 이 키트는 전이된 암 또는 종양을 치료하는데 사용되는 다른 화합물을 포함할 수도 있다. 이 키트는 추가적으로 본 발명의 방법을 항상 수행하기 위한 방향으로 기재된 설명을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 설명서는 키트의 용기로부터 분리된 종이 문서로서 함유될 수도 있고, 반면에 다른 구체예에서, 설명서는 키트의 용기에 부착된 라벨상에 기재될 수도 있다.
화학식 I의 화합물은 본원에서 전체적으로 제시된 바와 같은 정도로 전체가 모든 목적을 위해 참고로써 포함되는 후술하는 실시예 부분과 하기의 문헌에 기재되는 과정을 사용하여 용이하게 합성된다: 미국 특허 번호 6,605,617호, 미국 공개 특허 번호 2004/0092535호, 미국 특허출원 번호 10/983,174, 미국 공개 특허 번호 2004/0220196, 미국 특허출원 번호 10/982,757, 및 U.S. 미국 특허출원 번호 10/982,543.
화학식 I의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 및 혼합물은 약을 제조하는데 사용될 수도 있고, 본원에 기재된 목적을 위하여 사용될 수도 있으며, 그리고 본원에 기재된 바와 같은 다양한 생물학적 조건을 처리하는데 사용될 수도 있다.
약학 조제물은 어떤 화합물, 호변체 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 조합한 상기 기재된 어떤 구체예의 염을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 전이된 암과 연관된 질병을 치료하거나 개선하기 위해 본 발명의 하나 이상의 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 혼합물의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 결합제, 희석제 등과 함께 혼합함으로써 제조될 수도 있는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 전이암을 치료하는데 사용되는 조제물을 만드는데 사용될 수도 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 과립, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 좌약, 주사약, 에멀션, 엘릭시르, 현탁액, 또는 용액의 형태일 수 있다. 조성물은 다양한 경로의 투여, 예를 들어 경구 투여, 비강 투여, 직장 투여, 피하 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 또는 복강내 주사를 위해 조제될 수 있다. 하기의 투여 형태는 예로써 주어지며, 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
경구, 구강, 및 설하 투여, 분말, 현탁액, 과립, 정제, 알약, 캡슐, 젤캡, 및 캐플릿은 고체 투약 형태로서 허용가능하다. 이들은 예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 화합물, 약학적으로 허용가능한 염, 호변체, 또는 혼합물을 전분과 같은 적어도 하나의 첨가제 또는 다른 첨가제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 적절한 첨가제 또는 부형제는 수크로오스, 락토오스, 셀룰로오스 당, 만니톨, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 알기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 고무, 아라비아 고무, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 반-합성 폴리머 또는 글리세리드이다. 선택적으로, 경구 투약 형태는 비활성 희석제, 또는 마그네슘 스테아르산염과 같은 윤활제, 또는 파라벤 또는 소르브산과 같은 보존제, 또는 아스코르브산, 토코페롤 또는 시스테인과 같은 항-산화제, 분해 작용제, 결합제, 농축제, 완충제, 감미제, 향미제 또는 방향제의 투여를 돕기 위한 다른 성분을 함유할 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투약 형태는 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액의 형태가 될 수도 있고, 이것은 물과 같은 비활성 희석제를 함유할 수 있다. 약학 조제물 및 약은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 오일, 물, 알코올, 및 이들의 조합과 같은 멸균 액체를 사용하여 액체 현탁액 또는 용액으로서 제조될 수도 있다. 약학적으로 적절한 계면활성제, 부유제, 유화제는 경구 또는 비경구 투여를 위해 첨가될 수도 있다.
상기에서 주목한 바와 같이, 현탁액은 오일을 포함할 수도 있다. 이러한 오일은 땅콩유, 참기름, 면실유, 옥수수유 및 올리브유를 포함하지만 이것으로 제한되지는 않는다. 현탁액 제제는 또한 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세리드 및 아세틸화 지방상 글리세리드와 같은 지방산의 에스테르를 함유할 수도 있다. 이것으로 제한되지는 않지만, 폴리(에틸렌글리콜)과 같은 에테르, 미네랄 오일 및 광유와 같은 석유 탄화수소; 및 물은 또한 현탁액 조제물에서 사용될 수도 있다.
비강 투여를 위해서, 약학 조제물 및 약은 적절한 용매 및 이것으로 제한되지는 않지만, 안정화제, 항균제, 항산화제, pH 변경제, 계면활성제, 생물학적 이용가능성 변경제 및 이들의 조합과 같은 선택적으로 다른 화합물을 함유하는 스프레이 또는 에어로졸이 될 수도 있다. 에어로졸 조제물을 위한 추진제는 압축 공기, 질소, 탄소 디옥시드, 또는 탄화수소 기반된 낮은 비등 용매를 포함할 수도 있다.
주사가능한 투약 형태는 일반적으로 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 제조될 수 있는 수성 현탁액 또는 오일 현탁액을 포함한다. 주사가능한 형태는 용액 상 또는 현탁액의 형태일 수 있으며, 이것은 용매 또는 희석제와 함께 제조된다. 허용가능한 용매 또는 부형제는 멸균수, 링거액, 또는 등장 수성 식염수를 포함한다. 또 다르게는, 멸균 오일은 용매 또는 현탁제로서 사용될 수도 있다. 바람직하게는, 오일 또는 지방산은 천연 또는 합성 오일, 지방산, 모노-, 디- 또는 트리-글리세리드를 포함하는 비-휘발성이다.
주사를 위해, 약학 조제물 및/또는 약제는 상기 기술한 바와 같이 적절한 용액으로 재구성에 적합한 분말일 수 있다. 이들의 예는 동결 건조, 회전 건조 또는 스프레이 건조 분말, 비결정질 분말, 과립, 침전물, 또는 미립자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 주사를 위해서, 조제물은 선택적으로 안정화제, pH 변경제, 계면활성제, 생물학적 이용가능 변경제 및 이들의 조합을 함유할 수 있다.
직장 투여를 위해서, 약학 조제물 및 약제는 소장, S자 결장 만곡부 및/또는 직장에서 화합물의 방출을 위해서 좌약, 연고, 관장, 정제 또는 크림의 형태일 수도 있다. 직장 좌약은 본 발명의 하나 이상의 화합물, 또는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 호변체를 허용가능한 부형제, 예를 들어, 보통의 저장 온도에서 고체 상태로 존재하고, 직장에서와 같은 체내에서 약물을 방출하기에 적절한 온도에서 액체 상태로 존재하는, 코코아 버터 또는 폴리에틸렌 글리콜과 혼합함으로써 제조된다. 오일은 또한 부드러운 젤라틴 형태 및 좌약의 조제물의 제조에 사용될 수도 있다. 물, 염수, 수성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 및 글리세롤은 완충제 및 보존제 뿐 아니라, 펙틴, 카르보머, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스 또는 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 현탁제를 함유할 수도 있는 현탁액 조제물의 제조에 사용될 수도 있다.
상기 기재된 대표적인 투여 형태 이외에, 약학적으로 허용가능한 부형제 및 담체는 일반적으로 당업자들에게 잘 알려져 있고 따라서 본 발명에 포함된다. 이러한 부형제 및 담체는 예를 들어, 본원에서 충분히 제시되는 바와 같이 모든 목적에 대하여 그것의 전체가 참고로서 포함되는["Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)]에서 설명된다.
본 발명의 조제물은 하기 기술되는 바와 같이 단기-작용, 신속-방출, 장기-작용, 및 지속-방출이 되도록 설계될 수도 있다. 따라서, 약학 조제물은 또한 억제 방출 또는 저속 방출을 위해 제형될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 예를 들어, 마이셀 또는 리포솜, 또는 일부 다른 캡슐화 형태를 포함할 수도 있고, 또는 확장된 방출 형태로 투여되어 장기 저장 및/또는 송달 효과를 제공할 수도 있다. 그런까닭에, 약학 조제물 및 약제는 펠릿 또는 실린더로 압축되고 데포 주사로서 또는 스텐트와 같은 이식물로서 근육내로 또는 피하로 이식될 수도 있다. 이러한 이식물들은 실리콘 및 생분해성 폴리머와 같은 공지된 비활성 물질을 사용할 수도 있다.
구체적인 투약은 질환의 상태, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 및 대상의 식이, 투약 간격, 투여 경로, 배설율, 및 약물의 조합에 따라서 조절될 수도 있다. 유효량을 함유하는 상기 투약 형태 중 어떤 것은 일상적인 실험의 경계내에 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 있다.
치료적으로 효과적인 투여는 투여의 경로 및 투약 형태에 따라 변할 수 있다. 바람직한 화합물 또는 본 발명의 화합물들은 높은 치료 지수를 나타내는 조제물이다. 치료 지수는 LD50 및 ED50 사이의 비율로 나타낼 수 있는 독성 및 치료 효과 사이의 투여량 비이다. LD50은 모집단의 50%에 치사인 투여량이고, ED50은 모집단의 50%에 치료적으로 유효한 투여량이다. LD50 및 ED50은 동물 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 과정에 의해 결정된다.
본 발명의 문맥내에서 "치료하는 것"은 질환 또는 질병과 관계된 증상의 완화, 또는 그러한 증상의 추가적 진행 또는 악화의 정지, 질병 또는 질환의 저지 또는 예방을 의미한다. 예를 들어, 전이된 종양을 갖는 환자를 치료하는 관계에 있어서는, 성공적인 치료는 종양 또는 병든 조직에 영양을 공급하는 모세혈관의 증식의 감소, 암 성장 또는 종양과 관련된 증상, 모세혈관의 증식 또는 병든 조직의 완화, 모세혈관 증식의 정지, 또는 암과 같은 질병의 진행 또는 암세포의 성장에서 정지를 포함할 수도 있다. 치료는 또한 다른 치료제와 조합하여 본 발명의 약학 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 및 약학 조제물은 외과수술 과정 및/또는 방사선 치료 전, 동안 또는 후에 투여될 수도 있다. 본 발명의 화합물은 또한 안티센스 및 유전자 치료에 사용된 것들을 포함하여, 다른 항암 약물과 함께 투여될 수 있다. 적절한 조합은 암 연구 및 의약 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따르는 약학 조제물 및 약은 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 화학식 I의 화합물 또는 호변체, 염, 또는 혼합물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 약제 및 약학 조제물을 제조하는데 사용될 수도 있다. 이러한 약제 및 약학 조제물은 본원에 기재된 치료 방법에서 사용될 수도 있다.
본 발명의 화합물 및 조제물은 캄토테신, 독소루비신, 시스플라틴, 이리노테칸(CPT-11), 알킬화제, 토포이소머라아제Ⅰ 및 Ⅱ 억제제와 같은 항암 약물과 조합하여 사용될 때 상승효과를 나타내도록 보여졌던 바와 같은 치료 및 방사선 치료와 조합에서 사용에 특히 적합하다. 그런 까닭에, 본 발명은 항암 약물과의 조합에서 화학식 I의 화합물 그리고 호변체, 염 및/또는 혼합물을 포함하는 약학 조제물을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 조제물 및 약을 만드는 화합물, 호변체, 염 및/또는 혼합물의 사용을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 추가적인 항암 약물을 투여함으로써 전이암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 이마티닙 메실레이트(Gleevec), BAY43-9006, 브로스탈리신(Brostallicin), 레날리도마이드(Revlimid), 탈리도마이드(Thalomid), 도세탁셀(Taxotere), 엘로티닙(Tarceva), 바탈리닙(vatalinib (PTK-787)), VEGF-트랩, 펜레디딘(fenretidine), 볼테조미브(bortezomib), 베바시주맙(bevacizumab(Avastin)), 퍼투주맙(Pertuzumab), 및/또는 리툭시맙(rituximab), 및 본 발명의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 염, 호변체의 염, 혼합물, 또는 화합물, 호변체, 화합물의 염, 호변체의 염, 또는 혼합물을 포함하는 약학 조성물로부터 선택되는 항-암 약물을 필요한 대상에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 화합물은 대상의 변종을 치료하는데 사용될 수도 있다. 적당한 대상은 포유동물 및 인간과 같은 동물을 포함한다. 적당한 포유동물은, 이에 한정되지는 않지만 여우원숭이, 유인원, 및 원숭이와 같은 영장류; 랫트, 마우스, 및 기나아피그와 같은 설치류; 집토끼(rabbit) 및 산토끼(hare); 암소; 말; 돼지; 염소; 양; 유대류; 및 고양이과, 개과 및 곰고 같은 육식동물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 대상 또는 환자는 인간이다. 다른 구체예에서, 대상 또는 환자는 마우스 또는 랫트와 같은 설치류이다. 일부 구체예에서, 대상 또는 환자는 인간 이외의 동물이며, 어떤 이러한 구체예에서, 대상 또는 환자는 인간 이외의 포유동물이다.
본 발명에 사용되는 화합물은 호변체화 현상을 보일수도 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 내 화학 화학식은 단지 가능한 호변체 형태 중 하나를 나타낼 수 있으므로, 본 발명이 도시된 화학식의 어떤 호변체 형태를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 화학식 IA는 하기에서 하나의 호변체, 호변체 I로 나타낸다:
(화학식 I)
Figure 112007061604479-pct00011
Figure 112007061604479-pct00012
화학식IA의 다른 호변체, 호변체Ib 및 호변체 Ic를 하기에 나타낸다:
Figure 112007061604479-pct00013
Figure 112007061604479-pct00014
따라서 일반적으로 설명된 본 발명은 하기의 실시예를 참고함으로써 보다 용이하게 이해될 수 있고, 이는 실례로써 제공하고자 하는 것이며, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
하기의 약어는 화학 용어에 대하여 본 명세서 전반적으로 사용된다:
ATP: 아데노신 트리포스페이트
Boc: N-tert-부톡시카르보닐
BSA: 우 혈청 알부민
DMSO: 디메틸술폭시드
DTT: DL-디티오트레이톨
ED50: 모집단 중 50%에서 치료적으로 효과적인 투여량
EDTA: 에틸렌 디아민 테트라아세트산
EtOH: 에탄올
HPLC: 고압 액체 크로마토그래피
IC5O값: 측정된 활성의 50% 감소를 야기하는 억제제의 농도.
KHMDS: 칼륨 비스(트리메틸실릴)아미드
LC/MS: 액체 크로마토그래피/질량 분광기
THF: 테트라히드로푸란
화합물의 정제 및 특성화
본 발명의 화합물을 2690 분리 보듈(Milford, Massachusetts)을 갖는 워터 밀레니엄 크로마토그래피 시스템을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 특성화하였다. 분석 컬럼은 Alltech (Deerfield, Illinois)로부터의 Alltima C-18 역상, 4.6 x 250 mm였다. 기울기 용리는 전형적으로 5% 아세토니트릴/95% 물로 출발하고, 40분의 기간에 걸쳐서 100% 아세토니트릴로 진행시키는 것을 사용하였다. 모든 용매는 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)를 함유하였다. 화합물은 220 또는 254nm의 자외선(UV) 흡광에 의해 검출되었다. HPLC 용매는 Burdick and Jackson (Muskegan, Michigan), 또는 Fisher Scientific (Pittsburg, Pennsylvania)으로부터 왔다. 일부 예에서, 순도는 예를 들어, Baker-Flex 실리카 겔 1 B2-F 가요성 시트와 같은 유리 또는 플라스틱을 댄 실리카 겔 플레이트를 사 용하여 얇은 층 크로마토그래피(TLC)에 의해 평가하였다. TLC결과는 자외선하에서 시각적으로, 또는 주지된 요오드 증기 및 다른 각종 염색 기술을 사용하여 용이하게 검출하였다.
질량 분석을 2개의 LCMA 기구 중 하나 상에서 수행하였다: 워터스 시스템(Alliance HT HPLC 및 Micromass ZQ 질량 분광계; 컬럼: Eclipse XDB-C18, 2.1 x 50 mm; 용매 시스템: 0.05% TFA를 갖는 물 중 5-95% 아세토니트릴; 유속 0.8mL/분; 분자량 범위 150-850; Cone Voltage 20V; 컬럼 온도 4O℃) 또는 휴렛 팩커드 시스템(Series 1100 HPLC; 컬럼: Eclipse XDB-C18, 2.1 x 50 mm; 용매 시스템: 0.05% TFA를 갖는 물 중 1-95% 아세토니트릴; 유속 0.4 mL/분; 분자량 범위 150-850; Cone Voltage 50V; 컬럼 온도 30℃). 모든 분자량은 양자화 부모 이온의 것과 같은 것으로 보고된다.
GCMS 분석을 휴렛 팩커드 기구(질량 선택 검출자 5973을 갖는 HP6890 시리즈 기체 크로마토그래피; 주사기 부피: 1μL; 초기 컬럼 온도: 50℃; 최종 컬럼 온도: 250℃; 램프 시간: 20분; 기체 유속: 1mL/minute; 컬럼: 5% 페닐 메틸 실옥산, 모델 #HP 190915-443, 디멘션: 30.0m x 25μm x 0.25μm)상에서 수행하였다.
예비적 분리를 Flash 40 크로마토그래피 시스템 및 KP-Sil, 6OA (Biotage, Charlottesville, Virginia), 또는 C-18 역상 컬럼을 사용하는 HPLC를 사용하여 수행하였다. Flash 40 Biotage 시스템을 위해 사용하 전형적인 용매는 디클로로메탄, 메탄올, 에틸 아세테이트, 헥산 및 트리에틸아민이었다. 역상 HPLC에 대하여 사용된 전형적인 용매는 다양한 농도의 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 갖는 물이었다.
4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸피페라진 -1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일-1H-퀴놀린-2-온의 합성
Figure 112007061604479-pct00015
A. 5-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-2- 니트로아닐린
과정 A
Figure 112007061604479-pct00016
5-클로로-2-니트로아닐린(500g, 2.898mol) 및 1-메틸 피페라진(871g, 8.693 mol)을 농축기가 구비된 2000mL 플라스크에 넣었고, N2로 정화하였다. 플라스크를 100℃ 오일욕에 넣었고 5-클로로-2-니트로아닐린이 HPLC에 의해 결정되는 바와 같이 완전히 반응될 때까지 가열하였다(전형적으로 밤새). 5-클로로-2-니트로아닐린의 소멸을 HPLC로 확인한 후에, 반응 혼합물(여전히 따뜻함)을 기계적인 교반을 하면서 2500mL의 실온수에 직접 부었다. 결과 혼합물을 그것이 실온에 도달할 때까지 교반하였고, 그 후 그것을 여과하였다. 획득한 황색 고체를 1000mL의 물에 첨가하였고, 30분동안 교반하였다. 결과 혼합물을 여과하였고, 그리고 결과 고체를 TBME(500mL, 2X)로 세척하였고 그 후 러버댐 하에서 건조하였다. 결과 고체를 건조 트레이로 이동시켰고 50℃에서 진공오븐에서 건조시켜 황색 분말로서 670g(97.8%)의 표제 화합물을 얻었다.
과정 B
5-클로로-2-니트로아닐린(308.2g, 1.79mol)을 상단 교반기, 농축기, 가스 유입구, 첨가 깔대기, 및 온도계 탐침을 구비한 4-구 5000mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 그 후 N2로 정화하였다. 1-메틸피페라진(758.1g, 840mL, 7.57mol) 및 200 표준 강도 에탄올(508mL)을 교반하면서 반응 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 다시 N2로 정화하였고, N2 하에서 반응을 유지하였다. 플라스크를 97℃(+/-5℃)의 내부 온도로 가열 맨틀에서 가열하였고, HPLC에 의해 결정되는 바와 같이 반응이 완료될 때까지 그 온도에서 유지하였다(전형적으로 약 40시간). 반응이 완료된 후, 가열을 중단하였고, 교반하면서 내부온도를 약 20℃ 내지 25℃로 냉각시켰고, 반응을 2 내지 3시간동안 교반하였다. 침전이 이미 발생하지 않았으면 시드결정(0.20 g, 0.85 mmol) 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린을 반응 혼합물에 첨가하였다. 물(2,450 mL)을 내부 온도가 약 20℃ 내지 30℃의 범위의 온도로 유지시키면서 약 1 시간의 기간에 걸쳐서 교반된 혼합물에 첨가하였다. 물의 첨가를 완료한 후에, 반응 혼합물을 약 1 시간 동안 20℃ 내지 30℃의 온도에서 교반하였다. 후속하여 결과 혼합물을 여과하였고, 플라스크 및 필터 케이크를 물(3 x 2.56L)로 세척하였다. 금빛 황색 고체 생성물을 진공하에서 약 50℃ 진공오븐에서 416g(98.6% 수율)의 일정 중량까지 건조하였다.
과정 C
5-클로로-2-니트로아닐린(401g, 2.32mol)을 상부 교반기, 농축기, 가스 유입구, 첨가 깔대기, 및 온도계 탐침을 구비한 4-구 12L 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 후속하여 플라스크를 N2로 정화하였다. 1-메틸피페라진(977g, 1.08L, 9.75mol) 및 100% 에탄올(650mL)를 교반하면서 반응 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 다시 N2로 정화하였고, 반응을 N2하에서 유지하였다. 플라스크를 97℃(+/-5℃)의 내부 온도로 가열 맨틀에서 가열하였고 HPLC에 의해 결정되는 바와 같이 반응이 완료될 때까지(전형적으로 약 40시간) 그 온도에서 유지하였다. 반응이 완료된 후, 가열을 중단하였고 교반하면서 약 80℃의 내부 온도로 반응을 냉각시켰고, 물(3.15L)을 내부온도가 82℃(+/-3℃)에서 유지되는 동안 1시간의 기간에 걸쳐서 첨가 깔대기를 통해서 혼합물에 첨가하였다. 물의 첨가를 완료한 후, 가열을 중지하였고 20-25℃의 내부 온도로 4시간 이상의 기간에 걸쳐 반응 혼합물을 냉각하도록 허용하였다. 반응 혼합물을 그 후 20-30℃의 내부 온도에서 추가 시간 동안 교반하였다. 후속하여 결과 혼합물을 여과하였고, 플라스크 및 필터 케이크를 물(1 x 1L), 50% 에탄올(1 x 1 L), 및 95% 에탄올(1 x 1 L)로 세척하였다. 금빛 황색 고체 생성물을 건조 팬에 넣고 진공 오븐 약 50℃에서 진공하에 546g (99% 수율)의 일정 중량까지 건조시켰다.
B. [6-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]-아세트산 에틸 에스테 르의 합성
과정 A
Figure 112007061604479-pct00017
5000mL, 4-구 플라스크에 교반기, 온도계, 농축기, 및 가스 유입구/유출구로 구비하였다. 설치한 플라스크를 265.7g(1.12mol. 1.0eq)의 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린 및 2125mL의 200 표준 강도 EtOH로 채웠다. 결과 용액을 N2로 15분 동안 정화하였다. 다음에, 20.0g의 5% Pd/C(50% H2Ow/w)를 첨가하였다. H2를 혼합물을 통해 버블링 하면서 반응을 40-50℃(내부 온도)에서 격렬하게 교반하였다. 반응을 HPLC에의해 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린이 소멸되는 것을 시간마다 모니터하였다. 전형적인 반응 시간은 6시간이었다.
모든 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린이 반응으로부터 사라진 후에, 용액을 N2로 15분동안 정화하였다. 다음에, 440.0g(2.25mol)의 에틸 3-에톡시-3-이미노프로파노에이트 히드로클로라이드를 고체로서 첨가하였다. 40-50℃(내부 온도)에서 반응이 완료될 때 까지 교반하였다. 반응을 HPLC에 의해 디아미노 화합 물이 소멸되는 것에 따라서 모니터링하였다. 전형적인 반응 시간은 1 내지 2시간이었다. 반응이 완료된 후, 그것을 실온으로 냉각시켰고, 셀라이트 여과 물질의 패드를 통해서 여과하였다. 셀라이트 여과 물질을 무수 EtOH(2 x 250 mL)로 세척하였고, 여과액을 감압하에 농축시켜 진한 갈색/오렌지 오일을 얻었다. 결과 오일을 850mL의 0.37% HCl 용액에 녹였다. 고체 NaOH(25g)를 그 후 한번에 첨가하였고, 침전물이 형성되었다. 결과 혼합물을 1시간 동안 교반하였고, 그 후 여과하였다. 고체를 H2O(2 x 400 mL)로 세척하였고, 50℃ 진공오븐에서 건조시켜 251.7g(74.1 %)의 연한 황색 분말로서 [6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르를 제공하였다.
과정 B
5000mL, 4-구 재킷 플라스크는 기계적 교반기, 농축기, 온도 탐침, 가스 유입구, 및 오일 버블러를 구비하였다. 설치된 플라스크를 300g(1.27mol)의 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린 및 2400mL의 200 표준 강도 EtOH로 채웠다(반응은 95% 에탄올로 수행될 수 있고 수행되었고, 이 반응을 위해서 200 표준 강도 에탄올을 사용할 필요는 없다). 결과 용액을 교반하였고 15분동안 N2로 정화하였다. 다음에, 22.7g의 5% Pd/C(50% H2O w/w)를 반응 플라스크에 첨가하였다. N2로 정화한 후에, 플라스크를 통해 느리지만, 일정한 H2의 흐름을 유지하면서 반응 용기를 H2로 정화하였다. 반응을 45-55℃(내부 온도)에서 교반하는 동안 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린이 HPLC에 의해 결정되는 바와 같이 완전히 소비될 때까지 H2를 혼합물을 통해 버블링시켰다. 전형적인 반응 시간은 6시간이었다.
모든 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린이 반응으로부터 소멸된 후에, 용액을 15분 동안 N2로 정화하였다. 디아민 중간체는 공기에 민감하기 때문에 공기에 노출되지 않도록 주의하였다. 500g (2.56mol)의 에틸 3-에톡시-3-이미노프로파노에이트 히드로클로라이드를 약 30분의 기간에 걸쳐서 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 HPLC에 의해 결정되는 바와 같이 디아민이 완전히 소비될 때까지 N2하에 45-55℃(내부 온도)에서 교반하였다. 전형적인 반응 시간은 약 2시간이었다. 반응이 완료된 후, 반응물을 셀라이트 패드를 통하여 가온하면서 여과하였다. 후속하여 반응 플라스크 및 셀라이트를 200 표준 강도 EtOH(3 x 285 mL)로 세척하였다. 여과액을 5000mL 플라스크에서 합하였고, 약 3300mL의 에탄올을 진공하에서 제거하여 오렌지 색 오일을 얻었다. 물(530mL) 및 1M HCl을 그 후 결과 오일에 첨가하였고, 그리고 결과 혼합물을 교반하였다. 30% NaOH(200mL)를 약 25-30℃의 내부 온도를 유지하면서 약 20분의 시간에 걸쳐 첨가하면서, 결과 용액을 격렬하게 교반하는 한편, pH를 9와 10 사이로 이르게 하였다. 약 20 내지 25℃에서 내부 온도를 유지시키면서 결과 현탁액을 약 4시간 동안 교반하였다. 결과 혼합물을 여과하였고, 필터 케이크를 H2O(3 x 300 mL)로 세척하였다. 수집된 고체를 50℃에서 진공오븐에서 진공하에 일정 중량으로 건조시켜 연한 황색 분말로서 345.9g(90.1%)의 [6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르를 제공하였다. 또 다른 워크업 과정에서, 여과액을 합하였고, 에탄올을 적어도 약 90%가 제거될 때까 지 진공하에 제거하였다. 후속하여 중성 pH에서 물을 결과 오일에 첨가하였고, 그리고 용액을 약 0℃로 냉각시켰다. 수성 20% NaOH 용액을 그 후 빠르게 교반하면서 서서히 첨가하여 pH가 9.2까지 이르게 하였다(pH 미터로 판독). 결과 혼합물을 그 후 여과하였고, 상기 기술한 바와 같이 건조시켰다. 또 다른 워크업 과정은 97%의 높은 수율로서 밝은 황갈색 내지 밝은 황색 생성물을 얻었다.
[6-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-1H- 벤조이미다졸 -2-일]-아세트산 에틸 에스테르의 물 함량을 감소시키는 방법
이전에 워크업하고 약 8-9%의 H2O 함량으로 건조시킨 [6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르(120.7 그램)를 2000mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 무수 에탄올(500mL)로 용해하였다. 호박색 용액을 모든 용매가 제거될 때까지 가열과 함께 회전 증발기를 사용하여 진한 오일로 농축시켰다. 과정을 2번 더 반복하였다. 이렇게 얻어진 진한 오일을 플라스크에 남기고, 진공오븐에 넣고 50℃에서 밤새 가열하였다. Karl Fisher 분석 결과는 5.25%의 물 함량을 나타내었다. 이 방법에 의해 얻어진 낮은 물 함량은 하기 실시예의 과정에서 증가된 수율을 제공하였다. 톨루엔 및 THF와 같은 다른 용매는 이 건조 과정을 위해 에탄올의 위치에서 사용될 수도 있다.
C. 4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 합성
과정 A
Figure 112007061604479-pct00018
[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르(250g, 820mmol)(상기 기재된 바와 같은 에탄올로 건조됨)는 농축기, 기계적 교반기, 온도 탐침을 구비한 5000mL 플라스크에서 THF(3800mL)에 용해하였고, 아르곤으로 정화하였다. 2-아미노-6-플루오로-벤조니트릴(95.3g, 700mmol)을 용액에 첨가하였고, 내부 온도를 40℃로 올렸다. 모든 고체가 용해되고 용액 온도가 40℃에 도달하였을 때, 고체 KHMDS(376.2g, 1890mmol)를 5분의 기간에 걸쳐서 첨가하였다. 칼륨 염기의 첨가가 완료되었을 때, 불균질 황색 용액을 얻었고, 내부 온도는 62℃로 올라갔다. 60분의 시간 후에, 내부 온도는 다시 40℃로 감소하였고, 반응은 HPLC에 의해 완료된 것으로 결정되었다(어떤 출발 물질 또는 비고리화 중간물이 존재하지 않았다). 진한 반응 혼합물을 그 후 H2O(6000mL) 안으로 쏟고 그것이 실온에 도달할 때까지 결과 혼합물을 교반하여 퀀칭하였다. 혼합물을 그 후 여과하였고, 필터 패트를 물(1000 mL 2X)로 세척하였다. 밝은 황색 고체를 건조 트레이에 넣었고 진공오븐 내 50℃에서 밤새 건조시켜 155.3g (47.9%)의 바람직한 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온을 제공하였다.
과정 B
5000mL 4-구 재킷 플라스크는 증류 장치, 온도 탐침, N2 가스 유입구, 첨가 깔대기, 및 기계적 교반기를 구비하였다. [6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르(173.0g, 570mmol)를 반응기 안으로 채웠고, 그리고 반응기를 N2로 15분 동안 정화하였다. 건조 THF(2600 mL)를 그 후 교반과 함께 플라스크에 채웠다. 모든 고체를 용해시킨 후에, 용매를 필요하다면 가열을 사용하여 증류(진공 또는 대기(더 높은 온도는 물을 제거하는 것을 돕는다))에 의해 제거하였다. 1000mL의 용매를 제거한 후에, 증류를 멈추고 반응을 N2로 정화하였다. 1000mL의 건조 THF를 그 후 반응 용기에 첨가하였고, 그리고 모든 고체가 용해되었을 때, 다른 1000mL의 용매가 제거될 때까지 증류(진공 또는 대기)를 다시 수행하였다. 건조 THF를 첨가하고 용매를 제거하는 이 과정을 적어도 4번 반복하였고(4번째 증류에서는, 첫번째 3 증류에서의 단지 40% 대신에, 60%의 용매가 제거된다), 그 후 물 함량을 결정하기 위한 Karl Fischer 분석을 위해 1mL 샘플을 제거하였다. 만약 분석이 샘플이 0.20% 미만의 물을 함유한다는 것으로 나타내면, 다음 단락에 기술하는 바와 같이 반응을 계속하였다. 그러나, 만약 분석이 0.20% 이상의 물을 보인다면, 그 후 0.20% 미만의 물 함량을 달성할 때까지 상기 기재된 건조 과정을 계속하였다.
이전 단락에서 기술한 과정을 과정을 사용하여 약 0.20% 이하의 물 함량이 달성된 후에, 증류 장치를 환류 농축기로 대체하였고, 반응을 2-아미노-6-플루오로-벤조니트릴(66.2 g, 470 mmol)로 채웠다(일부 과정에서 0.95당량이 사용된다). 반 응을 그 후 38-42℃의 내부 온도로 가열하였다. 내부 온도가 38-42℃에 도달하였을 때, KHMDS 용액(1313g, 1.32mol, THF 중의 20% KHMDS)을 첨가하는 동안 약38-50℃에서 내부 온도를 유지하면서 5분의 기간에 걸쳐서 첨가 깔대기를 통해 반응에 첨가하였다. 칼륨 염기의 첨가가 완료되었을 때, 38-42℃에서 내부 온도를 유지하면서 반응을 3.5 내지 4.5시간 동안 교반하였다(일부 실시예에서 그것을 30 내지 60분 동안 교반하였고 반응은 그 시간내에 완료될 수도 있다). 후속하여 반응 샘플을 제거하였고 HPLC에 의해 분석하였다. 만약 반응이 완료되지 않았다면, 추가로 KHMDS 용액을 플라스크에 5분의 기간에 걸쳐서 첨가하였고 반응을 38-42℃에서 45-60분동안 교반하였다(첨가된 KHMDS 용액의 양은 하기에 의해 측정되었다: 만약 IPC 비가 <3.50이라면, 그 후 125mL를 첨가하였고; 만약 10.0≥IPC 비율>3.50이며, 그 후 56mL를 첨가하였고; 만약 20.0≥IPC 비≥10이면, 그 후 30mL를 첨가하였다). IPC 비는 비고리화 중간체에 해당하는 영역으로 나눈 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온에 해당하는 영역과 동일하다). 일단 반응이 완료되면(IPC 비율 > 20), 25-30℃의 내부 온도로 반응기를 냉각시켰고, 25-35℃의 내부 온도를 유지하면서 물(350mL)을 15분의 시간에 걸쳐 반응기 안으로 채웠다(하나의 대안에서, 반응을 40℃에서 수행하고 물을 5분 내에 첨가한다. 더 빠른 퀀칭은 시간이 지나면서 형성되는 불순물의 양을 줄인다). 환류 농축기를 그 후 증류장치로 대체하였고, 필요하다면 가열을 사용하여 증류(진공 또는 대기)에 의해 용매를 제거하였다. 1500mL의 용매를 제거한 후에, 증류를 중단하였고, 반응을 N2로 정화하였다. 그 후 내부 온도를 20-30℃에서 유지하면서 물(1660mL)을 반응 플라스크에 첨가하였다. 그 후 반응 혼합물을 20-30℃에서 30분 동안 교반하였고 5-10℃의 내부 온도로 냉각시킨 다음 1시간 동안 교반하였다. 결과 현탁액을 여과하였고, 그리고 플라스크 및 필터 케이크를 물(3 x 650 mL)로 세척하였다. 이렇게 얻어진 고체를 진공오븐 내에 50℃에서 진공하에 일정 중량으로 건조시켜 황색 분말로서 103.9 g (42.6% 수율)의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온을 얻었다.
과정 C
Figure 112007061604479-pct00019
[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르(608 g, 2.01 mol)(건조됨) 및 2-아미노-6-플루오로-벤조니트릴(274g, 2.01mol)을 가열 맨틀상에 고정시키고, 농축기, 기계적 교반기, 가스 유입구 및 온도 탐침를 구비한 4-구 12L 플라스크에 채웠다. 반응 용기를 N2로 정화하였고, 톨루엔(7.7 L)을 반응 혼합물에 채우는 한편 그것을 교반하였다. 반응 용기를 다시 N2로 정화하였고 N2 하에서 유지하였다. 혼합물의 내부 온도를 63℃(+/-3℃)의 온도가 달성될 때까지 상승시켰다. 혼합물의 내부 온도를 63℃(+/-3℃)에서 유지하는 한편 대략 2.6L의 톨루엔을 감압하에서 플라스크로부터 증류하였다(380 +/- 10 토르, 증류 헤 드 t= 40℃ (+/-10℃)(Karl Fischer 분석을 혼합물 내 물 함량을 체크하기 위하여 사용하였다. 만약 물 함량이 0.03%보다 크다면, 그 후 다른 2.6L의 톨루엔을 첨가하였고 증류를 반복하였다. 0.03% 미만의 물 함량이 얻어질 때까지 이 과정을 반복하였다). 0.03% 미만의 물 함량에 도달한 후에, 가열을 중단하였고, 반응을 N2하에서 17-19℃의 내부 온도로 냉각시켰다. THF 중의 칼륨 t-부톡시드(THF 중의 20%; 3.39kg, 6.04몰 칼륨 t-부톡시드)를 그후 반응의 내부 온도를 20℃ 미만으로 유지하도록 하는 속도에서 N2하에 반응에 첨가하였다. 칼륨 t-부톡시드의 첨가가 완료된 후, 반응을 20℃ 미만의 내부 온도에서 30분 동안 교반하였다. 온도를 그후 25℃로 올렸고, 반응을 적어도 1시간 동안 교반하였다. 온도를 그후 30℃로 올렸고, 반응을 그 후 적어도 30분 동안 교반하였다. 반응을 그 후 출발 물질의 소비에 대해 체크하기 위해 HPLC를 사용하여 완료에 대해 모니터링하였다(전형적으로 2-3 시간에, 출발 물질이 모두 소비되었다(영역 % HPLC에 의해 0.5% 미만)). 만일 반응이 2시간 후에 완료되지 않으면, 다른 0.05 당량의 칼륨 t-부톡시드를 한번에 첨가하였고, 반응이 끝났다는 것을 HPLC가 보여줄 때까지 과정을 완료하였다. 반응이 완료된 후, 650mL의 물을 교반된 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 그 후 50℃의 내부 온도로 가온하였고, THF를 감압하에 반응 혼합물로부터 증류시켰다(부피로 약 3L). 물(2.6L)을 그 후 첨가 깔대기를 사용하여 반응 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 그 후 실온으로 냉각시켰고, 적어도 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 그 후 여과하였고, 필터 케이크를 물(1.2L), 70% 에탄올(1.2L), 그리고 95% 에탄올(1.2L)로 세척 하였다. 밝은 황색 고체를 건조 트레이에 넣고, 일정한 중량이 얻어질 때까지 진공 오븐 내 50℃에서 건조시켜, 674g(85.4%)의 바람직한 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온을 제공하였다.
4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 정제
농축기, 온도 탐침, N2 가스 유입구, 및 기계적 교반기가 구비된 3000mL 4-구 플라스크를 가열 맨틀에 놓았다. 플라스크를 그 후 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온(101.0g, 0.26mol)으로 채우고, 황색 고체를 95% 에탄올(1000mL)에 현탁하였고 교반하였다. 일부 경우에는 8:1 용매비를 사용하였다. 현탁액을 그 후 약 1시간의 기간에 걸쳐 교반하면서 부드러운 환류로 가열하였다(약 76℃의 온도까지). 반응을 그 후 45-75분 동안 교반하는 한편 환류하였다. 이 때에, 플라스크로부터 가열을 제거하였고, 25-30℃의 온도로 현탁액을 냉각하도록 허용하였다. 현탁액을 그 후 여과하였고, 필터 패드를 물(2 x 500 mL)로 세척하였다. 황색 고체를 그 후 건조 트레이에 놓았고, 진공 오븐 내 50℃에서 일정 중량이 얻어질 때까지(전형적으로 16시간) 건조시켜, 황색 분말로서 97.2g(96.2%)의 정제된 생성물을 얻었다.
D. 4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 락트산 염의 제조
Figure 112007061604479-pct00020
3000mL 4-구 재킷 플라스크는 농축기, 온도 탐침, N2 가스 유입구, 및 기계적 교반기를 구비하였다. 반응 용기를 적어도 15분 동안 N2로 정화하였고, 그 후 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온(484g, 1.23mol)으로 채웠다. D,L-락트산(243.3g, 1.72mol의 모노머-하기의 단락 참조), 물(339mL), 및 에탄올(1211mL)의 용액을 제조하였고, 그 후 반응 플라스크에 채웠다. 교반을 중간 속도에서 개시하였고, 그리고 반응을 68-72℃의 내부 온도로 가열하였다. 반응의 내부 온도를 68-72℃에서 15-45분 동안 유지하였고, 그 후 가열을 중단하였다. 결과 혼합물을 10-20 마이크론 프릿을 통해 여과하여 12L 플라스크에 여과액을 수집하였다. 12L 플라스크는 내부 온도 탐침, 환류 농축기, 첨가 깔대기, 가스 유입구 출구, 및 상부 교반기를 구비하였다. 여과액을 그 후 중간 속도로 교반하였고, 환류로 가열하였다(약 78℃의 내부 온도). 부드러운 환류를 유지하면서, 에탄올(3,596mL)을 약 20분의 시간에 걸쳐서 플라스크에 채웠다. 반응 플라스크를 그 후 15-25분 내에 약 64-70℃ 범위의 내부 온도로 냉각시켰고, 이 온도를 약 30분 동안 유지하였다. 반응기를 결정에 대해 조사하였다. 만일 결정이 존재하지 않았다면, 그 후 4-아미노-5-플로오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온(484mg, 0.1mole%)의 락트산 염의 결정을 플라스크에 첨가하였고, 그리고 반응을 64-70℃에서 30분 동안 교반한 후 결정에 대해 플라스크를 다시 검사하였다. 일단 결정이 존재하면, 교반을 낮은 속도로 줄이고 64-70℃에서 추가로 90분 동안 반응을 교반하였다. 반응을 그 후 약 2시간에 걸쳐 약 0℃로 냉각시켰고, 25-50 미크론 프릿화 필터를 통해 결과 혼합물을 여과하였다. 반응기를 에탄올(484 mL)로 세척하였고, 내부 온도가 약 0℃가 될 때까지 교반하였다. 냉각 에탄올을 필터 케이크를 세척하는데 사용하였고, 그리고 이 과정을 2회 이상 반복하였다. 수집된 고체를 50℃에서 진공하 진공 오븐에서 일정 중량으로 건조시켜 510.7g(85.7%)의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 결정성 황색 락트산 염을 얻었다. 전형적으로 러버댐 또는 비활성 조건을 여과 과정 중에 사용하였다. 건조 고체가 강한 흡수성으로 나타나지 않는 반면, 습윤 필터 케이크는 물을 흡수하는 경향이 있으며, 점성이 있다. 습윤 필터 케이크의 대기에 대한 장기 노출을 피하기 위해 예방조치를 취하였다.
상업상의 락트산은 일반적으로 약 8-12% w/w 물을 함유하며, 모노머 락트산에 더하여 다이머 및 트라이머를 함유한다. 락트산 다이머 대 모노머의 몰비는 일반적으로 약 1.0 : 4.7이다. 상업적 등급 락트산은 모노락테이트 염이 우선적으로 반응 혼합물로부터 우선적으로 침전되므로 앞선 단락에 기술된 과정에서 사용될 수도 있다.
대사물질의 확인
본원에 참고로서 포함된 기재된 바와 같은 2주간의 독물학 연구로부터 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온(화합물 1)의 두 가지 대사산물은 확인되었고, 울혈된 래트 혈장의 특징이 있었다. 두 가지 확인된 대사산물은 하기에 보여지는 피페라진 N-옥시드 화합물(화합물 2) 및 N-디메틸화된 화합물(화합물 3)이었다.
Figure 112007061604479-pct00021
Figure 112007061604479-pct00022
화합물 1-3의 IC 50
많은 프로테인 티로신 키나아제의 키나아제 활성을 하기 표에 보여지는 IC50값을 제공하기 위하여 화합물 1-3에 대하여 하기에 제시하는 과정을 사용하여 측정 하였다.
Figure 112007061604479-pct00023
4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸 -4- 옥시도피페라진 -1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]퀴놀린-2(1H)-온( 화합물2 ) 및 4-아미노-5- 플루오로 -3-(6-피페라진-1-일-1H-벤즈이미다졸-2-일)퀴놀린-2(1H)-온( 화합물3 )의 합성
화합물 1의 확인된 대사산물의 구조를 확인하기 위하여, 대사산물을 독립적으로 합성하였다.
화합물 1의 N-옥시드 대사산물인 화합물 2를 하기의 반응식에서 보여지는 바와 같이 합성하였다. 화합물 1을 에탄올, 디메틸아세트아미드 및 과산화수소의 혼합물에서 가열하였다. 반응의 완료 후에, 화합물 2를 여과에 의해 분리하였고, 에탄올로 세척하였다. 필요하다면, 생성물을 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가적으로 정제할 수 있다.
Figure 112007061604479-pct00024
화합물 1의 N-데스메틸 대사산물 화합물 3을 하기의 반응식에서 보여지는 바와 같이 합성하였다. 5-클로로-2-니트로아닐린을 피페라진으로 처리하여 4를 얻었고 그 후에 부틸옥시카르보닐 (Boc) 기로 보호하여 5를 얻었다. 니트로 기의 환원 후에 3-에톡시-3-이미노프로피온산 에틸 에스테르로 농축하여 6을 얻었다. 염기로서 칼륨 헥사메틸디실아지드를 사용하여 6-플루오로안트라닐로니트릴과 함께 6의 농축이 7을 얻었다. 정제하지 않은 7을 수성 HCl로 처리하여 정제 후에 황색/갈색 고체로서 바람직한 대사산물을 얻었다.
Figure 112007061604479-pct00025
분석 과정
세린/트레오닌 키나아제
각종 단백질 세린/트레오닐 키나아제의 키나아제 활성을 ATP 및 인산화를 위한 세린 또는 트레오닌 아미노산 잔기를 함유하는 적당한 펩티드 또는 단백질을 제공하고, 세린 또는 트레오닌 잔기에 대한 포스페이트 부분의 전이를 분석함으로써 측정하였다. GSK-3, RSK-2, PAR-1 , NEK-2, 및 CHK1 효소의 키나아제 도메인을 함유하는 재조합 단백질을 바큘로바이러스(Baculovirus) 발현 시스템(InVitrogen)을 사용하여 Sf9 곤충 세포에서 발현시켰고 Glu 항체 상호작용(Glu-에피토프 태그 구조에 대한 것) 또는 금속 이온 크로마토그래피(His6(SEQ ID NO: 1)태그 구조)을 통해 정제하였다. Cdc2(GST 융합 구조) 및 사이클린 B를 Sf9 곤충 세포에서 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 동시 발현하였다. 재조합, 활성 Cdk2/사이클린 A는 상업적으로 이용가능하고 Upstate Biotechnology로부터 구매하였다. 분석에서 사용된 정제된 Cdc2 효소를 상업적으로 이용가능하였고, 그것을 New England Bio Labs로부터 구매할 수도 있다. 각각의 분석을 위해, 시험 화합물을 DMSO에 연속적으로 희석하였고, 그 후 적절한 키나아제 반응 완충액에 5-10nM의 33P 감마-표지된 ATP를 더하여 혼합하였다. 키나아제 단백질 및 적절한 비오틴화된 펩티드 기질을 첨가하여 150μL의 최종 부피를 얻었다. 반응을 3-4 시간동안 실온에서 배양하였고, 그 후 100μL의 반응 정지 완충액을 함유하는 스트렙타비딘 코팅된 흰 색 마이크로타이터 플레이트(Thermo Labsystems)로 이동시킴으로써 정지시켰다. 반응 정지 완충액은 50mL 비표지 ATP 및 30mL EDTA로 구성된다. 1시간의 배양 후에, 스트렙타비딘 플레이트를 PBS로 세척하였고, 200μL 마이크로신트(Microscint) 20 섬광 유체를 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 봉인하였고 TopCount를 사용하여 카운팅하였다. 각 화합물의 50% 억제(IC50)에 대한 농도를 XL Fit 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀에 의해 계산하였다.
반응 완충액은 트리스-HCl2 pH 7.5, 10 mM MgCl2, 2mM DTT, 4mM EDTA, 25mM 베타-글리세로포스페이트, 5mM MnCl2, 0.01% BSA/PBS, 0.5μM 펩티드 기질, 및 1μM 비표지 ATP를 함유하였다. GSK-3 효소 27nM, CHK1 5nM, Cdc2 1nM, Cdk2 5nM, 및 Rsk2 0.044 단위/mL에서 사용하였다. GSK-3 분석에 대하여, 비오틴-CREB 펩티드(비오틴-SGSGKRREILSRRP(pS)YR-NH2(SEQ ID NO:4))를 사용하였다. CHK1 분석에 대하여, 비오틴-Cdc25c 펩티드(비오틴-[AHX]SGSGSGLYRSPSMPENLNRPR[CONH2](SEQ ID NO:5))를 사용하였다. Cdc2 및 Cdk2 분석에 대하여, 비오틴-히스톤 H1 펩티드([lc비오틴]GGGGPKTPKKAKKL[CONH2](SEQ ID NO:6))을 첨가하였다. Rsk2 분석에서, 비오틴-p70 펩티드, 15mL MgCl2, 1mM DTT, 5mM EDTA, 2.7μM PKC 억제제 펩티드, 및 2.7μM PKA 억제제 펩티드를 사용하였다.
티로신 키나아제
수많은 단백질 티로신 키나아제의 키나아제 활성은 ATP 및 인산화를 위한 티로신 아미노산 잔기를 함유하는 적절한 펩티드 또는 단백질을 제공하고, 포스페이트 부분의 티로신 잔기로의 전이에 대하여 분석함으로써 측정하였다. FLT-1(VEGFR1), VEGFR2, VEGFR3, Tie-2, PDGFRα, PDGFRβ, 및 FGFR1 수용체의 세포질 도메인에 대응하는 재조합 단백질을 바큘로바이러스 발현 시스템(InVitrogen)을 사용하여 Sf9 곤충 세포에서 발현시켰고, Glu 항체 상호작용(Glu-에피토프 태그 구성물에 대해)을 통해 또는 금속 이온 크로마토그래피(His6(SEQ ID NO:1) 태그 구성물)에 의해 정제하였다. 각각의 분석을 위해, 시험 화합물을 DMSO에 연속적으로 희석하였고, 그 후 적절한 키나아제 반응 완충액에 ATP를 더하여 혼합하였다. 키나아제 단백질 및 적절한 비오틴화된 펩티드 기질을 첨가하여 50-100μL의 최종 부피를 얻었고, 반응을 1-3시간 동안 실온에서 배양하였고, 그 후 25-50mL의 45mM EDTA, 50mM Hepes pH 7.5를 첨가함으로써 정지시킨다. 정지된 반응 혼합물(75μL)를 스트렙타비딘 코팅된 마이크로타이터 플레이트(Boehringer Mannheim)로 이동시켰고 1시간 동안 배양하였다. 인산화된 펩티드 생성물을 DELFIA 분석 완충액이 항체 희석을 위한 1 mM MgCl2으로 보충되었다는 변경과 함께 유로퓸 표지된 항-포스포티로신 항체 PT66을 사용하여, DELFIA 시간-결정된 형광 시스템(Wallac 또는 PE Biosciences)으로 측정하였다. 시간 결정된 형광을 Wallac 1232 DELFIA 플루오로미터 또는 PE VictorⅡ 다중 신호 판독기에서 판독하였다. 50% 억제(IC50)에 대한 각 화합물의 농도를 XL Fit 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀에 의해 계산하였다.
FLT-1, VEGFR2, VEGFR3, FGFR3, Tie-2, 및 FGFR1 키나아제를 50mM Hepes pH 7.0, 2mM MgCl2, 10mM MnCl2, 1mM NaF, 1mM DTT, 1mg/mL BSA, 2μM ATP, 및 상응 비오틴화된 펩티드 기질에서 0.20-0.50μM에서 분석하였다. FLT-1, VEGFR2, VEGFR3, Tie-2, 및 FGFR1 키나아제를 각각 0.1μg/mL, 0.05μg/mL, 또는 0.1μg/mL로 첨가하였다. PDGFR 키나아제 분석을 위해서, 상기와 같은 동일한 완충 조건을 갖는 120μg/mL 효소를 ATP 및 1.4μM ATP에 펩티드 기질 농도, 및 0.25μM 비오틴-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO:2)펩티드 기질을 채우는 것을 제외하고 사용하였다.
재조합 및 활성 티로신 키나아제 Fyn, 및 Lck는 상업적으로 이용가능하며, Upstate Biotechnology로부터 구입하였다. 각각의 분석을 위해, 시험 화합물을 DMSO 중에 연속적으로 희석하였고, 그 후 적절한 키나아제 완충액에 10nM 33P 감마-표지된 ATP를 더하여 혼합하였다. 키나아제 단백질 및 적절한 비오틴화된 펩티드 기질을 첨가하여 150μL의의 최종 부피를 얻었고, 반응을 3-4시간 동안 실온에서 배양하였고, 그 후 100μL의 반응 정지 완충액 100mM EDTA 및 50μM 비표지 ATP를 함유하는 스트렙타비딘 코팅된 흰 색 마이크로타이터 플레이트(Thermo Labsystems)로 이동시킴으로써 정지시켰다. 1시간의 배양 후에, 스트렙타비딘 플레이트를 PBS로 세척하였고, 200μL 마이크로신트 20 섬광 유체를 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 봉인하였고 TopCount를 사용하여 카운팅하였다. 50% 억제(IC50)에 대한 각 화합물의 농도를 XL Fit 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀에 의해 계산하였다.
Fyn, Lck, 및 c-ABL에 대한 키나아제 반응 완충액은 50mM 트리스-HCl pH7.5, 15mM MgCl2, 30mM MnCl2, 2mM DTT, 2mM EDTA, 25mM 베타-글리세롤 포스페이트, 0.01% BSA/PBS, 0.5μM의 적절한 펩티드 기질(Fyn 및 Lck에 대해 비오틴화된 Src 펩티드 기질: 비오틴-GGGGKVEKIGEGTYGVVYK-NH2 (SEQ ID NO:3)), 1μM 표지되지않은 ATP, 및 1nM 키나아제를 함유시켰다.
c-Kit 및 FLT-3의 키나아제 활성은 ATP 및 인산화를 위한 티로신 아미노산 잔기를 함유한느 펩티드 또는 단백질을 제공하고, 포스페이트 부분의 티로신 잔기로의 전이를 분석함으로써 측정하였다. c-Kit 및 FLT-3 수용체의 세포질 도메인에 대응하는 재조합 단백질을 구입하였다(Proquinase). 시험을 위하여, 대표적인 화합물, 예를 들어, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온, 을 DMSO 중에 희석하였고, 그 후 하기에 기재되는 키나아제 반응 완충액에 ATP를 더하여 혼합하였다. 키나아제 단백질(c-Kit 또는 FLT-3) 및 비오틴화된 펩티드 기질(비오틴-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO:2))을 첨가하여 100mL의 최종 부피를 얻었다. 이들 반응을 2시간 동안 실온에서 배양하였고, 그 후 50μL의 45mM EDTA, 50mM HEPES, pH7.5의 첨가에 의해 정지하였다. 정지한 반응 혼합물(75μL)을 스트렙타비딘 코팅된 마이크로타이터 플레이트(Boehringer Mannheim)로 이동시켰고, 1시간 동안 배양하였다. 인산화된 펩티드 생성물을 DELFIA 분석 완충액이 항체 희석을 위한 1 mM MgCl2로 보충된 변형을 포함하는 유로퓸 표지된 항-포스포티로신 항체, PT66을 사용하여, DELPHIA 시간-결정된 형광 시스템(Wallac 또는 PE Biosciences)으로 측정하였다. 시간 결정된 형광을 Wallac 1232 DELFIA 플루오로미터 또는 PE VictorⅡ 다중 신호 판독기에서 판독하였다. 50% 억제(IC50)에 대한 각 화합물의 농도를 XL Fit 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀에 의해 계산하였다.
FLT-3 및 c-Kit 키나아제를 50mM Hepes pH 7.5, 1mM NaF, 2mM MgCl2, 10mM MnCl2 및 1 mg/mL BSA, 8μM ATP 및 1μM의 대응하는 비오틴화된 펩티드 기질(비오틴-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO:2))을 분석하였다. FLT-3 및 c-Kit 키나아제의 농도를 2nM에서 분석하였다.
4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸피페라진 -1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 실시간 및 포괄적인 이미징 평가
임상전의 다발성 골수종 모델에서의 효능
다발성 골수종(MM), B-세포 종양은 조혈모 골수 내 형질 세포의 클론 확장의 특징을 가지며, 통상적인 높은-투약량 화합 요법의 채택에도 불구하고 선천적이고 후천적인 약물 저항성의 진행에 기인하는 치명적 혈액 악성종양으로 남는다. MM 세포 우선의 서식처 및 성장의 골수 미소서식환경은, MM에 대한 통상적이고 새로운 치료에 저항을 진행시키는데 결정적인 역할을 하는 것으로 증명되었다. 그런까닭에, MM 세포 뿐 아니라 MM 세포-골수 미소서식환경 상호작용을 표적으로 하는 분자적 표적 약제는 MM을 치료하기 위한 잠재적인 기회를 제공한다. MM의 분자 병리를 이해하는데 최근의 진보는 이 질병의 치료를 위한 새로운 치료적 목표를 제공하였다. 이소성 발현되고 하향조절되는 FGFR-3는, 대략 15% MM 환자에서 발생하며 t(4;14) 염색체 전위로 인해 야기되고 임상에서 특히 나쁜 예후를 주는, MM에 대한 매력적인 치료적 표적이 되었다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온(화합물 1)은 VEGFR-2 및 PDGFR (키나아제 분석 중 IC50s ~20nM) 및 FGFR-3 (키나아제 분석 중 IC5O ~5nM)을 포함하는 복합 수용체 티로신 키나아제를 표적으로 하는 작은 분자 억제제이다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온이 시험관내의 FGFR-3 자동인산화 및 FGFR-3 돌연변이 MM 세포 내의 세포 증식을 억제하는 것으로 증명되었다(S. Trudel et al.; Blood; in press).
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 항골수종 효능을 평가하기 위하여, 생체 내의 임상전 MM 모델은 루시페라아제의 구성체로 안정적으로 감염된 돌연변이체 FGFR-3 (Y373C)을 발현하는 인간 KMS-11-luc 세포의 꼬리 정맥에 정맥주사 후에 발생된 다기관 MM 병소에서 발생되었다. 생발괄성 이미징(BLI)를 생체내 KMS-11-luc MM 종양의 성장 및 전이를 비-침투적으로 모니터하는데 사용하였다. 전이 병소의 조기 검출 및 연속의 포괄적인 모니터링을 이 모델이 있는 BLI에 의해 성공적으로 포착하였다. 거의 모든 KMS-11-luc 종양 세포 주사된 동물을 MM 병소를 발생시키기 위하여 일찌감치 26일째 찾았고, 이 모델 내 마비의 빈번한 발생을 야기하는 척추, 두개골 및 골반에 주로 집중되었다. 생체내 KMS-11-luc MM 모델에 정맥주사된 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 항-골수종 효능을 조사하였고, 20 mg/kg의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 매일의 경구 투여는, 연속적 BLI 이미징에 의해 검출된 바와 같이, 생체내 KMS-11-luc 종양 내 ERK의 인산화를 억제하고, KMS-11 종양 성장을 유효한 억제를 야기한다는 것이 증명되었음을 발견하였다. 게다가, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 항종양 성장 활성은 부형제 치료와 비교하여 동물 생존률에서 유효한 개선으로 번역되었다. 이 연구는 MM 환자에서 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 임상적 시도를 위한 추가적인 임상전의 기초를 제공하고 생체 내의 이러한 KMS-11-luc에서 통상적이거나 다른 분자적으로 목표된 약제와 조합하는 치료에서 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 추가적인 평가를 보증한다.
방법
일단의 18마리의 암컷(생후 약 8주) 면역결핍 SCID-베이지색 마우스를 Jackson laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 얻었고, 12 시간의 명/암 주기를 갖는 멸균 필터-탑 케이지 내 장애 시설에 넣었다. 모든 실험을 국제실험동물관리평가인증협회에 의해 인정되는 시설 내에서 그리고 연구소 동물 관리와 이용 위원회의 모든 지침 및 실험동물사용 및 관리에 관한 지침(국립 연구 위원회(National Research Council))에 따라서 수행하였다. FGFR-3 돌연변이체(Y373C)를 번식하는 KMS-11-luc MM 세포를 이스코브 배지+10% FBS + L-글루타민에서 배양하였고 1:2 내지 1:4의 범위에서 2회/1주를 경과하였다. 세포를 마우스마다 100μL HBSS 당 10x106 세포에서 정맥주사로 꼬리 정맥에 이식하였다. 마우스를 세포 이식한 날에 3GY(3.2분)에서 방사선을 조사하였다. 동물들은 매일 KMS-11-luc 세포가 주사된 후 48시간에서 출발하는 20 mg/kg의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 또는 부형제(각 군에서 n=9)의 경구 처리를 받았다. 생발광성 이미지(BLI)를 차광 카메라 박스 내에 장착된 고감도의, 냉각된 CCD 카메라를 포함하는 IVIS® 이미징 시스템(Xenogen)을 사용하여 얻었다. 광자/초에 의해 정량함으로서, 생발광성 신호의 이미지 및 측정을 8일 및 그 후 일주일에 한번, 루시페라아제 기질의 주사 후에 획득하였다. 동물의 체중을 일주일에 두번 모니터하였고 임상적인 관찰을 매일 기록하였다. 동물 관리 조절 및 지침에 따라서, 마우스를 마비 또는 그것들의 삶의 질을 위험하게 하는 경우에 CO2 흡입에 의해 희생시켰다.
결과
KMS-11-luc 세포가 SCID-베이지 마우스에 정맥주사로 주사된 후 8일째, 전체 몸통의 이미징은 폐, 간 및 비장을 포함하는 뼈 영역에 주로 집중된 세포 성장 및 가능한 MM 병변의 발생을 증명하였다. 두개골, 골반 및 척추를 포함하는 전형적인 발산 복합 골격 병변은 41 및 48일 사이에 마우스의 대부분에서 명확하게 관찰되며 후지 마비와 관계되고, 프로토콜에 따르는 마우스의 희생을 야기한다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 항종양 효능을 이 생체내 모델 중 KMS-11-luc에서 시험하였다. 마우스는 매일 KMS-11-luc을 주사한 후에 20 mg/kg의 화합물 1의 경구 치료를 받는 것을 시작하였다(n=9 마우스/군). 각 동물에서 포괄적이고 연속적인 광자수의 모니터링을 1주일의 염기 스케줄에서 수행하였다. 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 처리된 군에서 유효한 낮은 평균 광자 수를 도 1에서 보여진 바와 같은 부형제 치료와 비교하여 증명하였다. 이것은 부형제로 처리된 KMS-11-luc 및 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리된 것으로 주사된 마우스를 찍은 전체 몸통 BLI 이미지의 비교에 의해 쉽게 관찰하였다. 흥미롭게도, 화합물 1-처리된 마우스에서 KMS-11 다발성 골수종의 형태의 보급은 또한 상당히 더 적게 퍼진다. 전이는 복부 및 등 영역에서 제한되고, 두개골 영역, 척추골 또는 하지에서 광범위하게 발견되지 않는다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리된 마우스에서 광자수의 감소는 부형제로 처리한 마우스와 비교하는 생존 시간에서 유효한 증가에 의해 잘 반영된다. 91일째, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리한 마우스들 중 9 마리 중 5 마리는 전반적으로 건강한 상태로 살아있었다. 반면, 부형제-처리된 군 내의 대부분의 동물은 50일 근처에서 희생되었다. 게다가, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리된 마우스는 이 연구의 오랜 기간 동안 이 치료를 잘 견뎠다. 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리된 마우스의 생존 시간에서 분명한 개선 때문에, 이 연구는 실질적인 연구를 위해 91일째 종결하였다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온과 함께 일반적으로 키나아제 억제와 관련하는 추가적 연구, FGFR3의 억제, 및 다발성 골수종을 포함하는 암의 치료는 미국 공개 특허 번호 2004/0092535, 및 미국 특허 출원 번호 10/983,174, 미국 특허 출원 번호 2004/0220196, 및 미국 특허 번호 6,605,617에서 설명되고 있다. 그런까닭에, 이러한 참고문헌 각각은 본원에서 전체적으로 제시된 바와 같은 정도로 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참고로써 포함된다
인간 AML 의 실험적 종양 이종이식 모델에서 4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸피페라진 -1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]퀴놀린-2(1H)-온(화합물 1)의 활성
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온(화합물 1)은 새로운, 경구 활성의, 다표적된 작은 분자이며, 내피 및 종양 세포 증식에 포함된 FLT3 키나아제 및 클래스 Ⅲ, Ⅳ, 및 Ⅴ RTK에 대한 잠재적 활성을 나타낸다. 급성 골수성 백혈병(AML)에서 FLT3 돌연변이의 주어진 관련성, 화합물 1을 다른 FLT3 돌연변이 상태(MV4;11 FLT3 ITD vs. RS4;11 FLT3 WT)를 갖는 두 명의 인간 백혈병 종양 세포라인에 시험하였다. MV4;11에 대한 화합물 1의 항증식성 활성은 RS4;11과 비교하여 ~24-배 더 컸고, 구조적으로 활성화된 FLR3의 더 강력한 억제를 나타낸다. 화합물 1을 갖는 MV4;11 세포에서 수용체 인산화의 투약-의존성 변화 및 다운스트림 신호(STAT5 및 ERK/MAPK)는 분자적 기능의 메커니즘을 확인하였다. MV4;11 종양에서 pFLT3, pERK의 표적 조절을 화합물 1의 생물학적 활성 투여에서 달성하였다. 골수(BM)로부터 AML 세포의 종양 퇴화 및 박멸을 피하 및 BM 생착 백혈병 이종이식 모델에서 증명하였다. 종양 반응은 감소된 세포성 증식 및 활성 카스파아제-3에 대한 결정적인 면역조직화학적 염색 및 쪼개진 PARP를 특징으로 하며, 세포 사멸을 암시하는 것은 세포자살현상을 통해 매개된다. 이러한 데이타는 AML 내 화합물 1의 임상적인 평가를 지지한다.
셀 라인
인간 MV4;11 (FLT3 ITD) 및 RS4;11 (FLT3 WT) 백혈병 세포를 미국 조직 배양 콜렉션(Rockville, MD) 24-26으로부터 획득하였다. MV4;11 세포를 4mM L-글루타민, 5ng/ml 과립구대식세포(granulocytemacrophage)군체 자극 인자(GM-CSF, R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 10% 우태혈청(FBS, Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD)으로 보충한 이스코브 ㅂ변형 둘베코 배지(IMBM)에서 성장시켰다. RS4;11를 10% FBS, 1 mM 피루브산나트륨 및 10 mM HEPES (pH 7.4)를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 현탁액 배양으로서 성장시켰고 37℃ 및 5% CO2에서 습한 분위기로 유지하였다.
키나아제 분석
시험관내 FLT3 키나아제 분석을 8μM ATP 및 화합물 1의 연속적인 희석의 존재 내에서 2nM FLT3 효소(Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA)로 실행하였다. 1μM의 최종 농도에서 인산화된 펩티드 기질을 유로퓸-표지된 항-포스포티로신 항체(PT66)(Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA)으로 배양하였다. 유로퓸을 시간 결정된 형광을 사용하여 검출하였다. IC50을 비선형 회귀를 사용하여 계산하였다.
증식 분석
세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(10,000세포/웰)에서 플레이팅하혔고, 화합물 1의 연속적인 희석을 첨가하였다. RS4;11 세포를 FLT3 리간드(100ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN)로 자극하였다. 배양 기간(37℃에서 72시간)의 마지막에, 세포 생존능력을 MTS 분석(Promega, Madison, Wl)에 의해 측정하였다. EC50 값을 비선형 회귀를 사용하여 계산하였고, 그리고 처리된 흡광도 대 처리되지 않은 대조군 세포에서 50% 감소에 대하여 필요한 농도로서 정의하였다.
면역침전법 및 웨스턴 블롯 분석
시험관 내 분석에 대하여, MV4;11 및 RS4;11 세포를 화합물 1로 3시간동안 처리하였다. RS4;11 세포를 화합물 1로 배양한 후에 FLT3 리간드(100ng/mL)로 15분 동안 자극하였다. 약물로 배양한 후에, 세포를 획득하였고, 빙냉 PBS로 세척하였고 프로테아제 억제제(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 및 인산염 억제제(Sigma, St. Louis, MO)를 함유하는 RIPA 완충액(1% Nonidet P-40, 0.5% 나트륨 디옥시콜레이트, 0.1% 나트륨 도데실설페이트 염수로 완충된 1X 인산염, pH 7.2)으로 용해하였다. 생체내 표적 변화 분석을 위하여, 잘라낸 종양을 순간 냉동하였고, 150mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 50mM Hepes, pH 7.5, 10% 글리세롤, 1.0% 트리톤 X-100, 1mM EGTA, 50mM NaF, 1mM Na3VO4, 2mM Pefabloc(Roche)으로 용해하기에 앞서 -70℃에서 분지쇄하고 저장하였으며, 프로테아제 억제제 혼합물(Roche)을 완성하였다. 용해물의 단백질 함유량을 BCA 분석(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 측정하였다. pERK 웨스턴 블롯 분석을 pERK에 대한 마우스 항체로 수행하였고(1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA), 4℃에서 밤새 배양하였다. 전체 ERK 수준을 전체 ERK (Cell Signaling)에 대한 항체와 함께 재검사으로써 평가하였다. 세포막을 그 후 1:5000 홀스라디쉬 산화효소가 결합된 항-래빗 IgG(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)를 갖는 RT에서 1시간 동안 배양하였다. FLT3를검출하기 위한 면역침전법에 대하여, 동등한 양의 단백질(STAT5에 대하여 500μg; FLT3에 대하여 1000μg)을 인간 FLT3 또는 STAT5(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 대한 항체와 함께 밤새 4℃에서 그리고 단백질 A-아가로오스와 함께 2시간 동안 4℃에서 배양하였다. FLT3 또는 STAT5 인산화를 항-포스포티로신 항체(Cell Signaling로부터의 항-pFLT3 항체, 및 Upstate로부터의 항-pSTAT5 항체)로 검사함으로써 측정하였다. 단백질을 향상된 화학발광(ECL; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England)을 사용하여 검출하였고, Kodak film에 노출 후에 보이게 하였다. 스캐닝 밀도계를 띠세기를 정량하기 위하여 실행시켰다. 동일한 부하를 증명하기 위하여, 블롯을 제거하였고 전체 FLT3 또는 STAT5 단백질을 각각 측정하기 위하여 항-FLT3(Santa Cruz Biotechnology) 또는 항-STAT5(BD Biosciences)에 대한 항체로 리프로빙하였다. pFLT3, pERK 또는 pSTAT5의 양을 전체 FLT3, ERK 또는 STAT5 단백질 수준으로 정상화 하였고, 부형제 또는 비처리 대조군과 비교하였다.
유세포 분석
MV4;11 세포를 화합물 1로 3시간 동안 혈청이 결핍된 조건(OptiMEM 배지에서 밤새)하에 처리하였다. pSTAT5의 검출을 위하여, 세포를 1% 포름알데히드로 고정시켰고 90% 빙냉 메탄올로 투과시켰다. 투과된 세포(0.5-1x106)를 항-pSTAT5 항체(Cell Signaling)로 30분 동안 배양하였다. 동일 농도에서 정제된 래빗 IgG(Oncogene, San Diego, CA)를 아이소타이프 조절로서 사용하였다. 두번째 항체는 PE-결합된 염소 F(ab')2 항-래빗 IgG(Jackson Immunoresearch)이었다. 샘플을 FACScan 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 분석하기에 앞서 4℃의 어두운 곳에 저장하였다. 평균 형광 강도(MFI)를 CellQuest software (Becton Dickinson)을 사용하여 pSTAT5 염색을 위해 측정하였고 특이적 MFI는 아이소타이프 조절 항체의 MFI와 달랐다.
마우스 MV4;11 생착 모델로부터 골수(BM) 세포의 과정을 위하여, 대퇴부를 찬 식염수로 정화하였고 적혈구 세포를 FACS 용해 완충액(Becton Dickinson)으로 용해하였다. 마우스 BM 내 인간 백혈병 세포의 백분율 생착을 항-인간 HLA-A,B,C-FITC(vs. 아이소타이프-대등한 항체-FITC 조절)(BD Pharmingen)로 염색함으로써 측정하였다.
VEGF ELISA
MV4;11 세포를 화합물 1의 다양한 농도(0-1μM)를 갖는 배지를 함유하는 10% FBS에서 48시간 동안 배양하였다. 상청액을 원심분리 후에 수집하였고, VEGF 수준을 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)으로 측정하였다. 단백질 농도를 BIO-RAD 단백질 분석(Hercules, CA)을 사용하여 결정하였고, 결과를 단백질 농도로 표준화하였다.
생체내 효능 연구
암컷 SCID-NOD 마우스(생후 4-6주, 18-22g)를 Charles River (Wilmington, MA)로부터 얻었고 연구의 시작에 앞서 미생물에 감염되지 않도록 봉인하여 1주일 동안 순응시켰다. 동물들은 멸균 설치류 음식 및 물을 임의로 받았고 멸균 필터-탑 케이지에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. 모든 실험군은 국제실험동물관리평가인증협회의 지침하에 있었다.
피하 모델
MV4;11 및 RS4;11 세포를 SCID-NOD 마우스 내 피하(s.c.) 종양으로부터 가로질렀다. 세포(5 x 106 세포/마우스)를 50% Matrigel(Becton Dickinson)로 재구성하였고 SCID-NOD 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 구체적 연구 설계에서 약술한 바와 같이 종양이 200-1000 mm3이 되었을 때 치료를 개시하였다. 마우스는 랜덤하게 일단으로 분배되었다(효과적인 연구를 위하여 전형적으로 10마우스/군 및 약역학(PD) 연구를 위하여는 3-5마우스/군). 화합물 1을 경구 위관 영양법을 통해 용액으로서 투여하였다. 종양 부피 및 체중을 일주일에 2-3회 측정하였다. 종양의 Caliper 측정을 하기의 식을 사용하여 평균 종양 부피로 변환하였다: 1/2 (길이 x [너비]2). 백분율 종양 성장 억제(TGI)를 부형제-처리된 마우스와 비교하였다. 반응률을 치료 개시에서 종양 부피와 비교하여 완전 반응 CR(명백한 종양은 아님) 또는 부분적 반응 PR(50-99% 감소)으로서 정의하였다.
정맥내의 골수(BM) 생착 모델
SCID-NOD 마우스를 0.2ml 식염수 내 1x107 MV4;11 세포의 꼬리 정맥 주사에 앞서 방사선 조사하였다(3Gy). 화합물 1 또는 부형제 치료를 3주 후세포 접종에서 개시하였다. 마우스를 매일 모니터링 하였고, 빈사상태이거나 후지 부분의 손실의 조기 신호가 있을 때 안락사시켰다. 치료된 마우스의 증가된 라이프 스팬(ILS)을 평균 생존 시간(MST) 대 부형제 처리된 조절군 마우스에서 백분율 증가로서 계산하였다.
생체내에서 표적 조절
SCID-NOD 마우스(n=3 마우스/군)에서 MV4;11 피하 종양을 300mm3에서 단계화하였고 부형제 또는 화합물 1로 구성되는 치료를 10mg/kg에서 5일 동안 경구적으로 투여하였다. 화합물 1의 PD 특성을 특징짓기 위하여, 종양 샘플을 화합물 1의 투여에 따르는 다양한 시간(N=3 마우스/시점)에서 수집하였다.
면역조직화학법
잘라낸 종양을 10% 중성 완충된 포르말린에 실온에서 밤새 넣었고, 70% 에탄올로 옮기고 열 전자 엑셀시오르 처리장치(Pittsburgh, PA)를 사용하여 파라핀 첨가를 위한 처리를 하였다. 뼈(대퇴골) 샘플은 석회질을 제거하였다(ProtocolTM, Fisher Diagnostics, Middletown, VA). 파라핀 블록을 4μm 두께로 나누었고 양전기로 대전한 유리 슬라이드에 놓았다. 조직을 디스커버리 자동 슬라이드 머신(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용하여 염색하였다. 슬라이드를 Ki-67, pERK 및 PARP 염색에 대하여 항원을 회수하기 위한 압력 스티머 내 시트레이트 완충액(pH 6.0)으로 처리하였고, 카스파아제-3을 벤타나 시약 CC1으로 회수하였다. 사용된 최초의 항원은 Ki-67(1:750 희석, NovoCastra Laboratories, UK), pERK(1:100 희석, Biosource, Camarillo, CA), 항-인간 미토콘드리아(1:200, Chemicon, Temecula, CA), 쪼개진 카스파아제-3(1:200, 세포 신호) 쪼개진 PARP(1:100, Biosource)를 사용하였다. 두번째 항원은 염소 항-래빗 F(ab')2 비오틴화된 항체, 1:100 희석(Jackson ImmunoResearch)이었다. 슬라이드를 헤마톡실린 으로 대조염색하였고 커버 슬립을 장착하였다. 일반적 조직 형태학은 또한 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 평가된다.
통계적 분석
마이크로소프트 엑셀(Redmond, WA)을 사용하여 선형 회귀를 수행하였다. 두 처리군 사이의 통계적 유의성을 측정하는데 Student's t-테스트를 사용하였다. 복합적 비교는 분산의 일방향 분석(ANOVA)를 사용하였고, 다른 처리 평균을 비교하는 후-시험은 Student-Newman Keul's test(SigmaStat, San Rafael, CA)를 사용하였다. 생존 연구에 대하여, 다양한 치료 대. 부형제 군의 생존 곡선 사이의 유의성을 측정하기 위하여 로그 랭크 테스트를 사용하였다(Prism, San Diego, CA). 연구의 마지막에 정상 건강 상태로 희생된 마우스를 장-기간 생존자로 고려하였고 이 분석에서 삭제하였다. 차이점은 p<0.05인 통계적인 유의수준에서 고려된다.
결과
화합물 1은 FLT3 키나아제 활성의 강력한 억제를 증명한다
화합물 1의 특이성을 상기 기재된 정제 효소와 함께 ATP-경쟁적으로 결합하는 분석을 사용하여 RTK의 다양한 패널에 대해 시험하였다. 화합물 1은 c-KIT (2nM), VEGFR1/2/3(10nM); FGFR1/3(8nM); PDGFRβ(27nM) 및 CSF-1R(36nM) (하기의 표를 참조)에 대한 나노몰랄 활성을 갖는 FLT3(1nM)에 대해 매우 강력하게 되는 것을 발견하였다. 클래스 Ⅲ, Ⅳ 및 ⅤRTK에 대한 민감도를 확인하기 위하여, 화합물 1을 PI3K/Akt 및 MAPK(K) 경로 내의 다른 키나아제에 대해 시험하였고 무시해도 좋은 활성을 갖는 것을 발견하였다(IC50 > 10μM) (하기의 표를 참조).
Figure 112007061604479-pct00026
상기 표를 준비하기 위한 사용된 시험관내 RTK 분석을 상기 기술한 바와 같은 정제된 효소 및 ATP의 존재에서 화합물 1의 다양한 희석액으로 수행하였다. 인산화된 펩티드 기질(1μM)을 유로퓸-표지된 항-인특이적 항체로 배양하였고 유로퓸을 시간-결정된 형광을 사용하여 검출하였다.
MV4 ;11 ( FLT3 ITD ) 세포상 화합물 1의 강력한 항증식 효과
FLT3 의 억제가 시험관 내 성장억제로 변형되는 것을 측정하기 위하여, 화합물 1의 활성을 MTS 분석을 사용하여 MV4;11 및 RS4;11 세포에 대해 시험하였다. MV4;11 또는 RS4;11(FLT3 리간드의 존재에서)를 화합물 1의 연속적인 희석으로 배양하였다. 세포 생존 능력을 72시간 배양 기간 후에 MTS 분석에 의해 측정하였다. EC50 값을 비선형 회귀를 사용하여 계산하였고, 치료 대 비치료 대조군 세포의 흡광도에서 50%감소를 위해 필요한 농도로서 정의하였다. 화합물 1은 EC50=13nM로 투약-의존성 방법에서 MV4;11 세포의 증식을 강력하게 억제하였다. 비록 증식에서 유사한 농도-의존성 효과를 RS4;11 세포로 관찰하였지만, 이들은 화합물 1에 대략 24-배 적게 민감하였다(EC50 = 315nM). 화합물 1의 항증식 효과를 또한 MV4;11(EC50 ~ 6nM)로 보여진 것들과 유사한 EC50 농도와 함께 FLT3 ITD 돌연변이 세포, MOLM13 및 MOLM14 상에서 시험하였다. 이들 데이타는 억제에 더 민감하게 된 구조적으로 활성인 수용체와 함께, 화합물 1이 FLT3 ITD 및 WT 백혈병 세포 모두에서 활성인 것을 암시한다.
백혈병 세포에서 FLT3 - 매개된 신호 상 화합물 1의 시험관내 효과
화합물 1의 시험관내 세포적 활성을 FLT3 돌연변이 상태에 대조적인 두 명의 인간 백혈병 세포 라인 MV4;11 및 RS4;11 상에서 조사하였다(RT-PCR을 사용하여 확인함). 이러한 실험에서, 결핍된 혈청 MV4;11 (ITD) 또는 RS4;11 (WT) 세포를 세포 용해에 앞서 화합물 1의 증가된 농도로 3시간 동안 배양하였다. RS4;11 세포를 FLT3 리간드(100ng/ml)로 15분 동안 자극하였다. 전체 세포 용해물을 항-인간 FLT3 항체로 면역침전하였고, SDS-PAGE로 재용해하였다. 면역탁본을 항-포스포티로신 항체로 검사하였다. 또한 세포질을 제거하였고 FLT3의 동일한 부하를 증명하기 위하여 항-FLT3로 재검사하였다. pFLT3 내의 변화를 밀도계를 사용하여 기준선(어떤 치료도 없음)의 백분율로서 보고하였다. MV4;11 세포는 FLT3 수용체 내에서, 내부 탠덤 중복 돌연변이(ITD)를 가지며, 구조적으로 활성화된 FLT3를 야기한다. Levis M. et al., Blood, 99:3885-3891 (2002); O'Farrell A.M. et al., Blood, 101 :3597-3605 (2003). 이 활성은 외생적 리간드 자극의 부재에서 FLT3의 자동인산화를 야기한다. 혈청-박탈된 MV4;11 세포를 화합물 1로 3시간 동안 처리하였고 FLT3 수용체 활성 상의 직접적인 효과를 그것의 인산화 상태의 분석에 의해 측정하였다. 화합물 1의 증가하는 농도에 MV4;11 세포의 노출은 1-10 nM 사이의 EC50를 갖는 투약 의존적인 방법에서 pFLT3를 강력하게 억제하였다.
FLT3 ITD가 대략 20%의 AML 환자 블라스트에서 효과가 있는 반면, 대부분의 급성 백혈병은 WT FLT3를 발현한다. 백혈병의 RS4;11 세포상에서 화합물 1의 효과를 또한 활성 FLT3 수용체에 외생적 FLT3 리간드(100ng/ml, 15분)를 따라서 조사하였다(FLT3 WT). RS4;11 FLT3 WT 세포는 FLT3 리간드 자극의 부재에서 pFLT3의 낮은 기준 수준을 갖는다. 화합물 1 치료법은 RS4;11 세포 내 pFLT3 수준을 감소시켰다. 그러나, 비교적으로, 더 높은 농도가 WT FLT3 대 ITD의 조절을 위해 요구되었다. 완전한 억제는 > 0.5μM의 농도로 획득하였다.
화합물 1은 ERK 및 STAT5 , FLT3 억제의 다운스트림 목표를 조절한다
FLT3 억제 상 화합물 1의 효과를 추가적으로 특징짓기 위해, FLR3의 다운스트림 표적의 조절, 즉, 세포 생존 및 증식에서 열쇠 단백질인 STAT5 및 ERK를 조사하였다. MV4;11 세포를 화합물 1의 증가하는 농도로 3시간 동안 처리하였고 pERK 및 p-STAT5의 검출을 위한 유세포 분석 및 웨스턴 블롯에 의해 처리하였다. pERK 또는 pSTAT5 내의 변화를 기준선(어떤 처리도 없음)의 백분율로서 보고하였다. MV4;11 세포에서, FLT3의 활성 신호에 기인하여, 세포는 pERK 및 pSTAT5의 높은 기준 수준을 갖는다. 화합물 1은 투약-의존성 방법에서 ERK 및 STAT5의 인산화를 억제하였다. pERK 및 pSTAT5 기질적 억제(>50%)를 > 0.1μM의 농도에서 관찰하였다(유세포 분석 및 웨스턴 블롯). pERK 및 pSTAT5 상에서 화합물 1의 억제 효과는 FLT3 리간드-자극된 RS4;11세포와 비교하여 MV4;11에서 더 강력하였다.
화합물 1은 시험관내 MV4 ;11 세포에서 오토크라인 VEGF 생산을 억제한다
시험관내 VEGF 생산 상의 화합물 1의 효과를 다루기 위하여, ELISA를 MV4;11 배양 상청액 상에서 수행하였다. 이러한 실험에서, MV4;11 세포를 화합물 1의 증가하는 농도(0-1μM)로 48시간 동안 배지를 함유하는 10% FBS에서 배양하였다. 약물 치료의 부재에서, MV4;11 세포는 기질적 VEGF(180pg/ml)를 분비하였고, 반면에, 화합물 1은 투약-의존적 방법에서 0.001 및 0.01μM 사이의 EC50 및 > 0.5μM의 농도에서 완전한 억제로 VEGF 생산을 억제하였다.
화합물 1은 생체내에서 FLT3 신호를 조절한다
생체내에서 목표 조절을 시험하기 위하여, MV4;11 종양 함유 마우스(300-500mm3에서 단계가 나뉨)에 화합물 1(10mg/kg/d) 또는 부형제를 5일 동안 투여하였다. 4, 8, 24, 및 48시간 후투여에서 5일째 종양을 잘라내었고, 분지쇄하고 즉시 냉동(-70℃)하였다. 선택된 시점 후에 획득한 종양을, 균질화하였고 IP/웨스턴 블롯에 의해 pFLT3 및 pSTAT5 수준을 위해 분석하였다. pFLT3 또는 pSTAT5 조절을 위하여: 종양 용해물을 항-인간 FLT3 또는 항-STAT5 항체로 면역침전시켰고, SDS-PAGE로 재용해하였다. 면역탁본을 적절한 항포스포티로신 항체로 검사하였다. 세포질을 제거하였고 부하 대조군으로서 총 FLT3 또는 STAT5 단백질의 측정을 위하여 항-FLT3 또는 항-STAT5로 리프로빙하였다. pFLT3 및 pSTAT5 수준에서 유효한 감소를 전체 FLT3 또는 STAT 단백질에서 유효하지 않은, 화합물 1의 단일 투여 또는 복합 투여로, 일찌감치 4시간 후투여에서 관찰하였다. FLT3와 STAT5 모두의 인산화는 8시간 후투여에서 ~90%의 최대 억제값에 이르는 기준선에 관하여 하락하였고 24시간 동안 억제된 채로 남아있었다(~85% 억제). 포스포-FLT3는 기준선 수준에 근접하게 되돌아왔고, 반면에, p-STAT5는 48시간 후 투여에서 여전히 억제되었다. pERK 수준에서 감소는 또한 다운스트림 FLT3 신호의 차단을 나타내는 것이 관찰되었다.
생체내 효능 연구
생체내 MV4 ;11 및 RS4 ;11 종양상에서 화합물 1의 투여 반응 효과
시험관내 화합물 1의 효과가 생체내 종양 성장 억제와 관련되는지 여부를 확인하기 위하여, 화합물 1의 효능을 SCID-NOD 마우스 내 MV4;11 또는 RS4;11 종양 이종이식에 대해 시험하였다. 마우스를 종양 세포로 피하에 이식하였고 화합물 1 치료를 종양이 200-300 mm3이 되었을 때 개시하였다. 투약-반응 효능 연구에서, 화합물 1을 MV4;11 종양에 대해 1-30mg/kg/d, 및 RS4;11 종양에 대해 10-150 mg/kg/d의 투약 범위에서 경구적으로 투여하였다.
화합물 1은 MV4;11 종양에 대하여 매우 강력하였고, 투여량 > 5 mg/kg/d에서 유효한 종양 성장 억제로 좋은 투약-반응 효과를 나타내었다(도 2). 30 mg/kg/d의 투여량은 종양 퇴화를 유도하였고(9/10 종양 반응), 이는 부분적이고 완전한 반응자 모두로 구성되었다(1CR, 8PR). 적당한 종양 성장 억제를 투약의 2주후 1mg/kg/d (23%)에서 관찰하였고, 이 모델에서 최소의 통계적으로 유효한 투여량으로서 확인하였다(p< 0.01 대 부형제). 마우스 함유 RS4;11 종양에서, 화합물 1로의 치료는 종양 성장 억제를 야기하였지만, 어떤 퇴화도 관찰되지 않았다(도 3). 화합물 1의 억제 효과는 RS4;11 종양에 비교하여 MV4;11 종양에 대해 더 강력하였고, 각 모델에서 각각 최소의 효과적인 투여량으로써 정의되었다(8일째: 100mg/kg/d; RS4;11 tumors 대 1mg/kg/d에 대해 48% TGI, p<0.01; MV4;11 종양에 대해 23% TGI, p<0.01).
화합물 1의 또 다른 투약 계획은 동일한 효능이 있다
MV4;11 이종이식 종양에 대한 화합물 1의 간헐적 및 주기적 투여의 효과를 또한 시험하였다(도 4). 화합물 1을 매일, 격일(q.o.d.), 또는 주기적으로, 2 주기 동안 7일은 수행하고 7일은 하지 않으면서 30 mg/kg에서 경구적으로 투여하였다(도 4). 매일의 투여와 유사하게, 간헐적 투여 처방은 약물 처방의 며칠 내에 유효한 종양 퇴화를 만들었다(>94% TGI). 모든 세 개의 처방은 동일한 항종양 활성을 야기하였고(29일, p>0.05) 격일(6PR) 및 7일 수행/7일 중단(9PR)에서 보여진 다수의 반응은 매일의 치료(1CR, 9PR)로 보여진 것과 유사하였다
화합물 1은 거대한 MV4 ;11 종양에 대해 효과적이다
다양한 크기의 거대 MV4;11 종양 상의 화합물 1의 효과; 300, 500 또는 1000 mm3를 또한 조사하였다. 화합물 1(30 mg/kg/d)로의 치료는 모든 MV4;11 종양에서 유효한 퇴화를 유발하였고 이는 치료의 초기에서 처음 종양 크기와 관계없다(도 5). 종양 퇴화는 약물 치료의 3-5일 내에서 명백하다. 모든 치료된 종양은 15% 완전 반응 및 70% 부분적 반응으로 반응하였다(n=27). 남은 15%는 부수적 반응이었고 또는 안정하게 남아있었다. 투여를 50일 후에 중단하였다. 50일 치료 동안 어떤 종양도 다시 자라지 않았고, 화합물 1에 대해 나타내는 저항성은 진행하지 않았다. 치료의 중단 후 반응의 강도를 또한 시험하였다. 한 개의 CR 및 대략 50%의 PRs은 화합물 1 투여의 중단 후 40일 동안 지속되었다. 재성장(600-2000 mm3)하는 10개 종양을 연구 시작 90일(투여 중단 후 40일)에 30 mg/kg/d 화합물 1로 재처리하였고 60동안 계속하였다. 모든 종양은 화합물 1의 두번째 주기에 반응하였고(2 CR, 8 PR), 화합물 1에 종양 저항의 부족을 명백히 나타내었다.
생체 내 생물학적 활성의 조직학적 평가
종양 부피 및 목표 조절 종점에 더하여, 면역조직화학적 판독을 약물 활성의 지표로서 사용하였다. 발명자들은 30 mg/kg의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온(화합물 1)로 처리한 SCID-NOD 마우스에서 MV4;11 또는 RS4;11 종양 내 종양 세포자살/괴사 및 세포적 증식의 억제를 조직학 및 면역조직화학적 분석을 사용하여 평가하였다. 이 연구에서, SCID-NOD 마우스 함유 피하 MV4;11 종양(n=3-5 /군)을 부형제 또는 화합물 1의 30 mg/kg/일으로 5일 동안 처리하였다. 종양을 2-5일에 잘라냈다. 파라핀-첨가된 종양을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하거나 또는 Ki67(증식 마커), pERK(기계적 약역학 마커), 쪼개진 카스파아제-3(세포자살을 위함) 또는 PARP (세포자살을 위함)으로 면역탁본하였다(헤마톡실린으로 대조염색). 화합물 1 투여(30mg/kg/d)의 일시적인 효과를 1 또는 5번 투여 후에 MV4;11 종양에서 조사하였다. H&E 염색을 사용하는 형태학적 평가는, 골수 증식의 표시된 세포과다를 나타내는 MV4;11 종양 세포로 구성되는 부형제 처리된 종양을 나타냈다. 부형제 치료 군에서, 종양 세포를 높게 증식하는 세포의 종양세포를 나타내는 Ki67로 강하게 염색하였다. 투여 후 24시간까지, 화합물 1로 처리된 종양은 빽빽하게 찬 세포 내 감소를 보였고 세포자살/괴사 세포의 희소 영역으로 구성되었다(1일). 세포자살/괴사의 영역을 감소한 Ki67 염색과 일치하는 생존할 수 없는 종양의 유효 영역으로 5일 투여 후에 전달하였다. 표적 조절을 생체내에서 pERK의 면역조직화학적 염색으로부터 확인하였다. 포스포-ERK은 종양 내 pERK의 웨스턴 분석을 확증하는 5일 투여 기간 동안 화합물 1-처리된 종양 내에서 유효하게 낮았다. 화합물 1-유도된 세포자살은, 부형제 처리된 대조군과 비교하여 5일째 종양내 증가된 활성화된 카스파아제-3 및 쪼개진 PARP 염색이 분명하였다. 발명자들은 또한 30 mg/kg 화합물 1 치료와 함께 치료하는 것에 따르는 RS4;11 종양의 면역조직화학을 시험하였다. RS4;11 종양(n=3-5/군)을 부형제 또는 화합물 1의 30 mg/kg/일로 처리하였다. 종양을 9일째 잘라내었다. 파라핀-첨가된 종양을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하거나 Ki67, 또는 pERK으로 대조염색하였다(앞서 기술된 바와 같음). 감소된 pERK 뿐 아니라 감소된 세포질 및 증식의 유사한 효과는 화합물 1(30mg/kg/일)로 처리된 RS4;11 종양에서 명백하였다
추가적으로, 발명자들은 종양의 조직 구조를 평가하였고 부분적(>50% 종양 억제) 또는 완전한 반응(손으로 만질수 있는 종양 덩어리는 아님)으로서 정의하였다. 이들 연구에서, SCID-NOD 마우스 함유 피하 MV4;11 종양(n= 3-5/군)을 부형제 또는 화합물 1의 30 mg/kg/d으로 처리하였다. 부형제-처리된 종양을 15일째 제거하였고 화합물 1-처리된 종양을 89일째 제거하였다(화합물 1의 투여 50일 + 처리 없이 39일). 파라핀-첨가된 종양을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색 하였고 또는 Ki67(헤마톡실린으로 역염색)으로 대조염색하였다. 완전 반응자는 MV4;11 종양 세포가 전체적으로 결여되었고, 괴사 및/또는 반흔 조직의 나머지만을 나타내었다. 부분적 반응에서, Ki67-결정적 증식 종양 세포의 덩어리를 종양의 주변에서 관찰하였다.
화합물 1은 퍼진 인간 백혈병 세포를 함유하는 마우스의 생존 시간을 연장한다
화합물 1의 효능을 MV4;11 백혈병 모델에서 시험하였고 방사선 조사된 SCID-NOD 마우스의 꼬리 정맥에 접종하였다(도 6). 이 모델에서, MV4;11 세포는 골수(BM), 에 퍼졌고, 인간 백혈병에 유사한 질병 형태를 병리학적으로 모방한다. 1일째 MV4;11 세포를 마우스에 주사하였고 MV4;11 세포가 BM 내 합쳐진 후, 23일 째 화합물 1의 치료(20mg/kg, 매일 또는 7일 수행/7일 중단, n=10-12/군)를 개시하였다. 대조군(부형제-처리됨) 마우스는 종양 세포가 BM에 침투되는 결과로서, 51일의 평균 생존 시간으로 전형적으로 후지 마비를 유도하였다(도 6). 생존 연구에서, 화합물 1(23-100일)로 매일의 치료는 부형제-처리된 대조군(MST = 51일)과 비교했을 때 질병 진행에 시간을 유효하게 연장시켰고(p < 0.0001), 163% 증가된 생존 기간(ILS)를 증명하였다(도 6). 매일의 화합물 1 치료로, 눈에 띄게, 4마리의 마우스는 장기간 생존하였다(MST>160 일). 병리학적 분석 및 유세포 분석을 BM 내 MV4;11 세포의 % 생착의 양을 정하는데 사용하였다. 유세포 분석에서, 인간 MV4;11 세포를 항-인간 HLA-A1B1C를 갖는 마우스 BM 내에서 확인하였고 이는 인간 MHCI 상 에피토프에 결합한다. 부형제-처리된 마우스에서, 대략 2-19%의 전체 분리된 BM 세포는 생착된 MV4;11 세포로 구성된다(51일). 이는 또한 인간 미토콘드리아에 항체를 갖는 면역조직화학에 의해 확증되며 마우스 BM기질 내 인간 세포를 확인하는 MV4;11 세포를 염색한다. 화합물 1을 매일 25일이 넘게 투여하여 백혈병 존재량(< 1% BM 내 MV4;11 세포) 대 부형제 처리는 유효하게 감소하였다. 흥미롭게도, 화합물 1 처리 후 생존 마우스는 면역조직화학적으로 BM 내 종양 세포(167일째 ㅎ항-인간 미토콘드리아-결정적 세포의 부재로서 보여짐)의 어떤 증거도 없음을 보여주고 "치료"로서 정의된다. 화합물 1의 주기적 투약(7일 수행/7일 중단, 5주기)은 또한 유효하게 증가된 생존 시간(MST=118일, 131% ILS 대 부형제, p=0.0001)을 야기하지만, 매일의 처방만큼 효과적이지는 않았다(p= 0.007, 도 6)
전립선 암 셀 라인 내 화합물 1의 효능
화합물 1이 클래스 Ⅲ,Ⅳ 및 Ⅴ 수용체 티로신 키나아제(RTK)에 대한 다표적 키나아제 선택성을 갖기 때문에, 화합물 1의 활성은 전립선 암의 전이 모델에서 시험하였다. 화합물 1의 항 종양 효능을 PC-3M 종양을 사용하여 측정하였고 화합물 1에 의해 억제되는 열쇠 RTK VEGFR 및 FGFR을 발현하였다. PC-3M 세포는 뼈에 전이되는 것으로 보여졌고, 따라서 이 모델을 누드마우스 내 인간 전립선 암의 실험적 전이 이종이식 모델에서 화합물 1의 활성을 조사하는데 사용하였다.
셀 라인. 무효 p53, del PTEN, VEGFR, FGFR을 발현시키는 전이 인간 전립선 세포 라인 PC-3M 및 안정적으로 감염된 구성체의 루시퍼라아제를 이종항원을 갖는 기술계약 하에 획득하였다.
생체내 효능 연구. 수컷 누드 마우스(nu/nu)(생후 4-6주, 18-22g)를 Charles River (Wilmington, MA)로부터 얻었고 연구의 시작에 앞서 병원체가 없도록 밀봉하여 1주일 동안 순응시켰다. 동물들은 멸균 설치류 음식 및 물을 임의로 받았고 멸균 필터-탑 케이지에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. 모든 실험군을 국제실험동물관리평가인증협회의 지침 하에 수행하였다.
PC-3M luc 뼈 전이 모델. 루시퍼라아제의 구성체로 안정적으로 감염된 인간 전립선 암 셀 라인 PC-3M-luc 세포(1.5 x 106 세포)를 심장내주사를 통하여 주사하였다. 생발광성 이미징(Xenogen's IVIS® 이미징 시스템)을 세포 접종 후 생체내 성장 및 PC-3M-luc 종양의 전이를 비-침투적 모니터에 사용하였다. 거의 모든 PC-3M-luc 종양 세포-주입된 동물은 전립선 병소를 진행하였고, 이는 대퇴부, 및 하악골에 주로 집중되었다. 화합물 1, 탁솔, 또는 부형제 처리(n=7/군)를 4주 후-세포 접종(연구의 0일)에서 개시하였다. 마우스를 매일 모니터하였고 빈사상태일 때 안락사시켰다.
군 정보
투여는 세포 접종(연구의 0일) 후 4주째 개시하였다
1. 부형제(n=8)
2. 화합물 1, 50mg/kg, 경구로, 매일(n=7)
3. 탁솔, 15mg/kg, 복강내, 1주일에 3회(n=7)
종점. 효능(Xenogen's IVIS? 이미징 시스템을 사용하는 생체내 종양의 실시간 이미징)
면역조직화학. 뼈(대퇴부, 하악골) 샘플을 석회질화하였다(ProtocolTM, Fisher Diagnostics, Middletown, VA). 파라핀 블록을 4mm 두께로 잘랐고 양전자로 대전한 유리 슬라이드에 놓았다. 뼈 내의 PC-3M 세포의 일반적 조직 형태학 및 확인을 위해 조직을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
심장내주사를 통해 PC-3M-luc 세포로 배양한 수컷 누드마우스는 생체내 및 조직구조 평가에서 PC-3M-luc 종양 세포의 연속적인 전신 이미징에 의해 검출된 바와 같은 PC-3M 세포의 퍼진 성장을 보여주었다(도 7). 누드마우스 내 PC-3M 세포의 4주 후배양에서, 전신 이미징은 세포 성장의 진행을 증명하였고 전이 병소는 머리 및 복부 영역에서 주로 집중되었고, 이는 조직학 평가에 의해 증명되었으며 PC-3M 세포는 뼈(대퇴부 및 하악골)에 전이하였다. 일부 마우스에서, 종양 세포는 또한 흉부 영역에서 검출되었고, 이는 복부 접종에 따라 가능한 약간의 잔여 세포이다.
화합물 1로의 치료는 세포 접종 후에 일단 종양이 뼈에 전이되면 개시되었다(0일). 뼈 내의 종양의 존재를 또한 마우스의 전신 이미징에 의해 확인하였다. 화합물 1을 50 mg/kg/일에서 경구적으로 투여하였고 마우스의 연속적 스캐닝으로부터 결정된 바와 같이 부형제 처리와 비교하여 누드마우스 내 PC-3M luc 종양 세포의 전이적 성장을 억제하기 위하여 경향을 증명하였다. 0, 8 및 15/18일째 부형제로 처리한 마우스와 비교하여 화합물 1로 처리한 마우스는 감소된 평균 광자 강도(억제)를 나타내었다. 화합물 1 처리로의 종양 성장 억제를 광자수의 중앙값 억제를 사용하여 평가하였다(도 7). 도 7에서 보여진 바와 같이 화합물 1(50 mg/kg/d)로의 매일의 처리는 탁솔 처리(15 mg/kg)보다 더 효과적이었다. 탁솔 및 부형제로 처리하는 것 사이의 치료 효과 내 어떤 차이점도 관찰되지 않았다(도 7).
결과의 요약. 골수로 전이된 고체 종양을 치료하는데 화합물 1의 효능을 시험하였다. 이 모델에서, 누드마우스를 PC-3M-luc 세포와 함께 심장내로 접종하였다. PC-3M-luc 세포는 루시퍼라아제로 안정하게 감염된 인간 전립선 암 셀 라인이다. 접종에서, PC-3-luc 세포는 뼈를 포함하는 다기관으로 퍼졌다. 퍼진 종양 세포를 Xenogen, Corp.로부터 상업적으로 이용가능한 생체내 이미징 장치를 사용하여 시각화하였다.
누드마우스를 심장내에서 1.5 X 106 세포를 갖는 PC-3M-Luc 세포로 접종하였다. 접종 후 4주째, 부형제(n=8), 50 mg/kg에서 경구로, 화합물 1(n=7), 15 mg/kg에서 복강내로, 탁솔로 일주일에 3회 투여를 개시하였다. PC-3M-luc 세포 라인을 Xenogen로부터 구입하였고 마우스를 Xenogen's IVIS? 이미징 시스템을 사용하여 이미징하였다.
화합물 1로 처리한 마우스에서, 마우스는 부형제 및 탁솔 처리한 마우스에 대하여 감소된 광자 수의 경향을 보였다. 마우스의 머리 및 다리 영역으로부터 산출된 중앙값 광자수 및 그래프는 도 7에 나타내었다. 이 실험은 화합물 1로의 처리는 뼈로 퍼진 PC-3M-luc 세포의 성장을 잠재적으로 억제한다는 것을 확증한다.
4 T1 뮤린 유방 종양 모델 내 화합물 1의 효능
하기의 연구는 자발적인 4T1 뮤린 유방 종양 모델 내 화합물 1의 매일의 경구 투여를 평가한다.
암컷 BALB/c 마우스, 생후 9주(Charles River, Wilmington, MA),에 2.5x1054T1 세포(전이 간 종양으로부터 유도된 세포)를 오른쪽 옆구리 피하에 이식하였다. 치료는 평균 종양 부피가 140mm3 일 때 13일 후 시작하였다. 이를 연구 1일째로 지정하였다. 화합물 1을 정제한 물에서 용액으로서 조제하였고 일단 17일 동안 매일 경구적 공급으로 투여하였다.
치료군은 10, 30, 60, 100 및 150 mg/kg에서 부형제(물); 화합물 투여의 5개 군을 포함하였다(n=10/군).
연구 종점은 종양 성장, 동물 관찰 및 폐 및 간 전이의 계산을 포함한다. 치료 군 vs. 부형제의 쌍대 비교를 Student's t 테스트를 사용하여 평가하였다. 치료군 사이의 차이점을 쌍대 복합 비교를 위한 던(Dunn)의 방법에 따르는 비모수적 ANOVA(Kruskal-Wallis)를 사용하여 비교하였다. 부형제 군의 종양 부피에 기초한 18일 째 연구를 종료하였다.
결과의 요약. 치료 개시 후 4일 까지 10mg/kg 투여군을 모두 제외하고 일차적 종양 성장을 통계적으로 유효하게 억제하였다. 10, 30, 60, 100 및 150 mg/kg 투여량에 대한 최대 종양 성장 억제는 각각 32, 45, 50, 74 및 82%이었다(도 25, 표 X). 군들 사이의 비교는 10, 30과 60 mg/kg 투여 사이 대 150 mg/kg 투여 수준 및 10과 100mg/kg 군들 사이의 차이점을 드러낸다.
폐 및 간 전이를 조직내 눈에 보이는 검사에 의해 열거하였고 18일째 제거하였다. 부형제 처리한 대조군 마우스는 이전 연구에서 광범위하게 관찰된 폐 종양을 진행하지 않았고(~50%까지 감소됨) 통계적 비교에 영향을 미쳤다. 폐 전이는 화합물 1 대 부형제의 투여에 의해 유발되었다: 150 mg/kg 투여군에서, 91%까지 및 30, 60 및 100mg/kg 처리는 대조군 대 77% 이상까지의 간 종양 결절 수를 유발하였다(표 Y).
화합물 1에 의한 4 T1 일차 종양 성장 억제의 요약
화합물 1
투여량		 18일째 평균 종양부피(mm3) SD 18일째 처치군/대조군 최대 억제 %
(연구일)		 p 값 대
부형제
부형제(n=9) 2248 780
10mg/kg (n=8) 1798 513 0.80 32(11일) 0.187
30mg/kg (n=10) 1246 318 0.55 45(18일) 0.002
60mg/kg (n=10) 1248 295 0.56 50(11일) 0.002
100mg/kg (n=10) 624 184 0.28 74(14일) <0.001
150mg/kg
(n=9)		 402 95 0.18 82(18일) <0.001
투여 17일 후에 4 T1 자발적인 간 및 폐 전이에서 화합물 1의 효능
a) 간 전이 b) 폐 전이
화합물 1
투여량		 발병률 전이 수평균±SD 억제% 대 부형제 p값 대
부형제		 발병률 전이 수 평균±SD 억제% 대 부형제 p값 대
부형제
부형제(물)(n=9) 8/9 18±15 n/a n/a 9/9 27±14 n/a n/a
10mg/kg (n=8) 7/8 22±32 0 0.810 8/8 36±32 0 0.926
30mg/kg (n=10) 6/10 3±4 83 0.014 10/10 26±26 0 0.926
60mg/kg (n=10) 5/10 1±1 94 0.002 10/10 24±11 11 0.606
100mg/kg (n=10) 1/10 4±13 77 0.010 10/10 24±30 13 0.756
150mg/kg (n=9) 0/9 0±0 100 0.002 5/10 2±3 91 <0.001
요약 중의, 4T1 뮤린 유방암 종양 모델에서 화합물의 매일의, 경구적 투여의 효능을 이 실험에서 확인하였다. 유효한 일차 종양 성장 억제를 치료의 4일 후에 관찰하였다. 30, 60, 100 및 150 mg/kg의 화합물 1 투여는 각각 45%, 50%, 74% 및 82%에 의한 일차적 종양 성장을 억제하였다. 화합물 1 처리는 자발적인 폐 및 간 전이의 유효한 억제를 야기하였다. 많은 간 전이를 150 mg/kg 투여 수준에 의해 완전히 억제하였고 30, 60 및 100mg/kg에서 유효하게 감소하였다. 폐 전이는 150 mg/kg 투여 수준에서 통계적 유효수준(91% 억제)으로 감소되었다.
논의
암-세포 증식에서 관련된 표적의 비정상적인 세포내 키나아제 신호 경로는 세포적 과정을 방해할 수 있고 종양 성장의 억제를 야기한다. 이것을 두 가지의 소분자 표적 약제인 CML (Bcr-Abl) 및 위장내 기질 종양(c-KIT)에서 이마티닙(Gleevec) 및 난치의 진전된 또는 전이된 비-소세포 폐암(EGFR)에서 제피티니브(Irressa)에 의해 예시하였다. Druker B.J. Oncogene, 21 :8541-8546 (2002); Giaccone G. Clin Cancer Res. 10:4233S-4237S (2004). 종양 세포 내에서 화합물 표적 특이적 분자 결핍과 이 성공은 모두 FLT3 15,20-23를 포함하는 다른 발암 키나아제에 분자적 표적 치료상에서 연구하였다. FLT3 유전자 내 돌연변이는 AML1 내 유전적 변화가 가장 흔하며 환자의 거의 35%는 활성 돌연변이가 있다. FLT3 돌연변이는 AML 내 치료 표적으로서 FLT3를 나타내는 나쁜 임상적 예후를 주는 것으로 보였다. Thiede C. et al., Blood, 99:4326-4335 (2002); Schnittger S, et al., Blood, 2002; 100:59-66 (2002).
화합물 1은 종양 증식 및 혈관형성에서 포함되는 클래스 Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ RTK에 대한 나노몰랄 효능을 갖는 다표적 키나아제 억제제이다. 생화학적 키나아제 분석은 화합물 1이 FLT3에 대해 잠재적 활성을 갖는 것을 논증하였다(1nM의 IC5O). 두개의 백혈병 셀 라인 내 화합물 1의 활성은 FLT3 상태, MV4;11(FLT3 ITD) 및 RS4;11 (FLT3 WT)에 대조적 특징을 갖는다. 화합물 1은 투약-의존성 방법 내 FLT3 인산화를 줄이는 것을 보였고, 세포 내 분자 활성을 확인하였다. 시험관내, 화합물 1은 미토겐 MAPK 및 STAT5 경로, 세포 증식 경로 내 열쇠 조절자 모두에서 다음의 다운스트림 신호를 차단하였다. 흥미롭게도, 세포의 세포독성/증식 분석에서 화합물 1의 효과가 있다면 FLT3 표적 조절 상 활성을 RS4;11 세포보다 MV4;11에서 더 전달하였다. FLT3-ITD 및 야생형 FLT3에 대한 유사한 다른 효과가 다른 FLR3 억제제에 대해 보고되었다. 세포 증식을 구동하는 FLT3 ITD MV4;11 세포는 구조적으로 활성 신호를 가지며, FLT3 활성의 성장 독립을 지탱할 수 있는 그리고/또는 다른 발암 경로에 의존할 수도 있는 FLT3 WT (RS4;11) 세포와는 다르다고 생각할 수 있다. Minami Y. et al., Blood, 102:2969-2975 (2003); Kiyoi H. et al., Oncogene, 21 :2555-2563 (2002); Spiekermann K. et al., Clin Cancer Res. 9:2140-2150 (2003).
생체내 연구로부터의 결과는 화합물 1이 백혈병의 고체 종양 및 퍼진 BM 모델 모두에 대해 효능 활성을 가지는 것을 증명하였다. 임상전 모델 내 화합물 1의 분자적 활성을 범위 및 표적 조절의 강도를 연구하기 위하여 PD 말단을 사용하여 처리하였다. 화합물 1은 MV4;11 종양 내 pFLT3 및 pERK 모두에서 실질적으로 하향조절하는 것을 보여준다. 화합물 1의 단일 투여 또는 복합 투여에 따라 표적 조절(pFLT3)을 4시간까지 관찰하였고 24시간 까지 종양에서 지속하였다. 생물학적 효과는 또한 종양 조직학으로부터 명백하였고, 종양내에서 감소된 pERK, 증식 및 세포자살 반응을 약물 처리 후 1-2일 내에 관찰하였다. MV4;11의 고체 종양 이종이식에서, 종양 퇴화는 또한 약물 처리의 수일 내에 전달되었다. MV4;11 모델 내 화합물 1의 강력한 억제 효과는 다른 RTK의 억제와 조합하여 FLT3의 직접적 억제로부터 일어날 수도 있는 가능성이 있다. 데이타(RT-PCR, 보여지지 않음)는 MV4;11 세포가 또한 VEGFR1 , cKIT, PDGFRβ, FGFR1 , 및 CSF-1R, 화합물 1에 의해 강력하게 억제된 모든 RTK를 발현시키는 것을 나타낸다. 화합물 1은 VEGF1/2/3 에 대해 <10 nM 활성을 갖고, 데이타는 화합물 1이 시험관내 배양에서 MV4;11 내 오토크라인 VEGF 수준을 억제할 수 있음을 명확하게 증명한다. 생체내에서, 종양 세포 또는 종양 기질 세포(내피 세포를 포함)에 의해 분비된 VEGF 또는 FGF의 오토크라인 또는 파라크라인 억제는 이들 세포의 증식 및 생존을 억제할 수도 있다. Ferrara N. et al., Nat Med., 9:669-676 (2003); Compagni A. et ai, Cancer Res. 60:7163-7169 (2000); Carmeliet P. Nat Med., 9:653-660 (2003). 고체 종양 내 화합물 1의 추가적 활성은 혈관형성을 하는 동안 혈관주위세포의 보충 및 혈관의 돌연변이를 영향을 줌으로써 PDGFRβ에 대한 그것의 강력한 효과로부터 일어날 수도 있다. Carmeliet P. Nat. Med. 9:653-660 (2003); Ostman A. Cytokine Growth Factor Rev., 15:275-286 (2004). AML BM 모델에서, 발명자들은 화합물 1이 마우스의 생존을 개선하였고, 일부 마우스에서는 질병을 박멸한 것을 증명하였다. 이것은 직접적인 항-증식 효과 또는 골수 혈관형성의 조절에 의한 순환 블라스트 및 BM 질병 모두를 박멸하기 위한 화합물 1의 잠재력을 나타내며, 이는 블라스트 생존에서 역할을 할 수도 있다. Carow CE. et al., Blood, 87:1089-1096 (1996); Drexler H.G. Leukemia, 10:588-599 (1996).
화합물 1의 약학 및 표적 억제에 기초하여, 화합물 1의 간헐적 및 주기적 투여 계획을 연구하였다. 화합물 1의 또 다른 투여 계획은 화합물 1의 매일의 투여와 비교하여 유사한 활성을 증명하였고, 임상에서 유연한 투여 처방을 위한 잠재력을 암시하였다. 화합물 1의 복합 투여는 종양의 성장을 계속적으로 억제할 수 있었고 치료의 중단 후에 어떤 재발하는 종양을 약물로 재치료하는데 동일하게 민감하다는 것을 발견하였다. 일부 AML 환자가 계속된 치료에도 불구하고 키나아제 억제제로의 치료에서 병이 재발함을 보여준 바와 같이, 이러한 발견점들은 임상적 설정으로 옮겨진다면 적절하다. Fiedler W. et al., Blood, (2004); Cools J. et al., Cancer Res. 64:6385-6389 (2004). 대사 또는 세포적 유출(P-글리코단백질과 같은 약물 전달자의 발현을 통함)을 포함하는 복합 메커니즘, 또는 효소 활성 자리의 ATP결합 도메인 내의 돌연변이는 키나아제 억제제에 저항과 관련하는 것을 보여진 약물 결합을 방해한다. Bagrintseva K. et al., Blood, 103:2266-2275 (2004); Grundler R. et al., Blood, 102:646-651 (2003). 화합물 1은 P-GP 기질이 아니며, 약물 치료의 과정을 통하여 내구성 있는 반응은 화합물 1로 피할 수도 있는 저항성의 진전을 의미할 수도 있다.
AML을 위한 FLT3 억제제의 임상적 개발(SU11248 PKC412, CEP-701, MLN518)은 여전히 초기 단계에 있다. O'Farrell A.M. et al., Clin. Cancer Res. 9:5465-5476 (2003); Fiedler W. et al., Blood, (2004); Stone R.M. et al., Ann Hematol. 83 Suppl 1:S89-90 (2004); Smith B.D. et al., Blood, 103:3669-3676 (2004); DeAngelo D.J. et al., Blood, 102:65a (2003). 단일 약제 치료의 선택은 아직 유효한 반응을 생산하지 않았고, AML 내 FLT3 억제제의 미래의 임상적 개발은 세포독성 약물 또는 다른 분자적 표적 약물로 이들 약제와 조합하는 것에 의존한다. 데이터를 화합물 1에 대해 본원에 보고하였고, AML의 발병에서 역할을 하는 것으로 알려진 RTK 상의 추가적 활성으로 강력한 FLT3 억제제는 그것의 임상적 평가를 보장한다.
화학식 IB, 및 IC와 같은 화학식 I의 다른 화합물을 상기 기술한 바와 같이 제공하였다. 이들 화합물을 사용하는 연구를 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온에 대해 상기 기술한 바와 같은 계통적 분류법을 사용하여 수행하였다. 이들 연구는 이들 화합물이 또한 마우스, 인간, 및 다른 포유동물 대상에서 혈액 종양을 포함하는 전이 종양을 치료하는데 유용하다는 것을 보여줄 것이다.
본원에 인용된 모든 문서 또는 참고문헌은 본원에서 전체적으로 제시된 바와 같은 정도로 전체가 모든 목적을 위해 참고로써 본원에 포함된다. 본 발명은 본원에 예시를 위해 제시된 구체예로 제한되지 않으며, 본 발명의 범주내에 있는 것으로서 이들의 모든 이러한 형태를 포함하는 것으로 이해된다.

Claims (41)

  1. 화학식 IA의 화합물, 화합물의 호변체, 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 호변체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 전이된 전립선 암 치료용 조성물로서,
    화학식 IA의 화합물은
    Figure 112013086347039-pct00042
    (화학식 IA)
    이고,
    조성물 투여 후에 종양의 성장이 억제되는, 전이된 전립선 암 치료용 조성물.
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  3. 제 1 항에 있어서, 조성물은 화학식 IA의 화합물 또는 이들의 호변체의 락트산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 전이된 전립선 암은 환자의 뼈에 전이된 것을 특징으로 하는 조성물.
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