KR101329696B1 - 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 항체를 검출하기 위한 펩티드 - Google Patents

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 항체를 검출하기 위한 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리펩티드를 이용한 PRRSV 항체 및 항체 단편을 검출 및 정량화하는 조성물 및 방법을 제공하고 있다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 항체를 검출하기 위한 펩티드{PEPTIDES FOR DETECTION OF ANTIBODY TO PORCINE REPRODUCTIVE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS}
발명의 분야
본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive respiratory syndrome virus: PRRSV) 폴리펩티드를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 항체 및 항체 단편을 검출하고 정량하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경
돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)을 유발시키는 아테리바이러스(Arterivirus)(RNA 외피 바이러스)이다. 이러한 바이러스는 유산을 초래하는 성숙한 돼지에서 주된 생식기 문제를 유발시킬 수 있다. 성장중의 돼지에서, 그러한 증상은 폐사율의 증가, 식욕 감퇴, 발열, 호흡기 문제, 폐렴, 2차 박테리아 감염의 증가 및 위축성 비염을 포함한다. 신생 돼지에서, 그러한 바이러스는 호흡 곤란, 성장중지, 및 증가된 2차 박테이라 감염을 유발시킬 수 있다. 이러한 바이러스는 일차적으로 돼지에서 돼지로 전염된다. 이러한 바이러스는 또한 감염된 분변, 요(urine) 및 밀크를 통해서 초유 항체가 수유되지 않은 새끼돼지에 전염될 수 있다. 또한, 주사 바늘, 곤충 및 공기에 의한 전염이 가능하다.
PRRSV의 검출 방법이 본 기술분야에서 요구되고 있다. PRRS 항체 검출 키트, 예를 들어, HerdChek® PRRS Antibody 2XR Test Kit (IDEXX Labs, Inc., Westbrook, ME)가 시판되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 한 구체 예는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 12를 필수성분으로 하는 정제된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고 있다. 정제된 폴리펩티드는 PRRSV ORF7과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 아미노산을 한 말단에서 더 포함할 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 다량체 형태일 수 있다. 조성물은 추가로 담체를 포함할 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 이동 종결 서열(stop transfer sequence), 경막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 연결될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 13 및 천연 상태에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 폴리펩티드을 필수성분으로 하여 구성될 수 있다. 천연 상태에서는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 폴리펩티드는 비-PRRSV 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 천연상태에서는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18을 필수성분으로 하는 폴리펩티드를 포함한 정제된 융합 폴리펩티드를 제공한다. 천연 상태에서는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 폴리펩티드는 비-PRRSV 폴리펩티드일 수 있다. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18은 다량체형일 수 있다. 정제된 융합 폴리펩티드는 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 이동 종결 서열(stop transfer sequence), 경막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 13을 필수성분으로 하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 정제된 폴리펩티드 및 정제된 융합 폴리펩티드를 엔코딩하는 정제된 폴리누클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 또는 PRRSV 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13 또는 이들의 조합물을 필수성분으로 하여 구성되는 정제된 폴리펩티드를 폴리펩티드/항체 복합체가 형성되게 하는 조건하에서 PRRSV에 특이적인 항체를 포함하는 것으로 의심되는 시험 샘플과 접촉시키고, 폴리펩티드/항체 복합체를 검출함을 포함한다. 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 PRRSV에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재한다는 지표이며, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 PRRSV에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하지 않는다는 지표이다. 본 발명의 방법은 추가로 폴리펩티드/항체 복합체를 이들의 검출 전에 지시약과 접촉시킴을 포함할 수 있다. 항체는 항체의 단편일 수 있다. 시험 샘플중의 항체의 양이 결정될 수 있다. 폴리펩티드는 기질에 부착될 수 있다. 폴리펩티드는 다량체형일 수 있다. 폴리펩티드는 천연 상태에서는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13 또는 이들의 조합물을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 천연 상태에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 폴리펩티드는 비-PRRSV 폴리펩티드일 수 있다. 시험 샘플은 포유동물로부터 얻은 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 가역 흐름 크로마토그래프 결합 검정, 효소 결합된 면역흡착 검정, 방사면역검정, 적혈구응집 검정, 웨스턴 블롯 검정(western blot assay), 형광 편광 면역검정, 및 간접 면역형광 검정으로 이루어진 검정 그룹으로부터 선택된 검정을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체 예는 포유동물에서의 PRRSV 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 PRRSV 감염을 지니는 것으로 의심되는 포유동물로부터 생물학적 샘플을 얻고; SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13 또는 이들의 조합물을 필수성분으로 하여 이루어진 정제된 폴리펩티드를 폴리펩티드/항체 복합체가 형성되게 하는 조건하에서 생물학적 샘플과 접촉시키고; 폴리펩티드/항체 복합체를 검출함을 포함한다. 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 포유동물이 PRRSV 감염을 지니고 있다는 지표이며, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 포유동물이 PRRSV 감염을 지니지 않는다는 지표이다. 이러한 방법은 추가로 폴리펩티드/항체 복합체를 검출 전에 측정 가능한 시그널을 생성시키는 지시약과 접촉시킴을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 천연 상태에서는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13 또는 이들의 조합물을 필수성분으로 하여 이루어진 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체 예는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13인 PRRSV 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 그러한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 항체 단편일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체 예는 샘플중에서 PRRSV 폴리펩티드 또는 PRRSV를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 13을 포함하는 PRRSV 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 폴리펩티드/항체 복합체가 형성되게 하는 조건하에서 샘플과 접촉시키고; 폴리펩티드/항체 복합체를 검출함을 포함한다. 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 PRRSV 또는 PRRSV 폴리펩티드가 샘플에 존재한다는 지표이며, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 PRRSV 또는 PRRSV 폴리펩티드가 샘플에 존재하지 않는다는 지표이다. 하나 이상의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 항체 단편이다. 샘플은 혈청, 전혈, 가래, 밀크, 육즙, 폐 세척액, 폐 조직, 편도 조직, 또는 림프절 조직일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체 예는 PRRSV ORF 7에 특이적인 PRRSV 항체를 검출하는 진단 검정에서 위양성 빈도(incidence of false positive)을 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 진단 검정에서의 항체 포획 항원으로서 약 19 내지 약 28의 N-말단 아미노산 결실을 포함하는 PRRSV ORF 7 폴리펩티드를 사용함을 포함한다. PRRSV ORF 7 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18일 수 있다. 폴리펩티드는 한 말단에서 천연 상태에서는 PRRSV ORF 7과 연속적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 민감성 및 특이성을 지니는 폴리펩티드를 사용하여 PRRSV 항체 및 항체 단편을 검출하는데 이용될 수 있는 방법 및 조성물을 제공하고 있다.
발명의 상세한 설명
PRRSV 폴리펩티드
폴리펩티드는 아미드 결합에 의해서 공유결합되는 셋 이상의 아미노산의 폴리머이다. 폴리펩티드는 번역 후 변경될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 세포성 물질, 그 밖의 형태의 폴리펩티드, 화학적 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용된 화합물, 또는 이들의 조합물이 실질적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 제제이다. 세포성 물질, 배양 배지, 화학적 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용된 화합물이 실질적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 제제는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 이하의 그 밖의 폴리펩티드, 배양 배지, 화학적 전구체, 및/또는 합성에 사용된 그 밖의 화합물을 지닌다. 따라서, 정제된 폴리펩티드는 약 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%이상 순수하다.
본 발명의 정제된 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 단편 중 하나일 수 있다.
VR-2332 (굵은 글씨)(미국특허 제5,998,601호)(SEQ ID NO: 8); ISU-12(밑 줄)(SEQ ID NO: 9); 및 US-A(이탤릭체)(SEQ ID NO: 10)의 PRRSV의 세 가지 US ORF 7 균주의 서열이 표 1에서 비교되고 있다.
표 1
Figure 112007069677624-pct00001
세 가지 균주의 상대적인 동일성이 표 2에 기재되어 있다.
표 2
Figure 112007069677624-pct00002
컨센서스 서열은 SEQ ID NO: 11에 기재되어 있다:
Figure 112007069677624-pct00003
위치 5에서의 X는 N 또는 T일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 위치 5에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다. 위치 9에서의 X는 Q 또는 T일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 위치 9에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다. 위치 10에서의 X는 E 또는 K일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 위치 10에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다. 위치 11에서의 X는 E, R 또는 K일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 위치 11에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다. 위치 32에서의 X는 Q 또는 H일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 위치 32에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다. 위치 120에서의 X는 S 또는 P일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 위치 120에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다.
본 발명의 한 구체 예에서, 폴리펩티드는 U.S. 혈청형 PRRSV ORF7의 일부를 포함할 수 있다:
Figure 112007069677624-pct00004
위치 11에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 위치 11에서의 X는 Q 또는 H 일 수 있다. 위치 99에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 위치 99에서의 X는 P 또는 S일 수 있다. 위치 4에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체 예에서 폴리펩티드는 U.S. 혈청형 PRRSV ORF7의 일부 및 히스티딘 태그를 포함한다:
Figure 112007069677624-pct00005
위치 42에서의 X는 어떠한 아미노산을 의미한다. 특정의 구체 예에서, 위치 42에서의 X는 M 또는 I일 수 있다. 위치 49에서의 X는 어떠한 아미노산을 의미한다. 특정의 구체 예에서, 위치 49에서의 X는 Q 또는 H을 의미한다. 위치 137에서의 X는 어떠한 아미노산을 의미한다. 특정의 구체예에서, 위치 137에서의 X는 P 또는 S를 의미한다.
또 다른 구체 예는 N 말단 트렁케이티드된(truncated) PRRSV 릴리스태드(Lelystad) ORF7 폴리펩티드를 제공한다.
Figure 112007069677624-pct00006
위치 7에서의 X는 어떠한 아미노산을 의미한다. 특정의 구체 예에서, 위치 7에서의 X는 M 또는 I중 하나 일 수 있다. 또 다른 구체 예는
Figure 112007069677624-pct00007
이다. 위치 7에서의 X는 어떠한 아미노산일 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 위치 7에서의 X는 M 또는 I이다.
또 다른 구체 예는 His-태깅된 N-트렁케이티드 PRRSV 릴리스태드 ORF7 폴리 펩티드를 제공한다:
Figure 112007069677624-pct00008
위치 45에서의 X는 어떠한 아미노산을 의미한다. 특정의 구체 예에서, 위치 45에서의 X는 M 또는 I중 하나일 수 있다.
본 발명의 한 구체 예에서, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 및/또는 SEQ ID NO: 13은 전장 PRRSV ORF7을 포함하는 폴리펩티드보다 더 가용성이다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 PRRSV에 특이적인 항체에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 기본적 및 신규 특징은 이들 폴리펩티드가 전장 PRRSV ORF7보다 더 가용성일 수 있으며, PRRSV 검출 검정에서 전장 PRRSV ORF7 보다 더 큰 특이성을 지니며, 항-PRRSV 항체에 특이적으로 결합한다는 것이다.
본 발명의 한 구체 예는 전장 PRRSV ORF7 폴리펩티드보다 짧은 폴리펩티드를 제공한다. 특히 PRRSV ORF7 폴리펩티드는 N-말단 트렁케이션(truncation)을 지닌다. 즉, 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43 개 아미노산이 N-말단으로부터 제거된다. 본 발명의 바람직한 구체 예에서, PRRSV ORF7 폴리펩티드는 N-말단으로부터 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 또는 32개 아미노산이 제거된다. 다른 구체 예에서, PRRSV ORF7 폴리펩티드는 N-말단으로부터 약 16 내지 약 31개 아미노산이 제거되거나; N-말단으로부터 약 17 내지 약 30개 아미노산이 제거되거나; N-말단으로부터 약 18 내지 약 29개 아미노산이 제거되거나; N-말단으로부터 약 19 내지 약 28개 아미노산이 제거되거나; N-말단으로부터 약 20 내지 약 27개 아미노산이 제거되거나; N-말단으로부터 약 21 내지 약 26 개 아미노산이 제거된다. 존재하는 경우, 릴리스태드 PRRSV의 위치 약 25 및 위치 약 33에서 US PRRSV ORF7에서 발생하는 M 잔기는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다(참조예: SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 18).
본 발명의 폴리펩티드의 단편은 본 발명의 폴리펩티드의 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 변이성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 13에 나타낸 폴리펩티드 서열과 약 80% 이상, 또는 약 90, 96, 98, 또는 99% 이상 동일하며, 또한 본 발명의 폴리펩티드이다. 변이성 폴리펩티드는 하나 이상의 보존성 아미노산 변이 또는 그 밖의 작은 변화를 지니며 생물학적 활성을 보유, 즉 생물학적으로 기능적 등가물이다. 생물학적으로 활성인 등가물은 상응하는 야생형 폴리펩티드와 비교하는 경우 실질적으로 동일한 작용을 한다.
서열 상동성 백분율은 본 기술분야에 인지된 의미를 지니며, 두 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열 사이의 상동성을 측정하는 많은 방법이 있다. [참조예: Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)]. 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드를 정렬시키는 방법은 GCG 프로그램 패키지(Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol 215:403 (1990)), 및 스미스 및 와트만의 로컬 호몰로지 알고리즘(local homology algorithm of Smith and Waterman)(Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))를 이용하는 베스트핏 프로그램(Bestfit program)(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 포함한 컴퓨터 프로그램에서 분류된다. 예를 들어, -12의 갭 오픈 페널티(gap open penalty)와 -2의 갭 연장 페널티(gap extension penalty)를 부여한 아핀 갭 조사(affine gap search)를 수행하면서, FASTA 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램 ALIGN이 사용될 수 있다.
특정의 서열이, 예를 들어, 참조 서열에 약 95% 동일한지를 측정하는 어떠한 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 파라메터는 동일성 백분율이 참조 폴리누클레오티드의 전장에 걸쳐서 계산되며 참조 폴리누크레오티드중의 전체 누클레오티드수의 5% 까지의 동일성에서 갭이 허용되도록 설정된다.
변이체는 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드 서열 중 하나를 변경시키고 변경된 폴리펩티드의 성질을 평가하여 생물학적 균등물인지를 측정함으로써 동정될 수 있다. 변이체는 검정, 예컨대, 면역조직화학적 검정, 효소-결합된 면역흡착 검 정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 면역효소 검정 또는 웨스턴 블롯 검정에서 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동일하게 반응하면, 예를 들어, 본래의 폴리펩티드의 활성의 90 내지 110%를 지니면 생물학적 균등물이다. 한 가지 구체 예에서, 검정은 생물학적 균등의 폴리펩티드가 상응하는 반응성 항원 또는 항체에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 약 80, 95, 99, 또는 100%까지 감소되게 할 수 있는 경쟁적 검정이다. 상응하는 야생형 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체가 또한 변이성 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 본 발명의 변이성 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
보존성 치환은 아미노산이 유사한 성질을 지니는 또 다른 아미노산으로 치환되어 펩티드 화학분야의 전문가라면 폴리펩티드의 이차구조 및 감수성질(hydropathic nature)이 실질적으로 변화되지 않은 것으로 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
본 발명의 폴리펩티드는 추가로 단백질의 전달을 동시 번역적으로 또는 후 번역적으로 유도하는 시그날(또는 리더(leader)) 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드(예, poly-His)의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하거나 고형 지지체에 대한 폴리펩티드의 결합을 강화시키는 링커 또는 그 밖의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 영역 또는 소 혈청 알부민에 컨주게이트될 수 있다.
폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드가 천연 상태에서 정상적으로 결합되지 않은 아미노산 서열에 공유결합되거나 비공유결합적으로 연결될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 아미노산이 아닌 화합물 또는 분자에 공유결합 또는 비공유결합적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그날 서열, 이동 종결 서열, 경막 도메인, 단백질 정제 리간드 또는 이들의 조합물에 연결될 수 있다. 아미노산 스페이서는 본 발명의 폴리펩티드와 천연상태에서 일반적으로 연속적으로 결합되어 있지 않은 아미노산 서열이다. 아미노산 스페이서는 약 1, 5, 10, 20, 100, 또는 1,000 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
요구되는 경우, 폴리펩티드는 그 밖의 아미노산 서열, 예컨대, 아미노산 링커, 아미노산 스페이서, 시그널 서열, TMR 이동 종결 서열, 경막 도메인, 및 단백질 정제에 유용한 리간드, 예컨대, 글루타티온-S-트랜스페라제, 히스티딘 태그(tag), 및 스타필로코쿠스 단백질 A(staphylococcal protein A), 또는 이들의 조합물을 또한 함유할 수 있는 융합 단백질일 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드는 융합 단백질에 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편은 본 발명의 융합 단백질에 존재할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 또는 이의 단편, 또는 이의 조합물중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 다량체형일 수 있다. 즉, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 및/또는 SEQ ID NO: 13의 하나 이상의 복사체를 포함할 수 있다. 다량체 폴리펩티드는 다중 항원 펩티드(multiple antigen peptide(MAP))일 수 있다. [참조예: Tam, J. Immunol. Methods, 196:17-32 (1996)].
본 발명의 폴리펩티드는 PRRSV에 대해서 반응성인 항체에 의해서 인식되는 항원을 포함할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프(즉, 항원성 결정기)를 포함할 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 연속성 에피토프 또는 입체적 에피토프(conformational epitope)일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드내의 에피토프는 몇 가지 방법에 의해서 동정될 수 있다. (참조예: U.S. Patent No. 4,554,101; Jameson & Wolf, CABIOS 4:181-186 (1988)). 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 분리되고 스크리닝될 수 있다. 전체 폴리펩티드 서열을 함께 스패닝하는 일련의 짧은 펩티드는 단백질분해 절단에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 20-mer 폴리펩티드 단편으로 시작함으로써, 각각의 단편은 ELISA에서 인식된 에피토프의 존재에 대해서 시험될 수 있다. 예를 들어, ELISA 검정에서, PRRSV 폴리펩티드, 예컨대, 20-mer 폴리펩티드 단편이 고형 지지체, 예컨대, 플라스틱 다중벽 플레이트의 벽에 부착될 수 있다. 항체 집단은 비-특이적 흡수가 차단되는 조건하에서 표지되고, 고형 지지체에 첨가되고, 비표지된 항원에 결합되게 하며, 어떠한 결합되지 않은 항체 및 그 밖의 단백질은 세척된다. 항체 결합은, 예를 들어, 무색의 기질을 착색된 반응 생성물로 전환시키는 반응에 의해서 검출된다. 점진적으로 더 작으며 중첩되는 단편이 이어서 동정된 20-mer로부터 시험되어 대상 에피토프를 맵핑(mapping)할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합적으로 생산될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 본 기술분야에서 공지된 기술을 사용함으로써 적합한 발현 숙주 세포 시스템에서 발현될 수 있는 재조합 발현 벡터내로 도입될 수 있다. 다양한 박테리아, 효모, 식물, 포유동물 및 곤충 발현 시스템이 본 기술에서 이용될 수 있으며 어떠한 그러한 발현 시스템이 사용될 수 있다. 임의적으로는, 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 무세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 화학적으로 합성되거나 PRRSV 배양물로부터 얻을 수 있다.
PRRSV 폴리누클레오티드
본 발명의 폴리누클레오티드는 전체 미생물 지놈 미만의 지놈을 함유하며, 단일 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 폴리누클레오티드는 RNA, DNA, cDNA, 지놈성 DNA, 화학적으로 합성된 RNA 또는 DNA 또는 이들의 조합물일 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 그 밖의 성분, 예컨대, 단백질, 지질 및 그외 폴리누클레오티드가 없게 정제될 수 있다. 예를 들어, 폴리누클레오티드는 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 정제될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 상기된 폴리펩티드를 엔코딩한다. 본 발명의 한 구체 예에서, 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 또는 이의 조합물에서 나타나는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 그 밖의 누클레오티드 서열, 예컨대, 링커를 포함하는 서열, 스페이서, 시그널 서열, TMR 이동 종결 서열, 경막 도메인, 또는 글루타티온-S-트랜스페라제, 히스티딘 태그, 및 스타필로코쿠스 단백질 A와 같은 단백질 정제에 유용한 리간드를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 단리될 수 있다 단리된 폴리누클레오티드는 자연적으로 결합되어 있는 5' 및 3' 플랭킹 지놈 서열중 하나 또는 둘 모두와 바로 인접되지 않은 천연 폴리누클레오티드이다. 단리된 폴리누클레오티드는, 예를 들어, 임의의 길이의 재조합 DNA 분자로서, 천연 지놈에서 재조합 DNA 분자를 바로 플랭킹하는 천연 핵산 서열이 제거되거나 존재하지 않음을 조건으로 하는 재조합 DNA 분자이다. 단리된 폴리누클레오티드는 또한 비천연 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, cDNA 또는 지놈성 라이브러리, 또는 지놈성 DNA 제한 다이제스트(genomic DNA restriction digest)를 함유하는 겔 슬라이스내에 백 내지 백만의 그 밖의 핵산 분자중에 존재하는 핵산 분자는 단리된 폴리누클레오티드로 여겨지지 않는다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 또한 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 전장 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 및 변이성 또는 융합 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 축퇴성 누클레오티드 서열(degenerate nucleotide sequence), 본 발명의 누클레오티드 서열과 약 80% 이상, 또는 약 90, 96, 98 또는 99% 이상 동일한 상동 누클레오티드 서열, 및 이들의 상보서열이 또한 본 발명의 폴리누클레오티드이다. 서열 동일성 백분율은 "폴리펩티드" 부분에서 기재된 바와 같이 계산될 수 있다. 축중 누클레오티드 서열은 본 발명의 누클레오티드 또는 이의 단편을 엔코딩하지만, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy)에 기인하여 야생형 폴리누클레오티드 서열과는 핵산 서열에서 상이한 누클레오티드이다. 생물학적 작용성 PRRSV 폴리펩티드를 엔코딩하는 PRRSV 폴리누클레오티드의 상보성 DNA (cDNA) 분자, 동족체 종, 및 변이체가 PRRSV 폴리누클레오티드이다. 본 발명의 폴리누클레오티드는, 예를 들어, 생물학적 샘플, 타액, 혈액, 밀크, 육즙, 혈청, 폐 세척액, 가래, 폐, 편도선, 림프절 또는 그 밖의 조직 샘플, 요, 분변, 뇌척수액, 양수, 또는 상처 삼출액에 존재하는 핵산 서열로부터 분리될 수 있다. 폴리누클레오티드는, 예를 들어, 자동 합성기를 사용함으로써 실험실에서 또한 합성될 수 있다. 증폭 방법, 예컨대, PCR이 폴리펩티드를 엔코딩하는 지놈성 DNA 또는 cDNA중 하나로부터의 폴리누클레오티드를 증폭시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 천연 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있으며, 천연이 아닌 변경된 서열을 엔코딩할 수 있다. 요구되는 경우, 폴리누클레오티드는, 예를 들어, 복제 기점(origins of replication), 프로모터, 인헨서, 또는 숙주 세포에서 본 발명의 폴리누클레오티드의 발현을 유도하는 그 밖의 조절 요소를 포함한 발현 조절 요소를 포함하는 발현 벡터내로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 예컨대, pBR322, pUC, 또는 ColEl, 또는 아데노바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 타입 2 벡터 또는 타입 5 벡터일 수 있다. 임의적으로는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 시미안 바이러스 40(simian virus 40), 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 및 사이토메갈로바이러스 및 레트로바이러스 벡터, 예컨대, 쥐 육종 바이러스, 마우스 유암 바이러스, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) 및 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)를 포함한 그 밖의 벡터가 사용될 수 있다. 미니염색체(Minichromosome), 예컨대, MC 및 MCl, 박테리오파아지, 파아지미드, 효모 인공 염색체, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 코스미드(파아지 람다 cos 부위가 삽입되는 플라스미드) 및 레플리콘(replicon)(세포내 자체 조절하에 복제될 수 있는 유전적 요소)이 또한 사용될 수 있다.
발현 조절 서열에 작동가능하게 결합된 폴리누클레오티드를 제조하고, 이들을 숙주내에서 발현시키는 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다. (참조: 미국특허 제4,366,246호). 본 발명의 폴리누클레오티드는 폴리누클레오티드의 전사 및/또는 번역을 유도하는 하나 이상의 발현 조절 요소에 인접되거나 근접되어 위치되는 경우에 작동가능하게 결합된다.
본 발명의 폴리누클레오티드는, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머, 예를 들어, PCR 프라이머로서 사용되어 샘플, 예컨대, 생물학적 샘플중의 PRRSV 폴리누클레오티드의 존재를 검출할 수 있다. PRRSV 폴리누클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드화되는 그러한 프로브 및 프라이머의 능력은 이들이 주어진 샘플에서의 상보성 서열의 존재를 검출하는데 사용되게 한다. 본 발명의 폴리누클레오티드 프로브 및 프라이머는 샘플, 예컨대, 타액, 혈액, 밀크, 육즙, 혈청, 폐 세척액, 가래, 폐, 편도선, 림프절 또는 그 밖의 조직 샘플, 요, 분변, 뇌척수액, 양수, 또는 상처 삼출액을 포함한 생물학적 샘플에서 상보성 서열에 하이브리드화될 수 있다. 샘플로부터의 폴리누클레오티드는, 예를 들어, 겔 전기영동 또는 그 밖의 크기 분리 기술에 주어질 수 있거나 크기 분리 없이 고정될 수 있다. 폴리누클레오티드 프로브 또는 프라이머는 표지될 수 있다. 프로브 및 프라이머를 표지시키기에 적합한 표지 및 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 닉(nick) 번역 또는 키나아제에 의해서 혼입된 방사활성 표지, 비오틴 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 바이오발광 표지, 금속 킬레이터 표지 및 효소 표지를 포함한다. 샘플로부터의 폴리누클레오티드는 적합하게 엄격한 하이브리드화 조건하에 프로브 또는 프라이머와 접촉된다.
적용에 따라서, 다양한 하이브리드화 조건이 이용되어 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 다양한 선택도를 달성할 수 있다. 높은 선택도를 요하는 적용의 경우, 비교적 엄격한 조건, 예컨대, 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M 염농도에 의해서 제공된 저염 및/또는 고온 조건이 이용될 수 있다. 선택성이 덜 요구되는 적용의 경우, 덜 엄격한 하이브리드화 조건이 이용될 수 있다. 예를 들어, 염 조건은 약 0.14M 내지 약 0.9M 염의 범위이고, 온도는 약 20℃ 내지 약 55℃의 범위일 수 있다. 프로브 또는 프라이머를 포함하는 하이브리드화된 복합체 및 시험 샘플로부터의 상보성 폴리누클레오티드의 존재는 샘플중의 PRRSV 또는 PRRSV 폴리누클레오티드 서열의 존재를 나타낸다.
항체
본 발명의 항체는 본 발명의 PRRSV 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 및 안정하게 결합하는 항체 분자이다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단쇄 항체(scFv), 또는 항체의 단편일 수 있다. 항체의 단편은 온전한 항체의 항원 결합부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부분이며, 그러한 일부분은 온전한 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인이 없는 부분이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 어떠한 항체 부류일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토브에 결합한다. 항체는 적합한 실험실 동물중에서 생체내에서 제조되거나, 재조합 DNA 기술을 이용한 시험관내에서 제조될 수 있다. 항체를 제조하고 특성화하는 수단은 본 기술분야에 공지되어 있다. [참조예: Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992)]. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 동물, 예컨대, 사람 또는 그 밖의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 염소, 피그, 개, 소, 양, 원숭이, 또는 말에게 투여함으로써 생성될 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 수거하고, 항체를, 예를 들어, 황산암모늄으로 침전시킨 다음, 크로마토그래피, 예컨대, 친화성 크로마토그래피함으로써 혈장으로터 정제한다. 폴리클로날 항체를 생성시키고 처리하는 기술은 본 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "특이적으로 결합" 또는 "특이적"은 제 1항원, 예를 들어, 폴리펩티드가 다른 비특이적 분자에 비해서 더 큰 친화성으로 본 발명의 항체를 인식하고 그에 결합함을 의미한다. 비특이적 분자는 제 1항원과의 공통의 에피토프를 공유하지 않는 항원이다. 예를 들어, 비특이적 항원에 대해서 보다 더 효능적으로 결합되는 항원(예, 폴리펩티드)에 대해서 유도된 항체는 항원 특이적으로 결합되는 항체로 기재될 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 107 l/mol 이상의 결합 친화성 Ka로 결합되는 경우에 SEQ ID NO: 1, 2, 12, 또는 13(또는 본 발명의 그 밖의 서열)으로 이루어진 폴리펩티드에 특이적으로 결합된다. 특이적 결합은, 예를 들어, 본 기술분야에 공지된 방법을 이용한 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 또는 웨스턴 블롯 검정을 이용함으로써 시험될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 항체가 또한 용이하게 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드로 면역된 포유동물, 예컨대, 마우스로부터의 정상 B 세포가, 예를 들어, HAT-민감성 마우스 미엘로마 세포와 융합되어 하이브리도마(hybridoma)를 생성시킬 수 있다. PRRSV-특이적 항체를 생성시키는 하이브리도마는 RIA 또는 ELISA를 이용함으로써 동정될 수 있으며, 반고형 한천중에서 클로닝시키거나 희석을 제한함으로써 단리될 수 있다. PRRSV-특이적 항체를 생성시키는 클론은 또 다른 스크리닝 과정에 의해서 단리된다. 모노클로날 항체는 표준 기술, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 미세적정 플레이트에 결합시키고 모노클로날 항체의 결합을 ELISA 검정에 의해서 측정함으로써 특이성에 대해서 스크리닝될 수 있다. 모노클로날 항체의 생성 및 처리 기술은 본 기술 분야에 공지되어 있다. [참조예, Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)]. 모노클로날 항체의 특정 이소타입은 초기 융합으로부터 직접적으로 제조되거나, 클래스-스위치 변이체를 단리시키도록 sib 선택 기술을 이용함으로써 상이한 이소타입의 모노클로날 항체를 분비하는 모체 하이브리도마로부터 이차적으로 제조될 수 있다. [참조: Steplewski et al., P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spria et al., J. Immunolog. Meth. 74:307, 1984]. 본 발명의 모노클로날 항체는 또한 재조합 모노클로날 항체일 수 있다. (참조예: U.S. Patent No. 4,474,893; U.S. Patent No. 4,816,567). 본 발명의 항체는 또한 화학적으로 구성될 수 있다. (참조예: U.S. Patent No. 4,676,980).
본 발명의 항체는 키메라성 항체(참조예: U.S. Patent No. 5,482,856), 인간화된 항체[참조예: Jones et al., Nature 321:522 (1986); Reichmann et al, Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)], 또는 사람 항체일 수 있다. 사람 항체는, 예를 들어, 직접적인 불멸화(direct immortilization), 파아지 디스플레이, 유전자 이식 마우스, 또는 트리메라 방법(Trimera methodology)[참조예: Reisener et al., Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998)]에 의해서 제조될 수 있다.
PRRSV 항원(예, PRRSV 폴리펩티드)과 특이적으로 결합하는 항체가 PRRSV-감염된 동물, 예컨대, 피그로부터의 샘플, 예컨대, 타액, 혈액, 혈청, 밀크, 육즙, 폐 세척액, 가래, 폐, 편도선, 림프절 또는 그 밖의 조직 샘플, 요, 분변, 뇌척수액, 양수, 또는 상처 삼출액 샘플중의 PRRSV 또는 PRRSV 항원의 존재를 검출하는데 특히 유용하다. PRRSV 또는 PRRSV 항원에 대한 면역검정은 하나의 항체 또는 수 개의 항체를 이용할 수 있다. PRRSV 또는 PRRSV 항원에 대한 면역검정은, 예를 들어, PRRSV 에피토프에 대해서 유도된 모노클로날 항체, 하나의 PRRSV 폴리펩티드의 에피토프에 대해서 유도된 모노클로날 항체들의 조합, 상이한 PRRSV 폴리펩티드의 에피토프에 대해서 유도된 모노클로날 항체, 동일한 PRRSV 항원에 대해서 유도된 폴리클로날 항체, 상이한 PRRSV 항원에 대해서 유도된 폴리클로날 항체, 또는 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 조합을 이용할 수 있다. 면역검정 원안은, 예를 들어, 경쟁, 직접적인 반응, 또는, 예를 들어, 표지된 항체를 이용하는 샌드위치형 검정을 기초로 할 수 있다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 형광 표지, 화학발광 표지, 방사성활성 표지, 효소, 콜로이드성 금속, 방사성동위원소 및 바이오발광 표지를 포함한 본 기술분야에 공지된 어떠한 종류의 표지로 표지될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 지지체에 결합되고, PRRSV 또는 PRRSV 항원의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 지지체는, 예를 들어, 글라스, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나이론, 아밀라제, 천연 및 변성된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 한천 및 마글레타이트(magletite)를 포함한다.
본 발명의 항체는 추가로 면역친화성 컬럼에 의해서 PRRSV 또는 PRRSV 항원을 단리시키는데 사용될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 흡착 또는 공유결합에 의해서 고형 지지체에 고정되어서 항체가 그들의 면역선택적 활성을 보유하게 할 수 있다. 임의로, 스페이서기가 포함되어 항체의 항원 결합부위가 접근 가능하게 유지되게 할 수 있다. 고정된 항체는 이어서 샘플, 예컨대, 타액, 혈액, 혈청, 밀크, 육즙, 폐 세척액, 가래, 폐, 편도선, 림프절 또는 그 밖의 조직 샘플, 요, 분변, 뇌척수액, 양수, 또는 상처 삼출액을 포함한 생물학적 샘플로부터의 PRRSV 또는 PRRSV 항원을 결합시키는데 사용될 수 있다. 결합된 PRRSV 또는 PRRSV 항원은, 예를 들어, pH의 변화에 의해서 컬럼 매트릭스로부터 회수된다.
본 발명의 항체는 또한 다양한 세포 현상 또는 생리학적 조건에서의 본 발명의 폴리펩티드의 존재 및 분포를 분석하기 위한 면역편재화 연구에 이용될 수 있다. 항체는 또한 수동 면역화와 관련된 분자를 동정하고 비-단백질 항원의 생합성과 관련된 분자를 동정하는데 사용될 수 있다. 그러한 분자의 동정은 백신 개발에 유용할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체 및 단쇄 항체를 포함한 본 발명의 항체는 PRRSV에 의해서 야기된 질환의 완화 과정을 모니터하는데 사용될 수 있다. 동물로부터의 시험 샘플중의 PRRSV 항원에 대한 PRRSV 항체의 증가 또는 감소를 측정함으로써, 질환을 완화시킬 목적의 특정의 치료 방법이 효과적인지를 측정할 수 있다. 항체는, 예를 들어, 직접적인 결합 검정, 예컨대, RIA, ELISA, 또는 위스턴 블롯 검정을 이용함으로써 검출되고/거나 정량화될 수 있다.
검출 방법
본 발명의 방법은 시험 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플, 환경 샘플, 또는 실험 샘플 중의 PRRSV에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 검출하는데 사용될 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 동물, 예컨대, 말, 고양이, 개, 피그, 또는 사람으로부터의 타액, 혈액, 혈청, 밀크, 육즙, 폐 세척액, 가래, 폐, 편도선, 림프절을 포함한 생물학적 샘플 또는 그 밖의 조직 샘플, 요, 분변, 뇌척수액, 양수, 또는 상처 삼출액을 포함한다. 시험 샘플은 본 발명의 폴리펩티드와 조합되기 전에 비처리되거나, 침전되거나, 분별되거나, 분리되거나, 희석되거나, 농축되거나, 정제될 수 있다.
방법은 폴리펩티드/항체 복합체가 형성되게 하는 조건하에서 본 발명의 폴리펩티드를 시험 샘플과 접촉시킴을 포함한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 샘플중에 위치하는 PRRSV에 특이적인 항체에 특이적으로 결합된다. 본 구체 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 포획 시약으로서 작용한다. 본 기술 분야의 전문가라면 항체/폴리펩티드 복합체 결합을 검출하는데 이용되는 검정 및 그 조건을 잘 알고 있다. 샘플중에서의 폴리펩티드와 항-PRRSV 항체 사이의 복합체 형성이 검출된다.
본 발명의 항체는 PRRSV 감염을 지니는 것으로 예상되는 사람 또는 동물로부터의 시험 샘플을 얻음으로써 PRRSV 감염에 대한 진단 방법에 사용될 수 있다. 시험 샘플은 항체-항원 복합체(즉, 면역복합체)의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 본 발명의 항체와 접촉된다. 항체-항원 복합체의 양은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 측정될 수 있다. 대조 샘플중에서 형성된 것보다 더 높은 수준은 PRRSV 감염을 나타낸다. 대안적으로는, 본 발명의 폴리펩티드가 시험 샘플과 접촉될 수 있다. 양성 몸체 샘플중의 PRRSV 항체는 적합한 조건하에서 항원-항체 복합체를 형성할 것이다. 항체-항원 복합체의 양은 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명의 한 구체 예에서, 폴리펩티드/항체 복합체는 항체에 결합되는 지시약, 예컨대, 효소가 검출 가능한 반응을 촉진하는 경우에 검출된다. 임의로, 신호 생성 화합물을 포함하는 지시약이 폴리펩티드/항체/지시약 복합체가 형성되게 하는 조건하에서 폴리펩티드/항체 복합체에 적용될 수 있다. 폴리펩티드/항체/지시약 복합체가 검출된다. 임의로, 폴리펩티드 또는 항체는 폴리펩티드/항체 복합체의 형성 전에 지시약으로 표지될 수 있다. 방법은 임의로 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다.
본 발명의 검정은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 효소 결합된 면역 흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯, IFA, 방사면역검정(RIA), 혈구응집법(hemagglutination: HA) 및 형광 편광 면역검정(fluorescence polarization immunoassay: FPIA)을 포함한 경쟁, 직접적인 반응, 샌드위치형 검정을 기초로 한 검정을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 한가지 검정법은 가역 흐름 크로마토그래피 결합 검정, 예를 들어, SNAP® 검정을 포함한다. (참조: U.S. Pat. No. 5,726,010).
검정은 고형 상 또는 기질을 이용할 수 있거나 면역침전법 또는 고형 상을 이용하지 않는 그 밖의 어떠한 방법에 의해서 수행될 수 있다. 고형 상 또는 기질이 사용되는 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 고형 지지체 또는 기질, 예컨대, 미세 적정 웰, 자성 비드, 비자성 비드, 컬럼, 매트릭스, 막, 합성 또는 천연 섬유(글라스 또는 셀룰로오즈-기재 물질 또는 열가소성 폴리머, 예컨대, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에스테르)로 구성된 섬유질 매트, 미립물질(예, 글라스 또는 다양한 열가소성 폴리머)로 구성된 소결된 구조체, 또는 니트로셀룰로오즈, 나이론, 폴리설폰 등(일반적으로, 본래 합성된)으로 구성된 주조 막 필름에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 한가지 구체 예에서, 기질은 다공성 폴리에틸렌으로 일반적으로 알려진 폴리에틸렌의 소결된 미세 입자, 예를 들어, 크로멕스 코포레이션(Chromex Corporation)(Albuquerque, NM)으로부터의 10-15 미크론 다공성 폴리에틸렌이다. 이들 기질의 물질 모두는 적합한 형태, 예컨대, 필름, 시이트, 또는 플레이트로 사용될 수 있거나 적절한 불활성 담체, 예컨대, 페이퍼, 글라스, 플라스틱 필름, 또는 섬유상에 코팅되거나, 이에 결합 또는 적층될 수 있다. 고형 상에 펩티드를 고정하는 적합한 방법은 이온, 소수성, 공유성 상호작용 등을 포함한다.
한가지 검정 형태에서, 하나 이상의 폴리펩티드가 고형 상 또는 기판에 코팅될 수 있다. 항-PRRSV 항체 또는 이의 단편을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플은 PRRSV에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 컨주게이트된 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약과 함께 인큐베이션되는데, 고형 상의 폴리펩티드에 대한 PRRSV에 대해 특이적인 항체에 컨주게이트된 지시약 화합물 또는 고형 상의 폴리펩티드에 대한 시험 샘플의 항체의 항원/항체 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 동안 및 그러한 조건하에 인큐베이션된다. 고형상에 대한 항 PRRSV 항체에 컨주게이트된 지시약의 결합의 감소는 정량적으로 칭량될 수 있다. 확인된 음성 PRRSV 시험 샘플로부터 생성된 신호에 비한 신호에서의 측정 가능한 감소는 시험 샘플에서의 항-PRRSV 항체의 존재를 나타낸다. 이러한 형태의 검정은 시험 샘플에서의 항-PRRSV 항체의 양을 정량할 수 있다.
또 다른 검정 형태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드는 지지체 또는 기판상에 코팅된다. 본 발명의 폴리펩티드는 지시약에 컨주게이트되며, 시험 샘플에 첨가된다. 이러한 혼합물은 지지체 또는 기판에 적용될 수 있다. PRRSV 항체 가 시험 샘플에 존재하면, 이들은 지시약에 컨주게이트된 폴리펩티드 및 지지체 상에 고정된 폴리펩티드에 결합될 것이다. 폴리펩티드/항체/지시약이 이어서 검출될 수 있다. 이러한 형태의 검정은 시험 샘플중의 항-PRRSV 항체의 양을 정량할 수 있다.
또 다른 검정 형태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드가 지지체 또는 기판상에 코팅될 수 있다. 시험 샘플은 지지체 또는 기판상에 적용되고 인큐베이션된다. 샘플로부터의 결합되지 않은 성분은 고형 지지체를 세척용액으로 세척함으로써 세척된다. PRRSV 항체가 시험 샘플에 존재하는 경우, 이들은 고형 상에 코팅된 폴리펩티드에 결합할 것이다. 이러한 폴리펩티드/항체 복합체는 지시약에 컨주게이트되는 제 2의 종-특이적 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다. 폴리펩티드/항체/항-종 항체 지시약 복합체가 이어서 검출될 수 있다. 이러한 검정 형태는 시험 샘플중의 항-PRRSV 항체의 양을 정량할 수 있다.
폴리펩티드/항체 복합체 또는 폴리펩티드/항체/지시약 복합체의 형성은 방사성계측 방법, 칼로리계측 방법, 형광계측 방법, 크기 분리, 또는 침전 방법에 의해서 검출될 수 있다. 임의로, 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약에 결합되는 2차 항체의 첨가에 의한다. 폴리펩티드/항체 복합체와 연관된 신호 발생 화합물(표지)를 포함하는 지시약은 상기된 방법을 이용함으로써 검출될 수 있으며, 발색제, 촉매, 예컨대, 효소, 형광 화합물, 예컨대, 플루오레신(fluorescein) 및 로다민, 화학발광 화합물, 예컨대, 디옥세탄, 아크리디늄, 페난트리디늄, 루테늄, 및 루미놀, 방사성활성 원소, 직접적인 가시 표지, 및 보조 인자(cofactor), 억제제, 및 자성 입자 등을 포함한다. 효소의 예는 알카리성 포스파타제, 호스레디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 및 베타-갈락톡시다제 등을 포함한다. 특정의 표지의 선택은 중요하지는 않지만, 스스로 또는 하나 이상의 추가의 물질과 함께 신호를 생성시킬 수 있어야 할 것이다.
복합체의 형성은 시험 샘플중의 항-PRRSV 항체의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법은 환자에서의 PRRSV 감염을 진단하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 시험 샘플중의 항-PRRSV 항체의 양을 나타낼 수 있다. 많은 지시약, 예컨대, 효소의 경우에, 존재하는 항체의 양은 발생되는 신호에 비례한다. 시험 샘플의 형태에 따라서, 시험 샘플은 적합한 완충 시약으로 희석되거나, 농축되거나, 어떠한 조작 없이 고형 상과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 항체의 존재 및/또는 존재하는 항체의 양을 측정하기 위해서, 미리 희석된 혈청 또는 혈장 샘플, 또는 진한 표본, 예컨대, 요를 시험하는 것이 일반적으로 바람직하다.
본 발명은 추가로 샘플중에 항-PRRSV 항체 또는 항체 단편 또는 PRRSV 폴리펩티드를 검출하는 검정 키트(예, 제품)를 포함한다. 키트는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 및 샘플중의 항-PRRSV 항체 또는 항체 단편에 대한 폴리펩티드의 결합을 측정하는 수단을 포함한다. 키트 또는 제품은 또한 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 및 샘플중의 PRRSV 또는 PRRSV 폴리펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합을 측정하는 수단을 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체 및, 예를 들어, 포유동물에서의 PRRSV 감염의 확인을 위한 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체의 사용에 대한 설명서를 함유하는 장치를 포함할 수 있다. 그러한 키트는 또한 키트의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체가 PRRSV 감염의 확인을 위해서 사용될 수 있음을 나타내는 표지를 포함한 패키징 물질을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 그 밖의 성분, 예컨대, 완충액, 및 대조군 등이 그러한 시험 키드에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 검정, 및 키트는 환자에서의 PRRSV 감염에 대한 개체의 진단, 및 PRRSV 발생에 대한 전염성 연구에 유용하다. 본 발명의 폴리펩티드 및 검정은 그 밖의 폴리펩티드 또는 검정과 조합되어 그 밖의 유기체와 함께 PRRSV의 존재를 검출할 수 있다.
본원에 적합하게 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 특별히 개시되지 않은 어떠한 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에서 각각의 경우에, "포함하는", "필수적으로 이루어지는", 및 "이루어지는"중 어떠한 표현은 다른 두 표현중 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명을 위한 용어로서 사용되고 있고, 그러한 용어 및 표현은 나타내고 기재된 특징의 어떠한 등가물 또는 그 일부를 배제하는 의도가 아니며, 다양한 변화가 청구된 본 발명의 범위 내에서 가능하다는 것이 인지되고 있다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구체 예에 의해서 특별히 개시되고 있지만, 본원에 기재된 임의 특징, 개념의 변화 및 변경이 본 기술분야의 전문가에게는 자명할 수 있으며, 그러한 변경 및 변화가 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 의해서 정의되는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 여겨지는 것이 이해되어야 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 관점이 마쿠시 그룹( Markush group) 또는 그 밖 의 대안적인 그룹으로 기재되는 경우, 당업자라면 본 발명이 또한 마쿠시 그룹 또는 그 밖의 그룹의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 서브 그룹으로 기재되고 있음을 인지할 수 있을 것이다.
이하 기재는 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이며, 상기 넓은 의미의 용어로 기재된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 인용된 모든 참조문헌은 본원에서 참조로 통합되는 것이다.
실시예
실시예 1
PEXUSorf7을 상기된 바와 같이 발현시키고 정제하였다[문헌: EMBO J. 1984, 3: 1429-1434]. 재조합 전장 U.S.ORF7, N-말단 결실 유도체 U.S.ORF7 및 카르복시-말단 결실 유도체 U.S.ORF7 단백질을 제조자가 기재하고 있는 방법을 사용한 스튜디어 pET 발현 시스템(Studier pET expression system)을 사용함으로써 발현시켰다(EMD Biosciences, Ind., Madison, WI 53719). 하기된 단백질을 엔코딩하는 핵산을 제조자가 기재하고 있는 방법을 사용하여 pET200 발현 시스탬내로 클로닝시켰다. 재조합 단백질을 신속한 친화성 정제를 가능하게 하는 벡터에 의해서 엔코딩되는 아미노 말단에서의 히스티딘 태그(tag)와 함께 발현시켰다. 단백질을 제조자가 기재하고 있는 방법을 이용하여 이. 콜라이 균주 BL21(star)(E. coli strain BL21)로부터 발현시키고 정제하였다(EMD Biosciences). 이. 콜라이의 미정제 용해물을 SDS-PAGE 겔을 사용함으로써 분리하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오즈에 블롯팅하고, 니트로셀룰로오즈 블롯을 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 표준 기술을 이용하여 블로킹시켰다. [참조예: Sambrook and Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]. 돼지 항체의 존재를 염소 항-돼지 IgG HRP 컨주게이트(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, 19390)로 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 표준 기술을 이용하여 검출하였다.
PRRSV (U.S. 혈청형) 오픈 리딩 프레임 7(ORF7)의 서열은 길이가 123 개 아미노산이며 이하 기재되고 있다: 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스, U.S. 혈청형
Figure 112007069677624-pct00009
PEXUSorf7의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 4에 나타내고 있다. PRRS ORF7, U.S. 혈청형의 아미노산은 굵은 글씨 및 밑줄로 표시되고 있다. ORF7의 모든 123 개 아미노산이 존재한다:
Figure 112007069677624-pct00010
Figure 112007069677624-pct00011
U.S. 혈청형 ORF7의 아미노산 2 내지 123 개가 존재하며 SEQ ID NO: 5에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시되고 있다. 이러한 재조합 단백질은 노바겐(Novagen)으로부터의 pET200 발현 벡터를 사용함으로써 발현되었다. 37 개 아미노산 융합 태그가 단백질의 아미노 말단에 결합된다.
Figure 112007069677624-pct00012
21 개 아미노산이 ORF7 아미노 말단으로부터 결실되었다. 아미노산 22 내지 123 개가 존재하며, U.S. 형청형 ORF7 아미노산은 SEQ ID NO: 6에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시되고 있다. 재조합 단백질은 노바겐으로부터 pET200 발현 벡터를 사용함으로써 발현되었다. 아미노산 번호 25(전장 PRRS 단백질의)-메티오닌(M)-은 이소류신(I)로 전환되어 비정상 번역 출발 부위를 제거한다. 이러한 단백질은 단백질의 아미노 말단에 결합된 동일한 37 개 아미노산 융합 태크를 지닌다.
Figure 112007069677624-pct00013
U.S. ORF7의 카르복시 말단으로부터의 30 개 아미노산은 결실되었다. U.S. ORF7의 아미노산 2 내지 93 개가 존재하며, SEQ ID NO: 7에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시되고 있다. 재조합 단백질은 노바겐(Novagen)으로부터의 pET200 발현 벡터를 사용함으로써 발현되었다. 본 단백질은 단백질의 아미노 말단에 결합된 동일한 37 개 아미노산 융합 태그를 지닌다. 본 단백질은 PRRS 바이러스로부터의 유래되지 않은 벡터에 의해서 엔코딩되는 카르복시 말단에 결합된 추가의 30 개 아미노산 태그를 지닌다.
Figure 112007069677624-pct00014
실시예 2
웨스턴 블롯에서의 반응성:
본 데이터는 U.S. ORF7의 C-말단 결실 유도체(SEQ ID NO: 7)이 웨스턴 블롯에서 양성 돼지 혈청과 반응하지 않는 반면, 전장 U.S. ORF7 및 U.S. ORF7의 N-말단(a.k.a. 아미노-말단) 결실 유도체(SEQ ID NO: 6) 둘 모두는 양성 돼지 혈청과 반응함을 입증하고 있다.
표 3
Figure 112007069677624-pct00015
실시예 3
ELISA에서의 반응성
재조합 단백질은 제조자가 기재하고 있는 방법을 이용하여 스튜디어 pET 발현 시스템을 사용함으로써 발현시켰다(EMD Biosciences, Ind., Madison, WI 53719). 상기된 단백질을 엔코딩하는 유전자를 제조자가 기재하고 있는 방법을 이용하는 pET200 발현 시스템내로 클로닝시켰다. 재조합 단백질은 신속한 친화성 정제를 가능하게 하는 벡터에 의해서 엔코딩되는 아미노 말단에서의 히스티딘 태그와 함께 발현된다. 단백질은 제조자가 기재하고 있는 방법을 이용하는 이.콜라이 균주 BL21(star)로부터 발현되고 정제되었다((EMD Biosciences)
이뮬론 1 플레이트(Immulon 1 plate)를 탄산염 완충액, pH9.5중에 1㎍/ml의 정제된 재조합 단백질로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 "플리킹(flicking)" 및 패팅 건조(patting dry)에 의해서 비웠다. 플레이트를 PBS중의 2.5% BSA를 사용하여 밤새 블로킹시켰다. 플레이트를 플리킹 및 패팅 건조시키고, 10mM 트리스 완충액(pH7.5)중의 2.5% 수크로스로 오버-코팅시켰다. 플리킹 및 패팅 건조 후에, 플레이트를 4 시간 동안 진공 건조시키고 건조제와 함께 저장하였다.
샘플을 "돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 항체 시험 키트("Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Antibody Test Kit" (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook ME, catalog number 06-04404-00))로부터의 시판용 시약 및 방법을 이용하는 ELISA 플레이트상에서 시험하였다. 결과는 U.S. ORF7 단백질의 N-말단 결실 유도체(SEQ ID NO: 6)가 ELISA 검정에서 전장 단백질(SEQ ID NO: 5)와 유사한 방식으로 반응함을 입증하였다.
실시예 4
하기 릴리스태드 PRRSV ORF7 폴리펩티드를 본 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 제조하였다. 릴리스태드 ORF7 단백질로부터의 서열은 굵은 글씨 및 밑줄로 표시되고 있다. 그 밖의 아미노산은 이들 재조합 단백질에 첨가된 융합 파트너/태그이다.
pEX4 벡터에 의해서 발현된 베타 gal-ORF7 릴리스태드의 서열:
Figure 112007069677624-pct00016
pET200 벡터로부터 발현된 His-orf7 릴리스태드의 서열:
Figure 112007069677624-pct00017
pET200 벡터로부터 발현된 His-N-말단 트렁케이티드된 ORF7 릴리스태드의 서열. 본 N-말단 결실 펩티드는 아미노 말단으로부터 26 개 아미노산이 제거된다:
Figure 112007069677624-pct00018
pET200 벡터로부터 발현된 His 카르복시 트렁케이티드된 ORF7 릴리스태드의 서열. 본 C-말단 결실 펩티드는 카르복시 말단으로부터 34 개 아미노산이 제거된다:
Figure 112007069677624-pct00019
이들 폴리펩티드의 반응성은 웨스턴 블롯을 이용함으로써 시험되었다. 결과는 표 4에 기재되어 있다.
표 4
Figure 112007069677624-pct00020
본 데이터는 릴리스태드 ORF7의 C-말단 결실 유도체가 웨스턴 블롯에서 양성 돼지 혈청과 반응하지 않는 반면, 전장 릴리스태드 ORF7 및 릴리스태드 ORF7의 N-말단 결실 유도체 둘 모두는 양성 돼지 혈청과 반응함을 입증하고 있다.
실시예 5
ELISA에서의 반응성
재조합 단백질을 제조자가 기재하고 있는 방법을 이용하는 스튜디어 pET 발현 시스템을 이용함으로써 발현시켰다(EMD Biosciences, Ind., Madison, WI 53719). 상기된 폴리펩티드를 엔코딩하는 헥산을 제조자가 기재하고 있는 방법을 이용하는 pET200 발현 시스템내로 클로닝시켰다. 재조합 폴리펩티드는 신속한 친화성 정제를 가능하게 하는 벡터에 의해서 엔코딩되는 아미노 말단에서의 히스티딘 태그와 함께 발현된다. 단백질은 제조자가 기재하고 있는 방법을 이용하는 이.콜라이 균주 BL21(star)로부터 발현되고 정제되었다((EMD Biosciences). 이뮬론 1 플레이트(Immulon 1 plate)를 탄산염 완충액, pH9.5중의 1㎍/ml의 정제된 재조합 단백질로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 "플리킹(flicking)" 및 패팅 건조(patting dry)에 의해서 비웠다. 플레이트를 PBS중의 2.5% BSA를 사용하여 밤새 블로킹시켰다. 플레이트를 플리킹 및 패팅 건조시키고, 10mM 트리스 완충액(pH7.5)중의 2.5% 수크로스로 오버-코팅시켰다. 플리킹 및 패팅 건조 후에, 플레이트를 4 시간 동안 진공 건조시키고 건조제와 함께 저장하였다. 샘플을 "돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 항체 시험 키트("Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Antibody Test Kit" (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook ME, catalog number 06-04404-00))로부터의 시판용 시약 및 방법을 이용하는 ELISA 플레이트상에서 시험하였다. 결과는 릴리스태드 ORF7 단백질의 N-말단 결실 유도체가 ELISA 검정에서 전장 단백질 만큼 반응성임을 입증하였다.
실시예 6
트렁케이티드된 U.S. orf7 항원을 이용한 개선된 항체 검출 특이성
재조합 단백질 발현에 의해서 생성된 US Orf7의 N-말단 트렁케이트된 폴리펩티드(SEQ ID NO: 6)을 ELISA 포맷에서의 면역반응성에 대해서 시험하고 전장 US Orf7(SEQ ID NO: 5)와 비교하였다. SEQ ID NO: 5 및 6의 재조합 단백질은 상기된 바와 같이 발현시키고 정제하였다(실시예 3). 이뮬론® I 플레이트를 상기된 바와 같이 폴리펩티드로 코팅시켰다(실시예 3). 플레이트 코팅 및 이차 항체 결실은 양성 대조 돼지 혈청을 사용한 IDEXX HerdCheck® 2XR ELISA 검정의 신호와 대체로 등가의 특이적 신호를 생성시키도록 최적화되었다. 선택된 돼지 혈청에 대한 반응성을 ELISA에 의해서 검정하였다(참조, 표 7).
스크리닝된 혈청 샘플을 IFA 및 PCR을 포함한 그 밖의 방법에 의해서 PRRSV에 대해서 음성으로 지정되었으며, IDEXX HerdCheck® 2XR ELISA상에서 반응성을 나타냈다. 이는 2XR 플레이트상에서의 비특이적 신호의 존재를 제시한다. 이들 특징을 지니는 혈청 샘플은 IDEXX HerdCheck® 2XR ELISA상에서 위양성이며, PRRS 진단 분야에서의 전문가에 의해서 "싱글레톤(singleton)"으로 일반적으로 일컬어진다. US Orf7로부터의 N-말단 26 개 아미노산의 결실은 전장 US Orf7에 비해서 감소된 반응성 및 개선된 특이성을 나타내는 면역반응성 항원을 생성시켰다(각각 79% 특이성 대 69% 특이성). ≤ 0.200의 OD650 값은 샘플이 양성 및 음성 대조 표준을 사용하는 IDEXX HerdCheck® 2XR에 대한 최적화를 기준으로 음성인 것으로 여겨지는 컷오프 값으로 결정되었다. U.S. orf7 항원의 아미노-말단 부분의 트렁케이션(Truncation)은 돼지 혈청으로부터의 비-특이적 신호의 현저한 감소를 야기시켰다.
표 5
Figure 112007069677624-pct00021
실시예 7
트렁케이트된 릴리스태드 orf7 항원을 이용한 개선된 항체 검출 특이성
PRRS 바이러스의 릴리스태드 균주로부터의 전장 Orf7 (SEQ ID NO: 15) 및 N-말단 트렁케이트된 서열(SEQ ID NO: 16)을 이. 콜라이에서 발현시키고, 상기된 바와 같이 선택된 돼지 혈청에 대한 ELISA 분석을 위해서 분리하였다(실시예 5). 플레이트 코팅 및 이차 항체(컨주게이트) 희석은 양성 대조 혈청을 사용하는 IDEXX HerdCheck® 2XR ELISA 검정의 신호와 대체로 균등한 특이적 신호를 생성하도록 최적화되었다. 스크리닝된 혈청 샘플은 IFA 및 PCR을 포함한 그 밖의 방법에 의해서 PRRSV에 대해 음성으로 지정되었으며, IDEXX HerdCheck® 2XR ELISA상에서 반응성을 나타내었다.
N-말단 트렁케이트된 릴리스태드 orf7 단백질은 전장 릴리스태드 orf7 단백질에 비해서 감소된 면역반응성 및 개성된 특이성을 나타내었다(각각 42% 특이성에 비한 62% 특이성). ≤ 0.200의 OD650 값은 샘플이 양성 및 음성 대조 표준을 사용하는 IDEXX HerdCheck 2XR에 대한 최적화를 기준으로 음성인 것으로 여겨지는 컷오프 값으로 결정되었다. 릴리스태드 orf7 항원의 N-말단 부분의 트렁케이션은 돼지 혈청으로부터의 비-특이적 신호의 현저한 감소를 야기시켰다.
표 6
Figure 112007069677624-pct00022
표 7
ELISA에서의 전장 및 트렁케이티드된 orf7 폴리펩티드에 의한 "싱글레톤" 혈청 샘플의 반응성. OD650 값은 전장(FL) 및 N-말단 트렁케이티드된(Trn) 폴리펩티드에 대해서 나타내고 있으며, OD>0.2는 양성(굵은 글씨 값)이다.
Figure 112007069677624-pct00023
Figure 112007069677624-pct00024
SEQUENCE LISTING <110> Krah, Eugene R <120> Peptides for Detection of Antibody to Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus <130> 04-980A <150> 60/656348 <151> 2005-02-25 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 102 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X stands for any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X stands for any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223> X stands for any amino acid. <400> 1 Leu Cys Gln Xaa Leu Gly Lys Ile Ile Ala Xaa Gln Asn Gln Ser Arg 1 5 10 15 Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro 20 25 30 His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro 35 40 45 Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln 50 55 60 Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr 65 70 75 80 Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val 85 90 95 Thr Ala Xaa Pro Ser Ala 100 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> X can be any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X can be any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (137)..(137) <223> X can be any amino acid. <400> 2 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 His Pro Phe Thr Gly Ser Leu Cys Gln Xaa Leu Gly Lys Ile Ile Ala 35 40 45 Xaa Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys 50 55 60 Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val 65 70 75 80 Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile 85 90 95 Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser 100 105 110 Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr 115 120 125 Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Xaa Pro Ser Ala 130 135 140 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 3 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 115 120 <210> 4 <211> 533 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 4 Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Glu Ala Trp Asp Arg Ser Gly Ala 1 5 10 15 Trp Leu Leu Pro Val Ser Leu Val Lys Arg Lys Thr Thr Leu Ala Pro 20 25 30 Asn Thr Gln Thr Ala Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln 35 40 45 Leu Ala Arg Gln Val Ser Arg Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro 50 55 60 Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser 65 70 75 80 Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro 85 90 95 Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Trp Leu Glu Cys Asp Leu Pro Glu 100 105 110 Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp 115 120 125 Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro 130 135 140 Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Cys Tyr Ser Leu Thr Phe Asn 145 150 155 160 Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr Arg Ile Ile Phe Asp 165 170 175 Gly Val Asn Ser Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gly Arg Trp Val Gly 180 185 190 Tyr Gly Gln Asp Ser Arg Leu Pro Ser Glu Phe Asp Leu Ser Ala Phe 195 200 205 Leu Arg Ala Gly Glu Asn Arg Leu Ala Val Met Val Leu Arg Trp Ser 210 215 220 Asp Gly Ser Tyr Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Arg Met Ser Gly Ile 225 230 235 240 Phe Arg Asp Val Ser Leu Leu His Lys Pro Thr Thr Gln Ile Ser Asp 245 250 255 Phe His Val Ala Thr Arg Phe Asn Asp Asp Phe Ser Arg Ala Val Leu 260 265 270 Glu Ala Glu Val Gln Met Cys Gly Glu Leu Arg Asp Tyr Leu Arg Val 275 280 285 Thr Val Ser Leu Trp Gln Gly Glu Thr Gln Val Ala Ser Gly Thr Ala 290 295 300 Pro Phe Gly Gly Glu Ile Ile Asp Glu Arg Gly Gly Tyr Ala Asp Arg 305 310 315 320 Val Thr Leu Arg Leu Asn Val Glu Asn Pro Lys Leu Trp Ser Ala Glu 325 330 335 Ile Pro Asn Leu Tyr Arg Ala Val Val Glu Leu His Thr Ala Asp Gly 340 345 350 Thr Leu Ile Glu Ala Glu Ala Cys Asp Val Gly Phe Arg Glu Val Arg 355 360 365 Ile Glu Asn Gly Leu Leu Leu Leu Asn Gly Lys Pro Leu Leu Ile Arg 370 375 380 Gly Val Asn Arg His Glu His His Pro Leu His Gly Gln Val Met Asp 385 390 395 400 Glu Gln Thr Met Val Gln Asp Gly Asp Pro Met Pro Asn Asn Asn Gly 405 410 415 Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu 420 425 430 Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly 435 440 445 Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His 450 455 460 Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser 465 470 475 480 Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly 485 490 495 Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val 500 505 510 Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr 515 520 525 Ala Pro Pro Ser Ala 530 <210> 5 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of U.S. PRRSV serotype ORF7 with a 37 amino acid fusion tag is attached to amino terminus <400> 5 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 His Pro Phe Thr Gly Ser Leu Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys 35 40 45 Lys Lys Lys Gly Asp Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu 50 55 60 Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly 65 70 75 80 Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala 85 90 95 Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu 100 105 110 Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys 115 120 125 Thr Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu 130 135 140 Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser 145 150 155 160 Ala <210> 6 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising part of U.S. PRRSV serotype ORF7; amino acid number 25 - methionine is converted to isoleucine; a 37 amino acid fusion tag is attached to amino terminus of protein. <400> 6 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 His Pro Phe Thr Gly Ser Leu Cys Gln Ile Leu Gly Lys Ile Ile Ala 35 40 45 Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys 50 55 60 Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val 65 70 75 80 Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile 85 90 95 Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser 100 105 110 Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr 115 120 125 Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 130 135 140 <210> 7 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein containing part of U.S. PRSSV ORF7; a 37 amino acid fusion tag is present on the amino terminus of the protein; an additional 30 amino acid tag encoded by the expression vector is attached to the carboxy terminus. <400> 7 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 His Pro Phe Thr Gly Ser Leu Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys 35 40 45 Lys Lys Lys Gly Asp Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu 50 55 60 Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly 65 70 75 80 Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala 85 90 95 Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu 100 105 110 Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys 115 120 125 Thr Leu Ser Leu Glu Ser Leu Glu Lys Gly Glu Leu Asn Asp Pro Ala 130 135 140 Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu 145 150 155 160 Gln <210> 8 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 8 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Thr Glu Glu Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 9 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 9 Met Pro Asn Asn Thr Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala His 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 115 120 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 10 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 11 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X stands for any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X stands for any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X stands for any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> X stands for any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (120)..(120) <223> X stands for any amino acid. <400> 11 Met Pro Asn Asn Xaa Gly Lys Gln Xaa Xaa Glu Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Xaa 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Xaa Pro Ser Ala 115 120 <210> 12 <211> 102 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X stands for any amino acid. <400> 12 Cys Gln Leu Leu Gly Ala Xaa Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg 1 5 10 15 Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu 20 25 30 Ala Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser 35 40 45 Leu Cys Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr 50 55 60 Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly Glu Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met 65 70 75 80 Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Ala Ser Gln Gly Ala Ser 100 <210> 13 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tagged 5' truncated PRRSV Lelystad ORF7 polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> X stands for any amino acid <400> 13 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 His Pro Phe Thr Gly Ser Cys Gln Leu Leu Gly Ala Xaa Ile Lys Ser 35 40 45 Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu 50 55 60 Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu 65 70 75 80 Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe 85 90 95 Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly Glu Val Ser 100 105 110 Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile 115 120 125 Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser 130 135 140 <210> 14 <211> 551 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta gal-ORF7 Lelystad expressed by pEX4 vector <400> 14 Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Glu Ala Trp Asp Arg Ser Gly Ala 1 5 10 15 Trp Leu Leu Pro Val Ser Leu Val Lys Arg Lys Thr Thr Leu Ala Pro 20 25 30 Asn Thr Gln Thr Ala Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln 35 40 45 Leu Ala Arg Gln Val Ser Arg Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro 50 55 60 Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser 65 70 75 80 Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro 85 90 95 Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Trp Leu Glu Cys Asp Leu Pro Glu 100 105 110 Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp 115 120 125 Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro 130 135 140 Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Cys Tyr Ser Leu Thr Phe Asn 145 150 155 160 Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr Arg Ile Ile Phe Asp 165 170 175 Gly Val Asn Ser Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gly Arg Trp Val Gly 180 185 190 Tyr Gly Gln Asp Ser Arg Leu Pro Ser Glu Phe Asp Leu Ser Ala Phe 195 200 205 Leu Arg Ala Gly Glu Asn Arg Leu Ala Val Met Val Leu Arg Trp Ser 210 215 220 Asp Gly Ser Tyr Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Arg Met Ser Gly Ile 225 230 235 240 Phe Arg Asp Val Ser Leu Leu His Lys Pro Thr Thr Gln Ile Ser Asp 245 250 255 Phe His Val Ala Thr Arg Phe Asn Asp Asp Phe Ser Arg Ala Val Leu 260 265 270 Glu Ala Glu Val Gln Met Cys Gly Glu Leu Arg Asp Tyr Leu Arg Val 275 280 285 Thr Val Ser Leu Trp Gln Gly Glu Thr Gln Val Ala Ser Gly Thr Ala 290 295 300 Pro Phe Gly Gly Glu Ile Ile Asp Glu Arg Gly Gly Tyr Ala Asp Arg 305 310 315 320 Val Thr Leu Arg Leu Asn Val Glu Asn Pro Lys Leu Trp Ser Ala Glu 325 330 335 Ile Pro Asn Leu Tyr Arg Ala Val Val Glu Leu His Thr Ala Asp Gly 340 345 350 Thr Leu Ile Glu Ala Glu Ala Cys Asp Val Gly Phe Arg Glu Val Arg 355 360 365 Ile Glu Asn Gly Leu Leu Leu Leu Asn Gly Lys Pro Leu Leu Ile Arg 370 375 380 Gly Val Asn Arg His Glu His His Pro Leu His Gly Gln Val Met Asp 385 390 395 400 Glu Gln Thr Met Val Gln Asp Gly Asp Pro Lys Gly Phe Glu Phe Glu 405 410 415 Leu Gly Thr Leu Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser 420 425 430 Thr Ala Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu 435 440 445 Leu Gly Ala Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln 450 455 460 Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu 465 470 475 480 Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu 485 490 495 Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu 500 505 510 Ser Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val 515 520 525 Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln 530 535 540 Gly Ala Arg Asp Pro Leu Glu 545 550 <210> 15 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-orf7 Lelystad PRRSV expressed from the pET200 vector <400> 15 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 His Pro Phe Thr Gly Leu Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys 35 40 45 Lys Ser Thr Ala Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys 50 55 60 Gln Leu Leu Gly Ala Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly 65 70 75 80 Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala 85 90 95 Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu 100 105 110 Cys Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu 130 135 140 Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala 145 150 155 160 Ser Gln Gly Ala Ser 165 <210> 16 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-5'Trucated ORF7 Lelystad PRRSV expressed from the pET200 vector <400> 16 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 His Pro Phe Thr Gly Ser Cys Gln Leu Leu Gly Ala Ile Ile Lys Ser 35 40 45 Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu 50 55 60 Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu 65 70 75 80 Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe 85 90 95 Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly Glu Val Ser 100 105 110 Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile 115 120 125 Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser 130 135 140 <210> 17 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-3' truncated ORF7 Lelystad expressed from the pET200 vector <400> 17 Met Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly 1 5 10 15 Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Asp Asp Asp Lys Asp His Pro Phe Thr 20 25 30 Gly Leu Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ala 35 40 45 Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly 50 55 60 Ala Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys 65 70 75 80 Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp 85 90 95 Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser 100 105 110 Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser 115 120 125 <210> 18 <211> 102 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X stands for any amino acid <400> 18 Cys Gln Leu Leu Gly Ala Xaa Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg 1 5 10 15 Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu 20 25 30 Ala Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser 35 40 45 Leu Cys Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr 50 55 60 Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly Glu Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met 65 70 75 80 Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Ala Ser Gln Gly Ala Ser 100

Claims (32)

  1. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18로 이루어진 정제된 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 다량체형인 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 이동 종결 서열, 경막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합되는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 13로 이루어진 조성물.
  6. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18로 이루어진 폴리펩티드 및 천연 상태에서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18과 연속적으로 결합되어 있지 않은 1 내지 37개의 아미노산을 포함하는 정제된 융합 단백질.
  7. 제 6항에 있어서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18이 다량체형인 정제된 융합 단백질.
  8. 제 6항에 있어서, 정제된 융합 폴리펩티드가 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 이동 종결 서열, 경막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물을 포함하는 정제된 융합 단백질.
  9. 제 6항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 13으로 이루어진 정제된 융합 단백질.
  10. 제 1항의 정제된 폴리펩티드를 엔코딩하는 정제된 폴리누클레오티드.
  11. 제 6항의 정제된 융합 폴리펩티드를 엔코딩하는 정제된 폴리누클레오티드.
  12. 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 또는 PRRSV 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법으로서,
    (a) 폴리펩티드/항체 복합체가 형성되게 하는 조건하에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 정제된 폴리펩티드를 PRRSV에 특이적인 항체를 포함하는 것으로 의심되는 시험 샘플과 접촉시키고;
    (b) 폴리펩티드/항체 복합체를 검출함을 포함하며;
    폴리펩티드/항체 복합체의 검출이 PRRSV에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재함을 나타내고, 상기 복합체의 항체는 PRRSV에 특이적이고, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 및 SEQ ID NO: 13의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며,
    폴리펩티드/항체 복합체의 부재가 PRRSV에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하지 않음을 나타내는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, (a)의 복합체를 (b)의 수행 전에 지시약과 접촉시킴을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 항체가 항체의 단편인 방법.
  15. 제 12항에 있어서, 시험 샘플 중의 항체의 양이 측정되는 방법.
  16. 제 12항에 있어서, 폴리펩티드가 기판에 결합되는 방법.
  17. 제 12항에 있어서, 폴리펩티드가 다량체형인 방법.
  18. 제 12항에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드 및 천연 상태에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 13과 연속적으로 결합되어 있지 않은 1 내지 37개의 아미노산을 포함하는 융합 단백질인 방법.
  19. 제 12항에 있어서, 시험 샘플이 포유동물로부터 얻은 생물학적 샘플을 포함하는 방법.
  20. 제 12항에 있어서, 방법이 가역적 흐름 크로마토그래피 결합 검정, 효소 결합된 면역흡착 검정, 방사면역검정, 혈구응집 검정, 웨스턴 블롯 검정, 형광 편광 면역검정, 및 간접 면역형광 검정으로 이루어진 검정 군으로부터 선택된 검정을 포함하는 방법.
  21. 인간을 제외한 포유동물에서 PRRSV 감염을 검출하는 방법으로서,
    (a) PRRSV 감염이 의심되는 포유동물로부터의 생물학적 샘플을 얻고;
    (b) 폴리펩티드/항체 복합체가 형성되게 하는 조건하에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 13 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 정제된 폴리펩티드를 생물학적 샘플과 접촉시키고;
    (c) 폴리펩티드/항체 복합체를 검출함을 포함하며;
    폴리펩티드/항체 복합체의 검출이 포유동물이 PRRSV 감염을 지님을 나타내며, 상기 복합체의 항체는 PRRSV에 특이적이고, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18 및 SEQ ID NO: 13의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며,
    폴리펩티드/항체 복합체의 부재가 포유동물이 PRRSV 감염을 지니지 않음을 나타내는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, (b)의 폴리펩티드/항체 복합체를 (c)의 수행 전에 측정 가능한 신호를 발생시키는 지시약과 접촉시킴을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드 및 천연 상태에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 13과 연속적으로 결합되어 있지 않은 1 내지 37개의 아미노산으로 이루어진 융합 단백질인 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. PRRSV ORF 7에 특이적인 PRRSV 항체를 검출하는 진단 검정에서 위양성(false positive)의 유발율을 감소시키는 방법으로서,
    진단 검정에서 항체 포획 항원으로 19 내지 28개 N-말단 아미노산 결실을 포함하는 PRRSV ORF 7 폴리펩티드를 사용함을 포함하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, PRRSV ORF7 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 18인 방법.
  31. 제 29항에 있어서, PRRSV ORF7 폴리펩티드가 천연 상태에서 PRRSV ORF7와 연속적으로 결합되어 있지 않은 1 내지 37개의 아미노산을 한 말단에서 추가로 포함하는 방법.
  32. 제 1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 천연 상태에서 PRRSV ORF7와 연속적으로 결합되어 있지 않은 1 내지 37개의 아미노산을 한 말단에서 추가로 포함하는 조성물.
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