KR101321203B1 - 신선초 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신선초박 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신선초 착즙시 발생하는 다량의 부산물을 추출, 농축, 정제 공정을 통해 기능성분인 고함량 신선초박 추출물을 제조하여 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신선초박 추출물은 원물인 신선초의 착즙액에 비해서도 우수한 췌장베타세포 보호 활성과 혈당조절 활성에 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 신선초박 추출물은 당뇨병 예방, 개선 및 치료의 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신선초 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 개선용 조성물{Anti-diabetic composition comprising Angelica Keiskei Koid. extracts}

본 발명은 신선초 추출물을 포함하는 당뇨병의 예방 및 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신선초 녹즙의 착즙 후, 잔여물인 신선초박으로부터 수용성 성분을 제거한 신선초박 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 및 개선용 조성물에 관한 것이다.

우리 몸에 흡수된 탄수화물은 근육, 지방, 간 등의 조직에서 주로 췌장베타세포로부터 분비된 인슐린 작용에 의해 흡수된 후 연소되어 에너지를 생산한다. 따라서 인슐린은 체내 당 대사의 평형을 담당함으로써 혈중 당 농도를 조절한다. 당뇨병은 유전, 자가 면역, 비만, 과식 등의 유전적, 환경적인 요인으로 인하여 췌장베타세포로부터 인슐린 분비가 정상적으로 이루어지지 못하거나 말초 조직에서 인슐린 저항이 발생하여 분비된 인슐린에 반응하는 민감도가 감소하여 발생하는 당대사 이상으로 인한 고혈당이 근본적인 원인으로 고혈당이 지속됨에 따라 대사상의 변화가 초래된다.

현재 사용되고 있는 당뇨병 치료제는 대부분이 인슐린 주사제와 경구투여용으로 사용하는 혈당강하제이다. 경구투여용으로 사용되고 있는 혈당강하제는 다음의 다섯 종류인데 Biguanide의 일종인 metformin, 핵수용체의 일종인 peroxisome proliferator-activated receptors(PPARγ)에 직접적으로 작용하여 활성화시키는 thiazolidinedione계열의 pioglitazone과 rosiglitazone, 소장에서 탄수화물의 흡수에 관여하는 효소인 α-glucosidase의 활성을 억제함으로써 식후 혈당치가 상승하는 것을 억제하는 기능의 α-glucosidase 저해제, 그리고 췌장베타세포의 인슐린 분비를 촉진시키는 sulfonylureas와 non-sulfonylureas이다. 최근 핵수용체 PPARγ의 직접적인 활성제인 thiazolidinedione, pioglitazone 계열의 약물들이 간독성을 일으킨다는 결과들이 보고되면서 안전성에 대한 문제가 제기된 바 있다.

따라서 자연에 존재하고 지금까지 주로 식품으로 섭취하여 안전성이 입증되면서 동시에 기능성을 갖추고 있는 천연물에 대한 관심이 급증하고 있는 추세이다. 따라서 천연물 유래 혈당 조절 기능성 소재에 대한 탐색과 과학적인 연구가 활발히 이루어지고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 우수한 혈당 조절 효과를 가지며 안전하게 적용될 수 있는 천연물질을 탐색하는 연구를 수행하던 중, 미나리과 식물인 신선초(Angelica Keiskei Koid.)의 녹즙 착즙 후 발생하는 부산물인 신선초박을 이용하여, 이로부터 수용성 성분을 제거하는 정제 공법을 적용하여 신선초박 추출물을 제조하고, 상기 추출물이 우수한 혈당 조절 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신선초 착즙시 발생하는 부산물로부터 추출한 신선초박 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 신선초박 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신선초박 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 신선초박의 유기용매 추출물을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 추출물에 물을 첨가하여 수용성 성분을 제거하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 수용성 성분이 제거된 추출물을 탄소수 1 내지 6의 알코올을 첨가하여 알코올 용해 분획을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 당뇨병 예방, 개선 및 치료활성을 가지는 신선초박의 비수용성 분획물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 검토한다.

본 발명의 조성물은 신선초박 추출물을 유효성분으로 포함하며, 당뇨병에 대해서 우수한 예방, 개선 및 치료 효과를 가지고 있다.

본 발명에서 신선초박은 신선초의 착즙 과정에서 나오는 부산물을 말한다. 착즙은 고체성 혹은 반유동성 원료로부터 액즙을 분리하는 과정으로 예를 들어 대상물을 파쇄 후 압착기로 압착 착즙하는 것을 말한다. 신선초박은 착즙 후 잔류 고형성분을 나타낸다.

본 발명의 신선초박 추출물은 바람직하게는 신선초박의 유기용매 추출물로 이의 비수용성 분획이다.

바람직하게는 본 발명의 신선초박 추출물은

(a) 신선초박의 유기용매 추출물을 제조하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 추출물에 물을 첨가하여 수용성 성분을 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

이를 각 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

(a) 단계는 신선초박의 유기용매 추출물을 제조하는 단계이다.

본 단계에서 신선초박은 당업계에 공지된 용매 추출법에 의해 추출될 수 있다. 추출 용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 아세톤, 에틸아세테이드, n-핵산, 디에틸에테르, 아세톤, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 탄소수 1개 내지 6개의 알코올 또는 이의 혼합용매로 추출할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올을 용매로 추출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 에탄올을 용매로 이용하여 추출하였으며, 그 수율을 향상시키기 위하여 100% 에탄올을 용매로 이용하였다. 추출시간은 이에 제한되지는 않으나, 1 내지 20시간동안 추출할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 15시간동안 추출하며, 더욱 바람직하게는 12 내지 13시간동안 추출할 수 있다. 또한, 추출 온도는 이에 제한되지는 않으나, 25℃ 내지 75℃에서 추출할 수 있고, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 60℃에서 추출할 수 있으나, 75℃ 초과에서는 안정도가 떨어져 추출 공정의 수행이 어려워 바람직하기 않으며, 25℃ 미만에서는 추출효율이 떨어져 바람직하지 않다.

(b) 단계는 상기 (a) 단계의 추출물에 물을 첨가하여 수용성 성분을 제거하는 단계이다.

본 단계에서는 수용성 성분을 제거하여 비수용성 침전물을 수득하기 위한 단계이다. 수용성 성분을 제거하기 위한 방법은 당업계에서 공지된 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어, 과량의 물을 첨가하고, 교반하여 수용성 성분이 물에 녹도록 하여 제거할 수 있다. 또한 물을 첨가하고 이의 정제과정에서 수용성 성분을 제거, 즉 이에 제한되지는 않으나, 여과지를 이용한 분리, 한외여과막을 이용한 분리 및 크로마토그래피에 의한 분리, 탈색 과정 중에 제거할 수 있다. 또한, 치소필터로 여과하여 침전물을 수득하고, 이를 다시 물과 혼합하여 다시 여과하는 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 신선초박 추출물은 (c) 상기 (b) 단계의 수용성 성분이 제거된 추출물을 탄소수 1 내지 6의 알코올을 첨가하여 알코올 용해 분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

즉, 본 발명의 신선초박 추출물은

(a) 신선초박의 유기용매 추출물을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 추출물에 물을 첨가하여 수용성 성분을 제거하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 수용성 성분이 제거된 추출물을 탄소수 1 내지 6의 알코올을 첨가하여 알코올 용해 분획을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 (a), (b) 단계는 상기 기재한 바와 같으며, (c) 단계는 상기 (b) 단계의 수용성 성분이 제거된 추출물을 탄소수 1 내지 6의 알코올을 첨가하여 알코올 용해 분획을 수득하는 단계이다.

알코올의 첨가로 본 발명의 유효성분의 함량이 높아지며, 다른 비활성성분을 추가적으로 제거할 수 있는 효과가 있다. 알코올은 바람직하게는 탄소수 1 내지 6의 알코올, 더 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 가장 바람직하게는 에탄올을 이용할 수 있다. 알코올에는 흡습성 등 물리화학적 성질을 반영하기 위하여 소량의 물(예를 들어, 95% 에탄올, 99% 에탄올의 형태)이 첨가된 형태일 수도 있다. 처리온도 및 시간은 비활성성분의 제거의 목적이 달성되는 한 특별히 제한되지는 않으나, 30℃ 내지 50℃에서 30분 내지 12시간동안 처리할 수 있다.

아울러, 상기 (b) 단계의 수용성 물질의 제거 및 (c) 단계의 알코올의 추가 처리로 본 발명의 신선초박 추출물의 관능이 개선되어 이의 활용성이 높아지는 효과가 있다.

한편, 본 발명의 신선초박 추출물의 제조시 처리, 보관 등의 용이함을 위하여 농축 및 정제과정, 여과 과정, 건조과정, 동결과정, 분말화 과정이 임의로 추가될 수 있다.

농축 과정은 이에 제한되지는 않으나, 침전농축, 증발농축, 감압농축, 한외여과법, 역삼투법 및 원심분리법을 이용하여 농축할 수 있으며, 여과 과정은 이에 제한되지는 않으나 여과망 또는 마이크로필터를 이용한 여과, 원심분리 및 분액깔때기를 이용할 수 있다. 건조 과정은 이에 제한되지는 않으나, 동결 건조 또는 분무 건조일 수 있고, 덱스트린 포접 등의 과정에 의해 분말화될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 신선초박의 추출을 위하여 유효 조건들을 확립하고, 본 발명의 다른 실시예에서는 이를 바탕으로 하여 신선초박 추출물, 보다 구체적으로는 신선초박의 에탄올 추출물의 비수용성 분획을 제조하였다.

본 발명의 실험 예에서는 상기에서 제조된 신선초박 추출물을 생쥐 유래 근육세포에 첨가하여 배양하였고, streptozotocin으로 유도된 당뇨모델 마우스에 투여하여 당뇨병의 예방, 개선 및 치료효과를 확인하였다. 그 결과, 비투여 대조군 및 신선초 착즙액 투여 대조군에 비해서 신선초박 추출물의 근육세포 내 포도당 흡수치를 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며(도 1), 비투여 대조군 및 신선초 착즙액 투여 대조군에 비해서 공복시 우수한 혈당 감소 조절 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 2). 아울러, 비투여 대조군 및 신선초 착즙액 투여 대조군에 비해서 신선초박 추출물의 혈당상승 억제 효과가 보다 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 3).

본 발명의 조성물은 신선초박 추출물을 유효성분으로 포함하며, 혈당 조절에 대해서 우수한 예방, 개선 및 치료 효과를 가지고 있다. 따라서, 본 발명은 신선초박 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다.

상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 건강식품으로는 신선초박 추출물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 신선초박 추출물과 당뇨병에 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 신선초박 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 신선초박 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 신선초박 추출물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.1 내지 90 중량%이다. 더 바람직하게는, 본 발명의 신선초박 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물은 특히, 당뇨병에 효과가 있는 것으로 알려진 활성 성분과 함께 혼합하여 건강식품의 형태로 제조될 수 있다.

아울러, 본 발명은 신선초박 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방, 개선 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물의 경우에는 상기 신선초박 추출물을 단독으로 포함하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed. Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 '경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성 성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화 할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 신선초박 추출물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 신선초박 추출물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 신선초박 추출물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 신선초박 추출물의 당뇨병의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

나아가, 상기 약학 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화 할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재 되어 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신선초박 추출물은 원물인 신선초 착즙액에 비해서도 우수한 당 흡수 및 혈당 조절 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 췌장베타세포를 보호하는 활성과 혈당조절 활성이 우수한 신선초박 추출물을 유효성분으로 하는 조성물 또는 이를 포함하는 조성물을 이용하여 당뇨병의 예방 개선 및 치료의 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 대조군(이하 '대조군'로 표시), 신선초 착즙액 투여군(이하 '신선초 착즙액'으로 표시), 신선초박 추출물 투여군(이하 '신선초 농축액'로 표시) 처리에 따른 근육세포 L6 내 당유사체의 흡수율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 신선초 착즙액 및 신선초박 추출물 처리에 따른 Streptozotocin으로 유도된 당뇨모델의 공복시 혈당 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 신선초 착즙액 및 신선초박 추출물 처리에 따른 Streptozotocin으로 유도된 당뇨모델의 경구 당부하검사 (Oral Glucose Tolerance Test) 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

신선초(박) 추출물 제조의 최적 조건 설정

본 발명의 신선초박 추출물 제조를 위한 최적의 조건을 설정하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. 본 발명에서 신선초박 추출물 제조를 위한 원물로는 신선초 녹즙 제조시 착즙하고 남은 고형성분의 부산물(신선초박)을 이용하였으며, (a) 신선초박을 탄소수 1개 내지 6개의 알코올 및 이와 물의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출하는 단계; (b) 상기 추출물을 농축하는 단계; (c) 상기 농축물에서 수용성 성분을 제거하는 정제 단계를 포함하는 방법에 따라 제조하였다. 보다 자세히 하기와 같다.

< 신선초(박)을 이용한 추출물 공정 수립>

1. 추출 용매, 시간 및 온도

1) 추출용매에 따른 추출효율 시험

추출용매에 따른 추출효율을 비교하기 위하여 정제수, 30% 에탄올, 60% 에탄올 및 100% 에탄올로 추출하였으며, 그 결과 정제수로 추출한 경우 에탄올 추출에 비하여 수율이 매우 떨어지는 것을 확인하였다. 에탄올 추출의 경우 100% 에탄올로 추출한 경우 가장 효율이 높은 것으로 나타났다.

2) 추출시간에 따른 추출효율 시험

추출시간에 따른 추출효율을 비교하기 위하여 추출시간을 5시간, 10시간, 15시간 및 20시간으로 하여 추출하였다. 그 결과 10시간과 15시간 사이에서 추출효율이 가장 크게 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 10시간에서 15시간까지 1시간 간격으로 추출 시간을 설정하여 비교하였다. 그 결과 12시간에서 13시간 동안 추출하는 경우가 가장 효율이 높은 것으로 나타났다.

3) 추출온도에 따른 추출효율 시험

추출온도에 따른 추출효율을 비교하기 위하여 추출온도를 실온, 25℃ 및 75℃로 하여 추출하였으며, 그 결과 온도가 높아질수록 고형물의 함량이 증가하기는 하나 75℃ 이상은 안정도가 떨어져 공정 수행이 어려워 50℃ 내지 60℃가 적합한 것으로 나타났다.

2. 농축 및 여과

가장 효율적인 농축 농도를 확립하기 위하여 상기 추출된 추출물을 1/2비율, 1/5비율 및 최대로 비율을 달리하여 농축을 실시하였다. 그 결과 농축율이 높아짐에 따라 고형물의 생성도 함께 증가하기는 하나 최대로 농축하는 경우 회수시 손실분이 발생하므로 1/5의 비율이 적합한 것으로 확인되었다.

유효성분 회수를 위한 여과공정을 최적화하기 위하여 20메쉬 여과망 또는 마이크로필터를 이용한 여과, 원심분리 및 분액깔때기를 이용한 여과를 실시하였다. 그 결과 원심분리의 경우 회수 효율은 높으나 회수시 다량의 손실분이 발생하며, 분액깔때기의 경우 분리 시간이 길며 용량이 적고 정밀분리가 어려운 것으로 나타났다. 여과망을 이용한 경우 20메쉬 여과망은 회수율이 적고, 마이크로필터를 이용하는 경우 회수율이 양호하며 작업 효율이 높은 것을 확인하였다.

3. 분리 및 정제

에탄올로 추출한 추출물을 감압농축방법으로 농축하여 불용성 침전물을 회수 건조하여 알콜에 녹이고 여과지로 여과 후 농축 건조하여 비수용성 성분을 수득하고 상기 불용성 침전물을 회수하고 남은 용액을 농축 건조하여 수용성 성분을 수득하는 방법으로 수용성 성분과 비수용성 성분을 분리하였다.

추출 용매로는 물, 에탄올 및 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 아세톤, 에틸아세테이드, n-핵산, 디에틸에테르, 아세톤, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 상기의 추출물에 대해 당업계에 공지된 농축장치, 농축법을 이용하여 농축하고 농축물에 대해 수용성 성분을 제거하기 위해 여과지를 이용한 침전물 분리, 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리, 탈색과정 등의 정제공정을 적용하였다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 2>

본 발명의 방법에 의한 신선초박 추출물제조

<2-1> 신선초박 추출물의 제조

신선초의 착즙 후의 부산물에 300중량%의 에탄올을 투입하여 교반하면서 열을 가하여 55℃에서 12시간 동안 추출하였다. 추출액을 이송관을 통하여 이송시키면서 이송관 내에서 1mesh에서 150mesh까지 여과하였으며, 여과 후 증발건조기(evaporator)를 이용하여 40브릭스(brix)로 저온 농축하여 에탄올 성분을 제거하고 이를 다시 60브릭스까지 55℃에서 농축시켰다.

상기 용액에서 석출된 성분을 치소필터에 85 ml/min의 속도로 통과시켜 침전물을 여과, 회수하였다. 회수 침지된 성분을 85℃에서 6시간 탈수 반응을 진행시켜 수분을 제거하였다.

회수된 침전물에서 비수용성 성분의 함량을 높이기 위해 침전물의 10배수의 물을 첨가하고 이를 80℃에서 2시간 가열 교반 한 후 냉각하여 물을 제거하고 동결 건조하는 방법으로 수용성 성분을 제거하였다.

또한, 추출물의 비수용성 성분을 더욱 높이기 위하여 다시 에탄올(95%)을 침전물의 15배수로 첨가한 다음 용액을 40℃에서 1시간동안 교반하였고, 이를 치소필터로 여과하여 신선초박 추출물을 얻었다.

이를 감압 농축 한 후 동결건조 하여 이하의 동물실험에 사용하였다.

< 실험예 1>

시험관내 ( in vitro ) 근육세포의 당흡수능 측정

<1-1> 시험시료의 제조

상기 실시예 2에서 제조된 본 발명의 신선초박 추출물의 근육세포 내 포도당 흡수능 비교 실험을 위한 시료는 다음과 같이 제조하였다. 500g의 일정량 신선초을 압착하여 착즙하여 착즙액을 획득 후 동결 건조하여 분말화한 후 무게를 측정하였다 (이하 신선초 착즙액으로 표시한다). 다음으로 착즙 후 발생하는 신선초박은 상기 실시예 1의 방법에 따라 가공하여 신선초박 추출물으로 제조한 후 무게를 측정하였다(이하 신선초박 추출물으로 표시한다). 500g의 신선초로부터 발생한 착즙액은 350g으로 고형분 5% 이며, 신선초박 150g으로부터 최종 생산한 신선초박 추출물은 10g으로 일정량의 신선초로부터 발생한 신선초 착즙액과 신선초박 추출물을 시험시료로 하였다.

<1-2> 시험관내 ( in vitro ) 근육세포의 당흡수능 측정

상기 실시예 2에서 제조된 혼합물을 시험물질로 하여 10 % FBS가 함유된 DMEM으로 24-well plate(melanin 정량)에 생쥐 유래 근육세포 L6 rat myocyte 세포를 1 X 10⁵cells/ml(final volume 3ml)으로 넣고 37℃ , 10% CO₂ incubator에서 24시간 배양한다. 배양 후 배지를 제거하고 DMEM 배지에 시험물질을 첨가하여 1일간 처리한다. 24시간 배양 후 형광 표지인자가 결합된 당유사체 2-NBDG 2-[N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino]-2- Deoxy-D-Glucose을 Serum-free DEME에 용해시킨 다음 30분 동안 세포에 처리하였다. 세포 내 흡수된 당유사체 2-NBDG의 형광세기를 측정하기 위하여 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 다음 RIPA 버퍼를 이용하여 용해시킨 후 Spectrofluorometer를 이용하여 다음의 파장(Ex: 475 nm; Em: 550 nm)에서 측정하였다. 측정한 값은 무처리 대조군을 기준으로 다음의 수학식을 이용하여 환산하였다. 수치들은 세 번 수행된 실험의 평균±S.D.로 나타내었다. 별표(*)는 무처리 대조군과 비교하여 유의적으로 감소함을 의미한다 (*: p<0.05, **: p<0.01).

실험결과, 도 1에 나타난 것과 같이, 신선초 착즙액은 대조군 대비 약 1.1배 당흡수를 촉진시킨 것에 비해 신선초박 추출물의 근육세포 내 포도당 흡수치를 약 1.6배로 유의적으로 높게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2>

Streptozotocin 으로 유도된 당뇨모델을 이용한 항당뇨 효과

<2-1> 실험동물 및 식이

상기 실시예 2에서 제조된 본 발명의 신선초박 추출물의 항당뇨 효과를 확인하기 위하여, C57BL/6J male(5주령)구입하여 일정한 온도 (25℃)와 습도 (50±5%)하에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. Streptozotocin(70㎎/㎏)을 복강내에 투여하였다. 주사 2일 후 쥐꼬리에서 채혈하여 공복시 혈당을 측정하였고 측정 결과 당뇨병 진단기준 (대한당뇨병학회 기준) 126㎎/dL 이상인 동물을 시험군으로 선정하였다. 정상군과 실험군은 각각 7마리씩 사용하였으며 정상군, 대조군 (시료 무처리군), 신선초 착즙액 투여군, 신선초박 추출물 투여군(100㎎/60㎏ 농도 동일함)으로 분류하였다. 시험물질은 경구(oral gavage) 투여하였으며 공복시 혈당과 체중, 음수량, 사료 섭취량을 주 2회 측정하며 총 5주간 실험을 진행하였다(한국영양학회지(Korean J Nutr) 2010; 43(4): 333~ 341).

<2-2> 혈당변화

주 2회 공복시 혈당을 꼬리에서 채혈하여 상용의 혈당 측정기(한독약품)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 총 4주간 실험기간 동안 대조군이 당뇨 유발 초기 평균 공복시 혈당 220㎎/dL 이상에서 지속적으로 상승하여 약 1.2배로 높아진 것으로 나타났으며, 신선초 착즙액은 초기 공복시 혈당을 기준으로 백분율로 환산한 결과 약 10% 의 감소율을, 신선초박 추출물은 약 39%의 감소율을 보여주는 것으로 나타냄으로써 신선초박을 활용한 신선초박 추출물의 혈당조절 효과가 보다 우수한 것을 확인할 수 있었다.

<2-3> 경구 당부하검사 ( Oral Glucose Tolerance Test )

단기간 혈당조절 능력을 시험하기 위하여 4주의 처리 후에 마우스를 공복 시키고 glucose (0.2g/kg)를 경구투여한 후 혈액샘플을 여러 시간 별로(0-120min) 꼬리에서 체혈하여 혈당을 측정하여 실험군과 대조군을 비교하였다.

실험결과 도 3에 나타난 바와 같이 신선초 착즙액 투여군에 비해 신선초박 추출물 투여군의 혈당이 상당히 감소하는 결과를 보여주었고, 이로써 신선초박을 활용한 신선초박 추출물의 혈당상승 억제 효과가 보다 우수한 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 신선초박 추출물은 원물인 신선초의 착즙액에 비해서도 우수한 포도당 흡수 능력 및 혈당 상승 억제 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 신선초박 추출물은 당뇨병 예방, 개선 및 치료의 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (6)

1. (a) 신선초 착즙 후의 부산물인 신선초박의 탄소수 1 내지 6의 알코올 추출물을 제조하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 추출물에 물을 첨가하여 수용성 성분을 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 신선초박의 비수용성 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 개선용 식품 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 신선초박의 비수용성 분획물은
   (a) 신선초박의 탄소수 1 내지 6의 알코올 추출물을 제조하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계의 추출물에 물을 첨가하여 수용성 성분을 제거하는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계의 수용성 성분이 제거된 추출물을 탄소수 1 내지 6의 알코올을 첨가하여 알코올 용해 분획을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
   
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