KR101297763B1

KR101297763B1 - 알츠하이머 병 치료용 의약의 제조를 위한 ｓ-아데노실메티오닌(ｓａｍ) 및 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(ｓｏｄ)의 용도

Info

Publication number: KR101297763B1
Application number: KR1020107018940A
Authority: KR
Inventors: 시그프리도 스카르파; 안드레아 푸소; 로셀리나 다미아니; 마우로 로시니
Original assignee: 그노시스 에스.피.에이.
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2013-08-20
Also published as: WO2009106302A1; CN101965197A; DK2249868T3; CN104189895B; CY1116782T1; NZ587608A; US20110020301A1; RU2010135467A; SI2249868T1; IL207807A0; JP2011513257A; RS54442B1; ES2550461T3; AU2009218723B2; CA2716893C; PT2249868E; BRPI0908024A2; RU2472513C2; HUE028183T2; ZA201006085B

Abstract

알츠하이머 병의 치료용 의약의 제조를 위한, 슈퍼옥시드 디스뮤타아제 (superoxide dismutase, SOD)와 조합된 S-아데노실메티오닌 (S-adenosylmethionine, SAM)의 용도.

Description

알츠하이머 병 치료용 의약의 제조를 위한 Ｓ-아데노실메티오닌(ＳＡＭ) 및 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(ＳＯＤ)의 용도{Use of S-adenosylmethionine(SAM) and superoxide dismutase(SOD) for the preparation of medicaments for the treatment of Alzheimer's disease}

본 발명은 알츠하이머 병의 치료용 의약의 제조를 위한, 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD)와 조합된 S-아데노실메티오닌 (S-adenosylmethionine, SAM)의 용도에 관한 것이다.

알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 매우 널리 퍼진 신경변성 형태의 치매이며 70 세 이상의 세계 인구의 높은 비율에, 남성 대 여성 간 1:2의 비율로 영향을 미친다. 보다 흔한 비-유전적 형태가 약 70 내지 75세의 나이에서 시작되고, 의학 및 약학의 발전과 동반된 향상된 생활 수준으로 인해 기대 수명이 증가하면서 AD의 발병률은 지속적으로 증가하고 있다. 알츠하이머 병은 14번, 19번 및 21번 (다운 증후군을 앓는 사람에게 전형적이다) 염색체의 일부 좌위(locus)의 돌연변이와 관련된, 유전적 질환 형태(genetically transmitted form)로도 존재한다. 가족성(familial) 형태의 AD의 조기 발병은 약 50세에 일어나고, 뇌의 퇴행을 야기하며 2-3 년 내에 사망을 수반한다. 후발성(late-onset) 형태의 알츠하이머 병도 뇌의 퇴행 및 사망을 초래하지만, 10년 이상의 기간이 소요된다.

뇌는 신경세포사이 공간(interneuronal space)에 다수의 플라크(plaque)를 보이며, 신경세포, 특히 대뇌 피질, 해마 및 편도의 신경세포 내, 및 인지 기능을 갖는 뇌의 다른 부분에서 전형적인 신경섬유 다발(neurofibrillary tangle)들을 나타낸다. 노인성 플라크로도 알려진 아밀로이드 플라크는, 펩티드 베타-아밀로이드(Aβ)의 중합체로, 보다 큰 단백질, 베타-아밀로이드 전구 단백질(beta-amyloid precursor protein, APP)에서 유래한다. APP는 고도로 보존된 막관통 당단백질 슈퍼패밀리(superfamily of transmembrane glycoproteins)의 구성원이다.

지난 10년 동안, 특히 분자적 메커니즘과 관련하여 그 병인론을 이해하려는 목적에서 AD 연구에 전념한 과학자들에 의해 많은 연구들이 수행되었다. 분자 성분들 및 이들의 조절에 대한 연구는 이들의 치료적 및 진단적 전망을 명확하게 할 수 있다. 프리세닐린(presenilin)에 관심이 집중되어 왔으며, APP의 가공(processing) 및 그에 따른 Aβ의 생성에 있어서 그의 역할은 매우 중요한 것으로 보인다. 이들 단백질, 프리세닐린 1 (PS1) 및 프리세닐린 2 (PS2)는 효소 활성을 나타내거나 또는 다른 효소, 즉 세크레타아제(secretase)의 활성을 조절하는 것으로 입증되었으며, 세크레타아제는 APP를 정상적으로 분해가능한 이화물질(catabolite) (알파-세크레타아제) 또는 펩티드 Aβ (베타- 및 감마-세크레타아제)로 절단시킨다. 가족성 AD에서, PS1 및 PS2를 코딩하는 유전자의 돌연변이는 Aβ의 과다한 생성 및 특히, 아밀로이드 생산성이 높은(highly amyloidogenic) 구조적 아형(isoform) Aβ-42의 축적을 야기한다. 최근, PS1 넉아웃 생쥐(PS1 knockout mouse)에 대한 실험은 감마-세크레타아제 활성의 큰 감소를 나타냈으며, PS1가 감마-세크레타아제 복합체에 속한다는 것뿐만 아니라 Aβ의 생성 및 축적에 있어서 주된 원인임을 입증했다. 베타-세크레타아제에 대해서는, BACE 유전자의 산물이 베타-세크레타아제 절단만을 수행할 수 있는 것으로 믿어지고 있다.

임상적으로 유용한 감마- 및 베타-세크레타아제 저해제의 개발은 알츠하이머 병에 대한 중요한 무기가 될 수 있으며, 현재 신경과학에서 가장 흥미로운 경쟁분야 중 하나이다. PS1의 활성은 완전히 억제될 수 없다는 것이 분명하게 입증되었으며, 이는 상기 단백질이 적혈구생성(erythropoiesis)에 관여하는 줄기세포와 같은, 많은 줄기세포의 성숙에 중요한 인자인 전달 인자(transduction factor) Notch-1)을 가공하는데 필요하기 때문이다.

DNA 메틸화에 의한 유전자 발현의 조절은 AD에 관여하는 유전자들을 발현할 수 있는 세포 배양 시스템에서 성공적으로 연구될 수 있다. 본 발명자들의 연구 결과로서, 노화에 관여하는 조절 메커니즘에서 매우 흥미로운 징조(indication)가 발견되었으며, 이는 노인들에서 DNA 저메틸화(DNA hypomethylation)의 점진적, 전반적 증가 및 노인성 치매를 앓는 환자에서 관찰되는 호모시스테인(homocysteine) 축적으로 구성된다. 호모시스테인 축적 및 DNA 저메틸화는 대사적으로 상관관계를 가지며, 호모시스테인의 메티오닌으로의 전환 부전(failure)은 강력한 DNA-메틸트랜스퍼라아제 저해제로 알려져 있는, S-아데노실호모시스테인의 합성 방향으로 대사를 역전(reverse)시키고, 그에 따라 DNA 저메틸화를 유도하기 때문이다. 특정한 서열의 시토신이 탈메틸화되면 많은 유전자들이 발현된다는 정립된 이론에 따라, 이러한 생화학적 패턴은 미발현된 유전자의 발현 및 정상적으로 발현되는 유전자의 과다발현을 야기할 수 있다. 이것이 AD의 경우일 수 있는데, PS1, 즉 감마-세크레타아제의 과다발현은 불연속적으로 알파-세크레타아제 활성을 넘어서고 그에 따라 펩티드 Aβ를 생성할 수 있으며, 이는 축적되어 수 년 후에 알츠하이머병을 유발할 수 있기 때문이다. AD에서 DNA 메틸화의 가능한 역할에 대한 추가적 징조는 AD 환자들이 뇌에서 훨씬 낮은 사후(post mortem) 메틸 공여체 수준을 나타낸다는 발견이다. S-아데노실메티오닌 (SAM)의 보다 낮은 이용가능성은 APP 대사에 관여하는 유전자의 발현량 변화 또는 증가를 쉽게 야기할 수 있고, 결과적으로 노인성 플라크에 펩티드 Aβ의 축적을 유발한다.

APP, PSl, PS2, BACE, 알파-세크레타아제, 감마-세크레타아제의 다른 구성성분들 및 Notch 1을 발현하는 신경아세포종 세포주 (SK-N-SH)에 대해 예비 실험을 실시하였다. 배양물을 엽산, 비타민 B12 및 비타민 B6를 결핍시킨 배양 배지로 처리하고 (호모시스테인의 대사를 변화시키기 위함), 여기에 SAM을 다양한 농도로 첨가하였다 (비타민 결핍의 효과를 상쇄하기 위함). 본 발명자들은 비타민 B-결핍 배지에서 PS1 및 BACE 발현의 증가를 발견했으며, SAM의 투여 후 PS1 및 BACE의 현저한 감소를 발견했다. APP 및 PS1 프로모터에 대한, HpaⅡ/PCR을 사용하여 수행된 실험에서 본 발명자들은 PS1 프로모터의 CpG 부위(site) 중 하나의 메틸화에 있어서 중대한 차이를 발견했다. 본 발명자들은 PS1 유전자가 외인성 SAM의 투여에 의해 부분적으로 침묵화될(silenced) 수 있는 것으로 결론내렸다. SAM의 투여는 PS1 발현을 감소시켜, 알파-세크레타아제에 유리하게 대사 균형(metabolic balance)을 회복시킬 수 있다. 또한, TgCRND8 계의 형질전환 마우스 및 상응하는 대조군을 사용하여 실험을 수행하였다; 이 마우스들은 인간 APP 유전자 돌연변이체의 존재를 특징으로 하고, 따라서 단시간 내에 아밀로이드 플라크를 발생시킬 수 있다. 이 동물들을 완전 식이(complete diet) 또는 B 그룹의 비타민이 결핍된 식이에 따라 섭식시켰다; 상기 세포들에서와 마찬가지로, 또다시 PS1 및 BACE 발현의 증가가 관찰되었다.

상기 두 실험 모델에서, 유전자 발현의 변화는 감마- 및 베타-세크레타아제 활성 증가 및 그에 따른 Aβ의 과다생성 효과를 나타냈으며, Aβ는 축적되어 대조 식이로 처리된 동물에서보다 빠르게 노인성 플라크를 형성하였다.

상기에서 요약된 데이터는 다음의 출판물에서 보고되었다:

Fuso A., Nicolia V., Cavallaro R.A., Ricceri L., D'Anselmi F., Coluccia P., Calamandrei G. 및 Scarpa S. 2008. B-Vitamin Deprivation Induces Hyperhomocysteinemia and Brain S-adenosylhomocsyteine, Depletes Brain S-adenosylmethionine, and Enhances PSl and BACE Expression and Amyloid-β Deposition in Mice. MoI. Cell. Neurosci. 37: 731-746.

Fuso A., Cavallaro R. A., Zampelli A., D'Anselmi F., Piscopo P., Confaloni A. 및 Scarpa S. 2007. γ-secretase is differentially modulated by alterations of Homocysteine cycle in neuroblastoma and glioblastoma cells. J. AIz. Dis. 11 : 275-290.

Cavallaro R. A., Fuso A., D'Anselmi F. 및 Scarpa S. 2006. The effect of S-adenosylmethyonine on CNS gene expression studied by cDNA mycroarrays analysis. J. AIz. Disease. 9: 415-419.

Scarpa S., Cavallaro R.A., D'Anselmi F. 및 Fuso A. 2006. Gene silencing through methylation: an epigenetic intervention on Alzheimer Disease. J. AIz. Disease. 9: 407-414.

Fuso A., Seminara L., Cavallaro R.A., D'Anselmi F. 및 Scarpa S. 2004. Homocysteine/S-adenosylmethionine Cycle Alterations Unbalance DNA Methylation Status with Consequent Up-regulation of Beta-amyloid Production. Mol. Cell. Neurosci. 28(1): 195-204.

Scarpa S., Fuso A., D'Anselmi F., Cavallaro R.A. 2003. Presenilin 1 gene silencing by S-adenosylmethionine: a treatment for Alzheimer disease? FEBS Letters 541 (1-3): 145-148.

Fuso A., Cavallaro R. A., Orru L., Buttarelli F.R. 및 Scarpa S. 2001. Gene silencing by S-adenosylmethionine in muscle differentiation. FEBS Letters 508 (3): 337-340.

또한 AD의 치료를 위한 SAM의 사용이 미국출원공개 제2002/025926호 및 미국출원공개 제2004/0048827호에서 제안되었다. 후자 문헌은 베타-세크레타아제, 프리세닐린 1 및 2, 및 베타-아밀로이드 단백질 전구체 유전자 발현을 방해하는 SAM의 능력을 증명했다. 상기 특허 출원 후 표지된 (삼중수소화된) SAMe를 사용하여 수행된 연구는 하기에 보고된 바와 같이, 경구 투여 후 중추 신경계에 도달하는 상기 분자의 능력을 입증했다.

AD의 치료에 있어서 SOD의 유익한 효과는 미국특허 제5519058호 및 중국특허 제1099224호에 제시된다.

AD가 아닌 병태(condition)에서의 사용을 위한, 다수의 활성 성분과 함께 SAM 및 SOD 모두를 포함하는 약제학적 조성물이 미국출원공개 제2003/129261호 및 WO 제 2005/041996호에 개시된다.

이제, S-아데노실메티오닌이 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD)와 조합되어 투여되는 경우, S-아데노실메티오닌의 활성이 놀랍게 향상될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 상기 효소는 혈액-뇌 관문(blood-brain barrier)을 통한 S-아데노실메티오닌의 통과를 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 비타민 B 결핍의 결과로 과다발현된 PS1 및 BACE 유전자의 발현을 감소시키는 데 있어서 SAM과 상승적으로 상호작용하는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명의 일 양태는 알츠하이머 병의 치료에 있어서, S-아데노실메티오닌 또는 그의 유도체 및 슈퍼옥시드 디스뮤타아제를 동시적, 개별적 또는 순차적 투여를 위한 조합 제제의 형태로 함유하는 의약품(product)에 관한 것이다.

투여량은 SAM 및 SOD의 매우 낮은 독성을 고려하여 넓은 범위 내에서 달라질 수 있으며, 환자의 체중, 성별 및 연령과 같은 다양한 인자들에 의존할 것이다. 그러나, 광범위하게는, 상기 투여량은 SAM에 대해 200 내지 2000 mg/일, 및 SOD에 대해 50 내지 1000 mg/일이 될 것이다.

SAM은 바람직하게 경구로 투여될 수 있고, 그 자체로 또는 토실레이트, 부탄디술포네이트, 디술페이트 토실레이트, 디술페이트 디토실레이트 또는 디술페이트 모노토실레이트와 같은 그의 안정한 염 형태로 투여될 수 있다. 투여의 유용한 한 형태는 WO 제2006/131382호에 개시된, SAM이 강화된 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 세포이다.

본 출원인에 의해 출원된 WO 제2006/131382호에 개시된 바와 같이, 사카로미세스 세레비시아 스트레인으로부터 발효에 의해 얻어지는 SOD는 글리아딘 필름(gliadin film) 상에 지지되거나 다른 위보호(gastroprotection) 기술을 사용하여 역시 경구로 투여될 수 있다. 경구 경로에 대한 대안으로서, SAM 및 SOD는 비경구적으로, 예를 들면 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.

이 제형들의 예는 아크릴 또는 메타크릴 중합체로 필름-코팅된 정제, 위내성(gastroresistant) 캡슐, 마이크로캡슐 등을 포함한다.

SAM 및 SOD는 동일한 투여 유닛(dose unit) 중에 존재하거나 또는 개별적으로 제형화되어 투여될 수 있다: 이러한 경우, 두 약물의 순차적, 동시적, 또는 개별적 사용에 대한 설명과 함께, 두 약물을 분리된 투여 형태로 포함하는 키트(kit)가 제공될 수 있다.

도 1a 및 1b는 마우스에서, 비타민 B-결핍 식이(vitamin B-deprived diet)에 의해 유도된 PS1 및 BACE의 과다발현에 대한 SAM 및 SOD의 효과를 보여준다.
도 2는 SK-N-BE계의 신경아세포종 세포에서, 단독 및 SAM과 조합된 상태의 SOD 및 글루타치온(glutathione, GSH)의 PS1 및 BACE 과다발현에 대한 효과를 보여준다.
도 3은 SAM 400 ㎍/일의 경구 투여 후 마우스 뇌 중의 삼중수소화 SAM의 수준을 보여준다.
도 4는 일주일의 치료 후 사람 신경아세포종 세포에서 아밀로이드-베타 생성의 측정을 보여준다.
도 5는 B-결핍 식이로 처리된 마우스의 적혈구 및 뇌에서 산화 상태에 대한SAM 및 SOD의 효과를 보여준다.
이제 본 발명은 이하 예시의 방법으로 기술되는 약리학적 시험을 통해 더욱 상세하게 기술될 것이다.

실시예 1 - 유전자 발현

구체적으로, TgCRND8 마우스 및 그에 상응하는 야생형 대조군에 대해, 약리적 농도 (400 ㎍/일)에서 SAM의 효과를 시험하였다.

유전자 발현 채널

RNA를 세포 배양물 및 균질화한 뇌로부터 추출하고, cDNA를 합성하였다. SYBR-Green 시약을 사용하여 Opticon2 DNA Engine (MJ Research)에서 수행되는 각각의 실시간 반응에 대해 총 cDNA 0.5 ㎍을 사용하였다. 표준 직선(standard linear curve)의 확장(amplification)에 의해 각각의 프라이머 쌍에 대한 증폭 효율을 미리 결정하였다. 실험 샘플을 특정한 유전자의 표준 곡선과 비교하여 표준 반응 중에 존재하는 특정한 cDNA의 양을 결정하였다. 표준물질(standard)을 양성 대조군에 의해 증폭된, 고도로 정제된 PCR 생성물로부터 수득하였다. 총 cDNA 수준을 β-액틴 대조군 (하우스키핑 유전자(gene housekeeping))까지 정규화시켰다.

그 결과는 SAM이 인 비보에서 결핍 식이(deprived diet)에 의해 유도된 PS1 및 BACE의 과다 발현도 역전시키고 (도 1), 심지어 상기 발현을 대조 식이에 의해 유도된 PS1 및 BACE 보다 낮은 수준까지 감소시킨다는 것을 보여준다.

호모시스테인 대사는 메틸화 및 산화환원반응에 관여하므로, 본 발명자들은 상기 두 유전자의 발현에 대한 다양한 항산화제들의 효과를 시험하였다. SK-N-BE계의 신경아세포종 세포를 사용하여 얻어진 첫 번째 데이터는 SOD 및 글루타치온 (SGH)이, SAM에 비해 적은 정도이지만, 비타민 결핍에 의해 유도된 PS1 및 BACE의 과다발현을 저해한다는 것을 보여주었다. 그러나, SOD 및 SAM이 함께 투여되는 경우에 이들이 상승 효과 (도 2)를 나타내며, 이는 상기 두 유전자의 발현을, SAM을 단독으로 사용하여 관찰된 수준에 비해 더 낮은 수준까지 추가적으로 감소시킨다 (15 내지 20% 더 낮음)는 것을 알게 된 것은 흥미롭다.

실시예 2 - SAM 흡수( uptake )

SAM이 혈관-뇌 관문을 통과한다는 것을 입증하기 위해 세포 및 마우스에 대해 실험을 실시했다.

세포 배양에 있어서, SAM 100 μM을 F14 세포 배양 배지 (시험 설계에 따라, 완전 배지 또는 비타민 B 결핍 배지)에 첨가하고, 96시간 후 배양을 중단하였다.

마우스에 대해, SAM 400 ㎍/일을 섭식 프로브 니들(feeding probe needle)을 사용하여 경구로 투여하고, 동물을 2 개월 후 희생시켰다; 상기 동물들을 시험 설계에 따라, 완전 식이 또는 비타민 B-결핍 식이로 섭식시켰다. Varian HPLC 시스템을 사용하여 HPLC에 의해 SAM 수준을 분석하였다. 세포 및 균질화한 뇌를 증류수에서 용해시키고, 1.5 M PCA를 사용하여 거대분자(macromolecule)를 침전시켰다. 표준 SAM 곡선을 실험 샘플의 전과 후에 계산하였다. 삼중수소화 SAM의 분석을 위해, 세포들을 전술된 바와 같이 처리하고, 마우스들은 방사성 약물에의 노출을 최소화하기 위해 4일 동안 처리하였다. 세포 및 균질화한 뇌를 증류수에서 용해시켰다. 용해된 뇌의 일부를 초음파처리하고, 원심분리하여 막과 세포 소기관을 분리하였다; 또다른 일부는 거대분자를 분리하기 위해 초음파처리 후, 과염소산(perchloric acid, PCA)으로 처리하였다. 베타 계수기를 사용하여 신틸레이션(scintillation)에 의해 방사성 SAM의 흡수를 측정하였다.

SAM의 세포내 수준은 1 (대조군)에서 2.5 내지 3 μM까지 증가한 것으로 밝혀졌다. 상기 증가가 SAM의 상승된 세포외 농도의 존재하에서 내부 저장량(endogenous reserve)의 증가에 의한 것이 아니라 외인성 SAM의 흡수에 기인한 것인지 여부를 확립하기 위해, 방사성 SAM을 사용하여 시험을 수행하였다. SK-N-BE 세포 배양물에 삼중수소화 SAM (SAM[3H]) 100 μM을 첨가하고, 세포 용해 및 방사능 계수(radioactivity count)에 의해 흡수를 평가하였다. 세포 용해물(lysate) 중 SAM 1.5 μM의 방사능 계수가 발견되었다; 이 수치는 비-삼중수소화 SAM을 사용하여 나타난, 1에서 2.5 배로의 증가에 필적하며 상기 세포내 증가가 외인성 SAM의 흡수에 기인한 것임을 분명하게 나타낸다.

SAM 400 ㎍/일을 경구로 투여받은 마우스의 뇌 용해물에서 비슷한 SAM 수준의 증가가 발견되었다; 다시 한번, SAM[3H]를 400 및 800 ㎍/일의 농도로 사용하여 추가적 시험을 실시하였다. 전체 뇌 용해물 중 방사능 증가는 400 ㎍의 SAM으로 처리된 마우스의 뇌 당 SAM 0.5 ng 및 800 ㎍의 SAM으로 처리된 마우스의 뇌 당 1 ng에 상당한다 (도 3).

전체 뇌 용해물의 일부를 또한 초음파처리하고 원심분리하여 투명한(cleared) 용해물 (세포질)을 얻고, 이 투명한 용해물의 또다른 일부를 과염소산(PCA)을 사용하여 침전시켜 단백질을 제거하였다 (가용성 용해물). 800 ㎍의 SAM으로 처리된 마우스에서 유래된 상기 가용성 용해물이 SAM 0.5 ng에 상당하는 방사능 수준을 나타낸다 (반면, 전체 용해물 및 투명한 용해물은 더 높은 수준을 나타냄)는 것을 알게 된 것은 흥미로우며, 이는 외인성 SAM에 결합된 과량의 메틸기가 다른 세포 분자들과 결합되었다(conjugated)는 것을 나타낸다.

실시예 3 - 신경아세포종 세포주에서의 아밀로이드 생성

방법: 배지 및 세포 배양

신경아세포종 SK-N-BE 사람 세포주를 10% FCS를 함께 포함하는 F14 배지 중에 유지시키고 완전 분화 배지(1% FCS 및 10 μM 레틴산(retinoic acid)을 첨가한 대조 배지) 또는 엽산, 비타민 B12 및 비타민 B6(B 결핍) 결핍 분화 배지로 옮겼다. 배양물을 이틀마다 재-공급시키고(re-fed) 96 경과시 중단하였다.

동물 및 식이

약 3 주령에, 마우스를 체계적으로 대조 식이군 또는 결핍 식이군으로 분류하고, 사료 및 물을 자유롭게(ad libitum) 제공하였다. 대조군(AIN-93M; 식이 A: 엽산 mg 1.98; 비타민 B12 mg 0.025; 비타민 B6 mg 7) 및 실험 식이 (AIN-93M B; 식이 B, 엽산, 비타민 B12 및 비타민 B6 결핍)는 Mucedola (이탈리아)로부터 구입하였다. 두 식이 모두는 장관 박테리아에 의한 엽산 형성을 억제하고 엽산의 유일한 공급처는 식이가 되도록 보장하기 위해, 1 % 술파티아졸을 포함했다. 또한, 다른 세 개의 동물 군들은 SAM (800 ㎍/일) 또는 SOD (10 U/일) 또는 두 약물의 조합 (SAM 400 ㎍/일 및 SOD 5 U/일)을 투여받았다. 처리 1주일 후, 마우스를 마취시키고 희생시켜 뇌와 혈액을 얻었다. 혈액을 심장 천자(heart puncture)에 의해 EDTA 2 g/dl를 포함한 시험관에 수집하고, 즉시 원심분리하여 혈장 및 적혈구를 분리한 후, -800 ℃에서 저장하였다. 뇌를 PBS로 관류시키고 제거하였다.

아밀로이드 분석

균질화한 뇌를 50 mM TRIS-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.2% Nonidet P-40, 1% CHAPS, 2 mM EDTA, PMSF (200 μM), 류펩틴(Leupeptin) (1 μM), 펩스타틴(Pepstatin) A (1 μM) 및 칼페인(Calpain) 저해제 I (5 μM)을 사용하여 용해시켰다. Aβ 1-42 면역분석 키트 (BioSource International, 벨기에)를 이용한 ELISA 시험을 위하여 단백질 추출물을 사용하였다; ELISA 키트는 10 pg/mL까지(1-42) 우수한 선형 감도(linear sensitivity)를 보장한다. 모든 측정은 3회씩 실시하였다.

통계적 분석

일원 ANOVA를 산출하고, 보고된 유의한(p<0.05) 차이를 평가하기 위해 Bonferroni 사후 검정(post test)을 이용하였다.

결과

도 4에서 보고된 데이터로부터, SAM과 SOD 간의 상승효과(synergy)가 분명하게 나타났고, 도 4를 참조하여, 하기의 보고된 통계 분석에 의해 확인되었다.

B 결핍 대 대조 : p<0.001

B 결핍+SAM 및 B 결핍+SOD 대 B 결핍 : p<0.001

B 결핍+SAM+SOD 대 B 결핍 : p<0.001

B 결핍+SAM+SOD 대 B 결핍+SAM 및 B 결핍+SOD : p<0.001

Claims

S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine, SAM) 및 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD)의 조합을 포함하는, 알츠하이머 병 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 PS1 (프리세닐린1) 및 BACE (beta-site APP-cleaving enzyme)의 과다발현(overexpression)을 억제하는 것인 약제학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 경구로 투여되는 것인 약제학적 조성물.
알츠하이머 병의 치료에서, 동시적, 개별적 또는 순차적 투여를 위한 조합 제제(combined preparation)의 형태로, (ⅰ) S-아데노실메티오닌 및 (ⅱ) 슈퍼옥시드 디스뮤타아제를 단독 활성 성분으로서 함유하는 의약품(product).
제4항에 있어서, SAM은 토실레이트, 부탄디술포네이트, 디술페이트 토실레이트, 디술페이트 디토실레이트 또는 디술페이트 모노토실레이트의 형태를 취하거나, 또는 SAM이 강화된(enriched) 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 세포 중에 함유된 것인 의약품.