KR101317215B1

KR101317215B1 - 환자맞춤형 혈전용해도/혈전용해저항도 측정방법

Info

Publication number: KR101317215B1
Application number: KR1020100012962A
Authority: KR
Inventors: 김동억
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2010-02-11
Publication date: 2013-10-15
Also published as: KR20110093116A

Abstract

본 발명은 환자맞춤형 혈전용해도 또는 혈전용해저항도의 측정방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 응고효소 인지 펩타이드에 형광물질이 부착된 프로브, 상기 프로브를 혈액과 혼합하여 제조한 혈전, 상기 혈전을 포함하는 측정용 조성물 또는 혈전용해도 또는 혈전용해저항도 측정용 키트 및 상기 혈전을 사용하여 시험물질의 혈전용해도 또는 혈전용해저항도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

환자맞춤형 혈전용해도/혈전용해저항도 측정방법 {Measuring methods for thrombolysis and thrombolytic resistance customized to individual patients}

혈전은 생체 내 반응 중 자연스럽게 생성과 분해가 평형을 이루고 있는 대사과정의 산물로서 혈액의 응고와 관련이 있다. 혈액응고는 혈관벽의 손상, 수술 후 혈류속도의 변화에 따른 혈액 내 혈소판 수의 증가, 피브리노겐 (fibrinogen)의 증가 등 혈액조성에 변화가 생겼을 때 발생할 수 있다. 혈전의 생성은 손상된 혈관 내피세포에 혈소판이 부착하여 피브린(fibrin)을 형성하면서 시작된다. 혈전의 치료제는 혈전의 생성을 억제하거나 생성된 혈전을 용해시키는 작용을 하며 혈전의 생성을 억제하는 약물로는 헤파린, 안크로드, 와파린 등이 있으며, 혈전을 용해하는 약물로는 플라스민 (plasmin)을 활성화 시키거나 간접적으로 혈전을 용해시키는 유로키나제 (urokinase) 등이 있다.

혈전은 지혈작용의 일환으로 생기는 물질이며 지혈은 혈관벽이 손상되어 혈액이 유출되면 이를 방지하기 위하여 혈관이 수축하고 내경이 좁아지며 혈액응고 인자들이 관여하여 혈액을 응고시킴으로서 발생한다. 지혈과정은 크게 4단계로 나눌 수 있는데 1)혈관의 수축, 2)혈소판의 응집으로 생기는 혈전형성, 3)혈액응고, 4)응고된 혈액 내 섬유성 조직의 증식 순으로 일어난다. 즉, 혈관 상처부위에서 노출된 콜라겐 (collagen)에 혈소판과 조직이 모여 혈액응고가 시작되며 이 부위에 섬유성 조직이 증식하여 혈관이 막히게 되며, 이렇게 형성된 혈전은 뇌졸증과 같은 뇌 혈관계 질환의 원인이 되기도 한다. 일단 상처 등으로 노출된 콜라겐 주위로 혈소판이 모여들어 혈소판 뭉치가 커지면 혈소판의 코헤전 (cohesion)이 일어나며 아라키도닉산 (arachidonic acid)의 유리 및 산화가 일어나고 혈소판의 재정비가 일어나 혈전을 형성하는데, 이렇게 혈전이 생성됨과 동시에 혈액응고가 일어나는 과정에는 많은 인자가 관련한다.

이러한 혈액응고 과정의 산물이 피브린이며, 또한 혈관 내 혈액응고나 혈전의 생성 시 생체 내에는 스스로 이를 분해하는 기전이 있는데, 여기에 플라스민 (plasmin)이라는 세린 프로테아제 (serine protease)가 관여한다. 플라스민 (plasmin)은 피브리노겐 (fibrinogen)이나 피브린 (fibrin)을 용해시켜 혈액응고를 억제하며 간에서 유리되는 헤파린 (heparin)은 트롬빈 (thrombin)의 작용을 억제하여 항응고작용을 나타낸다.

혈전의 생성원인은 아직까지 정확하게 밝혀진 바 없으나 파종성혈관내응고병증 (disseminated intravascular coagulation, DIC)과 같은 선천적 유전질환, 신체의 노화에 따른 생리적 기능의 변화, 스트레스 등이 그 원인으로 지목되고 있으며, 특히 현대인의 과다한 업무로 인한 스트레스는 혈액응고기전에 관여하는 인자의 양에 변화를 일으켜 비정상적인 혈전을 일으키는 원인 중의 하나로 지목되고 있다.

혈전증으로 인한 심근경색, 뇌경색 등은 전체 사망률의 1/3을 차지하는 중요한 질환이다. 혈관 내에서 생성된 혈전이 체내혈전용해시스템 (endogenous thrombolysis system)을 통해 녹지 않고 커져서 혈관을 막으면 혈류가 급차단되고, 차단된 혈류가 공급하던 심장이나 뇌 세포가 산소/영양분 공급을 받지 못하게 되면서 급성 심근경색 또는 뇌경색 증상이 시작된다.

혈전용해저항성은 체내혈전용해시스템과 치료제로 주입된 혈전용해 제에 저항해 혈전이 녹지 않고 견디는 성질을 의미하며, 혈전용해저항성이 높을수록 혈전이 심근경색 / 뇌경색 증상을 유발시키거나 발생한 심근경색 / 뇌경색이 치료되지 않아 장애 또는 사망을 야기할 가능성이 높아진다.

이런 환자에 대한 응급 치료로서 혈전용해제를 정맥 또는 동맥으로 투여하는 방법이 사용된다. 혈전용해제를 이용한 급성기 뇌경색의 혈전용해치료 중 가장 대표적인 것은 1995년에 보고된 NINDS rt-PA 연구를 통해 FDA에서 승인된 rt-PA (recombinant tissue plasminogen activator)의 정맥 내 투여 및 PROACT II study 등을 통해 보고된 프로 유로 카이네이즈 (prourokinase) 를 이용한 동맥 내 혈전 용해술이다.

이러한 혈전용해치료는 뇌경색의 치료에 많은 기여를 하였으나 또한 제한점이 있는데, 예를 들어 혈관의 불완전한 재개통이나 시간적인 제약 및 치명적인 출혈합병증 등이 그것이다.

이에 본 발명자들은 어떤 혈전용해제가 환자에게 적합한 것인지 또는 어떠한 실험 물질이 상기 혈전용해 효과를 가지고 있거나 영향을 미치는 지를 테스트하는 방법을 개발하기 위해 본원 발명을 고안하였다.

본 발명의 목적은 응고효소 인지 펩타이드에 형광물질이 부착된 프로브, 상기 프로브를 혈액과 혼합하여 제조한 혈전, 상기 혈전을 포함하는 혈전용해도/혈전용해저항도 측정용 조성물 또는 키트 및 상기 혈전을 사용하여 시험물질의 혈전용해도/혈전용해저항도를 측정하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 환자맞춤형 혈전용해도 또는 혈전용해저항도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FXIII (factor 13) 응고효소 인지 펩타이드 (Ac-GNQEQVSPLTLLKWC-OH)에 형광물질이 부착된 프로브 (probe)를 제공한다. 상기 형광물질은 FITC, Cy3, Cy3.5, Texas-Red, Alexa-680, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy3B 등이 있으며, 바람직하게는 Cy5.5인 것을 특징으로 하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 일례로, FXIII (factor 13) 응고효소 인지 펩타이드 (Ac-GNQEQVSPLTLLKWC-OH)에 Cy5.5가 부착된 프로브인 Cy-F15 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형광 물질이 부착된 프로브와 혈액을 혼합하여 제조한 혈전을 제공한다. 혈전의 제작은 연구자들 사이에 사용되고 있는 방법들에 프로브를 섞는 변형된 방법을 사용할 수 있다. (The method used to prepare a white embolus was adapted and modified from Overgaard et al., 1992; J Cereb Blood Flow Metab. 1992 May;12(3):484-90. title: A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli., Overgaard K, Sereghy T, Boysen G, Pedersen H, Høyer S, Diemer NH.). 상기 혈액은 검사하고자 하는 개체와 동종의 개체로부터 사용할 수 있으나, 피검자의 혈액인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 일례로, 혈전의 제조 시에 프로브의 혼합이 혈전용해에 영향을 주고 있는 지에 관한 혼동효과 (confounding effect)를 모니터 할 수 있도록 1종 이상의 다중 농도의 프로브 (multi-concentration probe)가 포함될 수 있다.

한편, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 혈전을 포함하는 환자맞춤형 혈전용해도/저항도 측정용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 혈전은 피검자의 혈액과 형광물질 Cy5.5가 부착된 프로브를 혼합하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 환자맞춤형 측정용 키트를 제공한다. 상기 측정용 키트로는 예를 들면, 상기 혈전을 사용하여 시험물질의 혈전용해도 또는 혈전용해저항도를 측정하는 키트 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 측정용 키트는 상기 혈전을 사용하여 환자에게 적합한 혈전용해제 또는 혈전용해도에 직간접적으로 영향을 미치는 심뇌혈관계 약제 및 물질 중 환자에게 적합한 약제 및 조합 또는 대조군의 혈전용해도 또는 혈전용해저항도를 측정 또는 선별하는 데 활용될 수 있다.

다른 한편으로, 본 발명은 환자맞춤형 혈전용해도 또는 혈전용해저항도를 측정하는 방법을 제공한다. 이하 본 발명에 대해서 상세히 설명한다.

a) 채취된 혈액을 준비하는 단계;

b) 상기 혈액으로부터 혈전을 제작하는 단계;

c) 상기 혈전을 사용하여 시험물질의 혈전용해도 또는 혈전용해저항도를 측정하는 단계;

를 포함하는 환자맞춤형 혈전용해도 또는 혈전용해저항도 측정방법을 제공한다.

상기 a) 단계의 혈액 채취는 검사하고자 하는 개체와 동종의 개체에서 이루어지는 질 수 있으며, 바람직하게는 피검자의 혈액이 채취될 수 있다.

상기 b) 단계의 혈전의 제조는, 일례로 FXIII (factor 13) 응고효소 인지 펩타이드에 형광물질이 부착된 프로브를 혈액과 혼합하여 제조될 수 있다. 보다 자세하게, 상기 프로브 (probe)를 합성하는 일례로, 혈장 내FXIII (factor 13) 응고효소에 의해 그물망구조 (meshwork)를 형성함으로써 혈전의 구조를 튼튼하게 하는 섬유소 (fibrin) 사이 사이에, 형광물질이 부착되어 있으면서 FXIII 응고효소에 의해 인지되는 프로브를 혼합하여 제조될 수 있다. 이는 형광시그널을 방출할 수 있도록 하는 첫 단계로서 FXIII 응고효소인지 (FXIII enzyme recognizing) 펩타이드 (Ac-GNQEQVSPLTLLKWC-OH) 에 형광물질이 부착된 프로브 (probe)를 합성한다. 상기와 같이 혈전 내부 fiber (meshwork)들 사이 사이에 형광물질이 삽입됨으로써 테스트하고자 하는 혈전용해제의 효과를 분자수준에서 보다 예민하고 정교하게 반영하는 것이 가능하다.

상기 프로브 (probe)의 합성법은 관련문헌 (Tung et al. ChemBioChem 2003)에 적시된 방법에 따라 제조 될 수 있다. 상기 형광 물질에는 FITC, Cy3, Cy3.5, Texas-Red, Alexa-680, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy3B 등이 있으며, 바람직하게는 Cy5.5인 것을 특징으로 하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일례로, 상기 프로브는 Cy5.5가 부착된 Cy-F15 probe를 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

혈전의 제작은 연구자들 사이에 사용되고 있는 방법들에 프로브를 섞는 변형된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. (The method used to prepare a white embolus was adapted and modified from Overgaard et al. (1992). J Cereb Blood Flow Metab. 1992 May;12(3):484-90. title: A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli.authors: Overgaard K, Sereghy T, Boysen G, Pedersen H, Høyer S, Diemer NH.). 일례로 먼저, 혈액을 준비하여, 일정 혈액에 합성 제작한 프로브를 섞고 폴리에틸렌 튜브(polyethylene tube)안에 보관을 함으로써 혈전을 제작한다. 상기 프로브는 Cy-F15의 혼합자체가 혈전용해에 영향을 주고 있는 지에 관한 혼동효과 (confounding effect)를 모니터 할 수 있도록 1종 이상의 다중 농도의 프로브(multi-concentration probe) 형태로 포함될 수 있다.

또한, 용기에 혈장과 상기에서 제작된 혈전을 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 혈장은 검사하고자 하는 개체와 동종의 개체로부터 사용할 수 있으나, 피검자의 혈장인 것이 바람직하다.

또한, 생체조건에 보다 근접한 혈전용해도 또는 혈전용해저항도 측정이 가능하도록 용기에 특정세포를 코팅하는 단계를 더 포함 할 수 있다. 상기 용기는 웰 플레이트 (well plate)가 바람직하다.

상기 c) 단계의 시험물질의 경우 상기의 용기에 시험 물질 또는 대조시약을 섞는다. 즉, 상기의 시험 물질은 측정하고자 하는 혈전용해제를 포함한다. 또한, 일부 용기에는 형광 측정을 위한 기준 (control)으로 쓰일 다양한 농도의 형광 물질을 혈전 없이 섞어 두는 것을 더 포함할 수 있다.

상기 c) 단계의 혈전용해도 또는 혈전용해저항도를 측정하는 단계는 시험 물질 투여 전, 투여 후 수 시간에 거쳐 다양한 시간 대에 용기의 컬러형상과 형광형상을 획득하고, 용기 내 반응액의 헤모글로빈 농도 및 형광강도를 측정하는 것을 더 포함한다. 상기 헤모글로빈은 농도는 혈전용해도를 반영하는 2차 지표이다.

상기 형광강도의 측정은 형광분자영상 기기를 이용하여 혈전용해에 따라 정량적으로 분리되어 반응액에 흘러나온 형광과 용해되지 않고 남아 있는 혈전에서 방출되는 형광을 다양한 간격의 조리개 노출로 영상화하는 것을 포함한다. 또한, 혈전과 반응액에서 방출되는 형광은 영상처리소프트웨어를 이용하여 정성/정량 분석하며, 이와 더불어 반응액을 형광도 측정기(fluorometer)를 이용하여 직접 정량할 수 있다. 상기와 같은 형광 시그널 감지방법을 이용함으로써 미세한 감수성 차이까지 예민하게 측정 가능하도록 해 줄 수 있다.

상기 헤모글로빈 농도는 혈전에서 분리되어 반응액에 흘러나온 것으로 변형된 혈색소량 측정방법 (modified cyanomethemoglobin method, Van Assendelft et al., 1984)를 따라 수행하는 것이 바람직하다. 보다 자세하게 cyanomethemoglobin 시약과 반응액을 혼합하고 일정시간 상온에서 반응시킨 후 ELISA를 이용해 흡광도를 측정하는 것을 포함한다. 시험 물질 또는 대조 시약을 투여 전 측정한 값과 이들을 투여한 시간대별로 측정한 값의 차이를 퍼센트로 계산하는 것이 바람직하다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면, 일반인의 혈액으로부터 혈전용해도/혈전용해저항도를 측정함으로써 심근경색 / 뇌경색 등을 유발하는 혈전증 (symptomatic thrombosis) 위험도를 추정할 수 있을 것이며, 항혈전제 또는 항응고제 복용 등을 통해 심근경색/뇌경색 예방 치료를 받고 있는 환자의 혈액으로부터 혈전용해도 또는 혈전용해저항도를 측정함으로써 치료 적절성을 평가하고 약물 변경 등의 치료 방침을 결정하는데 도움을 줄 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따르면, 기존의 또는 새로 개발되는 항혈전제, 항응고제, 혈전용해제 및 혈전용해저항성에 영향을 미칠 수 있는 다양한 기타 약제 (예: 항암제)가 피험자 또는 실험동물의 혈전용해 저항도에 미치는 영향을 평가하는 데 사용됨으로써 신약개발에 기여할 수 있고,키트(kit)를 쉽게 자동기계화 시킬 수 있으므로, 이를 통해 고속 처리 분석(high throughput analyses)이 되도록 하면 상기 효과를 극대화 시킬 수 있을 것이다.

도 1은 24 well plate에 분주해 놓은 반응액과 혈전들을 나타낸다
도 2는 tPA를 이용한 혈전용해실험의 육안 (A) 및 형광영상 (B) 소견이다.
도 3은 tPA 투여 후 시간에 따른 Cy-F15 20 nM을 섞은 혈전 주위 반응액의 신호강도 변화를 나타낸다.
도 4는 tPA 투여 후 시간에 따른 혈전 주위 반응액 내의 헤모글로빈 농도변화를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

Cy-F15 probe 합성

피검자 혈장 내 FXIII (factor 13) 응고효소에 의해 그물망구조(meshwork)를 형성함으로써 혈전의 구조를 튼튼하게 하는 섬유소 (fibrin) 사이 사이에, 형광물질 Cy5.5를 혼합하여 제조하였다. 이는 형광시그널을 방출할 수 있도록 하는 첫 단계로서 ‘FXIII 응고효소-인지 (FXIII enzyme recognizing) 펩타이드 (Ac-GNQEQVSPLTLLKWC-OH)’에 형광물질 Cy5.5가 부착된 Cy-F15를 합성하였다. 합성법은 논문 (Tung et al. ChemBioChem 2003)을 참조하였다.

혈전 제작

혈전 제작은 연구자들 사이에 사용되고 있는 방법들에 Cy-F15를 섞는 변형된 방법을 사용하였다. 먼저 500μl의 혈액을 준비하였다. 100μl의 혈액, 100μl의 혈액에 각각 2μM 및 20μM의 Cy-F15가 섞인 혈액 100μl 씩을 30cm 길이의 polyethylene tube (PE-10 or PE-50) 안으로 3 ml 주사기를 이용하여 빨아올린 후 2시간 동안 실온 보관 후 22시간 동안 4°C에 보관하였다. 나머지 혈액 200μl를 3000 rpm에서 10분간 원심분리하고 혈장을 채취하여 -80°C에서 보관하였다. 또한, Cy-F15 probe를 2μM 및 20μM dual concentration을 사용함으로써 Cy-F15 probe의 mixing 자체가 혈전용해에 영향을 주고 있는 지에 관한 confounding effect를 모니터링 할 수 있었다.

세포 코팅

2% 자가 혈장이 포함된 0.15M PBS 250μl를 well plate또는 필요한 경우 테스트하고자 하는 세포인 혈관내피세포가 코팅되어 있는 well plate 에 분주하였다. 혈전이 만들어진 tube를 5cm 길이로 절단하고 tube 안에 있는 혈전을 생리식염수로 세척한 후 well plate에 분주해 놓은 PBS 위에 부유시켰다.

실험 물질 투여

각각의 well plate에 시험 약제로 혈전용해제인 5 μg/ml 농도의 tissue plasminogen activator (tPA) 또는 대조 (control) 시약으로 동량의 생리식염수를 섞었다. 일부 well plate에는 형광 측정 (calibration)을 위한 기준(standard)으로 쓰일 다양한 농도의 cy5.5 fluorochrome을 혈전 없이 혈장을 PBS 용액에 섞어 두었다 (혈장+PBS).

형광 강도 측정

시험 약제 투여 전, 투여 후 수 시간에 거쳐 다양한 시간대에 well plate의 컬러영상과 형광영상을 획득하였고, well plate 內 반응액의 헤모글로빈 농도 및 형광강도를 측정하였다. 형광분자영상 기기를 이용하여 fibrinolysis 즉 혈전용해에 따라 정량적으로 분리되어 반응액에 흘러나온 Cy5.5 형광과 용해되지 않고 남아있는 혈전에서 방출되는 Cy5.5 형광을 다양한 간격의 조리개 노출로 영상화 하였다. 혈전과 반응액에서 방출되는 Cy5.5 형광은 영상처리소프트웨어를 이용하여 정성/정량 분석하였으며, 이와 더불어 반응액을 형광도측정기 (fluorometer)를 이용하여 직접 측정했다.

헤모글로빈 농도 측정

혈전에서 분리되어 반응액에 흘러나온 헤모글로빈 농도 (혈전용해도를 반영하는 2차 지표)는 modified cyanomethemoglobin method (Van Assendelft 등, 1984)를 따라 수행하였다. 150μl의 cyanomethemoglobin 시약을 5μl의 반응액과 섞고 15분간 상온에서 반응시킨 후 ELISA를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정했다. 시험 약제 또는 대조 시약을 투여 전 측정한 값과 이들을 투여한 후 시간대별로 측정한 값의 차이를 퍼센트로 계산했다.

실험 결과

5 μg/ml 농도의 혈전 용해제와 대조군으로 생리식염수를 섞었으며, 도 1의 FXIII은 Cy-F15를 의미한다.

<1. 육안 소견>

tPA를 투여한 혈전들은 2시간 이내에 빠르게 용해되어 크기가 감소하였지만 대조군에서는 미약한 변화만이 관찰되었다.(도 2)

<2. 형광영상 소견>

20nM의 Cy-F15 probe를 섞은 well plate에서는 혈전의 형태 정성 분석 및 혈전용해 후 반응액으로 분리 유출된 Cy5.5 형광을 정량화 하는 작업에 용이하였다. 2nM의 Cy-F15 probe를 섞은 well plate에서는 혈전에서 나오는 형광 시그널이 saturation 되지 않을 정도의 세기이므로 혈전의 folding에 따른 모양과 중첩도의 변화에 관계없이 형광 신호를 시간대 별로 반복 정량 분석하는 작업에 용이하였다. 혈전 크기의 감소 및 형광 강도의 감소와 더불어 반응액의 형광 신호강도의 정량결과, tPA 투여 후 1시간까지 약 50% 강해짐을 확인할 수 있었다 (도 2, 3). 식염수를 투여한 대조군의 경우 6시간에 걸쳐 증가폭이 20% 이었으며, 이는 자가 혈장에 의한 endogeneous thrombolysis를 반영하는 것이다. Cy-F15 probe를 섞지 않은 혈전에서는 형광신호가 관찰되지 않았다.

<3. 헤모글로빈 농도 측정 결과>

tPA와 반응시킨 혈전들의 반응액 내 헤모글로빈 농도는 tPA 투여전과 비교하여 투여 후 1시간까지 최소 96% 이상 (Cy-F15 = FXIII 20 nM (+)), 6시간까지는 최대 161% (Cy-F15 = FXIII 2 nM (+))까지 증가하였다. tPA 대신 생리식염수를 넣은 대조군의 경우 6시간까지 최대 88% (Cy5.5-A15 = FXIII 20 nM (-))까지 증가하였다(도 4). Cy-F15를 섞은 혈전과 섞지 않은 혈전의 헤모글로빈 농도는 차이가 없었다. 즉, 혈전용해도 정량을 위해 mix한 Cy-F15 probe 자체가 혈전용해에 영향을 주는 confounding effect는 없었다. 도 3과 비교하면 헤모글로빈농도의 변화 추이와 Cy5.5 형광 신호 강도의 변화 추이가 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 헤모글로빈 농도의 변화 추세와 Cy5.5 형광 신호강도의 변화 추세가 차이 (discrepancy)를 보인다는 점은 이들이 서로 다른 종류의 biologic marker 임을 보여주는 것임을 알 수 있었다.

Claims

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1)GNQEQVSPLTLLKWC 서열을 갖는 FXIII (factor 13) 응고효소 인지 펩타이드에 형광물질인 Cy 5.5가 부착된 프로브(probe)를 제조하는 단계;
2) 상기 1)단계의 프로브와 혈액을 혼합하여 혈전을 제조하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 혈전에 자가 혈장과 혈전용해제를 처리하는 단계; 및
4) 상기 3) 단계의 자가 혈장과 혈전용해제에 의하여 혈전이 용해된 반응액에서 방출되는 형광 신호와 용해되지 않은 혈전에서 방출되는 형광신호를 측정하는 단계; 를 포함하는 환자 맞춤형 혈전용해도 측정 방법.
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제 9항에 있어서, 상기 혈전용해도 측정 방법은 섬유소 절단에 의한 혈전 용해를 측정하는 것임을 특징으로 하는, 환자 맞춤형 혈전용해도 측정 방법.
1)GNQEQVSPLTLLKWC 서열을 갖는 FXIII (factor 13) 응고효소 인지 펩타이드에 형광물질인 Cy 5.5가 부착된 프로브(probe)를 제조하는 단계;
2)상기 1)단계의 프로브와 혈액을 혼합하여 혈전을 제조하는 단계;
3)상기 2) 단계의 혈전에 자가 혈장과 시험물질을 처리하는 단계; 및
4)상기 3) 단계의 자가혈장과 실험물질에 의하여 혈전이 용해된 반응액에서 방출되는 형광 신호와 용해되지 않은 혈전에서 방출되는 형광신호를 측정하는 단계; 를 포함하는 환자 맞춤형 혈전용해제 스크리닝 방법.
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