KR101317090B1 - 필로카르핀 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 필로카르핀 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 추출공정 중 온도, pH 및 분해효소 조합에 따라 추출되는 필로카르핀 양을 극대화할 수 있는 필로카르핀 추출방법에 관한 것이다.

Description

필로카르핀 추출방법{METHOD FOR EXTRACTING PILOCARPINE}

본 발명은 필로카르핀 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 추출공정 중 온도, pH 및 분해효소 조합에 따라 추출되는 필로카르핀 양을 극대화할 수 있는 필로카르핀 추출방법에 관한 것이다.

필로카르핀(pilocarpine)은 Pilocarpus라는 운향과 식물에서 발견되는 이미다졸계 알칼로이드며, 세계적으로 브라질의 아마존강 유역에서 자생하는 자보란디(jaborandi)에서 추출되는 것으로 보고되어 있다(Pinheiro, 1997; Vieira, 1999; Pinheiro, 2002).

일반적으로 운향과는 160속과 1900종이 포함되어 있고, 열대지방과 온대지방에 넓게 분포하고 있다(Groppo et al., 2008; Cronquist 1988). pilocarpus는 신열대구의 교목 및 관목 식물로, 16종으로 이루어져 있으며 9개의 아종, 12개의 변종이 있으며, 멕시코 남부지방부터 중앙아메리카, 남아메리카 남부에 분포되어있다(Skorupa, 1996). Joseph(1967)은 브라질에 약 18종이, Kaastra(1982)는 10종이 있다고 보고되었으며, Kaastra가 밝힌 10종은 각각 P. pennatifolius , P. grandiflorus, P. jaborandi , P. trachylophus , P. microphyllus , P. giganteus Engler, P. peruvianus , P. riedelianus , P. spicatus , P. pauciflorus 등이 있다. Jaborandi는 브라질 인디언 투피족의 언어(ya-mbor-endi)에서 유래되었는데, 그 의미는 “침 흘리는 잡초”로, 1873년, Symphronio Coutinho가 브라질 페르남부쿠주에서 잎의 샘플을 유럽으로 가져오면서 서양의학에서 소개되었다(Hoimstedt et al, 1979).

이러한 Jaborandi는 관목이며, pre-Amazonian 우림의 하층 식물이고, 특히 마라냥주에 많이 존재 한다(Davies et al., 2001). 특히 종에 따라 필로카르핀 함량이 달리 보고되어 있는데, 예를 들어, Pilocarpus microphyllus 경우에는 20여종이 알려져 있으며, 브라질 마라냥주에 가장 많이 존재하며, 잎에 알칼로이드 물질이 가장 많이 함유 되어 있다(Pinheiro, 1997). 몇몇 알칼로이드는 동물에서 생리학적 효과가 있으며, 많은 경우에 약리학적으로 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Abreu, 2005). Jaborandi 잎은 평균 0.5%의 imidazole alkaloid pilocarpine을 포함하고 있고, isopilocarpine, jaborine, jaboridine, pilocarpidine과 같은 다른 알칼로이드가 같은 양으로 포함되어 있다(Merck, 1983).

또한, 필로카르핀은 콜린성 작용, 안압 감소 작용, 분비샘의 촉진작용, 발한 작용 등 다양한 약리학적 활성을 가진다(Migdal, 2000; Davies and Broadley, 2001). 그러나 이러한 중요성에도 불구하고 단지 몇 편의 논문만이 추출 관련하여 보고되어 있으며(Andrade-Neto et al., 1996; Avancini et al., 2003), 전세계적으로 합성 방법을 이용한 필로카르핀 생산에 주력하고 있다.

이에 본 발명은, 온도, pH 및 분해효소를 조합하여 필로카르핀의 수득 양을 극대화할 수 있는 필로카르핀 추출방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기의 과제를 해결하기 위해 다음과 같은 과제 해결수단을 제공한다.

(a) 건조된 자보란디 잎을 분쇄하는 단계;

(b) 상기 분쇄된 자보란디 잎 무게의 3배의 증류수를 상기 분쇄된 자보란디 잎에 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계;

(c) 상기 혼합액의 pH를 3으로 조정하는 단계;

(d) pH가 조정된 상기 혼합액을 섭씨 100도로 1시간 가열하는 단계;

(e) 상기 가열된 혼합액의 pH를 10.5로 조정하는 단계;

(f) 상기 혼합액에 상기 혼합액의 2배 중량인 클로로포름을 혼합하여 상분리를 유도하고, 상기 상분리된 혼합액의 하층액을 분리하는 단계;

(g) 상기 하층액을 증발시켜 농축시키는 단계

(h) 상기 농축된 하층액에 상기 하층액의 2배 중량의 황산을 혼합하여 상분리를 유도하는 단계;

(i) 상기 상분리된 혼합액의 하층액과 상층액으로부터 상층액을 분리하는 단계;

(j) 상기 분리된 상층액의 pH를 10.5로 조정하는 단계;

(k) 상기 pH가 조정된 상층액에 상기 상층액 2배 중량의 클로로포름을 혼합하여 상분리를 유도하고, 상기 상분리된 혼합액의 하층액을 분리하는 단계;

(l) 상기 하층액을 농축하는 단계;

(m) 상기 농축액에 부피비 1:4인 아세톤/메탄올 혼합액을 혼합하여 필로카르핀을 추출하는 단계까지 포함하는 것을 특징으로 하는 필로카르핀 추출방법을 제공한다.

또한, 상기 (c) 단계 이후, 셀룰레이즈 종합효소인 분해효소를 첨가하는 것을 특징으로 하는 필로카르핀 추출방법을 더 제공한다.

또한, 상기 농축은 회전진공 감압증발 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 필로카르핀 추출방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 자보란디 잎으로부터 추출되는 필로카르핀의 수득 양이 종래의 일반적인 추출방식에 비하여 대략 6.2배 정도 증가한다. 따라서, 다양한 약리학적 활성을 가지는 유용한 필로카르핀를 대량으로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명은 자보란디 잎으로부터 필로카르핀을 추출하는 방법의 단계도이다.
도 2는 pH에 따른 필로카르핀 추출양을 비교한 실혐결과이다.
도 3은 가열 온도 조건에 따른 필로카르핀 추출양을 비교한 실혐결과이다.
도 4는 가열 시간에 따른 필로카르핀 추출양을 비교한 실혐결과인 생산함량 데이터이다.
도 5 내지 8은 실시예 1 내지 3의 공정 조건에 따른 추출효과를 실험한 결과로서, HPLC 분석 결과 및 함량 비교 데이터이다.
도 9 및 10은 분해효소를 조합한 결과에 따른 추출효과를 실험한 결과로서, 각각 필로카르핀 함량 데이터 및 HPLC 분석 결과이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 각 실시예를 이용하여, 본 발명을 상세히 설명한다.

이하의 실시 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 상세한 설명이며, 본 발명의 권리 범위를 제한하는 것이 아님은 당연할 것이다. 따라서, 본 발명과 동일한 기능을 수행하는 균등한 발명 역시 본 발명의 권리 범위에 속할 것이다.

또한 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.

상술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 자보란디(Jaborandi) 잎으로부터 필로카르핀을 다량 추출할 수 있는 액상 추출 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 추출공정의 온도, pH 및 분해효소에 필로카르핀의 수득 양이 의존하는 점을 확인하였으며, 상기 변수 들의 조합에 따라 대략 6.2배 정도 증가되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

도 1은 본 발명은 자보란디 잎으로부터 필로카르핀을 추출하는 방법의 단계도이다.

도 1을 참조하면, 먼저, 건조된 자보란디 잎을 분쇄한다. 상기 건조는 5일간 진행되며, 상기 분쇄된 잎에 상기 잎 무게의 3배에 해당하는 증류수를 혼합한다. 이후, 상기 분쇄된 잎과 증류수로 이루어진 혼합액의 pH를 3으로 조정한다. 특히, 본 발명자는 pH를 2 내지 10중에서 pH가 3인 경우, 필로카르핀 추출이 최대화되는 점을 확인하였다.

이후, 상기 pH가 3으로 조정된 혼합액을 섭씨 100도로 1시간 가열한다. 본 발명에 따른 추출공정에서 pH뿐만 아니라, 혼합액을 가열하는 시간과 온도 또한 필로카르핀 추출량에 크게 영향을 미치므로, pH 3의 혼합액을 섭씨 100도로 1시간 가열하여, 필로카르핀 추출효과를 극대화한다. 가열하고 나서 20분 후, 액체망을 이용해서 액체를 걸러주고 pH 조정을 위해 다시 한번 pH 측정을 하였다. 이후 확인 후 상기 혼합액의 pH를 10.5로 조절하며, 조절에 사용 하는 용매는 암모니아를 사용하였다.

이후, 상기 pH가 조절된 혼합액에 2배의 클로로포름의 용액을 넣어주고 2시간 가량 섞어 준다. 그 다음, 분리를 위해 20분 방치하고, 상분리된 혼합액 중 노란색의 클로로포름 하층액을 분리하고, 이를 회전진공 감압증발기를 이용하여 농축시켰다. 이후, 상기 하층액에 20%황산 수용액을 2배만큼 혼합하여 2시간 섞어준 이후, 20분 방치하여, 다시 상분리를 유도하였다. 상분리 후, 하층액은 버리고 상층액을 pH조절을 위해 다시 한번 pH 측정을 하였다. 이후, 확인 후, 암모니아 용매를 이용해 상기 상층액의 pH를 10.5로 조절 해주고 20분 방치하였다.

이후, 상기 pH가 조정된 상층액에 상기 상층액 2배 중량의 클로로포름을 혼합하여 상분리를 유도하고, 상기 상분리된 혼합액의 하층액을 분리하였는데, 본 발명의 일 실시예에서 이 단계는 1회 진행하였다. 이후, 상기 하층액을 농축하는데, 본 발명의 일 실시예에서 상기 농축은 이전 농축에 비하여 농축 수준이 높으며, 이로써 하층액은 완전 농축된다. 이후, 완전 농축된 하층액(필로카르핀 추출액)에 부피비 1:4인 아세톤/메탄올 혼합액을 혼합하여, 필로카르핀을 수득한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 혼합액은 아세톤 1 ml와 메탄올 4 ml이었으나, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상술한 바와 같이 상분리와 상층액을 분리하고, 암모니아 용매, 황산 등으로 pH를 조절하는 단계를 반복하고, 이후 흰색의 하층액만을 분리하고, 이를 회전진공 감압증발기로 농축하여 필로카르핀 추출액을 제조한다.

이하 본 발명에 따른 pH, 가열시간, 가열온도, 그리고 분해효소 사용에 따른 필로카르핀 추출 효과를 설명한다.

실시예 1: pH 조건을 조절

본 발명에서 pH 조건을 찾기 위해서 여러 종류의 pH을 선택하여 실험을 진행하였다.

도 2는 pH에 따른 필로카르핀 추출양을 비교한 실혐결과이다.

도 2를 참조하면, 필로카르핀의 양을 향상시키기 위해서 우선 pH2에서부터 9까지 실험을 진행한 결과, pH3 조건에서 색깔 반응도 더 붉은색으로 나왔으며 또한, 추출 실험을 진행 결과 더 많은 필로카르핀 함량이 추출되는 것을 HPLC로 확인할 수 있다.

실시예 2: 가열 온도 조절

본 발명에서 가열 온도 조건을 찾기 위해서 여러 종류의 가열 조건을 선택하여 본 발명을 진행 하였다.

도 3은 가열 온도 조건에 따른 필로카르핀 추출양을 비교한 실혐결과이다.

도 3을 참조하면, 가열 온도를 50℃, 100℃ 로 진행하였다. 50℃에서 가열 및 추출하였을 경우, 필로카르핀 양을 HPLC로 확인한 결과 135 mg/kg 임을 알수 있는 반면, 상기 가열 온도를 100℃로 실험을 진행하였을 때에는 훨씬 많은 241mg/kg 으로 추출 결과를 확인하였다.

실시예 3: 가열 시간 조절

본 발명에서 가열 시간을 찾기 위해서 여러 종류의 시간을 조절하면서 실시하였다.

도 4는 가열 시간에 따른 필로카르핀 추출양을 비교한 실혐결과인 생산함량 데이터이다.

도 4를 참조하면, 시간을 1시간, 2시간으로 설정하고 실험을 진행하였다. 가열 시간 2시간으로 설정을 하고 추출을 하여 HPLC로 결과를 확인한 결과, 211 mg/kg의 천연 필로카르핀의 양을 추출하였다. 또한 상기 본 실험에서 1시간을 설정하여 가열 실험을 진행하고 똑같은 방법으로 천연 필로카르핀을 추출하여 HPLC로 확인한 결과 필로카르핀 양이 2시간 가열한 양보다 더 많은 천연 필로카르핀 양을 추출하였다는 것을 확인하였다. HPLC로 양을 조사한 결과 256 mg/kg의 양을 확인하였다.

실시예 4: 천연 필로카르핀 추출의 최적화

본 발명에서 최적의 조건을 조합 한 결과 pH3, 가열 온도 100°C, 가열 시간 1시간이 조건을 혼합하여 실험 결과 필로카르핀의 최대의 생산량을 확인 하였다.

도 5 내지 8은 실시예 1 내지 3의 공정 조건에 따른 추출효과를 실험한 결과로서, HPLC 분석 결과 및 함량 비교 데이터이다.

도 5 내지 8을 참조하면, 실시예 1 내지 3의 방법을 조합하여 각각의 조건에서 최적 조건을 확인할 수 있다. 본 발명에서는 pH3, 가열 온도 100℃, 가열 시간 1시간등으로 공정 조건을 설정하여 실험을 진행한 결과 천연 필로카르핀의 양이 833 mg/kg 인 것으로 확인되었다.

실시예 5: 분해효소 포함한 천연 필로카르핀 추출의 최적화

본 발명에서 최적의 조건에서 분해효소를 조합한 결과 천연 필로카르핀 추출량의 증가를 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에서 사용된 분해효소는 셀룰레이즈 종합효소이었으며, 분해효소는 황산에 의하여 pH가 3으로 조절된 후, 용액에 혼입된다.

도 9 및 10은 분해효소를 조합한 결과에 따른 추출효과를 실험한 결과로서, 각각 필로카르핀 함량 데이터 및 HPLC 분석 결과이다.

도 9 및 10을 참조하면, 본 발명에서는 천연 필로카르핀 추출의 최적화 조건으로부터 더 많은 천연 필로카르핀의 추출을 위해 분해효소를 포함하여 실험을 진행하였다.

그 결과, pH3, 가열 온도100℃, 가열 시간 1시간 등으로 하고 분해효소를 포함하여 동일한 방법으로 추출 실험을 진행한 결과, 분해효소를 첨가하지 않은 경우보다 2배 이상의 필로카르핀을 추출할 수 있다는 것을 확인하였다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (3)

1. (a) 건조된 자보란디 잎을 분쇄하는 단계;
   (b) 상기 분쇄된 자보란디 잎 무게의 3배의 증류수를 상기 분쇄된 자보란디 잎에 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계;
   (c) 상기 혼합액의 pH를 3으로 조정하는 단계;
   (d) pH가 조정된 상기 혼합액을 섭씨 100도로 1시간 가열하는 단계;
   (e) 상기 가열된 혼합액의 pH를 10.5로 조정하는 단계;
   (f) 상기 혼합액에 상기 혼합액의 2배 중량인 클로로포름을 혼합하여 상분리를 유도하고, 상기 상분리된 혼합액의 하층액을 분리하는 단계;
   (g) 상기 하층액을 증발시켜 농축시키는 단계
   (h) 상기 농축된 하층액에 상기 하층액의 2배 중량의 황산을 혼합하여 상분리를 유도하는 단계;
   (i) 상기 상분리된 혼합액의 하층액과 상층액으로부터 상층액을 분리하는 단계;
   (j) 상기 분리된 상층액의 pH를 10.5로 조정하는 단계;
   (k) 상기 pH가 조정된 상층액에 상기 상층액 2배 중량의 클로로포름을 혼합하여 상분리를 유도하고, 상기 상분리된 혼합액의 하층액을 분리하는 단계;
   (l) 상기 하층액을 농축하는 단계;
   (m) 상기 농축액에 부피비 1:4인 아세톤/메탄올 혼합액을 혼합하여 필로카르핀을 추출하는 단계까지 포함하는 것을 특징으로 하는 필로카르핀 추출방법.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 농축은 회전진공 감압증발 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 필로카르핀 추출방법.
   

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