KR101289812B1 - 에르리키아 에인지에 대한 항체를 검출하기 위한 펩티드 - Google Patents
에르리키아 에인지에 대한 항체를 검출하기 위한 펩티드 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii), 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체, 항체 단편 및 폴리펩티드를 검출 및 정량하는 조성물 및 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 및 항체 단편, 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 및 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
과립구 에르리히증은 포유동물에서 발생하며 과립구 세포가 진드기 매개제인 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)로 감염됨에 의해 야기된다. 인간에서 빈번하게 보고되는 과립구 에르리히증의 징후는 빈혈 및 저혈소판증이다. 개에서 일반적인 임상적 징후는 열 및 절름발이이다.
간접 면역형광 검정(IFA) 및 효소-결합된 면역흡수 검정(ELISA)이 감염된 세포, 세포 용해물 또는 정제된 에르리키아 단백질에 대한 환자의 혈액 또는 혈청으로부터의 항체의 결합을 측정함에 의해 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 의해 야기된 질병의 진단에서 보조제로서 종종 이용된다. 일반적으로, 이러한 시험은 대용 마커로서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)가 아닌 에르리키아 종(예를 들어, 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 또는 에르리키아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis))을 이용하여 수행되는데, 그 이유는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)-특이적인 시약이 조직 배양에서 용이하게 성장하지 않아서, 예컨대 면역-형광 검정(IFA)에 대해 이전에는 사용될 수 없었기 때문이다. 대용 마커를 이용하는 검정은 상기 시험에 사용된 항원 또는 항원들의 순수하지 않은 특성 및 비-특이적인 특성과 직접 관련된 감수성 및 특이성의 문제로 인해 이용이 매우 제한적이다. 보다 정밀한 검정을 고안하기 위해서는 정제된 부분 단백질 (즉, 전체 에르리키아 단백질의 단편)과 같은 고도로 정제된 시약이 요구된다. 본 발명은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)가 아닌 에르리키아 종으로부터의 전체 정제된 에르리키아 단백질, 부분적으로 정제된 전체 에르리키아 단백질, 감염된 세포, 또는 세포 용해물 대신 사용될 수 있는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)로부터 유래된 특정 합성 펩티드 서열을 기술한다.
발명의 개요
본 발명의 일 구체예는 본질적으로 서열번호 3 또는 서열번호 4로 구성된 정제된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 정제된 폴리펩티드는 본질적으로 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 본질적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 이들의 조합물로 구성될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 다합체 형태일 수 있고 담체를 추가로 포함할 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 지시 시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 종료 이동 서열, 트랜스막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 이들의 조합물을 포함하는 정제된 융합 폴리펩티드를 제공한다. 폴리펩티드 중 적어도 하나는 다합체 형태일 수 있다. 정제된 융합 폴리펩티드는 지시 시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 종료 이동 서열, 트랜스막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 정제된 폴리펩티드 또는 정제된 융합 단백질을 엔코딩하는 정제된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 이들의 조합물을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체를 포함할 것으로 의심되는 시험 샘플과 폴리펩티드/항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 접촉시키고 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하는 것을 나타내며, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하지 않는 것을 나타낸다. 항체는 항체 단편일 수 있다. 시험 샘플에 존재하는 항체의 양을 측정할 수 있다. 폴리펩티드는 기질에 부착될 수 있다. 폴리펩티드는 지시 시약에 부착될 수 있다. 폴리펩티드/항체 복합체는 표지된 항-항체 종을 이용하여 검출될 수 있다. 시험 샘플은 포유동물로부터 수득된 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 포유동물은 인간, 고양이, 말 및 개로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 이 방법은 미세역가 플레이트 검정, 가역적인 흐름의 크로마토그래피 결합 검정, 효소 결합된 면역흡수 검정, 방사면역검정, 적혈구응집 검정, 웨스턴 블롯 검정, 형광 분극 면역검정, 및 간접적인 면역형광 검정으로 구성된 검정의 군으로부터 선택된 검정을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 포유동물에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염된 것으로 의심되는 포유동물로부터 생물학적 샘플을 수득하고; 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 이들의 조합물을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 생물학적 샘플과 폴리펩티드/항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 접촉시키고; 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 것을 포함한다. 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 포유동물이 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염된 것을 나타내고, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 포유동물이 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염되지 않은 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 구체예는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4이다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
추가로 본 발명의 또 다른 구체예는 샘플에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 샘플과 폴리펩티드/항체 복합체를 형성할 수 있는 조건하에 접촉시키고 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 것을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4를 포함한다. 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드가 샘플에 존재하는 것을 나타내고, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드가 샘플에 존재하지 않는 것을 나타낸다. 샘플은 혈청, 전혈, 소변 또는 타액일 수 있다.
따라서, 본 발명은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 및 항체 단편, 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 및 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드를 검출하는데 사용될 수 있는 민감하고 특이적인 방법 및 조성물을 제공한다.
발명의 상세한 설명
에르리키아 카니스(Ehrlichia canis)의 P30 단백질의 면역우세 영역은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 이전에 동정되었다. 참조, 2001년 1월 18일 출원된 미국 특허 출원 09/765,736호. 동정된 서열은 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis)의 여러 단리물의 외막 단백질의 서열에 대해 강력한 상동성을 나타내었다. 여러 외막 단백질의 상동 영역으로부터의 서열에 상응하는 합성 펩티드를 합성하여 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis)에 대한 항체 및 항체 단편을 검출하기 위한 진단 검정에 성공적으로 사용하였다.
에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 및 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis)는 에르리키아 그룹의 동일한 혈청형내에서 구분되는 관련 유기체의 상이한 종이다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)의 폴리펩티드 서열이 면역우세 영역을 동정하기 위해 조사되었다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 막 단백질로는 C-1, OK-2, OK-1, MO-3 및 MO-1이 있다 (Gusa 등, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 39, No. 11, pp. 3871-3876 (2001)). 본 발명의 면역우세 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 펩티드를 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 면역우세 폴리펩티드와의 비교에 의해 동정하였다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 막 단백질의 아미노산 번호 16 내지 35에 상응하는 하기 서열을 동정하였고 합성 펩티드를 합성하기 위한 기재로서 이용하였다:
펩티드 I. 단백질 C-1, OK-2, OK-1 및 MO-3의 아미노산 번호 16 내지 35
AETKKTFGLEKNYDGAKIED (서열번호 1)
상동 유전자로부터의 하기 서열도 동정하였다:
펩티드 II. 단백질 MO-1의 아미노산 번호 16 내지 35
AETKRTFGLDKNYDGAQITD (서열번호 2)
본 발명의 또 다른 구체예는 하기 폴리펩티드를 제공한다:
펩티드 III.
AETKXTFGLXKNYDGAXIXD (서열번호 3),
여기에서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 3의 위치 5에 있는 X는 K 또는 R일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 3의 위치 10에 있는 X는 E 또는 D일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 위치 17의 X는 K 또는 Q일 수 있다. 여전히 본 발명의 또 다른 구체예에서, 위치 19의 X는 E 또는 T일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 하기 폴리펩티드를 제공한다:
펩티드 IV.
XAETKXTFGLXKNYDGAXIXD (서열번호 4),
여기에서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 일 구체예에서, 서열번호 4의 위치 1에 있는 X는 C이다. 본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 4의 위치 6에 있는 X는 K 또는 R일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 4의 위치 11에 있는 X는 E 또는 D일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 4의 위치 18에 있는 X는 K 또는 Q일 수 있다. 여전히 본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 4의 위치 20에 있는 X는 E 또는 T일 수 있다.
에르리키아
에인지
(
Ehrlichia
ewingii
) 폴리펩티드
폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 공유적으로 결합된 3개 이상의 아미노산의 중합체이다. 폴리펩티드는 번역-후 개질될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 세포 물질, 다른 유형의 폴리펩티드, 화학적 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용된 화학물질, 또는 이들의 조합물이 실질적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 제조물이다. 세포 물질, 배양 배지, 화학적 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용된 화학물질이 실질적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 제조물은 다른 폴리펩티드, 배양 배지, 화학적 전구체, 및/또는 합성에 사용된 다른 화학물질을 약 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 미만으로 지닌다. 따라서, 정제된 폴리펩티드는 약 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상으로 순수하다.
본 발명의 정제된 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 단편은 본 발명의 폴리펩티드의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 예로는 서열번호 1, 2, 3 및 4로 도시된 것들이 있다. 변이 폴리펩티드는 서열번호 1-4로 도시된 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%, 또는 약 90, 96, 98 또는 99% 동일하며, 본 발명의 폴리펩티드이기도 하다. 변이 폴리펩티드는 하나 이상의 보존적 아미노산 변이 또는 다른 소수 개질을 지니며 생물학적 활성을 보유하고, 즉 생물학적으로 기능적인 등가물이다. 생물학적으로 활성인 등가물은 상응하는 야생형 폴리펩티드와 비교해 볼 때 실질적으로 동등한 기능을 지닌다.
% 서열 동일성은 효능으로 인식된 기술이며 두 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열간의 동일성을 측정하기 위한 수많은 방법이 존재한다. 참조. 예컨대 Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991). 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 정렬하는 방법이 GCG 프로그램 패키지 (Devereux et al, Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al, J. Moke. Biol. 215:403 (1990)), 및 스미스 및 워터맨의 국소 상동성 알고리즘 (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))을 사용하는 베스트핏 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 포함하는 컴퓨터 프로그램에서 요약된다. 예를 들어, FASTA 알고리즘을 적용시키는 컴퓨터 프로그램 ALIGN이 -12의 갭 공개 페널티 및 -2의 갭 연장 페널티를 갖는 유사 갭 탐색을 지니며 사용될 수 있다.
특정 서열이 예를 들어 참조 서열과 약 95% 동일한지를 결정하기 위해 임의의 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 파라미터는 동일성 %가 참조 폴리뉴클레오티드의 전장에 걸쳐 산출되고 참조 뉴클레오티드에 있는 뉴클레오티드 총 수의 5% 이하의 동일성에서 갭이 허용되도록 설정된다.
변이체는 본 발명의 폴리펩티드 서열 중 하나를 개질시키고, 개질된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 이것이 생물학적 등가물인지를 결정함에 의해 일반적으로 동정될 수 있다. 변이체는 이것이 면역조직화학 검정, 효소-결합된 면역흡수 검정(ELISA). 방사면역검정(RIA), 면역효소 검정 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 검정에서 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동일하게 반응하는 경우, 예컨대 원래 폴리펩티드 활성의 90-110%를 지니는 경우에 생물학적 등가물이다. 일 구체예에서, 검정은 경쟁 검정이고, 여기에서 생물학적으로 동등한 폴리펩티드는 상응하는 반응성 항원 또는 항체에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 약 80, 95, 99 또는 100%까지 감소시킬 수 있다. 상응하는 야생형 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 변이 폴리펩티드에도 특이적으로 결합한다. 본 발명의 변이 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
보존적 치환은 아미노산이 유사한 특성을 지니는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것이며, 펩티드 화학 분야의 당업자는 폴리펩티드의 이차 구조 및 수치료 특성이 실질적으로 변화되지 않을 것임을 예상할 것이다. 일반적으로, 하기 그룹의 아미노산이 보존적 변화를 나타낸다: ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
본 발명의 폴리펩티드는 번역과 동시에 또는 번역 후에 단백질의 전달을 유도하는 시그널(또는 리더) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드(예컨대, 폴리-His)의 합성, 정제 또는 동정의 용이성을 위해, 또는 고체 지지체로의 폴리펩티드의 결합을 향상시키기 위해 링커 또는 다른 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 영역 또는 소 혈청 알부민에 컨주게이션될 수 있다.
폴리펩티드는 사실상 폴리펩티드와 보통은 무관한 아미노산 서열에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 추가로, 폴리펩티드는 아미노산 이외의 화합물 또는 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 지시 시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 종료 이동 서열, 트랜스막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 단백질 정제 리간드는 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 있는 하나 이상의 C 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 스페이서는 사실상 본 발명의 폴리펩티드와 일반적으로 무관한 아미노산 서열이다. 아미노산 스페이서는 약 1, 5, 10, 20, 100 또는 1000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
요망되는 경우, 폴리펩티드는 융합 단백질일 수 있고, 이는 아미노산 링커, 아미노산 스페이서, 시그널 서열, TMR 종료 이동 서열, 트랜스막 도메인, 및 단백질 정제에 유용한 리간드, 예컨대 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그, 및 스타필로코커스 단백질 A, 또는 이들의 조합물과 같은 다른 아미노산 서열을 함유할 수도 있다. 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드가 융합 단백질에 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 단편이 본 발명의 융합 단백질에 존재할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 이의 단편, 또는 이들의 조합물 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 다합체 형태일 수 있다. 즉, 폴리펩티드는 서열번호 1-4 또는 이들의 조합물의 하나 이상의 복사체를 포함할 수 있다. 다합 폴리펩티드는 다중 항원 펩티드 (MAP)일 수 있다. 참조, 예컨대 Tam, J. Immunol. Methods, 196: 17-32 (1996).
본 발명의 폴리펩티드는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 대해 반응성인 항체에 의해 인식되는 항원을 포함할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프 (즉, 항원 결정인자)를 포함할 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 연속 에피토프 또는 구조 에피토프일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드내 에피토프는 여러 가지 방법에 의해 동정될 수 있다. 참조, 에컨대 미국 특허 출원 제 4,554,101호; Jameson & Wolf, CABIOS 4:181-186 (1988). 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 단리되고 스크리닝될 수 있다. 전체 폴리펩티드 서열에 함께 걸쳐있는 일련의 짧은 펩티드는 단백분해 절단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 20-량체 폴리펩티드 단편으로 시작하여, 각 단편은 ELISA에서 인식되는 에피토프의 존재에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, EPISA 검정에서, 20-량체 폴리펩티드 단편과 같은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드는 플라스틱 다중-웰 플레이트와 같은 고체 지지체에 부착된다. 항체의 개체군을 표지하고, 고체 지지체에 첨가시켜 비-특이적 흡수가 차단되는 조건하에 비표지된 항원에 결합시키고, 임의의 결합되지 않은 항체 및 다른 단백질을 씻어 낸다. 예를 들어 무색 기질을 착색된 반응 생성물로 전환시키는 반응에 의해 항체 결합을 검출한다. 이후 관심있는 에피토프를 지도화하기 위해 동정된 20-량체로부터 점점 더 작고 중복되는 단편을 시험할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 발현 벡터에 도입하고, 이것을 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 적합한 발현 숙주 세포 시스템에서 발현시킬 수 있다. 다양한 세균, 효소, 식물, 포유동믈, 및 곤충 발현 시스템이 당 분야에서 이용가능하며 임의의 이러한 발현 시스템이 사용될 수 있다. 임의로, 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 무-세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 폴리펩티드는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 세포로부터 화학적으로 합성되거나 수득될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 기본적이고 신규한 특징은 이들이 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체에 특이적으로 결합하고 정제되거나 정제되지 않은 모든 에르리키아 단백질 보다 더 큰 감수성 및 특이성을 지니며 결합된다는 것이다.
본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 1-4에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 1-4를 갖는 폴리펩티드의 에피토프를 인식하는 항체 또는 다른 면역 반응 (예컨대, 면역 시스템의 T-세포 반응)을 유도할 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 서열번호 1-4에 도시된 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드의 단편일 수도 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 단편의 길이는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산일 수 있다.
에르리키아 에인지(
Ehrlichia ewingii
) 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전체 보다 적은 미생물 게놈을 함유하며 단일- 또는 이중-가닥 핵산일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 RNA 또는 DNA 또는 이들의 조합물일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단백질, 지질 및 다른 폴리뉴클레오티드와 같은 다른 성분들이 없도록 정제될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 정제될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 기술된 폴리펩티드를 엔코딩한다. 본 발명의 일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1-4에 도시된 폴리펩티드 또는 이들의 조합물을 엔코딩한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 링커, 시그널 서열, TMR 종료 이동 서열, 트랜스막 도메인, 또는 단백질 정제에 유용한 리간드, 예컨대 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그 및 스타필로코커스 단백질 A를 코딩하는 서열과 같은, 다른 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단리될 수 있다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 본래 관련이 있는 5' 및 3' 플랭킹 게놈 서열 중 하나 또는 둘 모두와 바로 연속되지 않는 천연-발생 폴리뉴클레오티드이다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 천연-발생 게놈에서 재조합 DNA 분자를 즉시 플랭킹하는 천연적으로 발견된 핵산 서열이 제거되거나 부재하는 경우, 예를 들어 임의 길이의 재조합 DNA 분자일 수 있다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 비-천연 발생 핵산 분자를 포함할 수도 있다. 예를 들어 cDNA 또는 게놈 라이브러리, 또는 게놈 DNA 제한 소화물을 함유하는 겔 슬라이스내에서 100개 내지 백만개의 다른 핵산 분자에 존재하는 핵산 분자는 단리된 폴리뉴클레오티드로 고려되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 단편을 포함할 수도 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전장 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 및 변이 또는 융합 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 퇴화 뉴클레오티드 서열, 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80, 또는 약 90, 96, 98 또는 99% 동일한 상동 뉴클레오티드 서열 및 이의 보체들도 본 발명의 폴리뉴클레오티드이다. % 서열 동일성은 "폴리펩티드" 섹션에서 기술된 대로 산출될 수 있다. 퇴화 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 엔코딩하나 유전자 코드의 퇴화로 인해 핵산 서열에 있어서 야생형 폴리뉴클레오티드 서열과 상이한 폴리뉴클레오티드이다. 생물학적으로 기능성인 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드를 엔코딩하는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리뉴클레오티드의 상보적인 DNA (cDNA) 분자, 종 상동체, 및 변이체도 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 감염된 개체의 혈액, 혈청, 타액 또는 조직과 같은 생물학적 샘플에 존재하는 핵산 서열로부터 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 자동 합성기를 이용하여 실험실에서 합성될 수도 있다. PCR과 같은 증폭 방법이 폴리펩티드를 엔코딩하는 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나 사실상 발생하지 않는 변경된 서열을 엔코딩할 수 있다. 요망되는 경우, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 복제원, 프로모터, 인핸서, 또는 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 다른 조절 인자를 포함하여, 발현 조절 인자를 포함하는 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 예를 들어 플라스미드, 예컨대 pBR322, pUC 또는 ColE1, 또는 아데노바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 타입 2 벡터 또는 타입 5 벡터일 수 있다. 임의로, 신드비스 바이러스, 시미안 바이러스 40, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 및 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스 벡터, 예컨대 뮤린 육종 바이러스, 마우스 유방 종양 바이러스, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 및 로우스 육종 바이러스를 포함하나 이로 제한되지 않는 다른 벡터를 사용할 수 있다. MC 및 MC1과 같은 미니염색체, 박테리오파지, 파지미드, 효모 인공 염색체, 세균 인공 염색체, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 코스미드 (파지 람다 cos 부위가 삽입된 플라스미드) 및 레플리콘 (세포에서 이들 스스로의 조절하에 복제할 수 있는 유전자 엘리먼트)이 사용될 수도 있다.
발현 조절 서열에 작동가능하게 결합된 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법 및 숙주 세포에서 이들을 발현시키는 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 참조, 예컨대 미국 특허 제 4,366,246호. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이것이 하나 이상의 발현 조절 엘리먼트에 인접하게 또는 가깝게 정위될 때 작동가능하게 연결되어, 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 유도한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 생물학적 샘플과 같은 샘플에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 프로브 또는 프라이머, 예를 들어 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드화되는 이러한 프로브 및 프라이머의 능력은 이들이 주어진 샘플에서 상보적인 서열의 존재를 검출하는데 이용될 수 있도록 할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 타액, 가래, 혈액, 소변, 배설물, 뇌척수액, 양수, 상처 삼출물, 또는 조직을 포함하는 생물학적 샘플과 같은 샘플에서 상보적인 서열에 하이브리드화될 수 있다. 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 겔 전기영동 또는 다른 크기 분리 기술로 처리될 수 있거나 크기 분리 없이 고정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 표지될 수 있다. 적합한 표지, 및 프로브 및 프라이머를 표지하는 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 새김눈 번역에 의해 혼입된 방사성 표지, 또는 키나아제, 비오틴 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 생체발광 표지, 금속 킬레이터 표지 및 효소 표지를 포함한다. 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드를 적합한 가혹성의 하이브리드화 조건하에 프로브 또는 프라이머와 접촉시킨다.
적용에 따라서, 다양한 하이브리드화 조건이 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 선택도를 변화시키기 위해 사용될 수 있다. 높은 선택성이 요구되는 적용의 경우, 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M 염의 염 농도에 의해 제공되는 바와 같이, 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건과 같은 비교적 엄격한 조건이 사용될 수 있다. 보다 적은 선택성이 요구되는 적용의 경우, 덜 엄격한 하이브리드화 조건이 사용될 수 있다. 예를 들어 염 농도는 약 0.14M 내지 약 0.9M 염이고, 온도는 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위이다. 프로브 또는 프라이머를 포함하는 하이브리드화된 복합체 및 시험 샘플로부터의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 존재는 샘플 중 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 나타낸다.
항체
본 발명의 항체는 본 발명의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 안정하게 결합되는 항체 분자이다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단쇄 항체 (scFv) 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 단편은 완전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 완전한 항체의 일부이고, 여기서 상기 일부에는 완전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인이 없다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편이 있다.
본 발명의 항체는 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 항체 부류일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프에 결합된다. 항체는 적합한 실험실 동물의 생체내에서 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 항체를 제조하고 특정하는 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 참조, 예컨대 Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992). 예를 들어, 폴리클로날 항체가 본 발명의 폴리펩티드를 인간 또는 다른 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 염소, 돼지, 개, 소, 양, 당나귀 또는 말과 같은 동물에게 투여함에 의해 제조될 수 있다. 면역된 동물로부터의 혈청을 수집하고 예를 들어 암모늄 설페이트를 이용한 침전에 이어 친화력 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피에 의해 혈장으로부터 항체를 정제한다. 폴리클로날 항체를 제조하고 프로세싱하는 기술은 당 분야에 공지되어 있다.
"특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"이란 폴리펩티드와 같은 제1 항원이 본 발명의 항체를 인식하고 다른 비-특이적인 분자보다 큰 친화력으로 이에 결합하는 것을 의미한다. 비-특이적인 분자는 제1 항원과 공통 에피토프를 공유하지 않는 항원이다. 예를 들어, 비-특이적 항원 보다 효과적으로 결합하는 항원에 대해 생성된 항체 (예컨대, 폴리펩티드)가 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 기술될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 서열번호 1-4로 구성된 폴리펩티드에 107 l/mol 이상의 결합 친화력 Ka로 특이적으로 결합한다. 특정 결합은 당 분야에 널리 공지된 방법론을 이용하여 예를 들어 효소-결합된 면역흡수 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA) 또는 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 시험될 수 있다.
추가로, 본 발명의 폴리펩티드 상에 존재하는 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 항체가 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드로 면역된 마우스와 같은 포유동물로부터의 정상적인 B 세포가, 예를 들어 HAT-민감성 마우스 골수종 세포에 융합되어 하이브리도마를 생성할 수 있다. 하이브리도마 생성 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체가 RIA 또는 ELISA를 이용하여 동정되고 반-고체 아가에서 클로닝시키고 희석을 제한함에 의해 단리될 수 있다. 클론 생성 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)-특이적인 항체를 또 다른 라운드의 스크리닝에 의해 단리한다. 모노클로날 항체는 표준 기술을 이용하여, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 미세역가 플레이트에 결합시키고 ELISA 검정에 의해 모노클로날 항체의 결합을 측정함에 의해 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하고 프로세싱하기 위한 기술이 당 분야에 공지되어 있다. 참조, 예컨대 Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975). 모노클로날 항체의 특정 이소형이 초기 융합물로부터 선택됨에 의해 직접 제조되거나, sib 선택 기술을 이용하여 부류-스위치 변이체를 단리시킴에 의해 상이한 이소형의 모노클로날 항체를 분비하는 어버이 하이브리도마로부터 부차적으로 제조될 수 있다. 참조, Steplewski et al, P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spria et al, J. Immunolog . Meth. 74:307, 1984. 본 발명의 모노클로날 항체는 재조합 모노클로날 항체일 수도 있다. 참조, 예컨대 미국 특허 제 4,474,893호; 미국 특허 제 4,816,567호. 본 발명의 항체는 화학적으로 구성될 수도 있다. 참조, 예컨대 미국특허 제 4,676,980호.
본 발명의 항체는 키메라 (참조, 예컨대 미국 특허 제 5,482,856호), 인간화 (참조, 예컨대, Jones et al., Nature 321:522 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Bio1. 2:593 (1992)), 또는 인간 항체일 수 있다. 인간 항체는 예를 들어 직접 무한증식화, 파지 디스플레이, 유전자이식 마우스, 또는 트리메라(Trimera) 방법에 의해 제조될 수 있다, 참조, 예컨대 Reisener et al., Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998).
에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 (예컨대, 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드)가 인간과 같은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염된 동물로부터의 혈청, 혈액, 소변 또는 타액과 같은 샘플 중 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원의 존재를 검출하는데 특히 유용하다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원에 대한 면역겸정은 하나의 항체 또는 수 개의 항체를 이용할 수 있다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원에 대한 면역검정은, 예를 들어 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 항체, 하나의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)의 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 항체의 조합물, 상이한 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드의 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 항체, 동일한 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원에 대해 유도된 폴리클로날 항체, 상이한 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원에 대해 유도된 폴리클로날 항체, 또는 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 조합물을 이용할 수 있다. 면역검정 프로토콜은 예를 들어 경쟁, 직접 반응, 또는 예를 들어 표지된 항체를 이용하는 샌드위치 타입 검정에 기초할 수 있다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 형광, 화학발광, 방사성, 효소, 콜로이드 금속, 방사동위원소 및 생체발광 표지를 포함하는, 당 분야에 공지된 임의의 유형의 표지로 표지될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 지지체에 결합되어 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 지지체로는 예를 들어 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 개질된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 마글레타이트가 있다.
본 발명의 항체는 면역친화력 컬럼에 의해 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 유기체 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원을 단리시키는데 추가로 이용될 수 있다. 항체는 예를 들어 흡수 또는 공유 결합에 의해 고체 지지체에 첨부될 수 있어서 항체가 이들의 면역선택적 활성을 보유한다. 임의로, 스페이서 그룹을 포함할 수 있어서 항체의 항원 결합 부위가 접근가능하게 유지된다. 고정된 항체는 이후 타액, 혈청, 가래, 혈액, 소변, 배설물, 뇌척수액, 양수, 상처 삼출물 또는 조직을 포함하는 생물학적 샘플과 같은 샘플로부터의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 유기체 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원에 결합하는데 이용될 수 있다. 결합된 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 유기체 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원은 예를 들어 pH의 변화에 의해 컬럼 매트릭스로부터 회수된다.
본 발명의 항체는 다양한 세포 사건 또는 생리적 조건 하에 본 발명의 폴리펩티드의 존재 및 분배를 분석하는 면역국소화 연구에 사용될 수도 있다. 항체는 수동 면역화에 수반되는 분자를 동정하고 비-단백질 항원의 생체분석에 수반되는 분자를 동정하는데 사용될 수도 있다. 이러한 분자의 동정은 백신을 개발하는데 유용할 수 있다. 예를 들어 모노클로날 항체 및 단쇄 항체를 포함하는 본 발명의 항체는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 의해 야기되는 질병의 완화 추이를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 동물로부터의 시험 샘플 중 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항원에 대한 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체의 증가 또는 감소를 측정함에 의해, 질병의 완화를 목적으로 하는 특정 치료 섭생이 효과적인지를 결정할 수 있다. 항체는 RIA, ELISA, 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 직접 결합 검정을 이용하여 검출되고/거나 정량될 수 있다.
검출 방법
본 발명의 방법은 생물학적 샘플, 주위 샘플 또는 실험실 샘플과 같은 시험 샘플에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 검출하는데 이용될 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어 말, 고양이, 개, 또는 인간과 같은 포유동물로부터의 혈청, 혈액, 세포, 혈장, 또는 조직을 포함할 수 있다. 시험 샘플은 본 발명의 폴리펩티드와 조합되기 전에 비처리되거나, 침전되거나, 분획화되거나, 분리되거나, 희석되거나, 농축되거나 정제될 수 있다.
이 방법은 폴리펩티드/항체 복합체, 즉 면역복합체가 형성될 수 있는 조건하에 본 발명의 폴리펩티드를 시험 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 샘플에 위치한 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체와 특이적으로 결합한다. 당업자는 항체/폴리펩티드 복합체 결합을 검출하는데 사용되는 검정 및 조건을 잘 알고 있다. 샘플 중 폴리펩티드 및 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체의 복합체의 형성이 검출된다.
본 발명의 항체는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염된 것이 의심되는 인간 또는 동물로부터 시험 샘플을 수득함에 의해 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 시험 샘플을 항체-항원 복합체 (즉, 면역복합체)가 형성될 수 있는 조건하에 본 발명의 항체와 접촉시킨다. 항체-항원 복합체의 양은 당 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 대조 샘플에서 형성된 것 보다 높은 수준이 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염을 나타낸다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 시험 샘플과 접촉시킬 수 있다. 포지티브 신체 샘플 중의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체는 적합한 조건하에 항원-항체 복합체를 형성할 것이다. 항체-항원 복합체의 양은 당 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체에 결합되는 효소 컨주게이트와 같은 지시 시약이 검출가능한 반응을 촉매작용하는 경우, 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다. 임의로, 시그널 발생 화합물을 포함하는 지시 시약이 폴리펩티드/항체/지시제 복합체를 형성시킬 수 있는 조건하에 폴리펩티드/항체 복합체에 적용될 수 있다. 폴리펩티드/항체/지시제 복합체가 검출된다. 임의로, 폴리펩티드 또는 항체를 지시 시약으로 표지시킨 후 폴리펩티드/항체 복합체를 형성한다. 이 방법은 포지티브 또는 네거티브 대조군을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 항체를 고체상 또는 기질에 부착시킨다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함하는 시험 샘플을 기질에 첨가하는 것이 가능하다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가한다. 항체는 고체상에 사용된 것과 동일한 항체이거나 상이한 공급원 또는 종으로부터 온 것이거나 지시 시약, 예컨대, 효소 컨주게이트에 결합될 수 있다. 각 첨가 이전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 발색단 또는 효소 기질이 첨가되고, 컬러가 나타나게 된다. 컬러 반응이 종료되고 예를 들어 분광광도계를 이용하여 컬러를 정량할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체를 고체상 또는 기질에 부착시킨다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함하는 시험 샘플이 기질에 첨가되는 것이 가능하다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제2 항-항체 종이 첨가된다. 이러한 제2 항체는 고체상 항체와 상이한 종으로부터 온 것이다. 제2 항체에 특이적으로 결합하고 고체상 항체에 특이적으로 결합하지 않는 제3 항-항체 종을 첨가한다. 제3 항체는 효소 컨주게이트와 같은 지시 시약을 포함할 수 있다. 각 첨가 이전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 발색단 또는 효소 기질이 첨가되고, 컬러가 나타나게 된다. 컬러 반응이 종료되고 예를 들어 분광광도계를 이용하여 컬러를 정량할 수 있다.
본 발명의 검정은 효소 결합된 면역흡수 검정(ELISA), 웨스턴 블롯, IFA, 방사면역검정(RIA), 적혈구응집 검정(HA), 형광 분극 면역검정(FPIA), 및 미세역가 플레이트 검정(미세역가 플레이트의 하나 이상의 웰에서 수행된 임의의 검정)을 포함하나 이로 제한되지 않는, 경쟁, 직접 반응 또는 샌드위치-형 검정에 기초한 것들을 포함하며, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 한 검정은 가역적인 흐름 크로마토그래피 결합 검정, 예를 들어 SNAP® 검정을 포함한다. 참조 미국 특허 제 5,726,101호.
검정은 고체상 또는 기질을 이용할 수 있거나 면역침전 또는 고체상을 이용하지 않는 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 고체상 또는 기질을 이용하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 미세역가 웰, 자기 비드, 비-자기 비드, 컬럼, 매트릭스, 막, 합성 또는 천연 섬유로 구성된 섬유질 매트 (예컨대, 유리 또는 셀룰로오스-기재 물질 또는 열가소성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에스테르), 미립자 물질로 구성된 소결 구조 (예컨대, 유리 또는 다양한 열가소성 중합체), 또는 니트로셀룰로오스로 구성된 주물 막 필름, 나일론, 폴리설폰 등 (사실상 일반적으로 합성임)과 같은 고체 지지체 또는 기질에 직접 또는 간접적으로 부착된다. 바람직한 기질은 일반적으로 다공성 폴리에틸렌으로 공지되어 있는, 예를 들어 크로멕스 코퍼레이션 (Chromex Corporation, Albuquerque, NM)으로부터의 10-15 미크론의 다공성 폴리에틸렌인, 폴리에틸렌의 소결된 미세 입자이다. 이들 기질 물질 모두는 필름, 시트 또는 플레이트와 같은 적합한 형상으로 사용될 수 있거나, 종이, 유리, 플라스틱 필름 또는 직물과 같은 적합한 불활성 담체 위로 코팅될 수 있거나 이에 결합되거나 적층될 수 있다. 고체상에 펩티드를 고정시키는 적합한 방법으로는 이온, 소수성, 공유 상호작용이 있다.
한 유형의 검정 포맷에서, 하나 이상의 폴리펩티드가 고체상 또는 기질 위에 코팅될 수 있다. 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 또는 이의 단편을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플을, 고체상의 폴리펩티드에 대한 시험 샘플의 항체 또는 고체상의 폴리펩티드에 대해 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체에 컨주게이션된 지시 시약 화합물의 항원/항체 복합체를 형성하기에 충분한 시간 및 조건하에, 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 컨주게이션된 시그널 생성 화합물을 포함하는 지시 시약과 함께 인큐베이션한다. 고체상에 대한 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체에 컨주게이션된 지시 시약의 결합의 감소를 정량적으로 측정할 수 있다. 확인된 네거티브 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 시험 샘플로부터 생성된 시그널과 비교하여 측정가능한 시그널에서의 감소는 시험 샘플 중 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체의 존재를 나타낸다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플 중 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체의 양을 정량할 수 있다.
또 다른 유형의 검정 포맷에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 지지체 또는 기질위에 코팅한다. 본 발명의 폴리펩티드가 지시 시약에 컨주게이션되어 시험 샘플에 첨가된다. 이 혼합물을 지지체 또는 기질에 적용한다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체가 시험 샘플에 존재하는 경우, 이들은 지지체 상에 고정된 지시 시약 및 폴리펩티드에 컨주게이션된 폴리펩티드와 결합할 것이다. 이후, 폴리펩티드/항체/지시제 복합체가 검출될 수 있다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플 중 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체의 양을 정량할 수 있다.
또 다른 유형의 검정 포맷에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 지지체 또는 기질위에 코팅한다. 시험 샘플을 지지체 또는 기질에 적용하고 인큐베이션한다. 고체 지지체를 세척액으로 세척함에 의해 샘플로부터 결합되지 않은 성분을 세척하여 제거한다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체가 시험 샘플에 존재하는 경우, 이들은 고체상에 코팅된 폴리펩티드와 결합할 것이다. 이러한 폴리펩티드/항체 복합체를 지시 시약과 컨주게이션된 제2 종-특이적인 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 폴리펩티드/항체/항-항체 종 지시제 복합체를 이후 검출할 수 있다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플 중 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체의 양을 정량할 수 있다.
폴리펩티드/항체 복합체 또는 폴리펩티드/항체/지시제 복합체의 형성은 방사선측정, 색 측정, 형광측정, 크기-분리, 또는 침전 방법에 의해 검출될 수 있다. 임의로, 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 시그널 생성 화합물을 포함하는 지시 시약과 커플링되는 제2 항체의 첨가에 의해 이루어진다. 폴리펩티드/항체 복합체와 결합되는 시그널 생성 화합물(표지)을 포함하는 지시 시약은 상기 기술된 방법을 이용하여 검출될 수 있고, 색소원 작용제, 효소 컨주게이트와 같은 촉매, 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 화합물, 디옥세탄, 아크리디늄, 페난트리디늄, 루테늄 및 루미놀과 같은 화학발광 화합물, 방사성 엘리먼트, 직접 가시 표지, 및 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다. 효소 컨주게이트의 예로는 알칼리 포스페이트, 양고추냉이 과산화효소, 베타-갈락토시다제 등이 있다. 특정 표지의 선택은 중요하지 않으나, 이것은 자체적으로 또는 하나 이상의 추가 물질과의 컨주게이션에 의해 시그널을 생성할 수 있을 것이다.
복합체의 형성은 시험 샘플 중 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법은 환자에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염을 진단하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 시험 샘플 중 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체의 양 또는 분량을 나타낼 수도 있다. 효소 컨주게이트와 같은 다수의 지시 시약을 이용하는 경우, 존재하는 항체의 양은 생성되는 시그널에 비례한다. 시험 샘플의 유형에 따라서, 이것은 적합한 완충 시약으로 희석되거나, 농축되거나, 임의의 조작없이 고체상에 접촉할 수 있다. 예를 들어, 존재하는 항체의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해서는, 이것이 미리 희석된 시험 혈청 또는 혈장 샘플이거나 소변과 같은 농축 표본인 것이 바람직하다.
본 발명은 샘플 중 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 또는 항체 단편, 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii), 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드를 검출하기 위한 검정 키트 (예컨대, 제조품)를 추가로 포함한다. 키트는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 및 샘플에서 항-에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 또는 항체 단편에 대한 폴리펩티드의 결합을 결정하기 위한 수단을 포함한다. 키트 또는 제조품은 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 및 샘플에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합을 결정하기 위한 수단을 포함할 수도 있다. 키트는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체, 및 예컨대 포유동물에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염을 동정하기 위해 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체를 사용하기 위한 지침서를 함유하는 장치를 포함할 수 있다. 키트는 키트의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체가 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염을 동정하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 표지를 포함하는 패키징 물질도 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 완충액, 대조군 등과 같은 다른 성분들이 상기 시험 키트에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 검정, 및 키트는 예를 들어 환자에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염의 개개 경우를 진단하고, 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 발발의 역학을 연구하는데 유용하다.
본 발명의 폴리펩티드 및 검정은 다른 유기체와 함께 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)의 존재를 검출하기 위해 다른 폴리펩티드 또는 검정과 병용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 및 검정은 심장충 및/또는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 및/또는 아나플라스마 파고사이토필라(Anaplasma phagocytophila) 및/또는 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis)를 검출하기 위한 시약과 조합될 수 있다.
에르리키아
에인지(
Ehrlichia ewingii
)에
의해 야기된 질병의 치료, 경감 또는 예방 방법
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 항체는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 의해 야기된 질병을 치료, 경감 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 단편과 같은 항체를 인간과 같은 동물에게 투여할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 항체 또는 이의 단편을 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 동물에게 투여한다. 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 치료적 유효량은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염의 징후를 완화시키거나 피검체에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 유기체의 양을 감소시키는데 효과적인 양이다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 면역원성 조성물로서 존재할 수 있으며 숙주에서 면역 반응을 일으키는데 사용될 수 있다. 면역원성 조성물은 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 조성물은 동물의 면역 시스템을 민감하게 하여 결과적으로 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염 효과를 완화시키거나 예방하는 면역 반응을 생성하는데 특히 유용하다. 동물 모델에서 면역 반응의 유도는 예를 들어 최적 용량 또는 투여 경로를 결정하는데 유용할 수 있다. 면역 반응의 유도는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 의해 야기된 질병 또는 감염을 치료, 예방 또는 경감시키는데 사용될 수도 있다. 면역 반응은 체액성 면역 반응 또는 세포 매개된 면역 반응, 또는 이들의 조합을 포함한다. 면역 반응은 예컨대 디펜신의 생성을 촉진함에 의해 전반적인 숙주 반응을 촉진하는 것을 포함할 수도 있다.
에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 대해 동물에 의한 항체 역가의 생성은 감염으로부터의 보호 및 감염의 제거에 중요할 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 전달 후 항체 역가의 검출 및/또는 정량은 항체 역가를 유도하는데 특히 효과적인 에피토프를 동정하는데 사용될 수 있다. 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 대한 강력한 항체 반응을 책임지는 에피토프가 상이한 길이의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드에 대한 항체를 유도함에 의해 동정될 수 있다. 특정 폴리펩티드 에피토프에 의해 유도된 항체는 이후 예를 들어 ELISA 검정을 이용하여 폴리펩티드가 강력한 반응을 생성함에 있어서 가장 효과적인 에피토프를 함유하는지를 결정함에 의해 시험될 수 있다. 이후 이러한 에피토프 또는 에피토프를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 구성할 수 있고 강력한 항체 반응을 유도하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 항체를 마우스, 토끼, 기니아 피그, 짧은꼬리원숭이, 비비, 침팬지, 인간, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이와 같은 포유동물, 또는 닭이나 오리와 같은 동물에 투여하여 생체내 항체를 유도할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 주입은 구성 및 개질의 단순성에 있어서 실제적인 이점을 지닌다. 추가로, 폴리뉴클레오티드의 주입은 숙주에서 폴리펩티드의 합성을 초래한다. 따라서, 폴리펩티드가 원시 번역-후 개질, 구조 및 형태를 지니는 숙주 면역 시스템에 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 "네이키드(naked) DNA"로서 피검체에게 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 항체의 투여는 근내, 정맥내, 페내, 근내, 진피내, 복막내, 또는 피하 주사, 에어로졸, 비강내, 주입 펌프, 좌제, 점막, 국소, 및 경구를 포함하며, 생물학적 탄도 총("유전자 총")을 이용하는 주입을 포함하는, 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 항체는 경구 투여를 위해 단백질 담체와 동반될 수 있다. 투여 방법을 조합하여 사용하여 면역 반응을 유도할 수도 있다. 항체는 약 0.5 mg 내지 약 200 mg의 매일 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 항체는 약 20 내지 약 100 mg의 매일 용량으로 투여된다.
치료용의 약제학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985)]에 개시되어 있다. 담체는 숙주에게 유해한 항체의 생성을 자체적으로 유도해서는 안된다. 이러한 담체로는 큰, 서서히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 다당류, 예컨대 라텍스 작용기화된 SEPHAROSE®, 아가로오스, 셀룰로오스, 셀로로오스 비드 등, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 예컨대 폴리글루탐산, 폴리라이신 등, 아미노산 공중합체, 펩토이드, 리피토이드, 및 불활성 무독성 바이러스 입자 또는 세균 세포가 있으나, 이로 제한되지 않는다. 리포솜, 하이드로겔, 시클로덱스트린, 생체분해가능한 나노캡슐, 및 생체접착제가 본 발명의 조성물에 담체로서 이용될 수도 있다.
약제학적으로 허용되는 염을 본 발명에 조성물에 이용할 수도 있으며, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 또는 설페이트와 같은 무기염 뿐만 아니라 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 또는 벤조에이트와 같은 유기산의 염이 있다. 특히 유용한 단백질 기질로는 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오브알부민, 파상풍 톡소이드, 및 당업자에게 널리 공지된 다른 단백질이 있다. 본 발명의 조성물은 물, 염수, 포스페이트 완충된 염수, 링커액, 행크스액, 글루코오스, 글리세롤, 덱스트로오스, 말로덱스트린, 에탄올 등과 같은 액체 또는 부형제를 단독으로 또는 조합하여 함유하고, 습윤제, 에멀젼화제, 긴장성 조정제, 세척제, 또는 pH 완충제와 같은 물질을 함유할 수도 있다. 살균제와 같은 추가의 활성제를 사용할 수도 있다.
요망되는 경우, B7-1 또는 B7-2와 같은 림프구 또는 MIP1α, GM-CSF, IL-2 및 IL-12와 같은 사이토킨으로의 면역원 제시를 향상시키는 공-자극성 분자를 본 발명의 조성물에 포함시킬 수 있다. 임의로, 애주번트가 조성물에 포함될 수도 있다. 애주번트는 특이적 면역 반응을 비특이적으로 증가시키는데 사용될 수 있는 물질이다. 일반적으로, 본 발명의 애주번트 및 폴리펩티드는 면역 반응에 제공되지 전에 혼합되거나 별도로 제공되나, 동물의 동일한 부위에 제공된다. 애주번트는 예를 들어 오일 애주번트 (예컨대, 프로인트 완전 및 불완전 애주번트) 무기염 (예컨대, Alk(SO4)2; AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), 실리카, 알룸, Al(OH)3 및 Ca3(PO4)2), 폴리뉴클레오티드 (즉, 폴릭(Polyic) 및 폴리 AU 산), 및 특정 천연 물질 (예컨대, 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 왁스 D 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 및 브루셀라 속의 막에서 발견되는 물질)을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 애주번트로는 MF59-0, 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, 노르-MDP로서 언급됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835A, MTP-PE로서 언급됨), 및 2% 스쿠알렌/TWEEN® 80 에멀젼 중에 세균에서 추출된 세 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로오스 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI가 있으나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 섭취될 수 있는 정제, 구강 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 주사가능한 제형, 마우스워시, 덴트리피스 등으로 제형화될 수 있다. 상기 조성물 및 제조물 중의 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 항체의 비율은 0.1% 내지 60%의 단위 중량으로 다양할 수 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 항체의 투여는 동물에서 적어도 1주, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 이상 지속되는 면역 반응을 유도할 수 있다. 임의로, 면역 반응은 일차 주사 후 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년 이후에 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 항체의 1회 이상의 추가 접종 주사를 제공함에 의해 동물에서 지속될 수 있다. 요망되는 경우, 공-자극성 분자 또는 애주번트가 조성물 이전, 이후 또는 이와 함께 제공될 수도 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 이들의 조합물을 포함하는 본 발명의 조성물을 사용되는 특정 조성물에 적합한 수단으로 예를 들어 ELISA에 의해 검출되는 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 투여한다. 폴리뉴클레오티드는 비비, 침팬지, 개, 또는 인간과 같은 포유동물에게 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 1000 ng/kg, 0.001 mg/kg, 0.1 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 용량으로 근내 주사될 수 있다. 폴리펩티드 또는 항체는 포유동물에게 0.01, 0.05, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5 또는 10 mg/kg의 용량으로 근내 주사될 수 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 항체, 또는 이들의 조합물은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염되지 않은 동물에게 투여될 수 있거나, 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)-감염된 동물에게 투여될 수 있다. 조성물 중 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체의 특정 투여량은 종류, 연령, 성별, 동반 약물치료, 조성물이 투여되는 포유동물의 일반적인 상태, 및 조성물의 투여 방법을 포함하나 이로 제한되지 않는 많은 인자에 의존적일 것이다. 본 발명의 조성물의 유효량은 일상적인 실험만을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
본원에 예시를 위해 기술된 본 발명은 본원에 구체적으로 기술되지 않은 임의의 엘리먼트 또는 엘리먼트들, 제한 또는 제한들 없이도 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각 경우에 "포함하는", "필수적으로 구성된" 및 "구성된"이라는 표현 중 어떠한 것도 이들의 통상의 의미를 유지하면서 다른 두 용어로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현들은 서술 용어로서 제한 없이 사용된 것이고, 상기 용어 및 표현들의 사용에서 제시되거나 기술된 임의의 특징 또는 이의 일부를 지닌 등가물을 제외하려는 의도가 아니며, 다양한 개질이 청구된 본 발명의 범위내에서 가능한 것으로 이해된다. 따라서, 비록 본 발명이 바람직한 구체예에 의해 구체적으로 기술되었으나, 본원에 기술된 개념의 임의의 특징, 개질 및 변형이 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 그러한 개질 및 변형은 설명 및 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위내에서 고려되는 것임을 이해하여야 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹 또는 대안적인 다른 그룹에 의하여 기술된 경우, 당업자는 본 발명이 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 임의의 개별적인 멤버 또는 멤버의 서브그룹에 의해 그렇게 기술된 것임을 이해할 것이다.
하기는 예시를 목적으로 제공된 것이며 상기 넓은 용어로 기술된 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 본 설명에 인용된 모든 참조문헌이 본원에 참조로서 포함된다.
실시예
1: 항-
컨주게이트
종을
지시제로서
이용한 검정 결과
3개의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 포지티브 및 3개의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 네거티브 개 샘플을 싱클레어 리서치 (Sinclair Research, Columbia, MO)로부터 수득하였다. 포지티브 및 네거티브 샘플을 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 전혈 용해물을 항원 공급원으로서 이용하여 아이덱스 레버러토리스 서비시즈 레퍼런스 레버러토리에 의한 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) IFA를 이용하여 에르리키아 항체에 대해 시험하였다. 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 항체에 대한 종-특이적인 혈청 검정에서 혈액이 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) IFA에 반응성이고 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 항체에 비반응성인 동물은 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 이외의 에르리키아 감염과 관련된 것으로 의심된다. 후속하여 샘플을 허가 된 IDEXX SANP® 3Dx® 시험을 이용하여 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis)에 대한 항체에 대하여 시험하였고, 샘플은 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 항체에 대해 네거티브인 것으로 나타났다. 검정 결과를 표 I에 제시한다.
에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)-항체 미세역가-플레이트 기재 면역검정 결과를 서열번호 1로 제시된 합성 펩티드를 이용하여 수득하였다. 합성 펩티드를 미세역가 웰 상에 고정하고 희석된 시험 샘플을 미세역가 웰에 첨가시켜 결합되지 않은 항체를 세척에 의해 제거하였다. 고정된 펩티드에 결합된 항체를, 개, 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase, HRPO) 컨주게이트의 경우에, 항-종과 반응시키고, 세척하고, HRPO 기질을 첨가시킴에 의해 검출하였다. 개별적인 미세역가 웰의 광학 밀도를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다. 이 결과를 표 I에 제시한다.
실시예
2:
에르리키아
에인지
(
Ehrlichia
ewingii
) 합성 펩티드 (서열번호 1) 컨주게이트를
지시제로서
이용한 검정 결과
3개의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 포지티브 및 3개의 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 항체 네거티브 개 샘플을 싱클레어 리서치로부터 수득하였다. 포지티브 및 네거티브 샘플에 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 전혈 용해물을 IFA 슬라이드에 대한 항원 공급원으로서 이용하여 아이덱스 레버러토리스 서비시즈 레퍼런스 레버러토리에 의해 결정된 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) IFA 역가를 공급하였다. 후속하여 IFA 샘플을 허가된 IDEXX SANP? 3Dx? 시험을 이용하여 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis)에 대한 항체에 대하여 시험하였고, 샘플은 에르리키아 카니스(Ehrlichia canis) 항체에 대해 네거티브인 것으로 나타났다.
에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)-항체 미세역가-플레이트 기재 면역검정 결과를 서열번호 1로 제시된 합성 펩티드를 이용하여 수득하였다. 합성 펩티드를 미세역가 웰 상에 고정하고 이를 양고추냉이 과산화효소(HRPO)의 경우에, 지시 시약과 컨주게이션시켰다. 시험 샘플 및 면역검정 펩티드/지시제를 코팅된 미세역가 웰에 첨가하고, 이것을 인큐베이션하고 세척하였다. 고정된 펩티드 및 펩티드/지시 시약에 결합된 항체를 미세역가 웰에 고정시켰다. 이 복합체를 HRPO 기질 시약을 첨가하여 검출하였다. 개별적인 미세역가 웰의 광학 밀도를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다. 이 결과를 표 II에 제시한다.
표 I. 고체 지지체상에 코팅된 에르리키아 에인지 ( Ehrlichia ewingii ) 펩티드 (서열번호 1) 및 항-개/검출용 지시제를 이용하여 미세역가 플레이트-기재 ELISA 결과에 대한 IFA 역가 결과 비교
표 II. 고체 지지체상에 코팅된 에르리키아 에인지 ( Ehrlichia ewingii ) 펩티 드 (서열번호 1) 및 에르리키아 에인지 ( Ehrlichia ewingii ) 펩티드 (서열번호 1)/검출용 지시제를 이용하여 미세역가 플레이트-기재 ELISA 결과에 대한 IFA 역가 결과 비교
SEQUENCE LISTING
<110> O'Connor, Thomas P.
<120> Peptides for Detection of Antibody to Ehrlichia ewingii
<130> 04-838
<140> 11/063027
<141> 2005-02-22
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Ehrlichia ewingii
<400> 1
Ala Glu Thr Lys Lys Thr Phe Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Asp Gly Ala
1 5 10 15
Lys Ile Glu Asp
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Ehrlichia ewingii
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<211> 20
<212> PRT
<213> Ehrlichia ewingii
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X is any amino acid
<400> 3
Ala Glu Thr Lys Xaa Thr Phe Gly Leu Xaa Lys Asn Tyr Asp Gly Ala
1 5 10 15
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20
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> Ehrlichia ewingii
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid
<400> 4
Xaa Ala Glu Thr Lys Xaa Thr Phe Gly Leu Xaa Lys Asn Tyr Asp Gly
1 5 10 15
Ala Xaa Ile Xaa Asp
20
Claims (34)
- 서열번호 3으로 구성된 정제된 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 정제된 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 서열번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 3으로 구성되는 정제된 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 다합체 형태인 정제된 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 담체를 추가로 포함하는 정제된 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 지시 시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 종료 이동 서열, 트랜스막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합된 정제된 폴리펩티드.
- 삭제
- 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩티드를 포함하는 정제된 융합 폴리펩티드.
- 제 8항에 있어서, 폴리펩티드 중 1종 이상이 다합체 형태인 정제된 융합 폴리펩티드.
- 제 8항에 있어서, 정제된 융합 폴리펩티드가 지시 시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 시그널 서열, 종료 이동 서열, 트랜스막 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물을 포함하는 정제된 융합 폴리펩티드.
- 제 3항의 정제된 폴리펩티드를 엔코딩하는 정제된 폴리뉴클레오티드.
- 제 8항의 정제된 융합 폴리펩티드를 엔코딩하는 정제된 폴리뉴클레오티드.
- (a) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 구성된 정제된 폴리펩티드를 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체를 포함하는 것으로 의심되는 시험 샘플과 폴리펩티드/항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 접촉시키고;(b) 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 것을 포함하며,여기에서 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하는 것을 나타내고, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하지 않는 것을 나타내는, 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법
- 제 13항에 있어서, (a)의 복합체를 (b)를 수행하기 전에 지시 시약과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 시험 샘플 중의 항체의 양이 결정되는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 기질에 부착되는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 지시 시약에 부착되는 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 지시 시약이 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)를 포함하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 다합체 형태인 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4를 포함하는 융합 단백질인 방법.
- 제 21항에 있어서, 상기 폴리펩티드 중 1종 이상이 다합체 형태인 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 시험 샘플이 포유동물로부터 수득된 생물학적 샘플을 포함하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 상기 포유동물이 인간, 고양이, 말 및 개로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 방법이 미세역가 플레이트 검정, 가역적인 흐름 크로마토그래피 결합 검정, 효소 결합된 면역흡수 검정, 방사면역검정, 적혈구응집 검정, 웨스턴 블롯 검정, 형광 분극 면역검정, 및 간접 면역형광 검정으로 구성된 검정의 군으로부터 선택된 검정을 포함하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 표지된 항-항체 종을 이용하여 검출되는 방법.
- (a) 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염된 것으로 의심되는 포유동물로부터 생물학적 샘플을 수득하고;(b) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4를 포함하는 정제된 폴리펩티드를 생물학적 샘플과 폴리펩티드/항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 접촉시키고;(c) 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 것을 포함하며,여기에서 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 포유동물이 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염된 것을 나타내고, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 포유동물이 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)에 감염되지 않은 것을 나타내는, 포유동물에서 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 감염을 검출하는 방법.
- 제 27항에 있어서, (b)의 폴리펩티드/항체 복합체를 (c)를 수행하기 전에 측정가능한 시그널을 생성하는 지시 시약과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제 27항에 있어서, 상기 포유동물이 인간, 고양이, 말 및 개로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4인 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드의 1종 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체.
- 제 30항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 항체 단편인 항체.
- (b) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4를 포함하는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드의 1종 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 샘플과 폴리펩티드/항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 접촉시키고;(c) 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 것을 포함하며,여기에서 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드가 샘플에 존재하는 것을 나타내고, 폴리펩티드/항체 복합체의 부재는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드가 샘플에 존재하지 않는 것을 나타내는, 샘플 중 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii) 폴리펩티드 또는 에르리키아 에인지(Ehrlichia ewingii)를 검출하는 방법.
- 제 32항에 있어서, 상기 하나 이상의 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 항체 단편인 방법.
- 제 32항에 있어서, 상기 샘플이 혈청, 전혈, 소변 또는 타액인 방법.
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