MX2007009099A - Tratamiento de tumores con metastasis. - Google Patents

Abstract

Metodos para el tratamiento de cancer metastatico tal como un tumor que forma metastasis incluyen administrar un compuesto de Estructura 1, un tautomero del compuesto, una sal farmaceuticamente aceptable del compuesto, una sal farmaceuticamente aceptable del tautomero, o una mezcla del mismo a un sujeto. El compuesto, tautomero, sal del compuesto, sal del tautomero, o mezcla del mismo se puede usar para preparar medicamentos para el tratamiento del cancer metastatico. La variable A tiene los valores aqui definidos.

Description

TRATAMIENTO DE TUMORES CON METÁSTASIS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere generalmente a métodos y composiciones para el tratamiento de tumores con metástasis en sujetos. Más particularmente, la presente invención proporciona el uso de un compuesto tal como 4-amino-5-fluoro-3- [6- (4- metilpiperazin-l-il)-lH-benzimidazol-2-il]quinolin-2(lH)-ona y tautómeros, sales y mezclas de los mismos en el tratamiento y preparación de medicamentos para tratar tumores con metástasis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los capilares alcanzan casi todos los tejidos del cuerpo humano y suministran a los tejidos con oxígeno y nutrientes así como también eliminan productos de desecho. Bajo condiciones típicas, las células endoteliales que revisten los capilares no se dividen, y los capilares por lo tanto, no se incrementan normalmente en número o tamaño en un adulto humano. Bajo determinadas condiciones normales, sin embargo, tal como cuando se daña un tejido, o durante ciertas partes del ciclo menstrual, los capilares comienzan a proliferar rápidamente. Este proceso de formación de nuevos capilares comienza a proliferar rápidamente. Este proceso de formación de nuevos capilares a partir de los vasos sanguíneos pre- REF..184862 existentes se conoce como angiogénesis o neovascularización. Ver Folkman, J. Scientific American 275, 150-154 (1996) . La angiogénesis durante la cicatrización de heridas es un ejemplo de la neovascularización patofisiológica durante la vida del adulto. Durante la cicatrización de heridas, los capilares adicionales proporcionan un suministro de oxígeno y nutrientes, promueven el tejido de granulación, y ayudan en la remoción de desechos. Después de la terminación del proceso de cicatrización, retroceden normalmente los capilares. Lymboussaki, A. "Vascular Endothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos, Adults, and in Tumors" Academic Dissertation, University of Helsinki, Molecular/Cáncer Biology Laboratory and Department of Pathology, Haartman Institute, (1999). La angiogénesis también juega un papel importante en el crecimiento de células de cáncer. Se sabe que una vez que un nido de células de cáncer alcanza un determinado tamaño, aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, las células de cáncer deben desarrollar un suministro de sangre con objeto de que el tumor crezca más grande ya que la difusión no será suficiente para suministrar a las células de cáncer con suficiente oxígeno y nutrientes. Así, la inhibición de la angiogénesis se espera que detenga el crecimiento de las células de cáncer. Los receptores de cinasa (RTKs) son polipéptidos de transmembrana que regulan el crecimiento y diferenciación celular en desarrollo, la remodelación y la regeneración de tejidos de adultos. Mustonen, T. et al., J. Cell Biology 129, 895-898 (1995); van der Geer, P. et al. Ann Rev. Cell Biol. 10, 251-337 (1994). Los ligandos de polipéptidos conocidos como factores de crecimiento o citocinas, se conoce que activan las RTKs. Las RTKs de señalización involucran el enlace a ligandos y un giro en la conformación en el dominio externo del receptor, lo que resulta en su dimerización. Lymboussaki, A. "Vascular Endothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos, Adults, and in Tumors" Academic Dissertation, University of Helsinki, Molecular/Cáncer Biology Laboratory and Department of Pathology, Haartman Institute, (1999); Ullrich, A. et al., Cell 61 , 203-212 (1990). El enlace del ligando al RTK resulta en la transfosforilación del receptor en residuos específicos de tirosina y la posterior activación de los dominios catalíticos para la fosforilación de los sustratos citoplásmicos. Id. Dos subfamilias de RTKs son específicas del endotelio vascular. Estas incluyen la subfamilia del factor de crecimiento endothelial vascular (VEGF) y la subfamilia del receptor Tie. Las RTK de Clase V incluyen VEGFR1 (FLT-1), VEGFR2 (KDR (humano), Flk-1 (ratón)), y VEGFR3 (FLT-4). Shibuya, M. et al., Oncogene 5, 519-525 (1990); Terman, B. et al., Oncogene 6, 1677-1683 (1991); Aprelikova, 0. et al., Cáncer Res. 52, 746-748 (1992). El cáncer es una enfermedad que involucra múltiples defectos genéticos que impulsan la proliferación de células de tumor. Por lo tanto, las estrategias que simultáneamente inhiban las trayectorias de señalización celular múltiple pueden conducir a resultados terapéuticos más favorables. La sobre-expresión de RTK y/o las mutaciones por activación están a menudo presentes en células de tumor y están implicadas en el crecimiento del tumor. Blume-Jensen, P and Hunter, T., Oncogenic Kinase Signaling, " Nature, 411 , pp. 355-65 (2001); Carmeliet, P., "Manipulating Angiogénesis in Medicine," J. Intern. Med., 255, pp . 538-61 (2004). La mayoría de las RTKs comprenden un dominio extracelular, el cual se asocial con los dominios del enlace al ligando y de cinasa intracelular que media la autofosforilación, el reclutamiento de las moléculas de señalización cadena abajo que disparan una cascada de eventos de transducción de señal. Hay más de 30 RTKs implicadas en el cáncer, por ejemplo RTK de tipo III (PDGFR, CSF-1 R, FLT3, y c-KIT), tipo IV (FGFR1-4) , y tipo V (VEGFR1-3) . El mieloma múltiple (MM) , una enfermedad de las células B malignas, se caracteriza por la acumulación de células clónales de plasma en lesiones de la médula ósea (BM) y del hueso osteolítico. El transplante de células madre autólogas (ASCT) y los avances en el cuidado de apoyo, han tenido un impacto importante en la enfermedad y la supervivencia a largo plazo. Attal, M. etal., N. Engl. J. Med., 1996; 335:91-97; and Barlogie, B. et al., Blood, 1997; 89:789-793. Sin embargo, los pacientes invariablemente recaen, y el MM permanece como una enfermedad universal fatal. La identificación de transubicaciones cromosomales no aleatorias en MM, ha resultado en el desarrollo de herramientas poderosas de pronóstico y la identificación de objetivos moleculares novedosos. Casi la mitad de los pacientes con MM sobre-expresan un oncogen supuesto, desregulado por una de las cinco transubicacíones recurrentes de inmunoglobulina pesada (IgH): llql3 (ciclina DI), 6p21 (ciclina D3 ) , 4pl6 (FGFR3 y MMSET), 16q23 (c-maf) y 20qll (mafB) . Kuehl, W. M. et al., Nat Rev Cáncer, 2002; 2:175-187; y Avet- Loiseau, H. etal., Blood, 2002; 99:2185-2191. Estas transubicaciones probablemente representan un evento temprano y posiblemente seminal en el desarrollo del MM. Más recientemente, ha estado claro que estas transubicaciones específicas de IgH imparten importancia de pronóstico. Particularmente, la transubicación t(4;14) la cual se presenta en aproximadamente 15% de los pacientes parece conferir un pronóstico particularmente pobre para MM, sin ningún beneficio terapéutico aparente de ASCT. Fonseca, R. et al., Blood, 2003; 101 :4569-4575; Keats, J. J. et al., Blood, 2003; 101 :1520-1529; Moreau, P. et al., Blood, 2002; 100:1579-1583; and Chang, H. et al., Br . J. Haematol., 2004; 125:64-68. Claramente, se requieren enfoques novedosos de tratamiento para estos pacientes. La transubicación t(4;14) es inusual en que parece desregular dos oncogenes potenciales, MMSET sobre der (4) y FGFR3 sobre der (14). Chesi, M. et al., Nat. Genet, 1997; 16:260-265; y Chesi, M. et al., Blood, 1998; 92:3025-3034. No se sabe si la desregulación de cualquiera o ambos de estos genes sea crítica para la patogénesis de MM, sin embargo, varias líneas de evidencia apoyan un rol para FGFR3 en el inicio y avance del tumor. La activación de WT FGFR3, una RTK, promueve la proliferación y supervivencia en células de mieloma y se transforma débilmente en un modelo de ratón hematopoyético. Plowright, E. E. et al., Blood, 2000; 95:992-998; Chesi, M. et al., Blood, 2001; 97:729-736; y Pollett, J. B. et al., Blood, 2002; 100:3819-3821. La posterior adquisición de mutaciones activadoras de FGFR3 en algunos MM se asocial con el avance hacia el mieloma de etapa tardía y son fuertemente transformadoras en diversos modelos experimentales. Chesi, M. et al., Blood, 2001; 97:729-736; y Li, Z. et al., Blood, 2001 ; 97:2413-2 19. Los estudios in vitro sugieren que FGFR3 puede impartir quimioresistencia, una observación apoyada por datos clínicos que demuestran las pobres respuestas a la quimioterapia convencional y la supervivencia mediana acortada de pacientes con MM de t(4;14). Fonseca, R. et al., Blood, 2003; 101 :4569-4575; Keats, J. J. et al., Blood, 2003; 101 : 1520- 1529; Moreau, P. et al., Blood, 2002; 100:1579-1583; y Chang, H. et al., Br.

J. Haematol . , 2004; 125:64-68. Estos hallazgos sugieren que la expresión ectópica de FGFR3 puede jugar un papel importante, aunque no singular, en la oncogénesis por mieloma, haciendo así a esta RTK un objetivo para la terapia de base molecular. La inhibición de FGFR3 en las líneas celulares t(4;14) de MM induce respuestas citotóxicas que demuestran que estas células permanecen dependientes de la señalización de FGFR3 a pesar de la complejidad de las alteraciones genéticas en estas células derivadas de pacientes en etapa terminal.

Trudel, S. et al., Blood, 2004; 103:3521-3528; Paterson, J. L. et al., Br. J. Haematol., 2004; 124:595-603; y Grand ,E.

K. et al., Leukemia, 2004; 18:962-966. Estas observaciones son congruentes con los resultados de la inactivación del receptor de tirosina en un intervalo de malignidades humanas en donde los éxitos clínicos se han documentado y alentado el desarrollo clínico de los inhibidores de FGFR3 para el tratamiento de estos pacientes con un pobre pronóstico.

Druker, B. J. et al., N. Engl. J. Med., 2001; 344:1031-1037; Demetri, G. D. et al., N. Engl. J. Med., 2002; 347:472-480; Slamon, D. J. et al., N. Engl. J. Med. 2001 ; 344:783- 792; y Smith, B. D. et al., Blood, 2004; 103:3669-3676.

La leucemia mielógena aguda (AML) es un cáncer agresivo y representa 90% de todas las leucemias agudas en adultos con una incidencia de 3.9 por 100,000 y un estimado de 10,500 nuevos casos cada año, A. et al., Exper. Rev. Anticancer. Ther., 3:695-710 (2003). Los agentes citotóxicos (AraC + antraciclina) pueden inducir la remisión en hasta el 70% de los pacientes con AML. Sin embargo, una gran fracción rece lo que refleja la necesidad de terapias más efectivas. Weick, J. K. et al., Blood, 88:2841-2851 (1996); Vogler, W.R. et al., J. Clin. OA7CO/.,, 10:1103-1111 (1992). La formación de genotipos de células de tumor indica que 25-35% de los blastos de AML llevan mutaciones de una tirosina cinasa del tipo f s ( flt3/Flk2/Stk-2 ) , mientras que una fracción más grande (>70%) expresa el FLT3 de tipo silvestre. Gilliiand, D.G. et al., Curr Opin. Hematol., 9:274-281 (2002); Nakao, M. et al., Leukemia, 10:1911-1918 (1996); Yokota, S. et al., Leukemia, 11 : 1605-1609 (1997). El receptor FLT3 es un miembro de las tirosina cinasas del receptor de Clase III (RTK) que incluye CSF-1 R, c-KIT, PDGFR, y se conocen funcionalmente que juegan un papel importante en la proliferación, diferenciación, y supervivencia de células hematopoyéticas, células dendríticas, células exterminadoras naturales (NK) y células progenitoras B. McKenna, HJ. et al. Blood, 95:3489-3497 (2000); Mackarehtschian, K. et al., Immunity, 3:147-161 (1995). FLT3, como otras RTKs, se caracteriza por cinco dominios extracelulares del tipo IG y contiene un dominio de inserto hidrofílico de cinasa. Blume-Jensen, P. et al., Nature, 411:355-365 (2001). La transducción de señal que sigue al ligamiento de FLT3 modula trayectorias múltiples cadena abajo, incluyendo STAT5 (transductor de señal y activador de la transcripción 5), Ras/MAPK (proteína cinasa activada con mitógeno) , y PI3K. Hayakawa, F. et al., Oncogene, 19:624-631 (2000); Takahashi, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 316:85-92 (2004); Zhang, S. et al., J. Exp. Med., 192:719-728 (2000); Rosnet, O. et al., Acta Haematol., 95:218-223 (1996). En células con FLT3 mutante, la señalización oncogénica se ha ligado a la activación constitutiva de cinasa (en ausencia del ligamiento con FLT3) que resulta de la activación desregulada de cinasa y/o la pérdida de la función del dominio autoinhibidor. Stirewalt, D. L. et al., Nat. Rev. Cáncer, 3:650-665 (2003); Brown, P. et al., Eur. J. Cáncer, 40:707-721 (2004). La caracterización molecular de estas mutaciones de FLT3 ha revelado ya sea duplicaciones internas en tándem (ITD) en la región de la yuxtamembrana de FLT3 o mutaciones de punto en el dominio de cinasa (ASP835/836) , con 17-34% que es FLT3 ITD y aproximadamente 7% de mutaciones de punto. Yamamoto, Y. et al., Blood, 97:2434-2439 (2001); Thiede, C, et al., Blood, 99:4326-4335 (2002); Abu-Duhier, F.M. et al., Br. J. Haematol., 113:983-988 (2001). Adicionalmente, hay una evidencia considerable que implica mutaciones de FLT3 ITD como un pronóstico negativo en AML, lo que se correlaciona con una recaída creciente de la enfermedad y una supervivencia global disminuida. Thiede, C. et al., Blood, 99:4326-4335 (2002); Schnittger, S. et al., Blood, 100: 59-66 (2002). Dada la relevancia de las mutaciones de FLT3 en AML, diversos enfoques dirigidos que utilizan inhibidores/anticuerpos de moléculas pequeñas de cinasas para FLT3 se exploran actualmente en las fases tempranas o preclínicas del desarrollo de fármacos. Brown, P. et al., Eur. J. Cáncer, 40:707-721 (2004); O'Farrell, A.M. et al., Clin. Cáncer Res., 9:5464-5476 (2003); Weisberg, E., et al., Cáncer Cell, 1:433-443 (2002); Smith, B.D. et al., Blood, (2004); Kelly, L.M. et al., Cáncer Cell, 1:421-432 (2002). En tumores de la próstata, además del papel de VEGFR, y PDGFR en la angiogénesis, varios factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) y sus receptores (FGFRs) aceleran la comunicación clave estromal-epitelial en el desarrollo y homeostasis de la próstata humana. Griffioen, A.W. and Molema, G., "Angiogénesis: Potentials for Pharmacologic Intervention in the Treatment of Cáncer, Cardiovascular Diseases, and Chronic Inflammation, " Pharmacol. Rev., 52, pp . 237-68 (2000); Ferrara, N.. "VEGF: an Update on Biological and Therapeutic Aspects," Curr. Opin. Biotechnol., 11 , pp. 617-24 (2000); Kwabi- Addo, B., Ozen, M., and Ittmann, M., "The Role of Fibroblast Growth Factors and their Receptors in Cáncer de próstata," Endocr. Relat. Cáncer, 11 , pp. 709-24 (2004); y Gowardhan, B., Douglas, D.A., Mathers, M.E., et al., "Evaluation of the Fibroblast Growth Factor System as a Potential Target for Therapy in Human Cáncer de próstata," Br. J. Cáncer, 92, pp . 320-7 2005) . Las alteraciones en la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) se han implicado en la patogénesis del cáncer de próstata. Ozen, M., Giri, D., Ropiquet, F. , Mansukhani, A., and Ittmann, M., "Role of Fibroblast Growth Factor Receptor Signaling in Cáncer de próstata Cell Survival," J. Nati. Cáncer Inst., 93, pp . 1783-90 (2001). En muchos casos, el cáncer de próstata hace metástasis preferiblemente con el hueso, y así los pacientes tienen un riesgo elevado de desarrollar complicaciones del esqueleto, y/o fracturas, lo cual es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con cáncer de próstata. Existe una necesidad para métodos de tratamiento de cáncer de próstata y para métodos de prevención de la metástasis de cáncer de próstata al hueso en pacientes con cáncer de próstata. Diversos compuestos sustituidos de indolilo se han descrito recientemente en WO 01/29025, WO 01/62251, y WO 01/62252, y se han descrito recientemente diversos compuestos de bencimidazolilo en WO 01/28993. Estos compuestos frecuentemente pueden inhibir, modular, y/o regular la transducción de señal de las tirosina cinasas sin receptor y del tipo de receptor. Algunos de los compuestos descritos contienen un fragmento de quinolona enlazado al grupo indolilo o bencimidazolilo. La síntesis de derivados de 4-hidroxi quinolona y 4-hidroxi quinolina se describe en diversas referencias las cuales se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos como si se establecieran completamente en la pésente. Por ejemplo, Ukrainets et al., han descrito la síntesis de 3- (benzimidazol-2-yl) -4-hidroxi-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina . Ukrainets, I. et al., Tet. Lett. 42, 7747-7748 (1995); Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 2, 239- 241(1992). Ukrainets también ha descrito la síntesis, actividad anticonvulsive y anti-tiróidica de otras 4-hidroxi quinolonas y los análogos de tio tales como lH-2-oxo-3- (2-benzimidazolil ) -4-hidroxiquinolina . Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 1 , 105-108 (1993); Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 8, 1105-1108 (1993); Ukrainets, I. et al., Chem. Heterocyclic Comp. 33, 600-604, (1997) . La síntesis de diversos derivados de quinolina se describe en WO 97/48694. Estos compuestos se describen como que pueden enlazarse a los receptores de la hormona nuclear y son útiles en estimular la proliferación de osteoblastos y el crecimiento de los huesos. Los compuestos también se describen por ser útiles en el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con las familias del receptor de la hormona nuclear. Diversos derivados de quinolina, en los cuales el anillo de benceno de la quinolona se sustituye con un grupo azufre, se describen en WO 92/18483. Estos compuestos se describen por ser útiles en formulaciones farmacéuticas y como medicamentos . Los derivados de quinolona y cumarina se han descrito por tener uso en una variedad de aplicaciones no relacionadas con la medicina y formulaciones farmacéuticas. Las referencias que describen la preparación de derivados de quinolona para uso en composiciones fotopolimerizables o para propiedades luminiscentes incluyen: Patente de E.U.A. No. 5,801,212 concedida a Okamoto et al.; JP 8-29973; JP 7-43896; JP 6-9952; JP 63-258903; EP 797376; y DE 23 63459 las cuales todas se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos como si se establecieran completamente en la presente. Diversos compuestos de quinolinona benzimidazol útiles en inhibir la angiogénesis y las tirosina cinasas del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular y en inhibir otras tirosina y serina/treonina cinasas incluyen 4-amino-5-fluoro-3- [5- ( 4-metilpiperazin-l-il ) -lH-benzimidazol- 2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona o un tautómero del mismo, se describen en los siguientes documentos los cuales cada uno se incorpora en la presente como referencia en sus totalidades y para todos los propósitos como si se establecieran por completo en la presente: patente de E.U.A. No. 6,605,617; patente de E.U.A. No. 6,756,383; solicitud de patente de E.U.A. No. 10/116,117 presentada (publicada el 6 de febrero, 2003, como US 2003/0028018 Al); solicitud de patente de E.U.A. No. 10/644,055 (publicada el 13 de mayo, 2004, solicitud de patente de E.U.A. No. 2004/0092535); solicitud de patente de E.U.A. No. 10/983,174; solicitud de patente de E.U.A. No. 10/706,328 (publicada el 4 noviembre, 2004, como 2004/0220196); solicitud de patente de E.U.A. No. 10/982,757; y solicitud de patente de E.U.A. No. 10/982,543. A pesar de los avances recientes en los métodos de tratamiento de tumores y del cáncer, existe todavía una necesidad importante para nuevos métodos de tratamiento del cáncer y especialmente para nuevos métodos y composiciones para tratar el cáncer metastático tal como tumores con metástasis. Los métodos para el tratamiento de mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda y cáncer de próstata se requieren además.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para tratar cáncer metastático y particularmente tumores metastáticos. La invención proporciona además el uso de los compuestos, tautómeros de los mismos, sales de los mismos y mezclas de los mismos en el uso de formulaciones farmacéuticas y medicamentos para tratar el cáncer metastático. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer metastático en un sujeto, tal como un paciente con cáncer humano. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, o cáncer de próstata. En otras modalidades, un método para tratar tumores metastáticos se proporciona. En otras modalidades, un método para tratar a un sujeto que tiene un tumor metastático se proporciona. Las modalidades adicionales proporcionan métodos para tratar tumores hematológicos. Otras modalidades proporcionan métodos para tratar tumores sólidos. Los métodos incluyen administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de la estructura I, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos. La estructura I tiene la siguiente fórmula : T en donde, A es un grupo que tiene una de las siguientes estructuras : en donde, R1 se selecciona de H o grupos alquilo de cadena recta o ramificada que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono . En diversas modalidades de los métodos de la invención, el crecimiento del cáncer o tumores que forma metástasis (en el sujeto) se inhiben después de la administración . En algunas modalidades, R1 es un grupo metilo, y el compuesto de la estructura I tiene la estructura IA IA En algunas modalidades, R1 es un hidrógeno, y el compuesto de la estructura I tiene la estructura IB IB En algunas modalidades, R1 es un grupo metilo, y el compuesto de la estructura I tiene la estructura IC IC Otras modalidades proporcionan métodos para tratar a un sujeto que tiene un tumor que forma metástasis que comprende: poner en contacto el tumor que forma metástasis con un compuesto de la estructura IA, IB o IC. En algunas modalidades, el compuesto se administra sistémicamente. Más particularmente el compuesto de la estructura I se administra oralmente o intravenosamente. En algunas modalidades, un segundo agente se administra al sujeto. Más particularmente el segundo agente es para el tratamiento de osteoporosis, tal como un bisfosfonato. En otras modalidades el segundo agente es un agente anticáncer. En algunas modalidades, el compuesto es un compuesto de la estructura I, IA, IB, o IC, y la sal de lactato del compuesto o el tautómero se administran al sujeto. En algunas modalidades, el tumor es mieloma múltiple y el sujeto es un paciente con mieloma múltiple con una transubicación cromosomal t(4;14). Más particularmente, el tumor es un tumor hematológico. En algunas modalidades, el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el mieloma múltiple expresa el receptor 3 del factor de crecimiento del fibroblasto . En algunas modalidades, el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y la mieloma múltiple que forma metástasis a un hueso del paciente tal como a la médula ósea. En algunas modalidades, el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el paciente es un humano . En algunas modalidades, el tumor es leucemia mielógena aguda (AML) y el sujeto es un paciente con leucemia mielógena aguda. En algunas de tales modalidades, el sujeto es un mamífero en el cual, en algunas modalidades, es un humano y en otras modalidades es un perro o gato. En algunas modalidades, el tumor o cáncer se selecciona de un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, o un cáncer de mama . En algunas modalidades, el tumor es cáncer de próstata, el sujeto es un paciente con cáncer de próstata, y el cáncer de próstata que forma metástasis a un hueso del paciente. En algunas modalidades, el tumor es cáncer de próstata, el sujeto es un paciente con cáncer de próstata, y el paciente es un humano. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un compuesto de la estructura I, IA, IB, y/o IC, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos en la preparación de un medicamento o una formulación farmacéutica para el uso en cualquiera de las modalidades de cualquiera de los métodos de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un kit que incluye un recipiente que comprende un compuesto de la estructura I, IA, IB, y/o IC, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos. El kit puede incluir otro compuesto para uso en el tratamiento de un cáncer que forma metástasis o un tumor. El kit puede además incluir una descripción escrita con direcciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención. En algunas modalidades, la descripción escrita puede incluir un documento que esta separado del recipiente del kit mientras que en otras modalidades, la descripción escrita puede ser escrita en una etiqueta que se fija al recipiente del kit. Los objetos adicionales, características y ventajas de la invención deberán ser aparentes de la siguiente descripción detallada y dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una gráfica que muestra que los ratones de color crema SCID inyectados con células KMS-11-luc y tratados con 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona (20 mg/kg/d) exhiben un conteo de fotones medio significativamente menor que aquellos relacionados con el vehículo. La figuras 2-5 son gráficas que muestran la actividad antitumor de la 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2 ( ÍH) -ona (Compuesto 1) en un modelo de xenoinjerto subcutáneo de MV4;11 humano o tumores leucémicos RS4;11 en los ratones SCID-NOD. Las células (FIGURA 2) MV4;11 o (FIGURA 3) RS4;11 se implantaron s.c. en el lado derecho de los ratones SCID-NOD (n= 10 ratones/grupo) . En los estudios MV4;11, el vehículo (0) o el compuesto 1 en dosis de 1 (•). 5 (?) , o 30 (B) mg/kg/d durante 15 días se administraron oralmente cuando los tumores fueron ~ 300 mm3. En los estudios RS4;11, el vehículo (0) o compuesto 1 en dosis de 10 (?) , 30 (B) , 100 (*) o 150 (•) mg/kg/d durante 8 días se administraron oralmente cuando los tumores fueron ~ 300 mm3. Los regímenes (FIGURA 4) que se efectúan diariamente, intermitentemente y en dosis de ciclos del compuesto 1 en la eficacia de los tumores MV4;11. El compuesto 1 se administró oralmente en una dosis de 30 mg/kg ya sea diariamente (B) , cada otro día/q.o.d. (•) o día 7 cíclico en/7 días (X) . (FIGURA 5) . El compuesto 1 induce la regresión de los tumores grandes MV4;11. Los tumores MV4;11 s.c. (n=10 ratones/grupo) se colocaron en etapas 300 (A), 500 (B) o 1000 (•) mm3. Los datos se expresaron como volumen de tumor medio + SE (n = 10 ratones/grupo) . La figura 6 es una gráfica que muestra que la 4-amino-5- fluoro-3- [6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona (Compuesto 1) prolonga la supervivencia de los ratones SCID-NOD que portan células MV4;11 intravenosas. Los ratones irritados SCID-NOD se implantaron con MV4;11 (1 x 107 células, i.v.), i.v. Los tratamientos se iniciaron en el día 23, que consisten de ya sea el vehículo oral (*) o compuesto 1 a 20 mg/kg dado diariamente (?) o en promedio de 7 días activado/7 días inactivado (H) a partir de 23 - 98 días. Los ratones que presentaron tempranamente parálisis de las extremidades traseras o condición de deterioro de salud se les aplico la eutanasia. La FIGURA 6 ilustra el porcentaje de supervivencia Kaplan-Meier contra la gráfica de tiempo (n= 10-12 ratones/grupo) . La figura 7 incluye gráficas que muestran el conteo de fotones individual (en escala grande) generado de las áreas abdominal, cabeza y pierna de ratones agénicos inyectados con células PC-3M-luc y luego tratadas con vehículo, taxol, o el compuesto 1. La gráfica muestra que el tratamiento con el compuesto 1 (154258) demuestra una tendencia para inhibir el conteo del fotón PC-3M-luc e inhibir el crecimiento de las células PC-3M-luc que sea diseminado en el hueso. La figura 8 es una gráfica de volumen de tumor contra el día de tratamiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para tratar cáncer metastático, particularmente tumores que forman metástasis, tales como mieloma múltiple que forma metástasis y cáncer de próstata que forma metástasis. La invención también proporciona el uso de los compuestos, tautómeros, sales y mezclas de los mismos en la preparación de medicamentos o formulaciones farmacéuticas para tratar cáncer metastático, particularmente tumores sólidos o tumores hematológicos. Las siguientes abreviaturas y definiciones se usan a través de esta solicitud: "AML" es una abreviatura que aparece para la leucemia mielógena aguda. "ALS" es una abreviatura que aparece para la esclerosis lateral amiotrófica. "AD" es una abreviatura que aparece para la Enfermedad de Alzheimer. "APP" es una abreviatura que aparece para la proteína precursora amiloide. "ASCT" es una abreviatura que aparece para el transplante de célula madre autológa. "BM" es una abreviatura que aparece para la médula ósea. "bFGF" es una abreviatura que aparece para el factor de crecimiento de fibroblasto básico.

"FGFR1", también referido como bFGFR, es una abreviatura que aparece para una tirosina cinasa que interactúa con el factor de crecimiento de fibroblasto FGF. "Cdc 2" es una abreviatura que aparece para el ciclo de división celular 2. "Cdk 2" es una abreviatura que aparece para la cinasa dependiente de la ciclina 2. "Cdk 4" es una abreviatura que aparece para la cinasa dependiente de la ciclina 4. "Chk 1" es una abreviatura que aparece para el punto de control de la cinasa 1. "CK1 e" es una serina/treonina cinasa que aparece para la caseína cinasa 1 (epsilon) . "c-ABL" es una abreviatura para una tirosina cinasa que aparece para un producto oncogeno originalmente aislado del virus de leucemia Abelson. "C-Kit" también conocido como el receptor del factor de célula madre o receptor del factor de mastocitos. "FGF" es una abreviatura para el factor de crecimiento de fibroblasto que interactúa con FGFR1. "FGFR3" es una abreviatura que aparece para el receptor del factor de crecimiento de fibroblasto de tirosina cinasa 3 que se expresa frecuentemente en cáncer de tipo mieloma múltiple . "Flk-1" es una abreviatura que aparece para el hígado de fetal de tirosina cinasa 1, también conocido como tirosina cinasa de dominio de inserto de cinasa o KDR (humano) , también conocido como receptor del factor de crecimiento endotelial vascular-2 o VEGFR2 (KDR (humano), Flk-1 (ratón)). "FLT-1" es una abreviatura que aparece para la tirosina cinasa-1 de tipo fms, también conocida como receptor del factor de crecimiento endotelial vascular-1 o VEGFR1. "FLT-3" es una abreviatura que aparece para la tirosina cinasa-3 de tipo fms, también conocida como la tirosina cinasa I de célula madre (STK I) . "FLT-4" es una abreviatura que aparece para la tirosina cinasa-4 de tipo fms, también conocido como VEGFR3. "Fyn" es una abreviatura que aparece para la cinasa de oncogen FYN relacionada a SRC, FGR, YES. "GSK-3" es una abreviatura que aparece para glicogen sintasa cinasa 3. "PAR-1" es una abreviatura que aparece para la cinasa también conocida como el desarreglo asociado con la cinasa, también conocido como HDAK. "Lck" es una abreviatura que aparece para la proteína de tirosina cinasa específica de linfocito. "MEKl" es una abreviatura que aparece para una serina treonina cinasa en el MAPK (Mitogeno activado de proteína cinasa) transducción de señal en dirección a un modulo que se forma de Raf-MEKl-ERK. Los MEKl fosforilan a ERK (cinasa regulada extracelular) . "MM" es una abreviatura que aparece para la mieloma múltiple . "NEK-2" es una abreviatura que aparece para la cinasa que se relaciona con NIM-A. "NIM-A" es una abreviatura que aparece para nunca en mitosis . "PDGF" es una abreviatura que aparece para la plaqueta derivada del factor de crecimiento. El PDGF interactúa con las tirosinas cinasas PDGFRa y PDGFRß. "Rsk2" es una abreviatura que aparece para la ribosomal S6 cinasa 2. "Raf es un serina/treonina cinasa en la dirección de la transducción de señal MAPK. "RTK" es una abreviatura que aparece para el receptor de tirosina cinasa. "Tie-2" es una abreviatura que aparece para la tirosina cinasa con los dominios de homología Ig y EGF. "VEGF" es una abreviatura que aparece para el factor de crecimiento vascular endotelial. "VEGF-RTK" es una abreviatura que aparece para el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de tirosina cinasa. La frase "metástasis" se refiere a la extensión de las células de cáncer de un tumor u otras partes del cuerpo. Las células de cáncer generalmente se extienden sistémicamente a manera de sistema linfático o torrente sanguíneo . La inhibición del crecimiento de un tumor que forma metástasis se media por la inhibición directa indicada del crecimiento de tumor y/o la inhibición sistémica de las células de cáncer las cuales tienen origen del tumor. Generalmente, la referencia un cierto elemento tal como hidrógeno o H es un medio para incluir todos los isótopos de aquel elemento. Por ejemplo, si un grupo en el compuesto de la estructura I se deja apagado o se muestra como H, luego este se define para incluir hidrógeno o H, deuterio, y tritio. La frase "grupos alquilo de cadena recta o ramificada que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono" se refiere a grupos alquilo que no contienen heteroátomos e incluyen 1 hasta 6 átomos de carbono. Así la frase incluye grupos alquilo de cadena recta tales como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, y similares. La frase también incluye isómeros de cadena ramificada de grupos alquilo de cadena recta, en incluyen pero no se limitan a, los siguientes los cuales se proporcionan a manera de ejemplo: -CH(CH3)2, -CH ( CH3 ) (CH2CH3 ) , CH(CH2CH3)2, -C(CH3)3, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH ( CH3 ) ( CH2CH3 ) , -CH2CH (CH2CH3) 2, -CH2C(CH3)3, -CH ( CH3 ) CH ( CH3 ) ( CH2CH3 ) , CH2CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH(CH3) (CH2CH3) , -CH2CH2C ( CH3 ) 3 , CH (CH3) CH2CH (CH3) 2- y otros. En algunas modalidades, los grupos alquilo incluyen grupos alquilo de cadena recta y ramificada que tienen 1 hasta 6 átomos de carbono. En otras modalidades, los grupos alquilo tienen desde 1 hasta 4 átomos de carbono. Todavía en otras modalidades, el grupo alquilo es un grupo alquilo de cadena recta que tiene 1 hasta 2 átomos de carbono (grupo metilo o etilo) . Todavía en otras modalidades, el grupo alquilo tiene solamente 1 átomo de carbono y es un grupo metilo (-CH3) .

Una "sal farmacéuticamente aceptable" incluye una sal con una base inorgánica, base orgánica, ácido inorgánico, ácido orgánico, o aminoácido ácido o básico.

Como sales de bases orgánicas, la invención incluye, por ejemplo, metales alcalinos tales como sodio o potasio; metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio o aluminio; y amoniaco. Como sales de bases orgánicas, la invención incluye, por ejemplo, trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, y trietanolamina. Como sales de ácidos inorgánicos, la presente invención incluye, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido borhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, y ácido fosfórico. Como sales de ácido orgánicos, la presente invención incluye, por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido malico, ácido metansulfónico, ácido bencensul fónico , y ácido p-toluensulfónico. Como sales de aminoácidos básicos, la presente invención incluye, por ejemplo, arginina, lisina y ornitina. Los aminoácidos ácidicos incluyen, por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico . En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer metastático en un sujeto, tal como un paciente con cáncer humano. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, o cáncer de próstata. En otras modalidades, un método para tratar tumores metastáticos se proporciona. En otras modalidades, un método para tratar a un sujeto que tiene un tumor metastático se proporciona. Las modalidades adicionales proporcionan métodos para tratar tumores hematológicos. Otras modalidades proporcionan métodos para tratar tumores sólidos. Los métodos incluyen administrar a un sujeto que necesite del mismo, una cantidad efectiva de un compuesto de la estructura I, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos. La estructura I tiene la siguiente fórmula: en donde, A es un grupo que tiene una de las siguientes estructuras: en donde, R1 se selecciona de H o grupos alquilo de cadena recta o ramificada que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y En algunas modalidades, el crecimiento del cáncer o tumores que forman metástasis se inhibe después de la administración del compuesto de la estructura I, el tautómero del compuesto, la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, la sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o la mezcla de los mismos. En algunas modalidades, R1 es un grupo metilo, y el compuesto de la estructura I tiene la estructura IA IA En algunas modalidades, R1 es un hidrógeno, y el compuesto de la estructura I tiene la estructura IB IB En algunas modalidades, R1 es un grupo metilo, y el compuesto de la estructura I tiene la estructura IC IC Otras modalidades proporcionan métodos para tratar a un sujeto que tiene un tumor que forma metástasis que comprende: poner en contacto el tumor que forma metástasis con un compuesto de la estructura IA, IB o IC. En algunas modalidades, el compuesto se administra sistémicamente. Más particularmente el compuesto de la estructura I se administra oralmente o intravenosamente. En algunas modalidades, un segundo agente se administra al sujeto. Más particularmente el segundo agente es para el tratamiento de osteoporosis, tal como un bisfosfonato. En otras modalidades el segundo agente es un agente anticáncer. En algunas modalidades, el compuesto es un compuesto de la estructura I, IA, IB, o IC, y la sal de lactato del compuesto o el tautómero se administran al sujeto. En algunas modalidades, el rango de supervivencia se extiende en el sujeto después de la administración de la estructura I, el tautómero del compuesto, la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, la sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o la mezcla de los mismos . Diversos tumores que forman metástasis pueden tratarse de conformidad con la invención. Los ejemplos de tumores hematológicos y cánceres incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena aguda, la mieloma múltiple, y similares.

En algunas modalidades, el tumor es mieloma múltiple y el sujeto es un paciente con mieloma múltiple con una transubicación cromosomal t(4;14). En algunas modalidades, el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el mieloma múltiple expresa el receptor 3 del factor de crecimiento del fibroblasto . En algunas modalidades, el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el mieloma múltiple que forma metástasis a un hueso del paciente tal como a la médula ósea del paciente. Debido a que los compuestos de la invención se concentran en el hueso, estos son particularmente útiles y eficaces en el tratamiento de tumores hematológicos que forma metástasis. En algunas modalidades el tumor es un tumor sólido. En otras modalidades el paciente que sufre de cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, o cáncer de próstata. Por lo tanto, en algunas modalidades, el cáncer o tumor es un cáncer de mama. En otras modalidades, el cáncer o tumor es un cáncer de hígado. Todavía otras modalidades, el cáncer o tumor es un cáncer de pulmón. Todavía otras modalidades, el cáncer o tumor es un cáncer de próstata. En otras modalidades el paciente que sufre de cáncer gástrico, cáncer del endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer adrenal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer peritoneal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer colorectal, o glioblastomas. Los métodos descritos en la presente son útiles en el tratamiento de cualquiera de tales cánceres. Los métodos son particularmente útiles en el tratamiento de cáncer que forma metástasis al hueso tal como el tratamiento de cáncer de próstata que forma metástasis al hueso de un paciente. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que tiene cáncer que forma metástasis al hueso. Tales cánceres pueden ser hematológicos o tumores sólidos. En algunas modalidades, el cáncer es el mieloma múltiple y en otras modalidades es cáncer de próstata . En algunas modalidades, el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el paciente es un humano. En algunas modalidades, el tumor es leucemia mielógena aguda (AML) y el sujeto es un paciente con leucemia mielógena aguda. En algunas de tales modalidades, el sujeto es un mamífero en el cual, en algunas modalidades, es un humano y en otras modalidades es un perro o gato. En algunas modalidades, el tumor es cáncer de próstata, el sujeto es un paciente con cáncer de próstata, y el cáncer de próstata que forma metástasis a un hueso del paciente. En algunas modalidades, el tumor es cáncer de próstata, el sujeto es un paciente con cáncer de próstata, y el paciente es un humano. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un compuesto de la estructura I, IA, IB, y/o IC, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos en la preparación de un medicamento o una formulación farmacéutica para el uso en cualquiera de las modalidades de cualquiera de los métodos de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un kit que incluye un recipiente que comprende un compuesto de la estructura I, IA, IB, y/o IC, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos. El kit puede incluir otro compuesto para uso en el tratamiento de un cáncer que forma metástasis o un tumor. El kit puede además incluir una descripción escrita con direcciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención. En algunas modalidades, la descripción escrita puede incluirse como un documento que se separa del recipiente del kit, mientras que en otras modalidades, la descripción escrita puede escribirse en una etiqueta que se fija al recipiente del kit. Los compuestos de la estructura I se sintetizan fácilmente usando los procedimientos descritos en la siguiente sección de ejemplos y la descripción en los siguientes documentos los cuales se incorporan para referencia en su totalidad y para todos los propósitos como se estable completamente en la presente: Patente de E.U.A. No. 6,605,617, solicitud de patente de E.U.A. publicada No. 2004/0092535, Solicitud de patente de E.U.A. No. 10/983,174, solicitud de patente de E.U.A. publicada No. 2004/0220196, Solicitud de patente de E.U.A. No. 10/982,757, y Solicitud de patente de E.U.A. No. 10/982,543. Los compuestos de la estructura I, tautómeros del compuestos, sales farmacéuticamente aceptables del compuestos, sales farmacéuticamente aceptables de los tautómeros, y mezclas de los mismos pueden usarse para preparar medicamentos, que pueden usarse para los propósitos descritos en la presente, y pueden usarse para tratar diversas condiciones biológicas como se describe en la presente . Las formulaciones farmacéuticas pueden incluir cualquiera de los compuestos, tautómeros, o sales de cualquiera de las modalidades descritas arriba en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable tal como aquel descrito en la presente. La presente invención también proporciona las composiciones, las cuales pueden prepararse por mezclas de uno o más compuestos de la presente invención, o tautómeros de sal farmacéuticamente aceptables de los mismos, o mezclas de los mismos con portadores, excipientes, enlazadores, diluyentes farmacéuticamente aceptables o similares para tratar o aliviar trastornos relacionados con tumores que forman metástasis. Las composiciones de la invención pueden usarse para crear formulaciones usadas para tratar tumores que forman metástasis como se describe en la presente. Tales composiciones pueden hacerse en la forma de, por ejemplo, granulos, polvos, tabletas, cápsulas, jarabes, supositorios, inyecciones, emulsiones, elixires, suspensiones o soluciones. Las presentes composiciones pueden formularse por diversas rutas de administración, por ejemplo, por administración oral, por administración nasal, por administración rectal, inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intramuscular, o inyección intraperitoneal. Las siguientes formas de dosis se dan a manera de ejemplo y no deberán construirse como limitantes de la presente invención. Para la administración oral, bucal y sublingual los polvos, suspensiones, granulos, tabletas, pildoras, cápsulas, cápsulas de gel, y capsuletas son aceptables como formas de dosis sólida. Estas pueden prepararse, por ejemplo, por mezclar uno o más compuestos de la presente invención, sales farmacéuticamente aceptables, tautómeros, o mezclas de los mismos, con al menos un aditivo tal como almidón u otro aditivo. Los aditivos adecuados son sucrosa, lactosa, azúcar de celulosa, manitol, maltitol, dextrano, almidón, agar, alginatos, chitinas, chitosanos, pectinas, goma de tragacanto, goma arábiga, gelatinas, colágenos, caseína, albúmina, polímeros sintéticos o semi-sintéticos o glicéridos. Opcionalmente, las formas de dosis orales pueden contener otros ingredientes para ayudar en la administración, tales como un diluyente inactivo, o lubricantes tales como estearato de magnesio, o conservadores tales como parabeno or ácido sórbico, o antioxidantes tales como ácido ascórbico, tocoferol o cisteina, un agente desintegrante, enlazador, espesante, amortiguador, endulzante, saborizante o agentes de perfume. Las tabletas y pildoras pueden además tratarse con materiales de acoplamiento adecuados conocidos en el arte. Las formas de dosis líquida para administración oral pueden ser en la forma de emulsiones, jarabes, elixires, suspensiones y soluciones farmacéuticamente aceptables, las cuales pueden contener un diluyente inactivo, tal como agua. Las formulaciones y medicamentos farmacéuticos pueden prepararse como suspensiones o soluciones líquidas usando un líquido estéril, tal como, pero no se limita a, un aceite, agua, un alcohol, y combinaciones de estos. Los sobrenadantes farmacéuticamente adecuados, agentes de suspensión, agentes emulsificantes, pueden agregarse por administración oral o parenteral.

Como se anota arriba, las suspensiones pueden incluir aceites. Tal aceite incluye, pero no se limita a, aceite cacahuate, aceite de ajonjolí, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz y aceite de olivo. La preparación de la suspensión puede también contener éster de ácido grasos tales como oleato de etilo, miristato de isopropilo, glicéridos de ácidos grasos y glicéridos acetilados de ácido graso. Las formulaciones de suspensión pueden incluir alcoholes, tales como, pero no se limitan a, etanol, alcohol de isopropilo, alcohol de hexadecilo, glicerol y propilen glicol. Los éteres, tales como pero no se limitan a, poli (etilenglicol) , hidrocarburos de petróleo tal como aceite mineral y petrolato; y agua pueden también usarse en las formulaciones de suspensión. Para la administración nasal, las formulaciones y medicamentos farmacéuticos pueden ser un rocío o aerosol que contiene un solvente (s) apropiado y opcionalmente otros compuestos tales como, pero no se limita a, estabilizadores, agentes antimicrobiales, antíoxidantes, modificadores de pH, tensoactivos, modificadores de biodisponibilidad y combinaciones de estos. Un propelente para una formulación de aerosol puede incluir aire comprimido, nitrógeno, dióxido de carbono, o un solvente de baja ebullición basado en hidrocarburo . Las formas de dosis inyectables generalmente incluyen suspensiones acuosas o suspensiones aceitosas las cuales pueden prepararse usando un agente humectante o dispersante adecuado y un agente de suspensión. Las formulaciones inyectables pueden ser en la fase de solución o en la forma de una suspensión, la cual se prepara con un solvente o diluyente. Los solventes o vehículos aceptables incluyen agua estéril, Solución Ringer, o una solución salina acuosa isotónica. Alternativamente, los aceite estériles pueden emplearse como solventes o agentes de suspensión. Preferiblemente, el aceite o ácido graso no es volátil, e incluye aceites sintéticos o naturales, ácidos grasos, mono-, di- o tri-glicéridos. Para la inyección, la formulación farmacéutica y/o medicamento puede ser un polvo adecuado para la reconstitución con una solución apropiada como se describe arriba. Los ejemplos de estos incluyen, pero no se limitan a, polvos de secado por congelado, secado giratorio o secado por rocío, polvos amorfos, granulos, precipitados, o partículas. Para la inyección, las formulaciones pueden opcionalmente contener estabilizadores, modificadores de pH, tensoactivos, modificadores de biodisponibilidad y combinaciones de estos.

Para la administración rectal, las formulaciones y medicamentos farmacéuticos pueden ser en la forma de un supositorio, un ungüento, un enema, una tableta o una crema para la liberación del compuesto en los intestinos, flexión sigmoide y/o recto. Los supositorios rectales se prepararon por mezclar uno o más compuestos de la presente invención, o sal farmacéuticamente aceptable o tautómeros del compuesto, con vehículos aceptables, por ejemplo, manteca de cacao o polietilen glicol, el cual se presenta en una fase sólida a aquellas temperaturas adecuadas para liberar un fármaco el interior del cuerpo, tal como en el recto. Los aceites también pueden emplearse en la preseparación de las formulaciones de tipo gelatina suave y supositorios. Agua, salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas y gliceroles pueden emplearse en la preparación de las formulaciones de suspensión las cuales pueden también contener agentes de suspensión tales como pectinas, carbomeros, metil celulosa, hidroxipropil celulosa o carboximetil celulosa, así como soluciones amortiguadoras y conservadores . Además de aquellas formas de dosis representativas descritas arriba, los excipientes y portadores farmacéuticamente aceptables se conocen por aquellos de habilidad en el arte y así se incluyen en la presente invención. Tales excipientes y portadores se describen, por ejemplo, en "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co . , New Jersey (1991), los cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad para todos los propósitos como se establece completamente en la presente.

Las formulaciones de la invención pueden diseñarse para ser de corta duración, rápida liberación, larga duración, y liberación sostenida como se describe a continuación. Así, la formulación farmacéutica puede también formularse para la liberación controlada o para liberación lenta. Las presentes composiciones pueden también comprender, por ejemplo, icelos o liposomas, u alguna otra forma encapsulada, o pueden administrarse en una forma de liberación excedida para proporcionar un efecto de liberación y/o almacenamiento prolongado. Por lo tanto, las formulaciones y medicamentos farmacéuticos pueden comprimirse en paletizados y cilindros e implantarse intramuscularmente o subcutáneamente como inyecciones de depósitos o como implantes tales como endoprótesis vasculares. Tales implantes pueden emplear materiales inertes conocidos tales como silícones y polímeros biodegradables. Las dosis específicas pueden ajustarse dependiendo en las condiciones de la enfermedad, la edad, peso corporal, condiciones de salud general, sexo y dieta del sujeto, intervalos de dosis, rutas de administración, rango de excreción y combinaciones de fármacos. Cualquier de las formas de dosis de arriba contiene cantidades efectivas así como con los enlaces de la experimentación de rutina y por lo tanto, así como con el alcance de la presente invención. Una dosis terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo de la ruta de administración y forma de dosis. El compuesto o compuestos preferidos de la presente invención es una formulación que exhibe un alto índice terapéutico. El índice terapéutico es la relación entre los efectos tóxicos y terapéuticos los cuales pueden expresarse como la relación entre LD50 y ED50. El LD5o en la dosis letal hasta 50% de la población y el ED5o es la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población. El LD50 y ED50 se determinaron por los procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células animales o animales experimentales. "Tratar" con el contexto de la presente invención, significa un alivio de los síntomas asociados con un trastorno o enfermedad, o detener el progreso de la enfermedad o el empeoramiento de estos síntomas o prevención o profilaxis de la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, dentro del contexto de los pacientes tratados con un tumor que forma metástasis, el tratamiento con buen resultado puede incluir una reducción en la proliferación de capilares que alimentan el tumor o el tejido enfermo, un alivio de síntomas relacionados a un crecimiento canceroso o tumor, proliferación de capilares o tejido enfermo, tejido enfermo, una detención en la proliferación capilar o una detención en el progresóte una enfermedad tal como cáncer o en el crecimiento de células cancerosas. El tratamiento puede también incluir administrar las formulaciones farmacéuticas de la presente invención en combinación con otras terapias. Por ejemplo, los compuestos y formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse antes de, durante o después del procedimiento de cirugía y/o terapia de radiación. Los compuestos de la invención pueden también administrarse en conjunto con otros fármacos anti-cáncer incluyendo aquellos usados en terapias antisentido o terapia de genes. Las combinaciones apropiadas pueden determinarse por aquellos de habilidad en la oncología o artes de la medicina. Las formulaciones y medicamentos farmacéuticos de conformidad a la invención incluyen el compuesto de la estructura I o tautómeros, sales, o mezclas de los mismos en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Así, los compuestos de la invención pueden usarse para preparar medicamentos y formulaciones farmacéuticas. Tales medicamentos y formulaciones farmacéuticas pueden usarse en el método de tratamiento descrito en la presente. Los compuestos y formulaciones de la presente invención son particularmente adecuados para uso en la terapia de combinación como aquellas que se muestran para exhibir el efecto sinérgico cuando se usa en combinación con fármacos anti-cáncer tales como camptotecina, doxorubicina, cisplatina, irinotecan (CPT-11), agentes alquilantes, inhibidores de topoisomerasa I y II y tratamiento de radiación. Por lo tanto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que incluyen el compuesto de la estructura I y tautómeros, sales, y/o mezclas de los mismos en combinación con un fármaco anticáncer. La invención también proporciona el uso de compuestos, tautómeros, sales, y/o mezclas que crean tales formulaciones y medicamentos. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de cáncer metastático al administrar un compuesto de la presente invención y un fármaco anticáncer adicional. El método incluye administrar a un sujeto que necesite del mismo, un fármaco anti-cáncer seleccionado de mesilato de imatinib (Gleevec) , BAY43-9006, Brostallicin, lenalidomida (Revlimid) , talidomida (Thalomid) , docetaxel (Taxotere), erlotinib (Tarceva), vatalinib ( PTK-787), VEGF-trap, fenretidina, bortezomib, bevacizumab (Avastin), pertuzumab, y/o rituximab, y un compuesto de la invención, un tautómero del compuesto, una sal del compuesto, una sal del tautómero, una mezcla del mismo, o una composición farmacéutica que comprende el compuesto, el tautómero, la sal del compuesto, la sal del tautómero, o la mezcla . Los compuestos de la invención pueden usarse para tratar una variedad de sujetos. Los sujetos adecuados incluyen animales tales como mamíferos y humanos. Los mamíferos adecuados incluyen, pero no se limitan a, primates tales como, pero no se limita a lémures, simios, y monos; roedores tales como ratas, ratones, y conejillos de indias; conejos y liebres; vacas; caballos; cerdos; cabras; ovejas; marsupiales; y carnívoros tales como felinos, caninos, y ursinos. En algunas modalidades, el sujeto o paciente es un humano. En otras modalidades, el sujeto o paciente es un roedor tal como un ratón o una rata. En algunas modalidades, el sujeto o paciente es un animal diferente a un humano y en algunas de tales modalidades, el sujeto o paciente es un mamífero diferente a un humano. Se deberá entender que los compuestos usados en la invención pueden mostrar el fenómeno de tautomerismo. Como las estructuras químicas dentro de esta especificación puede solamente representar una de las formas tautoméricas posibles, se deberá entender que la invención abarca cualquier forma tautomérica de la estructura de dibujo. Por ejemplo, la Estructura IA se muestra a continuación con un tautómero, Tautómero la: la Otros tautómeros de la Estructura IA, Tautómero Ib y Tautómero le, se muestran a continuación: Ib le La presente invención, así describe generalmente, se entenderá más fácilmente para referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan a manera de ilustración y no se pretende que limite la presente invención.

EJEMPLOS Las siguientes abreviaturas se usan a través de la solicitud con respecto a la terminología química: ATP: trifosfato de adenosina Boc: N-tert-Butoxicarbonil BSA: Albúmina de Suero de Bovino DMSO: Dimetiisulfóxido DTT: DL-Ditiotreitol ED50: Dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población EDTA: ácido etilen diamina tetraacético EtOH: Etanol CLAR: Cromatografía Líquida de Alta Resolución Valor IC50: La concentración de un inhibidor que provoca una reducción del 50% en una actividad medible. KHMDS: bis (trimetílsilil) amida de potasio CL/EM: Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masa THF: Tetrahidrofurano Purificación y Caracterización de los Compuestos Los compuestos de la presente invención se caracterizan por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) usando un sistema de cromatografía Waters Millenium con un módulo de Separación 2690 (Milford, Massachusetts). Las columnas analíticas fueron Alltima C-18 de fase inversa, 4.6 x 250 mm de Alltech (Deerfield, Illinois). Se usó un gradiente de elusión, típicamente iniciando con 5% acetonitrilo/95% agua y que progresa hasta 100% acetonitrilo durante un periodo de 40 minutos. Todos los solventes contienen ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA) . Los compuestos se detectaron por absorción de luz ultravioleta (UV) a ya sea 220 ó 254 nm. Los solventes CLAR fueron de Burdick and Jackson (Muskegan, Michigan) , o Fisher Scientific (Pittsburg, Pennsylvania). En algunos casos, la pureza se evaluó por cromatografía de capa delgada (CCD) usando placas de gel de sílice horneadas de vidrio o plástico, tales como, por ejemplo, láminas flexibles Baker-Flex de gel de sílice Gel 1 B2-F. Los resultados de CCD se detectaron rápidamente visualmente bajo luz ultravioleta, o al emplear vapor de yodo y otras diversas técnicas de teñido bien conocidas. El análisis de espectrometría de masas se realizó en uno de dos instrumentos CLAR: un sistema Agua s (Alliance HT CLAR y un espectrómetro de masa Micromass ZQ; Columna: Eclipse XDB-C18, 2.1 x 50 mm; Sistema solvente: 5-95% acetonitrilo en agua con 0.05% TFA; Relación de flujo 0.8 mL/minuto; Rango de peso molecular 150-850; Voltaje en cono 20 V; temperatura de columna 40°C) o un sistema Hewlett Packard (Series 1100 CLAR; Columna: Eclipse XDB-C18, 2.1 x 50 mm; Sistema solvente: 1-95% acetonitrilo en agua con 0.05% TFA; Relación de flujo 0.4 mL/minuto; Rango de peso molecular 150-850; Voltaje cono 50 V; temperatura de columna 30°C) . Todas las masa se reportan como aquellas de los iones precursores protonados. El análisis GCEM se realizó en un instrumento Hewlet Packard (cromatógrafo de gas serie HP6890 con un detector selectivo de masa 5973; volumen de inyector: 1 µL; temperatura de columna inicial: 50°C; temperatura de columna final: 250°C; tiempo de elevación: 20 minutos; relación de flujo de gas: 1 mL/minuto; Columna: 5% Fenil Metil Siloxano, Modelo #HP 190915-443, Dimensiones: 30.0 m x 25 µm x 0.25 µm) . Las separaciones preparativas se llevaron a cabo usando ya sea un sistema de cromatografía instantánea 40 y KP-Sil, 60A (Biotage, Charlottesville, Virginia), o por CLAR usando una columna de fase inversa C-18. Los solventes típicos empleados para el sistema Flash 40 Biotage fueron diclorometano, metanol, acetato de etilo, hexano y trietilamina. Los solventes típicos empleados para la CLAR de fase inversa fueron concentraciones variadas de acetonitrilo y agua con ácido trifluoroacético al 0.1%. Síntesis de 4-Amino-5-fluoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-l-il ) -1H-benzimidazol-2-il]-lH-quinolin-2-ona A. Síntesis de 5- (4-Metil-piperazin-l-il) -2-nitroanilina Procedimiento A La 5-cloro-2-nitroanilina (500 g, 2.898 mol) y 1-metil piperazina (871 g, 8.693 mol) se colocaron en un matraz de 2000 mL equipado con un condensador y purgado con N2. El matraz se colocó en un baño de aceite a 1000C y se calentó hasta que la 5-cloro-2-nitroanilina se hace reaccionar completamente (típicamente durante la noche) como se determina por CLAR. Después de que la CLAR confirma la desaparición de la 5-cloro-2-nitroanilina, la mezcla de reacción se vació directamente (todavía tibia) en 2500 mL de agua a temperatura ambiente con agitación mecánica. La mezcla resultante se agitó hasta que alcanza temperatura ambiente y luego se filtró. El sólido amarillo así obtenido se agregó a 1000 mL de agua y se agitó durante 30 minutos. La mezcla resultante se filtró, y el sólido resultante se lavó con TBME (500 L, 2X) y entonces se secó bajo vacío durante una hora usando un tapón de hule. El sólido resultante se transfirió a una charola de secado y se secó en un horno al vacío a 50°C hasta un peso constante para proporcionar 670 g (97.8%) del compuesto del título como un polvo amarillo.

Procedimiento B La 5-cloro-2-nitroanilina (308.2 g, 1.79 mol) se agregó a un matraz de fondo redondo de 5000 ml de 4 cuellos equipado con un agitador de domo, condensador, entrada de gas, embudo de adición, y sonda de termómetro. El matraz se purgó entonces con N2. La 1-metilpiperazina (758.1 g, 840 mL, 7.57 mol) y etanol grado 200 (508 mL) se agregaron al matraz de reacción con agitación. El matraz se purgó de nuevo con N , y la reacción se mantuvo bajo N2. El matraz se calentó en un manto de calentamiento hasta una temperatura interna de 97°C ( +/- 50C) y se mantiene a tal temperatura hasta que la reacción se completó (típicamente alrededor de 40 horas) como se determina por CLAR. Después de que la reacción se completó, se descontinuó el calentamiento y la reacción se enfrió hasta una temperatura interna de alrededor de 20°C hasta 25°C con agitación, y la reacción se agitó durante 2 hasta 3 horas. Los cristales sembrados (0.20 g, 0.85 mmol) de 5- ( -metil-piperazin-l-il ) -2-nitroanilina se agregaron a la mezcla de reacción salvo que la precipitación ya se halla presentado. El agua (2,450 mL) se agregó a la mezcla de reacción agitada durante un periodo de alrededor de una hora mientras la temperatura interna se mantuvo a una temperatura en el rango desde alrededor de 20°C hasta 30°C. Después la adición de agua se completó, la mezcla resultante se agitó durante alrededor de una hora a una temperatura de 20°C hasta 30°C. La mezcla resultante luego se filtró, y el matraz y la torta filtro se lavaron con agua (3 x 2.56 L) . El producto sólido amarillo dorado se secó hasta un peso constante de 416 g (98.6% de rendimiento) bajo vacío a alrededor de 50°C en un horno al vacío.

Procedimiento C 5-Cloro-2-nit roanilina (401 g, 2.32 mol) se agregó a un matraz de fondo redondo de 4 cuellos de 12 L equipado con un agitador de domo, condensador, entrada de gas, embudo de adición, y sonda de termómetro. El matraz se purgó entonces con N2. La 1-Metilpiperazina (977 g, 1.08 L, 9.75 mol) y 100% etanol (650 mL) se agregaron al matraz de reacción con agitación. El matraz se purgó de nuevo con N2, y la reacción se mantuvo bajo N2. El matraz se calentó en un manto de calentamiento hasta una temperatura interna de 97°C (+/- 5°C) y se mantiene a tal temperatura hasta que la reacción se completó (típicamente alrededor de 40 horas) como se determina por CLAR. Después de que la reacción se completó, se descontinuó el calentamiento y la reacción se enfrió hasta una temperatura interna de alrededor de 80°C con agitación, y agua (3.15 L) se agregó a la mezcla por medio de un embudo de adición durante el periodo de 1 hora mientras la temperatura interna se mantuvo a 82°C (+/- 30C) . Después de que la adición de agua se completó, se descontinuó el calentamiento y la mezcla de reacción se permitió enfriar durante un periodo de no menos que 4 horas hasta una temperatura interna de 20-25°C. La mezcla de reacción luego se agitó durante una hora adicional a una temperatura interna de 20-30°C. La mezcla resultante luego se filtró, y el matraz y la torta filtro se lavaron con agua (1 x 1 L), 50% etanol (1 x 1L), y 95% etanol (1 x 1L) . El producto sólido amarillo dorado se colocó en una plancha de secado y se seca hasta un peso constante de 546 g (99% de rendimiento) bajo vacío a alrededor de 50°C en un horno al vacío.

B. Síntesis de éster de etilo del ácido [6-(4-Metil-piperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] -acético Procedimiento A Un matraz de 4 cuellos de 5000 mL, se equipó con un agitador, termómetro, condensador, y entrada/salida de gas. El matraz equipado se cargó con 265.7 g (1.12 mol. 1.0 eq) de 5- ( 4-metil-piperazin-l-il ) -2-nitroanilina y 2125 L EtOH de grado 200. La solución resultante se purgó con N2 durante 15 minutos. Después, 20.0 g de 5% Pd/C (50% H20 p/p) se agregó. La reacción se agitó vigorosamente a 40-50°C (temperatura interna) mientras H se burbujeó a través de la mezcla. La reacción se monitoreó cada hora durante la desaparición de 5- ( 4-metil-piperazin-l-il ) -2-nitroanilina por CLAR. El tiempo de reacción típico fue 6 horas . Después de que toda la 5- ( 4-metil-piperazin-l-il ) -2-nitroanilina ha desaparecido de la reacción, la solución se purgó con N2 durante 15 minutos. Después, 440.0 g (2.25 mol) de clorohidrato 3-etoxi-3-imino?ropanoato de etilo se agregó como un sólido. La reacción se agitó a 40-50°C (temperatura interna) hasta que la reacción se completó. La reacción se monitoreó al seguir la desaparición del compuesto diamino por CLAR. El tiempo de reacción típico fue 1-2 horas. Después de que la reacción se completó, se enfrió a temperatura ambiente y se filtra a través de una almohadilla de material filtrado de Celite. El material filtrado de Celite se lavó con EtOH absoluto (2 x 250 mL) , y el filtrado se concentró bajo presión reducida proporcionando un aceite café/anaranjado espeso. El aceite resultante se tomó en 850 mL de una solución al 0.37% de HCl. Luego se agregó NaOH sólido (25 g) en una porción, y un precipitado formado. La mezcla resultante se agitó durante 1 hora y entonces se filtra. El sólido se lavó con H20 (2 x 400 mL) y se seca a 50°C en un horno al vacío proporcionando 251.7 g (74.1 %) de éster de etilo del ácido [ 6- ( -metil-piperazin-l-il ) -lH-benzoimidazol-2-il] -acético como un polvo amarillo pálido.

Procedimiento B Un matraz enchaquetado de 5000 mL de 4 cuellos se equipó con un agitador mecánico, condensador, sonda de temperatura, entrada de gas, y burbujeador de aceite. El matraz equipado se cargó con 300 g (1.27 mol) de 5- (4-metil-piperazin-l-il) - 2-nitroanilina y 2400 mL de EtOH grado 200 (la reacción puede ser y se ha conducido con 95% etanol y no es necesario para uso grado 200 de etanol para esta reacción) . La solución resultante se agitó y purgado con N2 durante 15 minutos. Después, 22.7 g de 5% Pd/C (50% H20 p/p) se agregó al matraz de reacción. El recipiente de reacción se purgó con N2 durante 15 minutos. Después de purgar con N2, el recipiente de reacción se purgó con H2 al mantener un flujo lento, pero constante de H2 a través del matraz. La reacción se agitó a 45-55°C (temperatura interna) mientras que H2 se burbujeó a través de la mezcla hasta que la 5- (4-metil-piperazin-l-il) -2-nitroanilina se consumió completamente como se determina por CLAR. El tiempo de reacción típico fue 6 horas. Después de que toda la 5- ( 4-metil-piperazin-l-il ) -2-nitroanilina se dispersó de la reacción, la solución se purgó con N2 durante 15 minutos. El intermediarion diamina es sensible al aire se tomó con cuidado para evitar la exposición al aire. 500 g (2.56 mol) de clorohidrato de 3-etoxi-3-iminopropanoato de etilo se agregó a la mezcla de reacción durante un periodo de alrededor de 30 minutos. La reacción se agitó a 45-55°C (temperatura interna) bajo N2 hasta que la diamina se consumió completamente como se determina por CLAR. El tiempo de reacción típico fue alrededor de 2 horas. Después de que la reacción se completó, la reacción se filtró mientras se calienta a través de una almohadilla de Celite. El matraz de reacción y Celite luego se tomaron con EtOH grado 200 (3 x 285 mL) . Los filtrados se combinaron en un matraz 5000 mL, y alrededor de 3300 mL de etanol se removió bajo vacío produciendo un aceite anaranjado. Agua (530 mL) y entonces ÍM HCL (350 mL) se agregaron al aceite resultante, y la mezcla resultante se agitó. La solución resultante se agitó vigorosamente mientras 30% NaOH (200 mL) se agregó durante un período de alrededor de 20 minutos manteniendo la temperatura interna a alrededor de 25-30°C mientras el pH se llevó hasta entre 9 y 10. La suspensión resultante se agitó durante alrededor de 4 horas mientras mantiene la temperatura interna a alrededor de 20-25°C. La mezcla resultante se filtró, y la torta filtro se lavó con H 0 (3 x 300 mL) . El sólido recolectado se secó hasta un peso constante a 50°C bajo vacío en un horno al vacío proporcionando 345.9 g (90.1%) de éster de etilo del ácido [6- (4-metil-piperazin-l-il) -lH-benzoimidazol-2-il] -acético como un polvo amarillo pálido. En un procedimiento de trabajo alternativo, los filtrados se combinaron y el etanol se removieron bajo vacío hasta que al menos alrededor de 90% se ha removido. Agua a un pH neutral luego se agregó al aceite resultante, y la solución se enfrió hasta alrededor de 0°C. Un a solución 20% NaOH acuosa luego se agregó lentamente con agitación rápida para traer el pH hasta 9.2 (se lee con medidor de pH) . La mezcla resultante luego se filtró y se seca como se describe arriba. El procedimiento de trabajo alternativo proporciona el producto color canela ligero hasta amarillo ligero en rendimientos como mayor como 97%.

Método para reducir el contenido de agua del éster de etilo del ácido [6- (4-Metil-piperazin-l-il) -lH-benzoimidazol-2-il] -acético El éster de metilo del ácido [ 6- (4-Metil-piperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] -acético (120.7 gramos) que se ha trabajado previamente y se seca a un recipiente de agua de alrededor de 8-9% de H20 se colocó en un matraz de fondo redondo de 2000 ml y se disuelve en etanol absoluto (500 mL) . La solución ámbar se concentró hasta un aceite espeso usando un roto evaporador con calentamiento hasta que todo el solvente se removió. El procedimiento se repitió dos veces más. El aceite espeso así obtenido se dejó en el matraz y se coloca en un horno al vacío calentado a 50°C durante la noche. Los resultados del análisis Karl Fisher indican un contenido de agua de 5.25%. El contenido de agua inferior obtenido por este método proporciona rendimientos incrementados en el procedimiento del siguiente Ejemplo. Otros solventes tales como tolueno y THF pueden usarse en lugar del etanol para este proceso de secado.

C. Síntesis de 4-Amino-5-fluoro-3- [6- (4-metil-piperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona Procedimiento A El éster de etilo del ácido [ 6- ( 4-Metil-piperazin-l-il ) -lH-benzimidazol-2-il ] -acético (250 g, 820 mmol) (secado con etanol como se describe arriba) se disolvió en THF (3800 mL) en un matraz de 5000 mL equipado con un condensador, agitador mecánico, sonda de temperatura, y purgado con argón. 2-Amino-6-fluoro-benzonitrilo (95.3 g, 700 mmol) se agregó a la solución, y el temperatura interna se elevó hasta 40°C. Cuando todos los sólidos se han disuelto y la temperatura de solución ha alcanzado 40°C, KHMDS sólido (376.2 g, 1890 mmol) se agregó durante un periodo de 5 minutos. Cuando la adición de la base de potasio se completó, una solución amarilla heterogénea se obtuvo, y el temperatura interna se eleva hasta 62°C. Después de un periodo de 60 minutos, la temperatura interna se vuelve a disminuir hasta 40°C, y la reacción se determinó para completarse por CLAR (sin material de partida o intermediario no ciclizado se presentó) . La mezcla de reacción espesa luego se apagó al vaciar en H20 (6000 mL) y se agita la mezcla resultante hasta que alcanza la temperatura ambiente. La mezcla luego se filtró, y la almohadilla filtrada se lavó con agua (1000 mL 2X) . El sólido amarillo brillante se colocó en una charola de secado y se secó en un horno al vacío a 50°C durante la noche proporcionando 155.3 g (47.9%) de la 4-amino-5-fluoro-3- [ 6-( 4 -meti1-piperazin-1-il) -ÍH- benzimidazol-2-il ] -lH-quinolin-2-ona deseada.

Procedimiento B Un matraz enchaquetado de 4 cuellos de 5000 mL se equipó con un aparato de destilación, una sonda de temperatura, una entrada de gas N2, un embudo de adición, y un agitador mecánico. El éster de etilo del ácido [ 6- ( 4-Metil-piperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] -acético (173.0 g, 570 mmol) se cargó con el reactor, y el reactor se purgó con N2 durante 15 minutos. THF seco (2600 mL) luego se cargó en el matraz con agitación. Después de que todo el sólido se disuelve, el solvente se removió por destilación (vacío o atmosférica) (la temperatura mayor ayuda para remover el agua) usando calor como sea necesario. Después de 1000 mL de solvente se ha removido, la destilación se detuvo y la reacción se purgó con N2. 1000 mL de THF seco luego se agregó al recipiente de reacción, y cuando todo el sólido se disolvió, la destilación (vacío o atmosférica) se condujo nuevamente hasta que otros 1000 mL de solvente se ha removido. Este proceso de agregar THF seco y y remoción de solvente se repitió al menos 4 veces (en la 4a destilación, 60% del solvente se remueve en lugar de justo 40% como en las primeras 3 destilaciones) después de lo cual una muestra de 1 mL se removió para el análisis Karl Fischer para determinar el contenido de agua. Si el análisis muestra que la muestra contiene menos que 0.20% de agua, entonces la reacción se continuó como se describe en el siguiente párrafo. Sin embargo, si el análisis muestra que más de 0.20% de agua, entonces el proceso de secado descrito arriba se continuó hasta que un contenido de agua de menos de 0.20% se alcanzó. Después de que un contenido de agua de menos de o alrededor de 0.20% se alcanzó usando el procedimiento descrito en el párrafo previo, el aparato de destilación se reemplazó con un condensador de reflujo, y la reacción se cargó con 2-amino-6-fluoro-benzonitrilo (66.2 g, 470 mmol) (en algunos procedimientos 0.95 equivalentes se usa) . La reacción luego se calentó hasta una temperatura interna de 38-42°C. Cuando la temperatura interna alcanza 38-42°C, la solución KHMDS (1313 g, 1.32 mol, 20% KHMDS en THF) se agregó a la reacción por medio del embudo de adición durante un periodo de 5 minutos manteniendo la temperatura interna a alrededor de 38-50°C durante la adición. Cuando la adición de la base de potasio se completó, la reacción se agitó durante 3.5 hasta 4.5 horas (en algunos ejemplos se agitó durante 30 hasta 60 minutos y la reacción puede completarse sin tal tiempo) mientras mantiene la temperatura interna a desde 38-42°C. Una muestra de la reacción luego se removió y se analiza por CLAR. Sí la reacción no se completó, la solución KHMDS se agregó adicional al matraz durante un periodo de 5 minutos y la reacción se agitó a 38-42°C durante 45-60 minutos (la cantidad de solución KHMDS agregada como se determina por lo siguiente: sí la relación IPC es < 3.50, entonces 125 mL se agregó; sí la relación 10.0 =IPC >3.50, entonces 56 mL se agregó; sí la relación 20.0 =IPC =IO, entonces 30 mL se agregó. La relación IPC es igual al área correspondiente a -amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4-metil-piperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona) dividida por el área correspondiente al intermediario no ciclizado) . Una vez que la reacción se completó (ka relación IPC > 20), el reactor se enfrió hasta una temperatura interna de 25-30°C, y agua (350 mL) se cargó en el reactor durante un periodo de 15 minutos mientras mantiene la temperatura interna a 25-35°C (en una alternativa, la reacción es conduce a 40°C y agua se agrega dentro de 5 minutos. El apagado rápido reduce la cantidad de impureza que se forma durante el tiempo) . El condensador de reflujo luego se reemplazó con un aparato de destilación y solvente se removieron por destilación (vacío o atmosférica) usando calor como sea requerido. Después de 1500 L del solvente se ha removido, la destilación se descontinuó y la reacción se purgó con N2. Agua (1660 mL) luego se agregó al matraz de reacción mientras mantiene la temperatura interna a 20-30°C. La mezcla de reacción luego se agitó a 20-30°C durante 30 minutos antes de enfriarse hasta una temperatura interna de 5-10°C y entonces se agita durante 1 hora. La suspensión resultante se filtró, y el matraz y la torta filtro se lavaron con agua (3 x 650 mL) . El sólido así obtenido se secó hasta un peso constante bajo vacío a 50°C en un horno al vacío para proporcionar 103.9 g (42.6% de rendimiento) de -amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4 -metil-piperazin-1-il ) -lH-benzimidazol-2-il ] -lH-quinolin-2-ona como un polvo amarillo.

Procedimiento C El é s t e r de et i l o de l áci do [ 6 - ( 4 -Met i l -pipera z i n - 1 - il ) -lH-benzimidazol-2-il ] -acético (608 g, 2.01 mol) (seco) y 2-amino-6-fluoro-benzonitrilo (274 g, 2.01 mol) se cargaron en un matraz de cuatro cuellos de 12 L colocado en un manto de calentamiento y equipado con un condensador, agitador mecánico, entrada de gas, y sonda de temperatura. El recipiente de reacción se purgó con N2, y tolueno (7.7 L) se cargó en la mezcla de reacción mientras se agitó. El recipiente de reacción se purgó de nuevo con N2 y se mantiene bajo N2. La temperatura interna de la mezcla se elevó hasta que una temperatura de 63°C ( +/- 3°C) se alcanzó. La temperatura interna de la mezcla se mantuvo a 63°C ( + /- 3°C) mientras aproximadamente 2.6 L de tolueno se destiló del matraz bajo presión reducida (380 +/- 10 torr, cabezal de destilación t = 40°C (+/- 10°C) (análisis Karl Fischer se usó para verificar el contenido de agua en la mezcla. Sí el contenido de agua fue mayor que 0.03%, entonces otros 2.6 L de tolueno se agregó y la destilación se repitió. Este proceso se repitió hasta que un contenido de agua de menos de 0.03% se alcanzó) . Después de que un contenido de agua de menos de 0.03% se alcanzó, se descontinuó el calentamiento, y la reacción se enfrió bajo N2 hasta una temperatura interna de 17-19°C. El t-butóxido de potasio en THF (20% in THF; 3.39 kg, 6.04 moles de t-butóxido de potasio) luego se agregó a la reacción bajo N2 a una relación de tal manera que la temperatura interna de la reacción se mantuvo debajo de 20°C. Después la adición del t-butóxido de potasio se completó, la reacción se agitó a una temperatura interna de menos de 20°C durante 30 minutos. La temperatura luego se elevó hasta 25°C, y la reacción se agitó durante al menos 1 hora. La temperatura luego se elevó hasta 30°C, y la reacción se agitó durante al menos 30 minutos. La reacción luego se monitoreó para terminación usando CLAR para verificar el consumo de los materiales de partida (típicamente en 2-3 horas, ambos materiales de partida se consumieron (menos de 0.5% por área % CLAR) ) . Sí la reacción no se completó después de 2 horas, otros 0.05 equivalentes de t-butóxido de potasio se agregó a un tiempo, y el proceso se completó hasta que CLAR muestra que la reacción se completó. Después de que la reacción se completó, 650 mL de agua se agregó a la mezcla de reacción agitada. La reacción luego se calentó hasta una temperatura interna de 50°C y el THF se destiló (alrededor de 3 L por volumen) bajo presión reducida de la mezcla de reacción. Agua (2.6 L) luego se agregó gota a gota a la mezcla de reacción usando un embudo de adición. La mezcla luego se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante al menos 1 hora. La mezcla luego se filtró, y la torta filtro se lavó con agua (1.2 L), con 70% etanol (1.2 L), y con 95% etanol (1.2 L) . El sólido amarillo brillante se colocó en una charola de secado y se secó en un horno al vacío a 50°C hasta que un peso constante se obtuvo proporcionando 674 g (85.4%) del -amino-5-fluoro-3- [6-(4-metil-piperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona deseada .

Purificación de 4-Amino-5-fluoro-3- [6- (4-metil-piperazin-l-il) -ÍH- benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona Un matraz de 3000 mL de 4 cuellos equipado con un condensador, sonda de temperatura, entrada de gas N2, y agitador mecánico se colocó en un manto caliente. El matraz luego se cargó con 4-amino-5-fluoro-3- [ 6~ ( 4-metil-pipera zin- 1-il ) -lH-benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona (101.0 g, 0.26 mol), y el sólido amarillo se suspendió en 95% etanol (1000 mL) y se agita. En algunos casos una relación 8:1 de solvente se usó. La suspensión luego se calentó hasta un reflujo suave (temperatura de alrededor de 76°C) con agitación durante un periodo de alrededor de 1 hora. La reacción luego se agitó durante 45-75 minutos mientras se pone a reflujo. En este punto, el calor se removió del matraz y la suspensión se permitió enfriar a una temperatura de 25-30°C. La suspensión luego se filtró, y la almohadilla filtrada se lavó con agua (2 x 500 mL) . El sólido amarillo luego se colocó en una charola de secado y se secó en un horno al vacío a 50°C hasta que un peso constante se obtuvo (típicamente 16 horas) para obtener 97.2 g (96.2%) del producto purificado como un polvo amarillo.

D. Preparación de la sal del ácido láctico de 4-Amino-5-fluoro-3- [6- (4-metil-piperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona ácido D.L-láctico EtOH, H20 Un matraz enchaquetado de 3000 mL de 4 cuellos se equipó con un condensador, una sonda de temperatura, una entrada de gas N2, y un agitador mecánico. El recipiente de reacción se purgó con N2 durante al menos 15 minutos y entonces se carga con 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4-metil- piperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona (484 g, 1.23 mol). Una solución de ácido D, L-láctico (243.3 g, 1.72 mol del monómero ver el siguiente párrafo), agua (339 mL), y etanol (1211 mL) se prepararon y entonces se carga al matraz de reacción. Se inició agitando a una relación media, y la reacción se calentó hasta una temperatura interna de 68-72°C. La temperatura interna de la reacción se mantuvo a 68-72°C durante 15-45 minutos y entonces se descontinuó el calentamiento. La mezcla resultante se filtró a través de un vidrio poroso de 10-20 mieras colectando el filtrado en un matraz de 12 L. El matraz de 12 L se equipó con una sonda de temperatura interna, un condensador de reflujo, un embudo de adición, una entrada una salida de gas, y un agitador de domo. El filtrado luego se agitó a una relación media y se calentó hasta reflujo (temperatura interna de alrededor de 78°C) . Mientras se mantiene un reflujo suave, etanol (3,596 mL) se cargó al matraz durante un periodo de alrededor de 20 minutos. El matraz de reacción luego se enfrió hasta una temperatura interna en el rango desde alrededor de 64-70°C dentro de 15-25 minutos y esta temperatura se mantuvo durante un periodo de alrededor de 30 minutos. El reactor se inspeccionó para cristales. Si los cristales no se presentaron, entonces los cristales de la sal del ácido láctico de 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- ( - metil-piperazin-1-il ) -lH-benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona (484 mg, 0.1 mole %) se agregaron al matraz, y la reacción se agitó a 64-70°C durante 30 minutos antes de inspeccionar nuevamente el matraz para los cristales. Una vez que los cristales se presentaron, la agitación se redujo a una relación inferior y la reacción se agitó a 64-70°C durante unos 90 minutos adicionales. La reacción luego se enfrió hasta alrededor de 0°C durante un periodo de alrededor de 2 horas, y la mezcla resultante se filtró a través de un filtro de 25-50 mieras de vidrio poroso. El reactor se lavó con etanol (484 mL) y se agita hasta que la temperatura interna fue alrededor de 0°C. El etanol frío se usó para lavar la torta filtro, y este procedimiento se repitió 2 veces más. El sólido recolectado se secó hasta un peso constante a 50°C bajo vacío en un horno al vacío proporcionando 510.7 g (85.7%) de la sal del ácido láctico amarillo cristalino de 4-amino-5-fluoro-3- [6- ( 4 -met il-piperazin-1-il ) -1H-benzimidazol-2-il ] -lH-quinolin-2-ona . Un tapón de hule o condiciones inertes se usaron típicamente durante el proceso de filtración. Mientras el sólido seco no aparece para ser muy higroscópico, la torta filtro húmeda tiende a tomar agua y volverse pegajosa. Las precauciones se tomaron para evitar la exposición prolongada de la torta filtro húmeda a la atmósfera.

El ácido láctico comercial generalmente contiene alrededor de 8-12% p/p agua, y contiene dímeros y trímeros en adición al ácido láctico monomérico. La relación molar del dímero de ácido láctico al monómero es generalmente alrededor de 1.0:4.7. El ácido láctico de grado comercial puede usarse en el proceso descrito en el párrafo precedente como la sal de monolactato preferentemente de precipitados de la mezcla de reacción.

Identificación de Metabolitos Dos metabolitos de 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- (4-metil-piperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] -lH-quinolin-2-ona (Compuesto 1) se ha identificado y caracterizado en plasma de rata agrupado de un estudio de toxicología de 2 semanas como se describe en las referencias incorporadas en la presente. Los dos metabolitos identificados fueron el compuesto de N-óxido de piperazina (Compuesto 2) y el compuesto N-desmetilado (Compuesto 3) mostrado a continuación .

Compuesto 2 Compuesto 3 IC5o de los Compuestos 1-3 La actividad de cinasa de un número de proteínas de tirosina cinasa se midió usando los procedimientos establecidos a continuación por los compuestos 1-3 para proporcionar los valores IC-50 mostrados en la siguiente tabla .

Tabla. IC50 de los compuestos 1-3 Síntesis de 4-Amino-5-fluoro-3- [6- (4-metil-4-oxidopiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2 (ÍH) -ona (Compuesto 2) y 4-Amino-5-fluoro-3- (6-piperazin-1-il-lH-benzimidazol-2-il) quinolin-2 (1 H) -ona (Compuesto 3) Para confirmar las estructuras de los metabolitos identificados del compuesto 1, los metabolitos se sintetizan independientemente . El compuesto 2, el metabolito N-óxido del compuesto 1, se sintetizó como se muestra en el esquema de reacción a continuación. El compuesto 1 se calentó en una mezcla de etanol, dimetilacetamida y peróxido de hidrógeno. Mientras se completó la reacción, el compuesto 2 se aisló por el filtrado y lavado con etanol. Si es necesario, el producto deberá purificarse además por cromatografía de columna.

El compuesto 3, el metabolito de N-desmetilo del Compuesto 1, se sintetizó como se muestra en el esquema de reacción a continuación. La 5-Cloro-2-nitroanilina se trató con piperazina para proporcionar el 4 el cual se protegió secuencialmente con un grupo butiloxicarbonilo (Boc) para proporcionar el 5. La reducción del grupo nitro seguido por la condensación con éste de etilo del ácido 3-etoxi-3-iminopropionico dio el 6. La condensación del 6 con 6-fluoroantranilonitrilo usando hexametildisilazida de potasio como la base proporciono el 7. El crudo 7 se trató con HCl acuoso para proporcionar el metabolito deseado como un sólido café/amarillo después de la purificación Procedimientos del ensayo Serina/treonina cinasa La actividad de cinasa de diversas proteínas de serina/treonina cinasa se midió por el ATP proporcionado y un péptido adecuado o proteína que contiene un residuo de serina o aminoácido de treonina por fosforilación, y ensayo para la transferencia de la porción de fosfato al residuo de serina o treonina. Las proteínas recombinantes que contienen los dominios de cinasa de las enzimas GSK-3, RSK-2, PAR-1, NEK-2, y CHK1 se expresaron en las células de insecto Sf9 usando un sistema de expresión de Baculovirus (InVitrogen) y se purificó por medio de la interacción del anticuerpo Glu (para constructo etiquetado en epitopo Glu) o por cromatografía de ion de metal (para His6 (SEQ ID NO: 1) constructo etiquetado). El Cdc2 (constructo de fusión GST) y ciclina B se co-expresaron en células de insecto Sf9 usando un sistema de expresión de Baculovirus. El recombinante, la Cdk2/ciclina A activa es comercialmente disponible y se obtiene de Upstate Biotechnology. La enzima Cdc2 purificada usada en el ensayo fue comercialmente disponible, y esto puede obtenerse de New England Bio Labs. Para cada ensayo, los compuestos de prueba se diluyeron en serie en DMSO y luego se mezclaron con la solución amortiguadora de la reacción de cinasa apropiada más 5-10 nM de 33P gamma-etiquetado ATP. La proteína de cinasa y el substrato de péptido biotinilado apropiado se agregaron para dar un volumen final de 150 µl. Las reacciones se incubaron durante 3-4 horas a temperatura ambiente y luego se detuvieron para transferirse a una placa de microtítulo blanca recubierta con estreptavidina (Thermo Labsystems) que contiene 100 µl_ de la solución amortiguadora de reacción de paro. La solución amortiguadora de reacción de paro consiste de 50 mM ATP no etiquetado y 30 mM EDTA. Después de 1 hora de incubación, las placas de estreptavidina se lavaron con PBS, y 200 µl fluido de escintilación Microscint 20 se agregó por pozo. Las placas se sellaron y se contaron usando TopCount. La concentración de cada compuesto por 50% inhibición (IC50) se calculó empleando la regresión no lineal usando Software de análisis de datos XL Fit. La solución amortiguadora de reacción contiene 30 M de Tris-HCl2 pH 7.5, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 4 mM EDTA, 25 mM beta-glicerofosfato, 5 mM MnCl2, 0.01% BSA/PBS, 0.5 µM substrato de péptido, y 1 µM ATP no etiquetado. La enzima GSK-3 se usó a 27 nM, CHK1 a 5 nM, Cdc2 a 1 nM, Cdk2 a 5 nM, y Rsk2 a 0.044 unidades/mL. Para el ensato GSK-3, el péptido biotin-CREB (Biotin- SGSGKRREILSRRP (pS) YR-NH2 (SEQ ID NO: 4)) se usó. Para el ensayo CHK1, un péptido biotina-Cdc25c (BiOtJn- [AHX] SGSGSGLYRSPSMPENLNRPR[CONH2] (SEQ ID NO: 5)) se usó. Para los ensayos Cdc2 y Cdk2, un péptido biotina-Histona Hl ( [lcBiotin]GGGGPKTPKKAKKL[CONH2] (SEQ ID NO: 6)) se usó. En el ensayo Rsk2, un péptido biotina-p70, 15 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, péptido inhibidor 2.7 µM PKC y péptido inhibidor 2.7 µM PKA se usaron.

Tirosina cinasas La actividad de cinasa de un número de proteínas de tirosina cinasa se midió por el ATP proporcionado y un péptido apropiado o proteína que contiene un residuo de aminoácido de tirosina por fosforilación, y el ensayo para la transferencia de la porción de fosfato al residuo de tirosina. Las proteínas recombinantes corresponden a los dominios citoplásmicos de los receptores FLT-1 (VEGFR1), VEGFR2, VEGFR3, Tie-2, PDGFRa, PDGFRß, y FGFR1 que se expresaron en las células de insecto Sf9 usando un sistema de expresión de Baculovirus (InVitrogen) y pueden purificarse por medio de la interacción del anticuerpo Glu (para constructos etiquetados de epítopo Glu) o por cromatografía de ion de metal (para los constructos HiS6 (SEQ ID NO: 1)). Para cada ensayo, los compuestos de prueba se diluyeron en serie en DMSO y luego se mezclaron con una solución amortiguadora de reacción de cinasa apropiada más ATP. La proteína cinasa y un substrato de péptido biotinilado apropiado se agregaron para dar un volumen final de 50-100 µl, las reacciones se incubaron durante 1-3 horas a temperatura ambiente y luego se detuvieron por la adición de 25-50 µl de 45 mM EDTA, 50 mM Hepes pH 7.5. La mezcla de reacción de paro (75 µl) se transfirió a una placa de microtítulo recubierta con estreptavidina (Boehringer Mannheim) y se incubó durante 1 hora. El producto de péptido fosforilado se midió con el sistema de fluorescencia de tiempo resuelto DELFIA (Wallac o PE Biosciences) , usando un Anticuerpo PT66 de anti-fosfotirosina etiquetado con europio con la modificación de que la solución amortiguadora de ensayo DELFIA se suplemento con 1 mM MgC12 para la dilución del anticuerpo. La fluorescencia resuelta en tiempo se leyó en un fluorómetro Wallac 1232 DELFIA o un lector de señal múltiple PE Víctor II. La concentración de cada compuesto por 50% inhibición (IC50) se calculó empleando la regresión no lineal usando Software de análisis de datos XL Fit. Las cinasas FLT-1, VEGFR2, VEGFR3, FGFR3, Tie-2, y FGFR1 se ensayaron en 50 mM Hepes pH 7.0, 2 mM MgCl2, 10 mM MnCl2, 1 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mg/mL BSA, 2 µM ATP, y 0.20-0.50 µM correspondiendo al substrato de péptido biotinilado. Las cinasas FLT-1, VEG FR2 , VEGFR3, Tie-2, y FGFR1 se agregaron a 0.1 µg/mL, 0.05 µg/mL, ó 0.1 µg/mL respectivamente. Para el ensayo de PDGFR cinasa, 120 µg/mL enzima con las mismas condiciones de la solución amortiguadora como arriba se usó excepto por cambiar ATP y concentraciones del substrato de péptido a 1.4 µM ATP, y 0.25 µM biotina-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO: 2) substrato de péptido. Las cinasas de tirosina activas y recombinantes Fyn, y Lck son comercialmente disponibles y se obtuvieron de Upstate Biotechnology. Para cada ensayo, los compuestos de prueba se diluyeron en serie en DMSO y luego se mezclaron con una solución amortiguadora de reacción de cinasa apropiada más 10 nM 33P gamma-etiquetado ATP. La proteína de cinasa y el substrato de péptido biotinilado apropiado se agregaron para dar un volumen final de 150 µl. Las reacciones se incubaron durante 3-4 horas a temperatura ambiente y luego se detuvieron para transferirse a una placa de microtítulo blanca recubierta con estreptavidina (Thermo Labsystems) que contiene 100 µl de solución amortiguadora de reacción de paro de 100 mM EDTA y 50 µM ATP no etiquetado. Después de 1 hora de incubación, las placas de estreptavidina se lavaron con PBS y 200 µl de fluido de escintilación Microscint 20 se agregó por pozo. Las placas se sellaron y se contaron usando TopCount. La concentración de cada compuesto por 50% inhibición (IC50) se calculó empleando la regresión no lineal usando Software de análisis de datos XL Fit. La solución amortiguadora de reacción de cinasa para Fyn, Lck, y c-ABL contiene 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 15 mM MgCI2, 30 mM MnCI2, 2 M DTT, 2 mM EDTA, 25 mM beta-glicerol fosfato, 0.01 % BSA/PBS, 0.5 µM de substrato de péptido apropiado (substrato de péptido Src biotinilado: biotin-GGGGKVEKIGEGTYGVVYK-NH2 (SEQ ID NO: 3) para Fyn y Lck), 1 µM ATP no etiquetado, y 1 nM cinasa. La actividad de cinasa de c-Kit y FLT-3 se midieron por proporcionar ATP y un péptído o proteína que contiene un residuo de aminoácido de tirosina por fosforilación, y ensayo para la porción de transferencia de fosfato al residuo de tirosina. Las proteínas recombinantes corresponden a los dominios citoplásmicos de los receptores c-Kit y FLT-3 obtenidos de ( Proquinase) . Para probar, un compuesto ejemplar, por ejemplo 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4-metilpiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2 (ÍH) -ona, se diluyó en DMSO y luego se mezcló con la solución amortiguadora de reacción de cinasa descrita a continuación más ATP. La proteína de cinasa (c-Kit o FLT-3) y el substrato de péptido biotinilado (biotina-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO: 2)) se agregaron para dar un volumen final de 100 µL. Estas reacciones se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se detuvieron por la adición de 50 µL de 45 mM EDTA, 50 mM HEPES, pH 7.5. La mezcla de reacción de paro (75 µL) se transfirió a una placa de microtítulo recubierta con estreptavidina (Boehringer Mannheim) y se incubó durante 1 hora. El producto de péptido fosforilado se midió con el sistema de fluorescencia de tiempo resuelto DELPHIA (Wallac o PE Biosciences) , usando un anticuerpo de anti-fosfotirosina etiquetado con europio, PT66, con la modificación de que la solución amortiguadora de ensato DELFIA se suplemento con 1 mM gCl2 para la dilución del anticuerpo. Los valores de fluorescencia resuelta en tiempo se determinaron en un fluorómetro Wallac 1232 DELFIA o un lector de señal múltiple PE Víctor II. La concentración de cada compuesto por 50% inhibición (IC50) se calculó empleando la regresión no lineal usando Software de análisis de datos XL Fit. Las cinasas FLT-3 y c-Kit se ensayaron en 50 mM Hepes pH 7.5, 1 mM NaF, 2 mM MgCI2, 10 mM MnCl2 y 1 mg/mL BSA, 8 µM ATP y 1 µM del substrato de péptido correspondiente biotinilado ( biot ina -GGL FDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO: 2) ) . La concentración de las cinasas FLT-3 y c-Kit se ensayaron en 2 nM.

Evaluación Detallada de la formación de imágenes y en tiempo real de 4-Amino-5-fluoro-3-f6- (4-metilpiperazin-l-il) -1H- benzimidazol-2-il] quinolin-2 (ÍH) -ona Eficacia en el modelo de mieloma múltiple preclínico El mieloma múltiple (MM) , un neoplasma de células B caracterizado por la expansión clonal de las células de plasma en la médula ósea hematopoyética, permanece como una malignidad hematológica fatal debido al desarrollo de la resistencia al fármaco adquirido e intrínseco debido a la introducción de quimioterapia de alta dosis convencional. Se ha demostrado que el microambiente de médula ósea, donde las células MM preferentemente se alojan y crecen, juegan un papel crucial en el desarrollo de resistencia a terapias convencionales y novedosas para M . Por lo tanto, los agentes de direccionamiento molecular se dirigen no solo a las células MM pero también con interacción microambiental de las células MM de médula ósea frecuentemente a una oportunidad potencial para tratar MM. Los avances recientes en el entendimiento de la patología molecular de MM proporcionan objetivos terapéuticos novedosos para el tratamiento de esta enfermedad. El FGFR-3 ectópicamente expresado y desrregulado, el cual se presenta en aproximadamente 15% MM de los pacientes resultando a partir de la transubicación cromosomal t(4;14) y confiere un pronóstico particularmente pobre en clínicos, que llegan a tener un objetivo terapéutico atractivo para MM. La 4 -Amino- 5-fluoro-3- [ 6- ( -metilpiperazin-l-il ) -1H-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona (Compuesto 1) es un inhibidor de molécula pequeña dirigido a cinasa de tirosina del receptor múltiple que incluye VEGFR-2 y PDGFR (IC50S -20 nM en ensayos de cinasa) y FGFR-3 (IC50 ~5 nM en ensayos de cinasa) . Sea demostrado que la 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4-metilpiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il]quinolin-2 (ÍH) -ona inhibe la autofosforilación FGFR-3 y proliferación celular en las células MM mutantes FGFR-3 in vitro (S. Trudel et al.; Blood; en impresión) . Para evaluar la eficacia antimieloma de 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4-metilpiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il ]quinolin-2(l H) -ona, un modelo MM preclínico in vivo se desarrolló en el cual las lesiones MM de multi-órgano se desarrollaron después de la inyección i.v. en la vena de la cola de de células KMS-11-luc humanas que expresan el FGFR-3 mutante (Y373C) establemente transfectado con un constructo de luciferasa. La formación de imágenes bioluminiscentes (BLI) se empleó para monitorear no invasivamente el crecimiento in vivo y metástasis de los tumores MM KMS-11-luc. La detección temprana y crecimiento de monitoreo comprensivo en serie de lesiones metastáticas se capturaron exitosamente por BLI con este modelo. Casi todos los animales inyectados con células de tumor KMS-11-luc se encontraron para desarrollar las lesiones MM como tempranamente como el día 26, los cuales se localizaron principalmente en la espina, cráneo y pelvis resultando en el desarrollo frecuente de la parálisis en este modelo. La eficacia del anti- ieloma de 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4-metilpiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il]quinolin-2 (ÍH) -ona en este i.v. inyectado in vivo el modelo KMS-11-luc MM se investigó y se encontró que la administración diariamente oral de 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- ( 4-metilpiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il ]quinolin-2(lH)-ona a 20 mg/kg, una dosis que se demuestra para inhibir la forsforilación de ERK en tumores KMS-11-luc in vivo, resuelto en una inhibición importante del crecimiento de tumor KMS-11, como se detectó por el formado de imágenes serie BLI. Además, la actividad del crecimiento antitumor de 4-amino-5-fluoro-3-[6-( 4-metilpiperazin-l-il ) -1H-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona se translado a un ambiente importante en el rango de supervivencia del animal comparado al tratamiento de vehículo. Estos estudios proporcionaron además bases preclínicas para los ensayos clínicos de 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona en pacientes MM y garantizan una evaluación adicional de 4-amino-5-fluoro-3- [6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2(lH)-ona en la terapia de combinación con agentes convencionales u otros objetivos moleculares en este modelo KMS-11-luc in vivo.

Método Un grupo de ratones beige SCID inmunodeficientes hembras (alrededor de 8 semanas de edad) se obtuvieron a partir del laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y se alojaron en una instalación de barrera en jaulas de pared superior con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. Todos los experimentos se llevaron a cabo en una instalación acreditada por la asociación para evaluación y acreditación de cuidado de animales de laboratorio internacional y de conformidad con la guía de cuidado y uso de animales de laboratorio (National Research Council). Las células KMS-11-luc MM que portan mutantes FGFR-3 (Y373C) se cultivaron en el medio Iscove +10% FBS + L-glutamina y se pasaron dos veces/semana en un rango de 1:2 hasta 1:4. Las células se implantaron por inyección intravenosa en la vena de la cola en células lOxlO6 por 100 µL HBSS por ratón. Los ratones se irradiaron a 3 GY (3.2 minutos) en el día de la implantación celular. Los animales se recibieron diariamente tratamiento oral de 20 mg/kg 4-amino-5-fluoro-3- [6- ( 4-metilpiperazín-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2 ( ÍH) -ona o vehículo (n = 9 cada grupo) partiendo de 48 horas después de que las células KMS-11-luc se inyectaron. El formador de imágenes Bioluminescent (BLI) se obtuvo usando un sistema formador de imágenes MS® (Xenogen) que incluye una cámara CCD enfriada, altamente sensible, montada en una caja de cámara hermética a la luz. Las imágenes y mediciones de las señales bioluminiscentes, como cuantificadas por fotón/segundo, se adquirieron en el día 8 y una semana posterior, después de la inyección del substrato de luciferasa. Los pesos del cuerpo animales se monitorearon dos veces una semana y la observaciones clínicas se registraron diariamente. De conformidad con la regulación y guías de cuidado animal, los ratones se sacrificaron por inhalación de C02 en el evento de parálisis o compromiso mayor en su calidad de vida.

Resultados En el día 8 después de que las células KMS-11-luc se inyectaron intravenosamente en ratones SCID-beige, el formador de imágenes de cuerpo completo demostró el desarrollo del crecimiento celular y la posibilidad de lesiones MM principalmente localizadas en la regiones extraesqueletales incluyendo pulmón, hígado y bazo. Las lesiones esqueletales múltiples difusas típicas incluyen cráneo, pelvis y espina claramente se observaron en la mayoría de los ratones entre el días 41 y el día 48 (como se observó en las imágenes BLI) las cuales se asocian con la parálisis de las extremidades traseras, resultando en el sacrificó de los ratones de conformidad al protocolo. La eficacia del antimieloma de 4-amino-5-f luoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il ]quinolin-2 (ÍH) -ona se probó en KMS-11-luc en este modelo in vivo. Los ratones comenzaron a recibir diariamente tratamiento oral del compuesto 1 a 20 mg/kg a 48 horas después de que las células KMS-11-luc se inyectaron (n= 9 ratones/grupo) . El monitoreó comprensivo y en serie de los conteos de fotones en cada animal se llevó a cabo en un programa de base semanal. Una cuenta de fotones media significativamente inferior en el grupo tratado con 4-amino-5-f luoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-l-il ) -lH-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona se demostró comparado al tratamiento de vehículo como se muestra en la FIGURA 1. esto se observó fácilmente por comparación del formador de imágenes BLI de cuerpo completo tomado de los ratones inyectados con KMS-11-luc tratados con el vehículo y aquellos tratado con 4-amino-5-f luoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2 (ÍH) -ona. De forma interesante, la diseminación del patrón de células de mieloma múltiples KMS-11 en el compuesto 1 de ratones tratados fueron también significativamente menos dispersados. La metástasis se restringe a áreas del abdomen y espalda y no se encontró extensivamente en las regiones craneales de las vértebras o miembros posteriores.

La reducción de cuentas de fotón en ratones tratados con 4 -amino-5-fluoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-l-il) -1H-benzimidazol-2-il] quinolin-2 ( ÍH) -ona está bien reflejada por incrementos importantes en el tiempo de supervivencia en comparación con los ratones tratados con vehículo. El día 91, 5 de 9 animales en aquellos ratones tratados con 4-amino-5-fluoro-3- [6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona se mantienen vivos con condiciones saludables generales. En contraste, la mayoría de los animales en el grupo tratado con vehículo se sacrificaron alrededor del día 50. Adicionalmente, los ratones tratados con 4-amino-5-fluoro-3-[6- (4-metilpiperazin-l-il) -1H-benzimidazol-2-il] quinolin-2 ( ÍH) -ona, toleraron este tratamiento bien por el periodo largo de este estudio. Debido a la mejora obvia en el tiempo de supervivencia de los ratones tratados con 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-1-il ) -lH-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona, el estudio se terminó el día 91 para consideraciones prácticas. Estudios adicionales con respecto a la inhibición de cinasa en general, inhibición de FGFR3, y tratamiento de cánceres que incluyen mieloma múltiple con 4-amino-5-fluoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2(lH)-ona se establecen en la solicitud de patente de E.U.A. publicada No. 2004/0092535, y Solicitud de patente de E.U.A. No. 10/983,174, Solicitud de patente de E.U.A. No. 2004/0220196, y Patente de E.U.A. No. 6,605,617. Por lo tanto, cada una de estas referencias se incorpora por ello para referencia en su totalidad y para todos los propósitos como si se establece completamente en la presente.

Actividad de 4-amino-5-fluoro-3- [6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2 (ÍH) -ona (Compuesto 1) en Modelos de Xenoinjerto de Tumor Experimental de AML Humano La 4-amino-5-fluoro-3-[6-( 4-metilpiperazin-l-il ) -1H-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona (Compuesto 1) es una molécula nueva, oralmente activa, pequeña multietiquetada, que exhibe una actividad potente contra la cinasa FLT3 y RTK de Clase III, IV, y V involucrados en la proliferación de célula endotelial y de tumor. Dada la relevancia de las mutaciones FLT3 en la leucemia mielógena aguda (AML) , el Compuesto 1 se probó en dos líneas de célula leucémica humana con diferentes estados de mutación FLT3 (M V4;ll FLT3 ITD vs . RS4;11 FLT3 WT) . La actividad antiproliferativa del Compuesto 1 contra MV4;11 fue -24 veces mayor en comparación con RS4;11, lo que indica una inhibición más potente del FLT3 constitutivamente activado. La modulación dependiente de la dosis de la fosforilación del receptor y señalización en dirección descendente (STAT5 y ERK/MAPK) en células MV4;11 células con el Compuesto 1 confirma el mecanismo de acción molecular. La modulación direccionada de pFLT3, pERK en tumores MV4;11 se alcanzó a dosis biológicamente activas del Compuesto 1. Las regresiones y erradicación de tumor de células AML de la médula ósea (BM) se demostraron en modelos de xenoinjerto leucémicos injertados en BM y subcutáneos. Las respuestas al tumor se caracterizan al reducir la proliferación celular y teñido inmunohistoquímico positivo de caspasa-3 y PARP desdoblada, lo que sugiere que la muerte celular se media por medio de la apoptosis. Estos datos soportan la evaluación clínica del Compuesto 1 en AML.

Líneas Celulares Las células leucémicas MV4;11 (FLT3 ITD) y RS4;11 (FLT3 WT) humanas se obtuvieron del American Tissue Culture Collection (Rockville, MD) 24-26. Las células MV4;11 se hicieron crecer en medio Dulbecco modificado de Iscoves (IMBM) complementado con suero de bovino fetal al 10% (FBS, Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD) que contiene 4 mM L-glutamina, 5 ng/ml factor estimulante de la colonia de granulocitomacrófago (GM-CSF, R&D Systems, Minneapolis, MN) y 1% Penicilina y estreptomicina. Las RS4;11 se hicieron crecer en medio RPMI-1640 que contiene 10 %FBS, 1 mM piruvato de sodio y 10 mM HEPES (pH 7.4) . Las células se hicieron crecer como cultivos de suspensión y se mantienen en una atmósfera humidificada a 37°C y 5% C02.

Ensayos de Cinasa Los ensayos de cinasa FLT3 in vitro se corrieron con enzima FLT3 2 nM (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) en la presencia de 8 µM ATP y diluciones en serie del Compuesto 1. El substrato péptido fosforilado a una concentración final de 1 µM se incubó con un anticuerpo anti-fosfotirosina etiquetado con europio (PT66) (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) . El europio se detectó usando fluorescencia de resolución por tiempo. El IC50 se calculó usando regresión no lineal.

Ensayos de Proliferación Las células se colocaron en placas de microtitulación de 96 pozos (10,000 células/pozo) y diluciones en serie del Compuesto 1 se agregaron. Las células RS4;11 se estimularon con ligando FLT3 (100 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN) . Al final del periodo de incubación (72 h a 37°C), la viabilidad celular se determinó por el ensayo MTS (Promega, Madison, Wl). Los valores EC50 se calcularon usando regresión no lineal, y se define como la concentración necesaria para una reducción del 50% en la absorbancia de células de control tratadas contra no tratadas.

Inmunoprecipitación y Análisis Western Blot Para experimentos in vitro, las células MV4;11 y RS4;11 células se trataron con el Compuesto 1 durante 3 horas. Las células RS4;11 se estimularon con ligando FLT3 (100 ng/mL) durante 15 minutos después de la incubación con el Compuesto 1. Después de la incubación con fármaco, las células se cosecharon, se lavaron con PBS enfriado en hielo y se Usaron con solución amortiguadora RIPA (1 % Nonidet P-40, 0.5% de desoxiclolato de sodio, 0.1 % dodeciisulfato de sodio en IX de solución salina amortiguada en fosfato, pH 7.2) que contiene inhibidores de proteasa (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) e inhibidores de fosfatasa (Sigma, St. Louis, MO) . Para análisis de modulación objetivo in vivo, los tumores resecados se congelaron instantáneamente, se pulverizaron y almacenaron a -70°C antes de la lisis con 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 50 mM Hepes, pH 7.5, 10% glicerol, 1.0% Tritón X-100, 1 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3V04, 2 mM Pefabloc (Roche) , y cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche) . El contenido de proteína de los lisados se determina usando el ensayo BCA (Bio-Rad, Hercules, CA) . El análisis Western blot para pERK se realizó con un anticuerpo de ratón para pERK (1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA) y se incubó a 4°C durante la noche. El nivel ERK total se evaluó al volver a colocar en sonda con anticuerpo contra el ERK total (Cell Signaling) . Las membranas se incubaron entonces durante 1 hora a temperatura ambiente con 1:5000 de IgG anti-conejo conjugado a peroxidasa de raíz de rábano (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) . Por inmunoprecipitación para detectar FLT3, cantidades iguales de proteínas (500 µg para STAT5; 1000 µg para FLT3) se incubaron con anticuerpos contra ya sea FLT3 o STAT5 humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante la noche a 4°C y con proteína A-agarosa durante 2 horas a 4°C. La fosforilación de FLT3 o STAT5 se midió al colocar en sonda con un anticuerpo anti-fosfotirosína (anticuerpo anti-pFLT3 de Cell Signaling, y anticuerpo anti-pSTAT5 de Upstate) . Las proteínas se detectaron usando quimioluminiscencia aumentada (ECL; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra) y se visualizan después de la exposición a película Kodak. La densitometría de barrido se realizó para cuantíficar las intensidades de banda. Para verificar la carga igual, se depuraron manchas y se volvieron a colocar en sonda con anticuerpos APRA ya sea anti-FLT3 (Santa Cruz Biotechnology) o anti-STAT5 (BD Biosciences) para medir la proteína FLT3 o STAT5 total, respectivamente. La cantidad de pFLT3, pERK o pSTAT5 se normalizó hasta niveles de proteína FLT3, ERK o STAT5 totales, y se compara al vehículo o controles no tratados .

Ensayos Citométricos de Flujo Las células MV4;11 se trataron con el Compuesto 1 durante 3 horas bajo condiciones privadas de suero (durante la noche en medio OptiMEM) . Para la detección de pSTAT5, las células se fijaron con formaldehído al 1%, y se permeabilizan con metanol enfriado en hielo al 90%. Las células permeabilizadas (0.5 - lxlO6) se incubaron con anticuerpo anti-pSTAT5 (Cell Signaling) durante 30 minutos. El IgG de conejo purificado (Oncogene, San Diego, CA) a la misma concentración se usó como el control de isotipo. El anticuerpo secundario fue un IgG anti-conejo F(ab')2 de cabra conjugado a PE (Jackson Immunoresearch) . Las muestras se almacenaron a 4°C en la oscuridad antes de analizar usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA) . La intensidad de fluorescencia media (MFI) se determinó para teñido pSTAT5 usando software CellQuest (Becton Dickinson) y el MFI específico fue la diferencia del MFI del anticuerpo de control de isotipo. Para el procesamiento de las células de médula ósea (BM) del modelo injertado a MV4;11 de ratón, se purgaron fémures con solución salina fría y células de glóbulos rojos usadas con solución amortiguadora de lisis FACS (Becton Dickinson) . El porcentaje injertado de células leucémicas hmanas en BM de ratón se determinó por teñido con HLA-A, B, C-FITC anti-humano (vs. Isotipo-anticuerpo alineado-control FITC) (BD Pharmingen) . ELISA VEGF Las células MV4;11 se cultivaron en 10% FBS que contiene medio con concentraciones diversas (0-1 µM) del Compuesto 1 durante 48 horas. Los sobrenadantes se colectaron después de la centrifugación, y los niveles VEGF se midieron por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Las concentraciones de proteína se determinaron usando el ensayo de proteína BIO-RAD (Hercules, CA) y los resultados se normalizaron hasta concentración de proteína.

Estudios de Eficacia In Vivo Se obtienen ratones SCID-NOD hembras (4-6 semanas de edad, 18-22 g) de Charles River (Wilmington, MA) y se aclimatan durante 1 semana en encierro libre de patógenos antes de iniciar el estudio. Los animales reciben alimento de roedor estéril y agua ad libitum y se alojaron en jaulas de tapa filtro estériles con ciclos de 12 horas de luz/oscuridad. Todos los experimentos están bajo las guías de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional.

Modelo Subcutáneo Las células MV4;11 y RS4;11 se paan de tumores subcutáneos (s.c.) en ratones SCID-NOD. Las células (5 x 106 células/ratón) se reconstituyen con Matrigel al 50% (Becton Dickinson) y se implantan s.c. en el flanco derecho de ratones SCID-NOD. Los tratamientos se iniciaron cuando los tumores están de 200-1000 mm3, como se resumen en los diseños de estudio específicos. Los ratones se asignan aleatoriamente en grupos (típicamente 10 ratones/grupo para estudios de eficacia y 3-5 ratones/grupo para estudios farmacodinámicos (PD)) . El compuesto 1 se administró como una solución por medio de alimentación oral. Los volúmenes de tumor y pesos corporales se evaluaron 2-3 veces semanalmente Las mediciones de calibrador de tumores se convierten en volumen de tumor medio usando la fórmula: 1/2 (longitud x [ancho]2) . El porcentaje de inhibición de crecimiento de tumor (TGI) se comparó con los ratones tratados con vehículo. Las relaciones de respuesta se definen como respuestas completas CR (sin tumor palpable) o respuestas parciales PR (50-99% de contracción) en comparación con el volumen del tumor al inicio del tratamiento.

Modelo de Injertado en Médula ósea (BM) Intravenoso Los ratones SCID-NOD se irradiaron (3 Gy) antes de la inyección en la vena de la cola de lxlO7 células MV4;11 en 0.2 ml de solución salina. Los tratamientos con el compuesto 1 ó vehículo se inician 3 semanas después de la inoculación celular. Los ratones se monitorean diariamente y se les aplica la eutanasia cuando están moribundos o tienen señales tempranas de pérdida de movilidad de miembros anteriores. La calidad vida incrementada (ILS) de ratones tratados se calculó como un porcentaje incrementado en el tiempo de supervivencia medio (MST) contra ratones de control tratados con vehículo.

Modulación Objetivo In Vivo Los tumores MV4;11 s.c. en ratones SCID-NOD (n= 3 ratones/grupo) se colocaron en etapas a 300mm3 y los tratamientos consisten de ya sea el vehículo o el Compuesto 1 se administraron oralmente a 10 mg/kg durante 5 días. Para caracterizar las propiedades PD del Compuesto 1, las muestras de tumor se colectaron a varios tiempo (N=3 ratones/punto de tiempo) después de la dosificación del Compuesto 1.

Inmunohistoquímica Los tumores vueltos a seccionar se colocan en formalina amortiguada neutral al 10% durante la noche a temperatura ambiente, se transfieren a etanol al 70% y se procesan para colocado en parafina usando un procesador de tejido Thermo Electron Excelsior (Pittsburgh, PA) . Se descalcifican muestras óseas (fémur) (ProtocolTM, Fisher Diagnostics, Middletown, VA) . Los bloques de parafina se seccionan hasta un espesor de 4 µm y se colocan en portaobjetos de vidrio positivamente cargados. Los tejidos se tiñen usando una máquina de portaobjetos automatizada (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) . Los portaobjetos se trataron con solución amortiguadora de citrato (pH 6.0) en una máquina de corriente a presión para recuperar el antígeno para teñido Ki-67, pERK y PARP, y caspasa-3 se recuperan por el reactivo Ventana CC1. Los anticuerpo primarios usados fueron Ki-67 (1:750 dilución, NovoCastra Laboratories, RU) , pERK (1:100 dilución, Biosource, Camarillo, CA) , mitocondria anti-humana (1:200, Chemicon, Temecula, CA) , caspasa-3 desdoblada (1:200, Cell Signaling) y PARP desdoblado (1:100, Biosource) . El anticuerpo secundario fue un anticuerpo biotinilado F(ab')2 anti-conejo de cabra, 1:100 dilución (Jackson ImmunoResearch) . Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina y se montan con una tapa. La morfología de tejido general también se evaluó usando teñido con hematoxilina y eosina.

Análisis Estadísticos Se realizó la regresión lineal usando el Microsoft Excel (Redmond, WA ) . La prueba t de Stuclent se usó para medir la importancia estadística entre dos grupos de tratamiento. Las comparaciones múltiples se dan usando análisis de variación de una vía (ANOVA) , y pruebas posteriores que comparan los diferentes medios de tratamiento se dan usando la prueba S t udent -Newman Keul (SigmaStat, San Rafael, CA) . Para estudios de supervivencia, la prueba de rango log se usó para determinar la importancia entre las curvas de sobrevivencia de varios tratamiento contra grupos de vehículo (Prism, San Diego, CA) . Los ratones sacrificados con estado de salud normal al final del estudio se consideran supervivientes de larga duración y se censuran en este análisis. Las diferencias se consideran estadísticamente importantes a p < 0.05.

RESULTADOS El Compuesto 1 Demuestra una Inhibición Potente de la Actividad de Cinasa FLT3 La especificidad del Compuesto 1 se probó contra un panel diverso de RTKs usando ensayos de enlace competitivos ATP con enzimas purificadas como se describe arriba. el Compuesto 1 se encontró que es altamente potente contra FLT3 (1 nM) con actividad nanomolar contra c-KIT (2 nM), VEGFR1/2/3 (10 nM) ; FGFR1/3 (8 nM) ; PDGFRß (27 nM) y CSF-1 R (36 nM) (ver la siguiente Tabla) . Para confirmar la selectividad contra los RTK de Clase III, IV y V, el Compuesto 1 se probó contra otras cinasas en las trayectorias Pl3K/Akt y MAPK(K) y se encontró que tiene una actividad insignificante (ICs0 > 10 µM) (ver la siguiente Tabla) .

Tabla. Actividad de 4-Amino-5-fluoro-3- [ 6- (4-metilpiperazin-1-il) -lH-benzimidazol-2-il]quinolin-2 (ÍH) -ona Contra Varios RTK Los ensayos RTK in vitro usados para preparar la tabla anterior se corrieron con varias diluciones del Compuesto 1 en la presencia de enzimas purificadas y ATP como se describe arriba. Los substratos de péptido fosforilados (1 µM) se incubaron con anticuerpos anti-fosfoespecífieos etiquetados con europio y el europio se detectó usando fluorescencia resuelta en tiempo.

Efectos Antiproliferativos Potentes del Compuesto 1 en Células MV4;11 (FLT3 ITD) Para determinar si la inhibición de FLT3 se traduce en la inhibición del crecimiento in vitro, la actividad del Compuesto 1 se probó contra células MV4;11 y RS4;11 usando el ensato MTS. Las MV4;11 o RS4;11 (en presencia de ligando FLT3) se incubaron con diluciones en serie del Compuesto 1. La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTS después de un periodo de incubación de 72 horas. Los valores EC50 se calcularon usando regresión no lineal, y se definen como la concentración necesaria para una reducción del 50% de absorbencia de células de control tratadas contra no tratadas. El compuesto 1 inhibe potentemente la proliferación de células MV4;11 en una manera dependiente de la dosis con EC50 = 13 nM. No obstante que los efectos dependientes de la concentración en la proliferación se observaron con células RS4;11, estos fueron aproximadamente 24 veces menos sensibles al Compuesto 1 (EC50 = 315 nM) . El efecto antiproliferativo del Compuesto 1 también se probó en las células mutantes FLT3 ITD, MOLM13 y MOLM 14 con concentraciones EC50 similares a aquellas vistas con MV4;11 (EC50 ~ 6 nM) . Estos datos sugieren que el Compuesto 1 es activo tanto en FLT3 ITD como células leucémicas WT, con el receptor constitutivamente activo siendo más sensible a la inhibición.

Efectos In Vitro del Compuesto 1 en Señalización Mediada por FLT3 en Células Leucémicas La actividad celular in vitro del Compuesto 1 se investigó en dos líneas de células leucémicas humanas MV4;11 y RS4;11 con estado mutacional FLT3 contrastante (confirmado usando RT-PCR) . En estos experimentos, las células MV4;11 (ITD) o RS4;11 (WT) alimentadas con suero se incubaron con una concentración incrementada del Compuesto 1 por 3 horas antes de la lisis celular. Las células RS4;11 se estimularon con ligando FLT3 (100 ng/ml) por 15 minutos. Los lisados celulares completos se inmunoprecipitaron con anticuerpo FLT3 anti-humano, resuelto por SDS-PAGE. Los inmunomanchados se probaron con anticuerpo anti-fosfotirosina . Las membranas también se depuraron y volvieron a colocar en sonda con anti-FLT3 para demostrar carga igual de FLT3. Los cambios en pFLT3 se reportaron como porcentaje de línea base (sin tratamiento) usando densitómetro. Las células MV4;11 tienen una mutación de duplicación en tándem interno (ITD) en el receptor FLT3, que resulta en FLT3 constitutivamente activado. Levis M. et al., Blood, 99:3885-3891 (2002); O' Farrell A.M. et al., Blood, 101 :3597-3605 (2003). Esta activación resulta en autofosforilación de FLT3 en ausencia de estimulación de ligando exógeno. Las células MV4;11 privadas de suero se trataron con el Compuesto 1 por 3 horas, y los efectos directos en la activación del receptor FLT3 se determinaron por análisis de su estado de fosforilación. La exposición de células MV4;11 a concentraciones incrementadas del Compuesto 1 inhibe potencialmente el pFLT3 en una manera dependiente de la dosis con EC50 entre 1-10 nM. Aunque los FLT3 ITD prevalecen a aproximadamente 20% de las descargas de paciente AML, las leucemias más agudas expresan WT FLT3. Los efectos del Compuesto 1 en células RS4;11 leucémicas también se investigó (FLT3 WT) siguiendo el ligando FLT3 exógeno (100 ng/ml, 15 minutos) para activar la fosforilación del receptor FLT3. Las células RS4;11 FLT3 WT tienen niveles básales bajos de pFLT3 en ausencia de estimulación del ligando FLT3. El tratamiento con Compuesto 1 disemina os niveles pFLT3 en células RS4;11. Sin embargo, comparativamente, las concentraciones mayores se requieren para modulación de WT FLT3 vs . ITD. La inhibición completa se obtuvo con concentraciones > 0.5 µM.

El Compuesto 1 Modula ERK y STAT5 , Objetivos cadena debajo de la inhibición de FLT3 Para caracterizar además los efectos del Compuesto 1 sobre la inhibición de FLT3, se investigó la modulación de los objetivos cadena abajo de FLT3, esto es, STAT5 y ERK, los cuales son proteínas clave en la supervivencia y proliferación celular. Las células MV4;11 se trataron con concentraciones crecientes del Compuesto 1 por 3 horas y se procesaron por citometría de flujo y por la técnica Western blot para la detección de pERK y p-STAT5. Los cambios en pERK o pSTATd se reportan como porcentaje de la línea base (sin tratamiento). En las células MV4;11, debido a la señalización active de FLT3, las células tienen altos niveles básales de pERK y pSTATd. El compuesto 1 inhibió la fosforilación de ERK y STAT5 en una forma dependiente de la dosis. La inhibición sustancial de pERK y pSTAT5 (>50%) se observó a concentraciones > 0.1 µM (citometría de flujo y Western blot) . Los efectos inhibidores del Compuesto 1 sobre pERK y pSTATd fueron más potentes en MV4;11 comparado a las células RS4;11 que estimulan el ligando FLT3. Compuesto 1 Inhibe la Producción Autocrina de VEGF en células MV4;11 In Vitro Para atender el efecto del Compuesto 1 en la producción de VEGF in vitro, se efectuó una ELISA sobre sobrenadantes de cultivo de MV4;11. En estos experimentos, se cultivaron las células MV4;11 en medios que contienen 10% FBS con concentraciones crecientes (0-1 µM) del Compuesto 1 por 48 horas. En ausencia del tratamiento con fármacos, las células MV4;11 segregan un VEGF sustancial (180 pg/ml), mientras que el Compuesto 1 inhibió la producción de VEGF en una forma dependiente de la dosis, con un EC50 entre 0.001 y 0.01 µM y la inhibición completa a concentraciones > 0.5 µM.

El Compuesto 1 Modula la Señalización de FLT3 In Vivo Para examinar la modulación del direccionamiento in vivo, se les administró a ratones que llevan el tumor MV4;11 (escalonado a 300-500 mm3) con el Compuesto 1 (10 mg/kg/d) o vehículo durante 5 días. Los tumores se fragmentaron el día 5 a 4, 8, 24, y 48 h posteriores a la dosis, se pulverizaron e inmediatamente se congelaron de forma instantánea (-70°C). Los tumores que se cosecharon después de puntos de tiempo seleccionados, se homogeneizaron y analizaron para los niveles de pFLT3 y pSTATd por IP/Western blot. Para la modulación de pFLT3 o pSTAT5: se inmunoprecipitaron lisados de tumor ya sea con anticuerpos anti-humano FLT3 o anti-STAT5, resueltos por SDS-PAGE. Se hicieron sondas de las inmunotinciones con un anticuerpo adecuado de antifosfotirosina . Se agotaron las membranas y se volvieron a formar sondas ya sea con anti-FLT3 o anti-STAT5 para la determinación de la proteína total FLT3 o STAT5 como controles de carga. Se observaron reducciones importantes en los niveles de pFLT3 y pSTATd tan pronto como 4 horas después de la dosis ya sea con una dosis simple o dosis múltiples del Compuesto 1, sin efectos en la proteína total FLT3 o STAT5. La fosforilación de FLT3 y STAT5 declinó con relación a la línea base al alcanzar una inhibición máxima de -90% a 8 horas después de la dosis y permaneció suprimida durante 24 horas (-85% de inhibición. La Fosfo-FLT3 regresó más cercana a los niveles de línea base, mientras que p-STAT5 estaba todavía inhibido (-60% inhibición) 48 horas después de la dosis. Las disminuciones en los niveles de pERK también se observaron, lo que indica un bloqueo de la señalización cadena abajo de FLT3.

Estudios de Eficacia In Vivo Efectos de Respuesta a la Dosis de Compuesto 1 sobre los Tumores MV4;11 y RS4;11 In Vivo Para determinar si los efectos in vitro del Compuesto 1 se correlacionan con la inhibición del crecimiento del tumor in vivo, se examinó la eficacia del Compuesto 1 contra los xenoinjertos del tumor MV4;11 o RS4;11 en ratones SCID-NOD. Se implantaron ratones s.c, con células de tumor y se iniciaron los tratamientos con el Compuesto 1 cuando los tumores eran de 200-300 mm3. En los estudios de eficacia de respuesta a la dosis, el Compuesto 1 se administró oralmente a un intervalo de dosis de 1-30 mg/kg/d para los tumores MV4;11, y 10-150 mg/kg/d para los tumores RS4;11. El Compuesto 1 fue altamente potente contra tumores MV4;11, lo que revela un efecto bueno de respuesta a la dosis con una inhibición importante del crecimiento del tumor a dosis de > 5 mg/kg/d (FIGURA 2) . Las dosis de 30 mg/kg/d indujeron la regresión del tumor (9/10 respuestas de tumor), lo cual consistió tanto de respuestas parciales como completas (1CR, 8PR). Una inhibición modesta del crecimiento del tumor se observó a 1 mg/kg/d (23%) después de 2 semanas de dosificación, y se identificó como la dosis efectiva estadísticamente mínima en este modelo (p< 0.01 vs . Vehículo). En los ratones que portan los tumores RS4;11, el tratamiento con el Compuesto 1 resultó en la inhibición del crecimiento del tumor, sin embargo no se observaron recaídas (FIGURA 3) . Los efectos inhibidores del Compuesto 1 fueron más potentes contra los tumores MV4;11 en comparación con los tumores RS4;11, definidos por las dosis efectivas mínimas respectivas en cada modelo (día 8: 100 mg/kg/d; 48% TGI, p<0.01 contra tumores RS4;11 vs . 1 mg/kg/d; 23% TGI, p<0.01 contra tumores MV4;11).

Programas Alternos de Dosis del Compuesto 1 son Igualmente Potentes Los efectos de las dosis cíclicas e intermitentes del Compuesto 1 contra los tumores del xenoinjerto MV4;11 también se examinaron (FIGURA 4) . El Compuesto 1 se administró oralmente a 30 mg/kg diariamente, cada tercer día (q.o.d.), o cíclicamente, 7 días activo seguido por 7 días inactivo durante 2 ciclos (FIGURA 4). Similar a la dosificación diariamente, los regímenes de dosificación intermitente produjeron regresiones importantes del tumor dentro de días del tratamiento del fármaco (>94% TGI) . Todos los tres regímenes resultaron en una actividad antitumor equivalente (día 29, p>0.05) y fueron similares los números de respuestas observadas con q.o.d. (6PR) y 7 días activo/7 días inactivos (9PR) con aquellos observados con el tratamiento diario (1CR, 9PR) .

Compuesto 1 es Efectivo Contra Tumores Grandes MV4;11 Los efectos del Compuesto 1 sobre tumores grandes MV4;11 de tamaños variables; 300, 500 o 1000 mm3 también se investigaron. El tratamiento con Compuesto 1 (30 mg/kg/d) indujo una regresión importante en todos los tumores MV4;11 la cual fue independiente de los tamaños iniciales del tumor al inicio del tratamiento (FIGURA 5) . Las regresiones del tumor fueron evidentes dentro de 3-5 días de tratamiento con el fármaco. Todos los tumores tratados respondieron (n=27), con 15% de respuestas completas y 70% de respuestas parciales. Los restantes 15% fueron respuestas menores o permanecieron estables. Se descontinuó la dosificación después de 50 días. Ninguno de los tumores volvió a crecer durante el tratamiento de 50 días, lo que indica que no se desarrolló la resistencia contra el Compuesto 1. También se examinó la duración de las respuestas después de descontinuar el tratamiento. Un CR y aproximadamente 50% de los PRs duraron 40 días después de cesar la dosificación del Compuesto 1. Diez tumores que volvieron a crecer (hasta 600- 2000 mm3) se retrataron con 30 mg/kg/d del Compuesto 1 iniciando en el día 90 del estudio (40 días después de cesar la dosificación) y continuaron por 60 días. Todos los tumores respondieron al Segundo ciclo del Compuesto 1 (2 CR, 8 PR) , indicando claramente una carencia de resistencia del tumor al Compuesto 1.

Evaluación Histológica de la Actividad Biológica In Vivo Además del volumen del tumor y los puntos finales de modulación del objetivo, se usaron lecturas inmunohistoquímicas como indicadores de la actividad del fármaco. Se evaluaron la apoptosis/necrosis de tumor y la inhibición de la proliferación celular en tumores MV4;11 o RS4;11 en ratones SCID-NOD tratados con 30 mg/kg de 4-amino-5-fluoro-3- [6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il ] quinolin-2 ( ÍH) -ona (Compuesto 1) al usar análisis de histología e inmunohistoquímica. En este estudio, los ratones SCID-NOD que llevan tumores s.c. MV4;11 (n=3-5/grupo) se trataron ya sea con Vehículo o Compuesto 1, 30 mg/kg/d por 5 días. Se extirparon los tumores en los días 2-5. Los tumores alojados en parafina se tiñeron ya sea con hematoxilina y Eosina o se inmunotiñeron con Ki67 (marcador de proliferación), pERK (marcador farmacodinámico mecánico), caspasa 3 dividida (para apoptosis) o PARP (para apoptotis) (con una contra-tinción de hematoxilina) . Los efectos temporales de la administración del Compuesto 1 (30 mg/kg/d) se investigaron en tumores MV4;11 después de 1 o 5 dosis. La evaluación morfológica al usar tinción por H&E, reveló que los tumores tratados con vehículo consistieron de células de tumor MV4;11 con una notable hipercelularidad indicativa de hiperplasia mieloide. En el grupo de tratamiento con vehículo, las células de tumor se tiñeron fuertemente con Ki67 lo que indica una composición de tumor de células altamente proliferadoras . A las 24 horas después de la dosificación, los tumores tratados con el Compuesto 1 mostraron una reducción en las células densamente empacadas y consistió de áreas dispersas de células apoptóticas/necróticas (día 1). Las áreas de apoptosis/ necrosis fueron más pronunciadas después de 5 dosis con áreas importantes de tumores no viables que coinciden con la tinción reducida de Ki67. Se confirmó la modulación del objetivo in vivo de la tinción inmunohistoquímica de pERK. La fosfo-ERK se disminuyó significativamente en tumores tratados con el Compuesto 1 durante el periodo de dosificación de 5 días, corroborando los análisis Western de pERK en tumores. La apoptosis inducida por el Compuesto 1, fue evidenciada de la caspasa 3 activada creciente y la tinción dividida de PARP en tumores en el día 5 comparado con los controles tratados con vehículo. También se examinó la inmunohistoquímica de los tumores RS4;11 después del tratamiento con el de 30 mg/kg de Compuesto 1. Los tumores RS4;11 (n=3-5/grupo) se trataron ya sea con Vehículo o Compuesto 1 a 30 mg/kg/d. Los tumores se fragmentaron en los días 9. Los tumores alojados con parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina o se inmunotiñeron con Ki67, o pERK (como se describió previamente) . Fueron evidentes efectos similares de celularidad y proliferación disminuidas así como un pERK reducido en tumores RS4;11 tratados con el Compuesto 1 (30 mg/kg/d) . Adicionalmente, se evaluó la histología de los tumores que se definieron como respuesta parcial (>50% de inhibición del tumor) o completa (ninguna masa palpable de tumor) . En estos estudios, los ratones SCID-NOD que llevan tumores s.c. MV4;11 (n=3-5/grupo) se trataron ya sea con Vehículo o Compuesto 1 a 30 mg/kg/d. Los tumores tratados con vehículo se fragmentaron el día 15 y los tumores tratados con el Compuesto 1 se fragmentaron el día 89 (50 dosis diarias de Compuesto 1 + 39 días sin tratamiento) . Los tumores alojados en parafina se tiñeron ya sea con hematoxilina y eosina o se inmunotiñeron con Ki67 (cn contra-tinción por hematoxilina). Las respuestas completas estaban totalmente desprovistas de células de tumor MV4;11, al desplegar solamente restos de la necrosis y/o tejido de cicatrización. En las respuestas parciales, se observaron cavidades de células de tumor de proliferación positiva a Ki67 en la periferia de los tumores.

Compuesto 1 Prolonga el Tiempo de Supervivencia en Ratones que Llevan Células de Leucemia Humana Diseminadas La eficacia del Compuesto 1 se probó en el modelo de leucemia de MV4;11 en el cual se inocularon las células dentro de la vena de la cola de ratones irradiados con SCID-NOD (FIGURA 6). En este modelo, las células MV4;11 se diseminan a la médula ósea (BM) , al imitar patológicamente un patrón de enfermedad similar a la leucemia humana. Se inyectaron los ratones con células MV4;11 en el día 1 y se iniciaron los tratamientos del Compuesto 1 (20 mg/kg, diariamente o 7 días activo/7 días inactivo, n=10-12/grupo) en el día 23, después del injerto de las células MV4;11 en BM. Los ratones de control (tratados con vehículo) típicamente producen parálisis de los miembros traseros como consecuencia de las células de tumor que infiltran la BM, con un tiempo mediano de supervivencia (MST) de 51 días (FIGURA 6) . En estudios de supervivencia, el tratamiento diario con el Compuesto 1 (día 23-100) retardó significativamente el tiempo para el avance de la enfermedad (MST = 134 días) comparado con controles tratados con vehículo (MST = 51 días) (p < 0.0001), lo que demuestra un intervalo de vida aumentado en 163% (ILS) (FIGURA 6). Extraordinariamente, con el tratamiento diario con el Compuesto 1, 4 ratones fueron supervivientes de largo plazo (MST > 160 días) . Los análisis histológicos y de citometría de flujo se usaron para cuantificar el % de injerto de células MV4;11 en BM. En los análisis de citometría de flujo, las células humanas MV4;11 se identificaron en la BM de ratón con un anticuerpo antihumano HLA-A1B1C el cual se enlaza a un epítopo en el MHCI humano. En ratones tratados con vehículo, aproximadamente 2-19% de células BM aisladas totales que consistieron de células injertadas MV4;11 (día 51 ,). Esto también se corroboró por la inmunohistoquímica con un anticuerpo para la mitocondria humana el cual tiñe las células MV4;11 identificando las células humanas en la matriz de ratón BM. El Compuesto 1 dosificado diariamente (20 mg/kg) durante 25 días redujo significativamente la carga leucémica (< 1% en células MV4;11 en BM) contra el tratamiento con vehículo. De manera interesante, los ratones que sobreviven después del tratamiento con el Compuesto 1 mostraron de por inmunohistoquímica ninguna evidencia de células de tumor (vista como una ausencia de células positivas a la mitocondria anti-humanas en el día 167) en la BM y se definieron como "curas". La dosificación cíclica del Compuesto 1 (7 días activo/7 días inactivo, 5 ciclos) también resultó en tiempos de supervivencia significativamente crecientes (MST = 118 días, 131 % ILS vs . vehículo, p = 0.0001), pero no fue tan efectivo como el régimen diariamente (p= 0.007, FIGURA 6) .

Eficacia del Compuesto 1 en el Tratamiento de Líneas Celulares de Cáncer de Próstata Debido a que el Compuesto 1 tiene una selectividad multidirigida a la cinasa contra las tirosina cinasas del receptor de Clase III, IV, y V (RTKs), se examinó la actividad del Compuesto 1 en un modelo metastático de cáncer de próstata. La eficacia antitumor del Compuesto 1 se evaluó al usar tumores PC-3M los cuales expresan las RTKs claves VEGFR y FGFR que se inhiben por el Compuesto 1. Las células PC-3M hn demostrado que forman metástasis al hueso, y este modelo se usó así para investigar la actividad del Compuesto 1 en un modelo de xenoinjerto metastático experimental de cáncer de próstata humano en ratones sin pelo. Líneas celulares. La línea celular de próstata humana metastática PC-3M que expresa p53 nulo, del PTEN, VEGFR, FGFR y transfectada establemente con un constructo de luciferasa se obtuvo bajo un acuerdo de licencia con Xenogen. Estudios de eficacia In vivo. Ratones macho sin pelo (nu/nu) (4-6 semanas de edad, 18-22 g) se obtuvieron de Charles River (Wilmington, MA) y se aclimataron durante 1 semana en un ambiente libre de patógenos previo al inicio del estudio. Los animales recibieron alimento para roedores estéril y agua ad libitum y se alojaron en jaulas con un filtro superior estériles con ciclos de 12 horas de luz/oscuridad. Todos los experimentos se efectuaron bajo los lineamientos de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratory Animal Care International. Modelo metastático en hueso de PC-3M. Células de la línea celular de cáncer humano de próstata PC-3M-luc (1.5 x 106 células) transfectadas de forma estable con un constructo de luciferasa se inyectaron por medio de inyecciones intracardiacas . La formación de imágenes bioluminiscentes (sistema de formación de imagines de Xenogen MS®) se usó para observar de forma no invasiva el crecimiento y la metástasis in vivo de tumores PC-3M-luc después de la inoculación celular. Casi todos los animales inyectados con células de tumor PC-3M-luc desarrollaron lesiones en la próstata, las cuales se localizaron principalmente en el fémur y las mandíbulas. Se iniciaron los tratamientos con el Compuesto 1, taxol, o vehículo (n=7/grupo) 4 semanas posteriores a la inoculación de las células (día 0 del estudio) . Se observaron diariamente los ratones y se les aplicó la eutanasia cuando estaban moribundos.

Información del Grupo. La dosificación se inició 4 semanas después de la inoculación celular (día 0 del estudio) 1. Vehículo (n=8) 2. Compuesto 1 , 50 mg/kg, p.o., diariamente (n=7) 3. Taxol, 15 mg/kg, i.p., 3 veces por semana (n=7) Puntos finales. Eficacia (formación de imágenes de tumores en tiempo real in vivo al usar el sistema formador de imágenes de Xenogen MS®) . Inmunohistoquímica. Se descalcificaron muestras óseas (fémures, mandíbulas) (ProtocolTM, Fisher Diagnostics, Middletown, VA) . Se seccionaron bloques de parafina hasta 4 mm de espesor y se colocan en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Los tejidos se tiñeron con hematoxilina y eosina para morfología e identificación de tejido general de células PC-3M en los huesos. Ratones sin pelo machos inoculados con células PC-3M-luc por medio de inyección intracardiaca mostraron un crecimiento diseminado de células PC-3M después de inoculación intracardiaca como se detecta por una formación de imagen de cuerpo entero en serie de células de tumor PC-3M-luc in vivo y evaluaciones histológicas (FIGURA 7) . Cuatro semanas después de la inoculación de células PC-3M en ratones sin pelo, la formación de imagen de cuerpo completo demuestra el desarrollo de crecimiento celular y lesiones metastáticas localizadas principalmente en la cabeza y áreas abdominales, que se confirmó por la evaluación histológica de que las células PC-3M forman metástasis en los huesos (fémur y mandíbulas). En algunos ratones, las células de tumor también se detectaron en áreas toráxicas, que posiblemente son algunas células residuales después de la inoculación intracardial . El tratamiento con el Compuesto 1 se inició cuatro semanas después de la inoculación celular una vez que los tumores han formado metástasis al hueso (día 0) . La presencia de tumores en el hueso también se confirmó por formación de imagen de cuerpo completo de ratones. El Compuesto 1 se administró oralmente a una dosis de 50 mg/kg/día y demuestra una tendencia para inhibir el crecimiento metastático de células de tumor PC-3M luc en ratones sin pelo comparados con el vehículo de tratamiento como se determina del barrido en serie de ratones. Los ratones tratados con el compuesto 1 muestra una intensidad de fotón media disminuida (inhibición) comparada con ratones tratados con el vehículo en los días 0, 8 y 15/18. La inhibición del crecimiento de tumor con el tratamiento del compuesto 1 también se evaluó usando la inhibición media de las cuentas de fotones (FIGURA 7) . El tratamiento diario con el Compuesto 1 (50 mg/kg/d) también fue más efectivo que el tratamiento de taxol (15 mg/kg) como se muestra en la FIGURA 7. No se observó diferencia en la eficacia del tratamiento entre el tratamiento con taxol y el tratamiento con el vehículo (FIGURA 7) .

Resumen de los resultados. La eficacia del Compuesto 1 para tratar un tumor sólido se forma metástasis en la médula ósea se probó. En este modelo, los ratones agénicos se inocularon intracardiacamente con células PC-3M-luc. Las células PC-3M-luc son una línea células de cáncer de próstata humano que se ha transfectado establemente con luciferasa. Hasta la inoculación, las células PC-3-luc diseminadas en órganos múltiples incluyendo hueso. Las células de tumor diseminadas se visualizaron usando equipo de formación de imágenes in vivo comercialmente disponible de Xenogen, Corp. Los ratones sin pelo se inocularon con células PC-3M-Luc intracardiacamente con células 1.5 X 106. Cuatro semanas después de inoculación, la dosificación se inició (día 0) con vehículo (n=8), Compuesto 1 a 50 mg/kg, p.o., diariamente (n=7), y taxol a 15 mg/kg, i.p., tres veces por semana, (n=7) . Las líneas celulares PC-3M-luc se adquirieron de Xenogen y a los ratones se formó imágenes usando sistema de formación de imágenes Xenogen ' s IVIS®. En los ratones tratados con el Compuesto 1, los ratones mostraron una tendencia de cuenta de fotón disminuida con relación al vehículo y taxol en ratones tratados. Las cuentas de fotón media y una gráfica generada de las áreas de la cabeza y piernas de los ratones se muestran en la FIGURA 7. Este experimento establece que el tratamiento con el Compuesto 1 potencialmente inhibe el crecimiento de células PC-3M-luc que se han diseminado en el hueso.

Eficacia del Compuesto 1 en el modelo de tumor de mama de murino 4T1 El siguiente estudio evalúa la dosificación oral diaria del Compuesto 1 en el modelo de tumor de mama de murino 4T1 metastático espontáneo. Los ratones BALB/c hembra, de 9 semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA) , se implantaron con células 2.5xl054Tl (células derivadas de un nodulo del hígado metastático) subcutáneamente en el flanco derecho. El tratamiento inicia 13 días después cuando el volumen de tumor promedio fue 140mm3. Esto se designa como estudio del día 1. El compuesto 1 se fomruló como una solución en agua purificada y se administra oral dada una vez al día durante 17 días. Los grupos de tratamiento incluyen, (n=10/grupo) : Vehículo (agua); cinco grupos del Compuesto dosis a 10, 30, 60, 100 y 150 mg/kg. Los puntos finales del estudio incluyen crecimiento de tumor, observaciones a los animales y enumeración de metástasis de pulmón e hígado. Las comparaciones en par de grupos de tratamiento vs . vehículo se evaluó usando prueba t de Student. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se compararon usando un ANOVA no paramétrico (Kruskal-Wallis ) seguido por el método de Dunn para comparaciones múltiples en par. El estudio se terminó en el día 18 con base en el volumen del tumor del grupo de vehículo .

Resumen de los resultados. El crecimiento de tumor primario estadísticamente se inhibió importantemente en todos excepto los grupos de dosis 10 mg/kg por 4 días después de iniciar el tratamiento. La inhibición del crecimiento de tumor máximo para las dosis 10, 30, 60, 100 y 150 mg/kg fue 32, 45, 50, 74 y 82%, respectivamente (Figura 25, Tabla X) . Una comparación entre los grupos revela diferencias (p<0.05) entre las dosis 10, 30 y 60 mg/kg contra el nivel de dosis 150 mg/kg y entre los grupos 10 y 100 mg/kg. Las metástasis de pulmón e hígado se enumeraron por inspección visual en tejidos removidos en el día 18. Los ratonres de control tratados con vehículo no desarrollaron tumores pulmonares a la extensión observada en estudios previos (disminuido por -50%) las cuales influyen en las comparaciones estadísticas. Las metástasis de pulmón se redujeron por administración del Compuesto 1 contra el vehículo, específicamente: en el grupo de dosis 150 mg/kg, por 91% y los tratamientos 30, 60 y 100 mg/kg reducen el número de nodulos de tumor de hígado por >77% contra controles (Tabla Y) .

Tabla X. Resumen de la inhibición del crecimiento de tumor primario 4T1 por el Compuesto 1 Tabla Y. Eficacia del Compuesto 1 en metástasis de hígado y pulmón espontáneo 4T1 del día 17 de dosificación En resumen, la eficacia diaria, la dosificación oral del Compuesto en el modelos de tumor de mama de murino se confirmó en este experimento. La inhibición del crecimiento de tumor primario importante se observó 4 días después del tratamiento. Las dosis del compuesto 1 de 30, 60, 100 y 150 mg/kg inhibe el crecimiento de tumor primario por 45%, 50%, 74% y 82%, respectivamente. El tratamiento del compuesto 1 resultan en inhibición importante de metástasis de pulmón e hígado espontáneo. El número de metástasis de hígado se inhibió completamente por el nivel de dosis 150 mg/kg y reduce importantemente a las dosis 30, 60 y 100 mg/kg. Las metástasis de pulmón se redujeron con estadística importante (91% de inhibición) al nivel de dosis 150 mg/kg.

DISCUSIÓN Las trayectorias de señalización de cinasa interacelular aberrante objetivo implicadas en la proliferación celular del tumor pueden afectar los procesos celulares y provocar la inhibición del crecimiento de tumor. Esto se ha ejemplificado por el enfoque de dos agentes objetivos de molécula pequeña imatinib (Gleevec) en CML (Bcr-Abl) y tumores estromales gastrointestinales (KIT c) y gefitinib (Irressa) en avance refractario o cáncer de pulmón de células pequeña no metastática (EGFR). Druker B.J. Oncogene, 21 :8541-8546 (2002); Giaccone G. Clin Cáncer Res. 10:4233S- 4237S (2004).

Ambos compuestos atacan defectos moleculares específicos en células de tumor y este éxito ha impulsado la investigación en las terapias objetivo moleculares a otras cinasas oncogénicas, incluyendo FLT3 15,20-23. Las mutaciones en el gen FLT3 son las más comunes alteraciones genéticas en AMLi donde casi 35% de los pacientes portan mutaciones activadas. Las mutaciones FLT3 se ha demostrado que confieren una prognosis clínica pobre de esta manera implicando FLT3 como un objetivo terapéutico en AML. Thiede C. et al., Blood, 99:4326-4335 (2002); Schnittger S, et al., Blood, 2002; 100:59- 66 (2002) . El compuesto 1 es un inhibidor de cinasa multiob etivo con potencia nanomolar contra la clase III, IV y V RTKs involucrada en la proliferación del tumor y angiogénesis. Los ensayos de cinasa bioquímicos demuestran que el Compuesto 1 tiene actividad potente contra contra FLT3 (IC50 de 1 nM) . La actividad del Compuesto 1 en dos líneas de células leucémicas se caracterizó con estado FLT3 contrarestante, MV4;11 (FLT3 ITD) y RS4;11 (FLT3 WT). El compuesto 1 se mostró para reducir la fosforilación FLT3 en una manera dependiente de dosis, confirmando la actividad molecular en las células. In vitro, el compuesto 1 bloquea las moléculas de señalización cadena abajo posterior en direcciones MAPK mitogénico y STAT5, ambos reguladores clave en direcciones proliferativas celulares. De forma interesante, la actividad en la modulación objetivo FLT3 se pronunció más en MV4;11 que en células RS4;11 como fueron los efectos del compuesto 1 en ensayos de citotoxicidad/proliferación de células. Los efectos diferenciales similares contra FLT3-ITD y FLT3 de tipo silvestre se han reportado para otros inhibidores FLT3. Puede razonarse que células FLT3 ITD MV4;11 tienen señales constitutivamente activas (Ras, STAT5) las cuales conducen a la proliferación celular, y difieren de las células FLT3 WT (RS4;11) las cuales pueden sostener el crecimiento independiente de la activación de FLT3 y/o puede depender de otras direcciones oncogénicas. Minami Y. et al., Blood, 102:2969-2975 (2003); Kiyoi H. et al., Oncogene, 21 :2555-2563 (2002); Spiekermann K. et al., Clin Cáncer Res. 9:2140-2150 (2003) .

Los resultados de estudios in vivo han demostrado que el compuesto 1 tiene actividad potente contra tanto tumor sólido como con modelos BM diseminados de leucemia. La actividad molecular del Compuesto 1 en modelos preclínicos se dirigió usando puntos finales PD para estudiar la extensión o duración de la modulación objetivo. El compuesto 1 se mostró para substancialmente regular completamente tanto pFLT3 como pERK en tumores MV4;11. La modulación objetivo (pFLT3) se observó por 4 horas y se sostuvo en tumores hasta 24 horas siguiendo una dosis sencilla o dosis múltiples del compuesto 1. Los efectos biológicos también fueron evidentes para histopatología de tumor, donde pERK disminuye, la proliferación y las respuestas de apoptosis en tumores donde se observaron dentro de 1-2 días de tratamiento de fármaco. En xenoinjertos de tumor sólidos de MV4;11, las regresiones de tumor también pronunciaron dentro de los días del tratamiento de fármaco. Es posible que los efectos inhibitorios potentes del Compuesto 1 en el modelo MV4;11 puedan realizarse de la inhibición directa de FLT3 en combinación con la inhibición de otros RTKs. Los datos (RTPCR, no mostrados) indican que las células MV4;11 también expresan VEGFR1 , cKIT, PDGFRß, FGFR1, y CSF-1R, todos RTKs potentemente inhibidos por el Compuesto 1. El compuesto 1 tiene actividad <10 nM contra las cinasas VEGF1/2/3, y los datos claramente demuestran que el compuesto 1 pueden inhibir los niveles VEGF de autocrina en cultivos MV4;11 in vitro. In vivo, la inhibición de autocrina o paracrina de VEGF secretado o FGF por células de tumor o células estromales de tumor (incluyendo células endoteliales) pueden inhibir la proliferación y sobrevivencia de estas células. Ferrara N. et al., Nat Med., 9:669-676 (2003); Compagni A. et al., Cáncer Res. 60:7163-7169 (2000); Carmeliet P. Nat Med., 9:653-660 (2003) . La actividad adicional del compuesto 1 en tumores sólidos puede resultar de sus efectos potentes contra PDGFRß al impactar el reclutamiento de pericitos y maduración de vasos sanguíneos durante la angiogénesis. Carmeliet P. Nat. Med. 9:653-660 (2003); Ostman A. Cytokine Growth Factor Rev., 15:275-286 (2004). En el modelo AML BM, se demostró que el Compuesto 1 mejora la sobrevivencia de ratones y en algunos ratones la enfermedad se erradica. Esto representa el potencial del compuesto 1 para erradicar tanto los blastos circulantes como la enfermedad BM por efectos antiproliferativos directos o regulación de la angiogénesis de la médula ósea, la cual puede jugar un papel en la sobrevivencia de blastos. Carow CE. et al., Blood, 87:1089-1096 (1996); Drexler H.G. Leukemia, 10:588- 599 (1996). Con base en la farmacología e inhibición objetivo del compuesto 1, los programas de dosis intermitentes y cíclicos del Compuesto 1 se estudiaron. Los programas de dosificación alternativa del compuesto 1 demuestra actividad similar comparada conn dosis diarias del compuesto 1, sugiriendo el potencial para los regímenes de dosificación flexibles en la clínica. Las dosis múltiples del Compuesto 1 fueron capaces para continuamente suprimir el crecimiento de tumores y cualesquiera tumores recurrentes después de la cesación del tratamiento se encontraron para ser igualmente sensibles al re-tratamiento con fármaco. Estos hallazgos son relevantes si se traducen al ambiente clínico, como algunos pacientes AML se han mostrado para recaer en el tratamiento con inhibidores de cinasa a pesar de continuar el tratamiento. Fiedler W. et al., Blood, (2004); Cools J. et al., Cáncer Res. 64:6385-6389 (2004) . Las mecanismos múltiples incluyen metabolismo o flujo celular (por medio de la expresión de transportadores de fármaco tales como P-glicoproteína) , o mutaciones en los dominios de enlace ATP de los sitios activos de enzima con fármaco enlazado se han mostrado para correlacionarse con resistencia a los inhibidores de cinasa. Bagrintseva K. et al., Blood, 103:2266-2275 (2004); Grundler R. et al., Blood, 102:646-651 (2003). El compuesto 1 no es un substrato P-GP, y las respuestas durables a lo largo del curso del tratamiento de fármaco pueden implicar que el desarrollo de la resistencia puede evitarse con el compuesto 1. El desarrollo clínico de inhibidores FLT3 (SU11248 PKC412, CEP-701 , MLN518) para AML todavía está fácilmente en las fases. O'Farrell A.M. et al., Clin. Cáncer Res. 9:5465- 5476 (2003); Fiedler W. et al., Blood, (2004); Stone R.M. et al., Ann Hematol. 83 Suppl l:S89-90 (2004); Smith B.D. et al., Blood, 103:3669- 3676 (2004); DeAngelo D.J. et al., Blood, 102:65a (2003). La selección de terapias de agente sencillo todavía no ha producido respuestas importantes, y el desarrollo clínico futuro de los inhibidores FLT3 en AML puede depender al combinar estos agentes con ya sea fármacos citotóxicos u otros agentes objetivo moleculares. Los datos reportados aquí para el compuesto 1, un inhibidor FLT3 potente con actividad adicional en RTKs conocidos para jugar papeles en la patogénesis de AML garantiza su evaluación clínica . Otros compuestos de la estructura I tales como compuestos de la estructura IB, y IC se prepararon como se describe arriba. Los estudios usando estos compuestos se llevan a cabo usando la metodología descrita arriba para 4-amino-5-fluoro-3- [6- (4-metilpiperazin-l-il) -lH-benzimidazol-2-il] quinolin-2 ( 1 H)-ona. Estos estudios mostrarán que estos compuestos también son útiles en el tratamiento de tumores que se forman de metástasis incluyendo tumores hematológicos, en ratones, humanos y otros sujetos mamíferos. Todos los documentos o referencias citadas en la presente se incorporan por ello para referencia en sus totalidades y para todos los propósitos como se establezca cuidadosamente en la presente.

Se entiende que la invención no se limita a las modalidades establecidas en la presente para ilustración, pero abarca todas las formas de los mismos que estará dentro del alcance de este documento. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (41)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor que forma metástasis, caracterizado porque comprende: administrar al sujeto un compuesto de la Estructura I, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla del mismo, I en donde, A es un grupo que tiene una de la siguiente Estructura en donde, R1 se selecciona de grupos alquilo de cadena recta o ramificada que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, y además en donde, el crecimiento del tumor que forma metástasis se inhibe después de la administración del compuesto de la Estructura I, el tautómero del compuesto, la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, la sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o la mezcla del mismo al sujeto.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Rl es un grupo metilo, y el compuesto de Estructura I tiene la Estructura IA IA

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto se administra sistémicamente .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además administrar un segundo agente al sujeto.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sal de lactato del compuesto de la Estructura I o el tautómero del mismo se administra al sujeto .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es mieloma múltiple y el sujeto es un paciente con mieloma múltiple con una transubicación cromosomal t(4;14).

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el mieloma múltiple expresa el receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos .

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el mieloma múltiple ha formado metástasis con un hueso del paciente.

9. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el segundo agente es para el tratamiento de osteoporosis.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el paciente es un humano .

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es leucemia mielógena aguda, y el sujeto es un paciente con leucemia mielógena aguda.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es un tumor hematológico.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es un tumor sólido.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor ha formado metástasis con un hueso en el sujeto.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto padece de y/o el tumor se selecciona de un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de hígado, o un cáncer de pulmón.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es cáncer de próstata y el sujeto es un paciente con cáncer de próstata.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es cáncer de próstata, el sujeto es un paciente con cáncer de próstata, y el cáncer de próstata ha formado metástasis con un hueso del paciente.

18. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el segundo agente es un bisfosfonato.

19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es cáncer de próstata, el sujeto es un paciente con cáncer de próstata, y el paciente es un humano.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es un humano.

21. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el segundo agente es un agente anticáncer .

22. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto de Estructura se administra oralmente .

23. El uso de un compuesto de Estructura I, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer con metástasis en un sujeto, I en donde, A es un grupo que tiene una de la siguiente Estructura en donde, R1 se selecciona de grupos alquilo de cadena recta o ramificada que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, y además en donde, el crecimiento del tumor en el sujeto se inhibe después de la administración del compuesto de la Estructura I, el tautómero del compuesto, la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, la sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o la mezcla del mismo al sujeto.

24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde Rl es un grupo metilo, y el compuesto de Estructura I tiene la Estructura IA IA

25. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el medicamento comprende además un segundo agente.

26. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde la sal de lactato del compuesto de Estructura I o el tautómero del mismo se usa para preparar el medicamento.

27. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es mieloma múltiple y el sujeto es un paciente con mieloma múltiple con una transubicación cromosomal t(4;14).

28. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el mieloma múltiple expresa el receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos.

29. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el mieloma múltiple ha formado metástasis con un hueso del paciente .

30. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es mieloma múltiple, el sujeto es un paciente con mieloma múltiple, y el paciente es un humano.

31. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es leucemia mielógena aguda, y el sujeto es un paciente con leucemia mielógena aguda.

32. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es un tumor hematológico .

33. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es un tumor sólido .

34. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el cáncer ha formado metástasis con un hueso en el sujeto.

35. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el sujeto padece y/o el cáncer se selecciona de un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de hígado, o un cáncer de pulmón .

36. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es cáncer de próstata y el sujeto es un paciente con cáncer de próstata .

37. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es cáncer de próstata, el sujeto es un paciente con cáncer de próstata, y el cáncer de próstata ha formado metástasis con un hueso del paciente.

38. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde el cáncer es cáncer de próstata, el sujeto es un paciente con cáncer de próstata, y el paciente es un humano.

39. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde el segundo agente es para el tratamiento de osteoporosis .

40. El uso de conformidad con la reivindicación 39, en donde el segundo agente es un bisfosfonato.

41. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde el segundo agente es un agente anticáncer.