KR20240017731A - Pdh 억제제의 신경 퇴행성 질환 치료 용도 - Google Patents

Pdh 억제제의 신경 퇴행성 질환 치료 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PDH 억제제의 신경 퇴행성 질환 치료 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, DJ-1 결실 파킨슨병 초파리 모델에서, PDK 활성화, DJ-1 및 HIF-1을 통한 PDK 발현 촉진, PDP 억제, 또는 PDH 억제제를 이용한 PDH의 유전적 및 약리학적 억제에 의해 ROS에 대한 민감도가 낮아지고, 도파민성 신경세포의 사멸이 현저히 감소되었으므로, 이들을 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.

Description

PDH 억제제의 신경 퇴행성 질환 치료 용도{Use of PDH inhibitors for treatment of neurodegenerative disease}
본 발명은 PDH 억제제의 신경 퇴행성 질환 치료 용도에 관한 것이다.
파킨슨병(Parkinson’s disease)은 1817년 James Parkinson에 의해 최초로 보고된 질병으로 나이가 들면서 노화로 인해 근육을 조절하는 신경전달물질인 도파민 분비가 이루어지는 흑색질(substantia nigra, SN)의 신경세포의 손실과 선조체의 도파민 결핍으로 인해 운동능력을 상실하는 대표적인 퇴행성 뇌질환의 일종이다. 파킨슨병은 65세 이상 인구의 1%, 85세 이상 인구에서는 5% 정도가 발병한다 (Twelves et al., Mov Disord 18, 19-31). 특징적인 임상적 증상으로는 떨림 (resting tremor), 서행(bradykinesia), 강직(rigidit) 및 자세 불안정(postural instability)을 수반하며 흑색질(substantia nigra, SN)내 도파민 신경 (dopaminergic neuron)의 선택적 소실(selective loss)에 의해 유발되며, 루이체(Lewy body)로 알려진 신경세포간 단백응집체(intraneuronal proteinous inclusion)의 존재가 대표적인 병리학적 특성이다 (Olanow et al., Annu Rev Neurosci 22,123-44). 파킨슨병의 발병 원인은 정확히 밝혀지지 않고 있다. 대부분의 파킨슨병인 산발형(sporadic form)의 경우 그 원인은 특발성(idiopathic)으로 거의 알려져 있지 않지만 환경적 요인(environmental factor)들과 아직 완전히 규명되지 않은 유전적 감수성(genetic susceptibility)간의 복잡한 상호작용이 중요한 원인으로 추정되고 있다 (Langston et al., Ann Neurol 44(3 Suppl 1): S45-52). 파킨슨병은 병리학적으로 중뇌의 흑색질(substantia nigra)에 존재하는 멜라닌 색소를 포함한 도파민성 신경세포와 신경 섬유(neurite fiber)의 특이적으로 손실과 선조체(striatum)의 도파민 결핍으로 인해 행동학적 이상 증세를 나타내게 된다. 또한 파킨슨병 환자의 신경 세포에서는 단백질 응집체인 루이체(Lewy body)가 질병의 표지 인자로 관찰된다. 파킨슨병의 대표적인 발병 기전으로는 산화적 스트레스(oxidative stress), 미토콘드리아 기능이상(mitochondrial dysfunction), 유비퀴틴-프로테아좀 기능이상(ubiquitin-proteasome dysfunction) 및 이상 단백질 축적(accumulation of misfolded proteins)이 있다. 파킨슨병은 위와 같은 환경적인 발병기전 뿐만 아니라 유전적 인자에 의해서도 발병되어지는데, 지금까지 파킨슨병과 관련된 유전자로는 α-synuclein (Polymeropoulos et al., Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease, Science 276 (1997), p2045-2047), LRRK2 (C. Paisan-Ruiz et al., Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease, Neuron 44 (2004), pp. 595-600) 등이 처음 보고되었으며, PINK1 (Valente et al., Hereditary parkinsonism with dementia is caused by mutations in ATP13A2, encoding a lysosomal type 5 P-type ATPase, Nat. Genet. 38 (2006), pp. 1184-1191), DJ-1(Bonifati et al.,Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism, Science 299 (2003), pp. 256-259) 및 ATP13A2(Ramirez et al.,Hereditary parkinsonism with dementia is caused by mutations in ATP13A2, encoding a lysosomal type 5 P-type ATPase, Nat. Genet. 38 (2006), pp. 1184-1191)이 보고되어 있다.
현재 유전성 파킨슨병(familial Parkinson's disease)을 일으키는 유전자 돌연변이인 DJ-1, Parkin, PINK1 등이 발견되어 연구되어지고 있으나, 이들 유전자는 거의 대부분의 세포에서 발현됨에도 불구하고, 유전성 파킨슨병(familial Parkinson's disease) 환자의 중뇌(midbrain) 흑질(substantia nigra) 내 도파민성 신경세포(dopaminergic neurons) 만을 특이적으로 사멸시킨다고 보고되었으며, 특히 열성 유전자인 DJ-1의 유전자 상실로 인해 발생하는 사립체 기능 이상과 산화적 스트레스 등이 연구되고 있다. 또한 이 유전자들의 기능 상실시 나타나는 변화들을 통해 신경 보호를 위한 치료제 및 바이오 마커를 발굴하고자 하는 연구들이 시도되고 있다.
파킨슨병(Parkinson's disease, PD)의 초기 발병 원인 유전자로 알려진 DJ-1 유전자는 최초에 종양유전자로서 발견되었고, 이 단백질은 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 작용과, MPP+, 6-OHDA 및 로테논(rotenone)과 같은 PD-유발자에 대한 신경보호작용을 포함한 다양한 작용을 한다는 것이 보고되었다. DJ-1 및 이의 유사체들이 주로 산화적 스트레스에 관련되어 있다는 것이 암시되어 왔으나, 이의 정확한 생화학적 메카니즘은 아직 규명되어 있지 않다. DJ-1 유전자에서의 동형 소실 돌연변이(homozygous deletion mutation)가 조기 발병된 상염색체 열성 파킨슨병(autosomal recessive early-onset Parkinson’s disease)의 원인이라고 밝혀진 이후, 세포 형질전환, RNA-단백질 상호작용의 조절, 안드로젠 수용체의 변형 및 정자 수정(sperm fertilization)을 포함하는 다양한 세포 공정과 관련된 인간 DJ-1는 크게 주목받고 있다. DJ-1은 산화적 세포질 환경에서 활성화되는 분자적 샤페론(chaperone)이다. 활성화된 DJ-1은 파킨슨병에 특징적인 세포질내 신경 봉입체(inclusion)인 레위 바디(Lewy bodies)의 주된 조성물인 α-시뉴클레인(α-synuclein) 응집을 억제한다. 또한 DJ-1은 세포자멸(apoptosis)의 레독스-민감성 음성 조절자로서도 작용한다. 마우스와 초파리(Drosophila)를 사용한 모델 연구에서는 DJ-1이 산화 스트레스에 대한 세포 생존 및 반응에 있어서 결정적인 역할을 한다고 보고된 바 있다. DJ-1의 용해도는 신경유전적 질병을 가진 뇌에서 불용해성의 응집체를 형성하면서 변경된다. DJ-1은 알츠하이머병을 포함하는 신경유전적 타우파시(tauopathies)의 범위 상에 있는 타우-양성 봉입체(inclusion)와 다계통 위축증(multiple system atrophy; MSA)의 α-시뉴클레인(α-synuclein)-양성 신경교 봉입체(inclusion)에 동시에 위치하고, DJ-1의 불용해성 형태는 단발성 파킨슨병 환자들의 뇌에서 크게 증가된다. 이는 DJ-1의 비정상적인 응집이 여러 신경유전학적 질병들의 발병기전에 관련되어 있다는 것을 보여준다.
본 발명의 목적은 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 신경 퇴행성 질환에서 신경세포의 산화 스트레스 민감도를 감소시키기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 신경 퇴행성 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 신경 퇴행성 질환 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 PDH의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PDH의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경 퇴행성 질환에서 신경세포의 산화 스트레스 민감도를 감소시키기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PDH의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 신경 퇴행성 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 신경 퇴행성 질환 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, DJ-1 결실 파킨슨병 초파리 모델에서, PDK 활성화, DJ-1 및 HIF-1을 통한 PDK 발현 촉진, PDP 억제, 또는 PDH 억제제를 이용한 PDH의 유전적 및 약리학적 억제에 의해 ROS에 대한 민감도가 낮아지고, 도파민성 신경세포의 사멸이 현저히 감소되었으므로, 이들을 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.
도 1은 PDK P 초파리의 특성을 확인한 도이다:
A: 첫 번째 엑손에 P-인자가 삽입된 PDK 돌연변이체 (PDK P )의 게놈 구조 모식도 (검은색 직사각형: 코딩 서열, 회색 직사각형: 비번역 영역);
B: 야생형 초파리 (WT) 및 PDK 돌연변이체 초파리 (PDK P )의 사진;
C: 야생형 초파리 (WT) 및 PDK 돌연변이체 초파리 (PDK P )에서 PDK 및 인접 유전자 pre1의 mRNA 발현 수준;
D: 야생형 초파리 (WT) 및 PDK 돌연변이체 초파리 (PDK P )에서의 ATP 함량;
E: 야생형 초파리 (WT) 및 PDK 돌연변이체 초파리 (PDK P )에서의 mtDNA 함량;
F: 로테논 (0.2mM)에 의해 유발된 산화 스트레스 하의 야생형 초파리 (WT) 및 PDK 돌연변이체 초파리 (PDK P )의 생존율; 및
G: H2O2 (1%)에 의해 유발된 산화 스트레스 하의 야생형 초파리 (WT) 및 PDK 돌연변이체 초파리 (PDK P )의 생존율.
도 2는 산화 스트레스에 의해 유도된 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리의 표현형에 대한 PDK 과발현에 의한 영향을 확인한 도이다:
A: 로테논 (0.2mM) 처리 후 대조군 초파리 (hs), DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (hs DJ-1β ex54 ) 및 PDK 과발현 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (hs>PDK DJ-1β ex54 )의 생존율;
B: H2O2 (1%) 처리 후 대조군 초파리 (hs), DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (hs DJ-1β ex54 ) 및 PDK 과발현 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (hs>PDK DJ-1β ex54 )의 생존율;
C: H2O2 처리 후 6일령 대조군 초파리 (elav), DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (elav DJ-1β ex54 ) 및 PDK 과발현 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (elav>PDK DJ-1β ex54 )에서 DL1, DM, PM 및 DL2 클러스터 내 도파민성 신경세포의 형광 이미지; 및
D: H2O2 처리 후 6일령 대조군 초파리 (elav), DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (elav DJ-1β ex54 ) 및 PDK 과발현 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (elav>PDK DJ-1β ex54 )에서 DL1, DM, PM 및 DL2 클러스터 내 평균 도파민성 신경세포의 수.
도 3은 산화 스트레스에 의해 유도된 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리의 표현형에 대한 PDP 돌연변이에 의한 영향을 확인한 도이다:
A: 첫 번째 엑손에 P-인자가 삽입된 PDP 돌연변이체 (PDP P )의 게놈 구조 모식도 (검은색 직사각형: 코딩 서열, 회색 직사각형: 비번역 영역);
B: 야생형 (WT) 및 PDP 돌연변이체 (PDPP)의 PDP 및 Rab39의 mRNA 발현 수준;
C: H2O2 (1%) 처리 후 대조군 초파리 (WT),　DJ-1 β　결손 돌연변이 초파리 (DJ-1 β ex54 ), PDP 돌연변이 초파리 (PDP P ), 및　PDP P 　및　DJ-1 β　이중 돌연변이 초파리 (PDP P 　DJ-1 β ex54 ) 군의 생존율;
D: H2O2 처리 후 6일령 대조군 초파리 (WT),　DJ-1β　결손 돌연변이 초파리 (DJ-1β ex54 ), PDP 돌연변이 초파리 (PDP P ), 및　PDP P 　및　DJ-1β　이중 돌연변이 초파리 (PDP P 　DJ-1β ex54 ) 군의 DL1, DM, PM 및 DL2 클러스터 내 도파민성 신경세포의 형광 이미지; 및
E: H2O2 처리 후 6일령 대조군 초파리 (WT),　DJ-1β　결손 돌연변이 초파리 (DJ-1β ex54 ), PDP 돌연변이 초파리 (PDP P ), 및　PDP P 　및　DJ-1β　이중 돌연변이 초파리 (PDP P 　DJ-1β ex54 ) 군의 DL1, DM, PM 및 DL2 클러스터 내 평균 도파민성 신경세포의 수.
도 4는 DJ-1의 PDK 발현 유도 기전을 확인한 도이다:
A: H2O2 (1%) 처리 후 야생형 (WT), DJ-1β 결손 돌연변이체 (DJ-1β ex54 ), 및 이형접합의(heterozygous) VHL 돌연변이를 가진 DJ-1β 결손 돌연변이체 (VHL -/+ DJ-1β ex54 )에서 PDK mRNA 발현 수준;
B: H2O2 (1%) 처리 후 야생형 (WT), DJ-1β 결손 돌연변이체 (DJ-1β ex54 ), 및 이형접합의(heterozygous) VHL 돌연변이를 가진 DJ-1β 결손 돌연변이체 (VHL -/+ DJ-1β ex54 )의 생존율;
C: H2O2 처리 후 6일령 야생형 (WT), DJ-1β 결손 돌연변이체 (DJ-1β ex54 ), 및 이형접합의(heterozygous) VHL 돌연변이를 가진 DJ-1β 결손 돌연변이체 (VHL -/+ DJ-1β ex54 )의 DL1, DM, PM 및 DL2 클러스터 내 평균 도파민성 신경세포의 수;
D: H2O2 처리 후 6일령 elav-GAL4 대조군 (elav), DJ-1β 결손 돌연변이체 (elav DJ-1β ex54 ) 및 Sima-과발현 DJ-1β 결손 돌연변이체 (elav>sima DJ-1β ex54 )의 DL1, DM, PM 및 DL2 클러스터 내 평균 도파민성 신경세포의 수;
E: PDK 유전자위에서 추정되는 HRE(hypoxia response elements)의 맵 모식도; 및
F: Sima-트랜스펙션된 S2 세포에서 PDK 리포터의 루시퍼레이즈 활성 비교 (WT: 야생형 리포터 플라스미드, HRE1: HRE1 부위-돌연변이, HRE2: HRE2 부위 돌연변이, 및 HRE1,2: HRE1 & HRE2-돌연변이).
도 5는 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리에서 PDH 억제제인 CPI-613에 의한 산화 스트레스 보호 효과를 확인한 도이다:
A: 1% H2O2 처리 후 야생형 (WT),　DJ-1 β　결손 돌연변이체 (DJ-1 β ex54 ) 및 CPI-613-처리한 DJ-1 β　결손 돌연변이체 (DJ-1 β ex54 CPI-613)의 생존율;
B: 0.2 mM 로테논 처리 후 야생형 (WT),　DJ-1β　결손 돌연변이체 (DJ-1β ex54 ) 및 CPI-613-처리한 DJ-1β　결손 돌연변이체 (DJ-1β ex54 CPI-613)의 생존율;
C: 로테논 처리 후 6일령 초파리 DL1, DM, PM 및 DL2 클러스터 내 평균 도파민성 신경세포의 수; 후
D: 로테논 처리 후 6일령 초파리의 DL1, DM, PM 및 DL2 클러스터 내 평균 도파민성 신경세포의 수.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 PDH(pyruvate dehydrogenase)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 신경 퇴행성 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 인지기능 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 파킨슨병인 것이 바람직하며, DJ-1의 결손/결실에 의한 파킨슨병인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, PDH의 발현 억제제는 PDH 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 앱타머일 수 있다.
일 구현예에서, PDH의 활성 억제제는 PDH 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 억제하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체 또는 앱타머일 수 있다.
일 구현예에서, PDH의 활성 억제제는 CPI-613(Devimistat), PDK(PDH kinase)또는 PDK의 발현 또는 활성 촉진제, 또는 PDP(PDH phosphatase)의 발현 또는 활성 억제제일 수 있으며, PDK의 발현 촉진제는 DJ-1 또는 이의 발현 촉진제, 또는 HIF-1(hypoxia-inducible factor 1) 또는 이의 발현 촉진제일 수 있다.
일 구현예에서, PDK, DJ-1 또는 HIF-1의 발현 촉진제는 바람직하게는 PDK, DJ-1 또는 HIF-1의 발현량을 증가시킬 수 있는 물질이며, 더욱 바람직하게는 PDK, DJ-1 또는 HIF-1를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터일 수 있으나, PDK, DJ-1 또는 HIF-1의 발현을 촉진시키는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, PDH 또는 PDP의 "발현 또는 활성 억제제"란 PDH 또는 PDP에 직접 또는 간접적으로 작용하여 PDH 또는 PDP의 발현을 감소 또는 억제시키는 물질을 의미하며, PDH 또는 PDP의 활성 또는 발현을 저해하는 물질이라면, 화합물, 단백질, 융합 단백질, 항체, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산, 추출물, 분획물 등을 포함할 수 있고, 상기 물질의 종류에는 제한이 없다. 상기 물질이 PDH 또는 PDP의 발현 또는 활성을 촉진시키는 기작은 특별히 제한되지 않으며, 일례로 전사, 번역 등의 유전자 발현을 증대시키거나, 활성형을 비활성형으로 전환시키는 기작으로 작용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “PDK, DJ-1 또는 HIF-1의 발현 촉진제”란 PDK, DJ-1 또는 HIF-1에 직접 또는 간접적으로 작용하여 PDK, DJ-1 또는 HIF-1의 발현을 개선, 유도, 자극, 증가시키는 물질을 의미하며, 상기 물질의 종류에는 제한이 없다. 상기 물질이 PDK, DJ-1 또는 HIF-1의 발현을 촉진시키는 기작은 특별히 제한되지 않으며, 일례로 전사, 번역 등의 유전자 발현을 증대시키거나, 비활성형을 활성형으로 전환시키는 기작으로 작용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "재조합 벡터(recombination vector)"란 PDK, DJ-1 또는 HIF-1를 발현시킬 수 있도록 제작된 벡터를 총칭하며, 바람직하게는 리포좀, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하며, PDK, DJ-1 또는 HIF-1를 체내에서 발현시킬 수 있는 벡터라면 이에 제한되지 않는다. 상기 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노부속바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 단순포진바이러스(herpes simplex virus), 알파바이러스(alpha virus) 등이 있다.
본 명세서에 있어서, "예방(prevention)"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 신경 퇴행성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "치료(treatment)"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 신경 퇴행성 질환 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 명세서에 있어서, "개선(improvement)"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 행위를 의미한다. 이때 상기 본 발명의 조성물을 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선을 위하여 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 개체의 상태 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 건강상태, 신경 퇴행성 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 경구 투여 하는 것이 가장 바람직하다. 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 PDH의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경 퇴행성 질환에서 신경세포의 산화 스트레스 민감도를 감소시키기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 산화 스트레스가 신경세포에 미치는 손상에 대하여 보호 효과를 나타내며, 상기 신경세포는 도파민성 신경세포일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 PDH의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 신경 퇴행성 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 신경 퇴행성 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 인지기능 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 파킨슨병인 것이 바람직하며, DJ-1의 결손/결실에 의한 파킨슨병인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 본 발명의 건강기능식품은 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 신경 퇴행성 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 후보 약물의 투여 전과 후의 PDH의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 PDH의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 후보 약물을 선별하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 질환 치료를 위한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 신경 퇴행성 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 인지기능 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 파킨슨병인 것이 바람직하며, DJ-1의 결손/결실에 의한 파킨슨병인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 발현 수준 측정은 mRNA의 발현 수준 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질 수준을 확인함으로써 알 수 있다. mRNA의 양은 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하여 확인할 수 있으며, 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 양은 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 후보 약물 처리군에서 PDH의 발현 또는 활성 수준이 감소되는 경우, 상기 후보 약물을 신경 퇴행성 질환 치료제인 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 수준이 감소한다는 것은 유의적으로 감소하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 수준이 감소하는 것 또는 유의적으로 감소하는 것은 5% 내지 95% (예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%) 감소된 양을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, "스크리닝"은 단백질, 융합 단백질, 항체, 펩티드, 항생물질, 효소, 화합물 등의 물질에 대하여 감수성 또는 활성 등의 특정 성질을 갖고 있는 특정 물질을 찾아내는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서, "신경 퇴행성 질환 치료제 후보 물질"은 통상적인 선정방식에 따라 PDH의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 핵산, 단백질, 항체, 화합물, 추출물 또는 천연물 등일 수 있다. 상기 신경 퇴행성 질환 치료제 후보 물질은 바람직하게는 PDH의 발현 및/또는 활성을 저해하는 물질일 수 있다.
본 명세서에 있어서, "개체(individual)"란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 돌연변이 초파리 제작
PDK P (PDK EY01879 ) 및 PDP P (PDP G1628 ) 돌연변이체를 Bloomington Stock Center에서 입수한 뒤, w 1118 대조군과 6 세대 동안 역교배하여 유전적 백그라운드 효과를 제거하였다. w 1118 , hs-GAL4 및 elav-GAL4 계통도 Bloomington Stock Center에서 입수하였다. PDK P 에서 P-인자(P-element)의 삽입 부위는 PDK ORF(open reading frame)의 +88 bp에 위치하며, PDP P 에서 P-인자 삽입 부위는 PDP 전사 시작 부위의 +52 bp에 위치한다. PDK cDNA를 LD23669 BDGP cDNA 클론으로부터 서브클로닝하고, C-말단 HA(hemagglutinin) 태그와 함께 pUAST 벡터로 삽입하였으며, 이를 w 1118 배아로 미세주입하였다. DJ-1β ex5 4 파리들은 Park et al., 2005에 기재된대로 제작하였으며, dVHL 1 및 UAS-sima는 Dr. Tien Hsu 및 Dr. Pablo Wappner로부터 제공받았다.
결과적으로, 하기 표시된 유전형의 초파리 계통들을 제작하였다: WT (+/Y); PDK P (PDK P /PDK P ); hs (hs-GAL4/+); hs DJ-1β ex54 (hs-GAL4/+; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ); hs>PDK DJ-1β ex54 (hs-GAL4/UAS-PDK; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ); elav (elav-GAL4/+); elav DJ-1β ex54 (elav-GAL4/+; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ); elav>PDK DJ-1β ex54 (elav-GAL4/UAS-PDK; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ); PDP P (PDP P /Y); DJ-1β ex54 (DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ); PDP P DJ-1β ex54 (PDP P /Y;; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ); VHL -/+ DJ-1β ex54 (VHL 1 /+; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ); elav>Sima DJ-1β ex54 (elav-GAL4/UAS-Sima; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ).
실시예 2. PDK 돌연변이체의 특성 확인
2-1. 표현형 및 PDK 발현 확인
3일령의 PDK P 초파리 5마리로부터 총 RNA를 추출한 뒤 역전사하고 QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific, USA)에서 SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japan)를 이용하여 정량적 real-time PCR을 수행하였고, 여기서, Rp49 수준을 내부 대조군으로 사용하고, 하기의 프라이머 세트들을 사용하였다: rp49 F (GCT TCA AGA TGA CCA TCC GCC C) 및 R (GGT GCG CTT GTT CGA TCC GTA AC), PDK F (CTG TTT CCA GTC CGA TTC TCA G) 및 R (CAG AAG GGC GAT CTC CTT CAT G), prel F (CAC CAG GAA CCT GGG AAT GAC) 및 R (CAG CAC GTA GTT GAA TCC ATT GGA G), PDP F (CTC CAT ATA GAT GTT CAA GTT CGT G) 및 R (GTA AAC GAA CTC GTT CTC CCT CAG), 및 Rab39 F (GAC AGC ACC GTG GGC AAG AG) 및 R (GAC TTG GTG ATC GAA CGG AAG C).
첫 엑손에 P-인자를 삽입한 PDK P 초파리 돌연변이 계통 (도 1A)은 성공적으로 성체로 발달한 것으로 나타났다 (도 1B). 또한, PDK P 초파리에서 PDK 전사 수준이 현저하게 감소된 반면 (도 1C), P-인자 삽입 부위에 인접한 유전자인 pre1의 전사 수준에는 변화가 없는 것으로 나타나, PDK P 돌연변이체에서 P-인자 삽입이 PDK 발현을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 1C).
2-2. 미토콘드리아 기능 확인
PDK(pyruvate dehydrogenase kinase)의 생리적 기능을 확인하기 위해, PDK P 돌연변이체에서 미토콘드리아 기능을 나타내는 ATP 수준 및 IFM(indirect flight muscles)에서 미토콘드리아의 수를 정량할 수 있는 mtDNA 함량을 분석하였다. 구체적으로, 5마리의 3일령 및 10일령 수컷 초파리의 흉부에서 총 DNA를 추출하고, Yang et al., 2017에 기재된 방법으로 정량적 real-time PCR을 수행하였으며, Rp49 유전체 DNA(genomic DNA) 수준을 내부 대조군으로 이용하였다. 또한, ATP 분석을 위해, 5마리의 3일령 수컷 초파리의 흉부를 절개하고 ATP 농도를 Yang et al., 2017에 기재된 방법으로 측정하였다. 상대적 ATP 수준은 총 단백질 농도에 대한 ATP 농도 비율로 계산되었고, 총 단백질 농도는 BCA(bicinchoninic acid) 분석으로 결정하였다.
그 결과, 3일령 및 10일령 PDK P 돌연변이체에서 ATP 수준이 대조군에 비해 변하지 않은 것으로 나타났으며 (도 1D), mtDNA 함량에서도 변화가 발견되지 않아 (도 1E), PDK 돌연변이체에서 일반적인 미토콘드리아 기능 및 존재도(abundance)가 유지되는 것을 확인하였다.
2-3. 산화 스트레스 민감도 확인
산화 스트레스에 대한 PDK의 역할을 확인하기 위해, 각 30마리의 3일령 파리로 구성된 대조군 암컷/수컷 초파리군, PDK P 돌연변이 암컷/수컷 초파리군 (n = 90 or 120)들을 6h 동안 공복 유지한 후, PBS, 5% 수크로오스 및 산화 스트레스제 (5 mM 로테논(rotenone) 또는 1% H2O2)를 함유하는 젤이 들어있는 바이알로 옮기고 시간에 따른 사멸 파리의 수를 계수하였다.
그 결과, 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I의 특이적인 억제제인 로테논에 의해 유발된 산화 스트레스 하에 PDK P 초파리의 생존율이 급격히 감소하였으며 (도 1F), PDK P 돌연변이체가 H2O2의 처리에 매우 민감한 것으로 나타나 (도 1G), PDK가 산화 스트레스에 대해 보호 역할을 하는 것을 확인하였다.
실시예 3. PDK 과발현에 의한 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리의 표현형 변화 확인
산화 스트레스에 대한 민감도가 신경 퇴행성 질환, 특히 PD(Parkinson's disease)와 관련되었으므로, DJ-1 돌연변이에 의한 PD에서 산화 스트레스에 대한 PDK의 보호 역할을 확인하기 위해, 산화 스트레스 하에서 (로테논 또는 H2O2) 대조군 초파리 (hs), DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (hs DJ-1β ex54 ) 및 PDK 과발현 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (hs>PDK DJ-1β ex54 )의 생존율을 확인하고, 대조군 초파리 (elav), DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (elav DJ-1β ex54 ) 및 PDK 과발현 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리 (elav>PDK DJ-1β ex54 )에서 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)의 수가 PDK 발현에 의해 변화되는지 확인하였다. 구체적으로, 30마리의 3일령 수컷 초파리를 6h 동안 굶긴 뒤 3일 동안 PBS, 5% 수크로오스 및 산화 스트레스제 (0.2 mM 로테논(rotenone) 또는 1% H2O2)를 함유하는 젤이 들어있는 바이알로 옮기고, Yang et al., 2017에 기재된 바와 같이 뇌를 적출한 뒤 4% 포름알데하이드로 고정한 뒤 항-TH 래빗 항체 (1:50; Pel-Freez, USA)로 염색하였다. 염색된 뇌 시료를 LSM 700 confocal microscope (Zeiss, Germany)로 관찰하고 DA 뉴런(도파민성 신경세포) 수의 변화를 확인하였다.
그 결과, 로테논 처리 하에 DJ-1β 결손 돌연변이체가 대조군에 비해 감소된 생존율을 나타냈으며, 특히, PDK의 과발현에 의해 DJ-1β 결손 돌연변이체의 감소된 생존율을 회복시키는 것으로 나타났다 (도 2A). 또한, PDK의 과발현은 H2O2 조건 하에서도 DJ-1β 결손 돌연변이체의 감소된 생존율을 회복시키는 것으로 나타났다 (도 2B). 또한, 산화 스트레스 하에, DJ-1β 결손 돌연변이체의 DL1(dorsolateral 1) 및 DM(dorsomedial) 클러스터에서 DA 뉴런의 수가 현저히 감소된 것으로 나타났으며, 이는 PDK의 과발현에 의해 효과적으로 억제되었다 (도 2C 및 D). 이와 같이, PDK 가 DJ-1β 결손 돌연변이체에서 산화 스트레스에 의해 유도된 표현형을 회복시켰으므로, PDK가 산화 스트레스에 대해 보호 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
실시예 4. PDP 돌연변이에 의한 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리의 표현형 변화 확인
PDC(PDH complex)의 첫 컴포넌트인 PDH(pyruvate dehydrogenase) E1 서브유닛을 PDK 및 PDP(PDH phosphatase)가 인산화/탈인산화함으로써 PDC의 활성을 조절하므로, PDP의 돌연변이에 의한 DJ-1β 결손 돌연변이 초파리의 표현형 변화를 확인하기 위해, 첫 번째 엑손에 P-인자가 삽입된 PDP 돌연변이체 (PDP P ) (도 3A)의 산화 스트레스에 의한 표현형 변화를 상기 실시예 3의 방법으로 확인하였다.
그 결과, PDP P 돌연변이체에서 PDP mRNA 발현은 감소되고 PDP의 옆에 위치한 유전자인 Rab39의 발현은 변화하지 않았다 (도 3B). 또한, H2O2 처리 하에 DJ-1β 결손 돌연변이체의 감소된 생존율이 PDP 돌연변이에 의해 현저히 회복되었다 (도 3C). 또한, PDP 돌연변이는 DJ-1β 결손 돌연변이체에서 H2O2에 의해 유발된 DA 뉴런 손실을 억제하였다 (도 3D 및 E). 이를 통해, PDP의 결손이 DJ-1β 결손 돌연변이체에서 산화 스트레스에 의해 유발된 표현형을 회복시키며, PDK 과발현을 약화시키는 것을 알 수 있다. 따라서, PDH 하향 조절이 DJ-1β 결손 돌연변이체를 산화 스트레스로부터 보호하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. PDK 발현 조절 경로 확인
산화 스트레스 하에서 PDK 발현 수준을 확인한 결과, H2O2 처리에 의해 야생형 초파리에서는 PDK의 mRNA 발현 수준이 증가되었으나, DJ-1β 결손 돌연변이체에서는 그렇지 않은 것으로 나타나 (도 4A), 산화 스트레스가 DJ-1 의존적인 방식으로 PDK의 발현 수준을 조절하는 것을 확인하였다. 이에, 이의 조절 기전을 확인하기 위해, DJ-1β 결손 돌연변이체에 VHL 돌연변이를 유도한 초파리 VHL -/+ DJ-1β ex54 (VHL 1 /+; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 )에서 산화 스트레스 하에서 PDK 발현 수준을 확인한 결과, H2O2에 의해 PDK mRNA 발현 수준이 증가되는 것으로 나타났다 (도 4A). 또한, VHL 돌연변이는 DJ-1β 결손 돌연변이체의 생존율을 증가시켰으며 (도 4B), 산화 스트레스 하의 DA 뉴런 사멸을 억제하는 것으로 나타났다 (도 4C). 또한, 포유동물의 HIF-1a의 초파리 동원체(orthologorthologue)인 Sima의 과발현 (elav>Sima DJ-1β ex54 (elav-GAL4/UAS-Sima; DJ-1β ex54 /DJ-1β ex54 ))이 DJ-1β 결손 돌연변이체에서 산화 스트레스로부터 DA 뉴런을 보호하는 것으로 나타났다 (도 4D). Sima의 PDK 유전자에 대한 전사 촉진(transactivation) 활성을 측정하기 위해, 프로모터 영역 (도 4E)을 pGL3 리포터 플라스미드 (Promega, Madison, WI, USA)에 하기 프라이머를 이용하여 서브클로닝하였다: PDK 프로모터 F (CGC ACG CGT CCA ACA CTT GTA GTG GTT AAA AGT GTA G) 및 R (CGC AGA TCT CTC ACT CTC TTC GCA GGA CGT TG). HRE 돌연변이를 가진 PDK 리포터는 하기 프라이머 세트와 QuikChangeTM site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies, USA)를 이용하여 제작하였다: HRE1 mut F (ACA CTG CGG CTC TCC CGA TCA AAA GCG CTC GCA GC) 및 R (GCT GCG AGC GCT TTT GAT CGG GAG AGC CGC AGT GT); 및 HRE2 mut F (CCC GCC TTT CAA CAC AAA AAC AAC AAC AAC AAA TCG GAG CAG AGC TAA CAC AA) 및 R (TTG TGT TAG CTC TGC TCC GAT TTG TTG TTG TGT TGA AAG GCG GG). 그 후 야생셩 또는 HRE 돌연변이 PDK 리포터, pUAST-Sima, pR-TK Renilla 리포터, 및 pMT-GAL4 플라스미드를 초파리 S2 세포주에 동시 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 2일 후, CuSO4를 처리하여 Sima 발현을 유도하고 24시간 후에 Dual-LuciferaseTM Reporter Assay Kit (Promega)를 이용하여 루시퍼레이즈 분석을 수행하였다. 그 결과, 프로모터 활성이 Sima 발현에 의해 증가하고 HRE1 돌연변이에 의해 감소하는 것으로 나타났다 (도 4F). 따라서, DJ-1이 VHL-HIF-1 경로를 통해 PDK 발현을 조절하여 DA 뉴런을 산화 스트레스로부터 보호하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. PDH 억제제에 의한 DJ-1β 결손 돌연변이체의 산화 스트레스 보호 효과 확인
PDH의 PDK-의존적 인산화를 유도하여 PDC 활성을 억제하는 CPI-613가 산화 스트레스에 의한 DJ-1β 결손 돌연변이체의 표현형에 미치는 영향을 확인하였다. 3일령의 초파리에 CPI-613 (10 mM) 또는 비히클 (대조군)을 처리하고 산화 스트레스에 의한 생존율을 확인한 결과, DJ-1β 결손 돌연변이체의 산화 스트레스 (H2O2 또는 로테논)에 의한 생존율 감소가 CPI-613 처리에 의해 현저하게 회복되는 것으로 나타났다 (도 5A 및 B). 또한, CPI-613가 산화 스트레스에 의한 DJ-1β 결손 돌연변이체의 DL1 및 DM 클러스터에서의 DA 뉴런 사멸을 억제하는 것으로 나타났다 (도 5C 및 D). 이를 통해, PDH 억제가 산화 스트레스에 의해 유도된 DJ-1β 결손 돌연변이체의 표현형을 회복시킬 수 있으므로, CPI-613이 DJ-1 관련 발병을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (12)

  1. PDH(pyruvate dehydrogenase)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 신경 퇴행성 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 인지기능 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, PDH의 발현 억제제는 PDH 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 앱타머인, 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, PDH의 활성 억제제는 PDH 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체 또는 앱타머인, 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, PDH의 활성 억제제는 CPI-613(Devimistat), PDK(PDH kinase), PDK의 발현 또는 활성 촉진제, 또는 PDP(PDH phosphatase)의 발현 또는 활성 억제제인, 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, PDK의 발현 촉진제는 DJ-1 또는 이의 발현 촉진제, 또는 HIF-1(hypoxia-inducible factor 1) 또는 이의 발현 촉진제인, 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. PDH의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경 퇴행성 질환에서 신경세포의 산화 스트레스 민감도를 감소시키기 위한 약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 산화 스트레스가 신경세포에 미치는 손상에 대하여 보호 효과를 나타내는, 약학적 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 도파민성 신경세포인, 약학적 조성물.
  10. PDH의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 신경 퇴행성 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 신경 퇴행성 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 인지기능 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 신경 퇴행성 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  12. 신경 퇴행성 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 단계;
    후보 약물의 투여 전과 후의 PDH의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    대조군 시료와 비교하여 PDH의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 후보 약물을 선별하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 질환 치료를 위한 약물 스크리닝 방법.
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