MX2010009384A - Uso de s-adenosilmetionina (sam) y superoxido dismutasa (sod) para la preparacion de medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

El uso de S-adenosilmetionina (SAM) en combinación con superóxido dismutasa (SOD) para la preparación de medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Description

USO DE S-ADENOSILMETIONINA (SAM) Y SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD) PARA LA PREPARACIÓN DE MEDICAMENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER La presente invención se refiere al uso de S-adenosilmetionina (SAM) en combinación con superóxido dismutasa (SOD) para la preparación de medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (AD) es una forma neurodegenerativa de demencia que estás muy difundida, que afecta a un alto porcentaje de la población mundial de más de 70 años, con una relación de 1 :2 entre hombres y mujeres. La incidencia de AD aumenta constantemente, como la forma no genética más común empieza alrededor de la edad de 70-75, y la espectativa de vida aumenta debido a los estándares de vida más altos en combinación con el progreso de la medicina y la farmacología. Esta enfermedad también existe como una forma genéticamente trasmitida asociada con mutaciones en algunos loci de cromosomas 14, 19 y 21 (típico en personas que sufren del síndrome de Down). El inicio temprano de la forma familiar de AD se lleva a cabo alrededor de los 50 años, y produce una degeneración del cerebro seguida por la muerte en 2 a 3 años. La forma de inicio tardío de la enfermedad también da lugar a la degeneración del cerebro y a la muerte, pero en un período de 10 años o más.

El cerebro presenta un gran número de placas en los espacios interneuronales y los típicos ovillos neurofibrilares en las neuronas, especialmente en la corteza cerebral, hipocampo y amígdala, y en otras partes del cerebro con funciones cognitivas. Las placas amiloides, también conocidas como placas seniles, son polímeros del péptido beta-amiloide (?ß), que se derivan de una proteína más grande: la proteína precursora beta-amiloide (APP). La APP es un miembro de la superfamilia altamente conservada de glicoproteínas transmembranales.

En la década pasada se llevaron a cabo numerosos estudios conducidos por científicos comprometidos en la investigación de la AD con la visión de entender su etiología, especialmente tomando en cuenta los mecanismos moleculares. La investigación sobre los componentes moleculares y su regulación puede aclarar sus prospectos terapéuticos y de diagnóstico. Se ha enfocado la tensión sobre las presenilinas, cuyo papel en el proceso de APP, y por lo tanto la producción de ?ß, parece ser altamente importante. Se ha de mostrado que estas proteínas, presenilina 1 (PS1) y presenilina 2 (PS2), presentan una actividad enzimática o regulan las actividades de otras enzimas, a saber secretasas, que dividen APP en catabolitos normalmente degradables (alfa-secretasa) o en péptidos ?ß (beta y gama-secretasa). En la AD familiar, las mutaciones de los genes que codifican para PS1 y PS2 llevan a una producción excesiva de ?ß y la acumulación de isoforma ?ß-42 en particular, que es altamente amiloidogénica. Recientemente, experimentos con ratones noqueados con PS1 evidenciaron una gran reducción en la actividad de gama-secretasa, demostrando que la PS1 , así como la pertenencia al complejo gama-secretasa, también tienen una gran responsabilidad en la producción y acumulación de ?ß. En los que se refiere a la beta-secretasa, se cree que el producto del gen BACE puede realizar solo la escisión de beta-secretasa.

El desarrollo de inhibidores de gama y beta-secretasa clínicamente útiles podría proporcionar un arma importante contra la enfermedad de Alzheimer, y actualmente es una de las competencias más excitantes en la neurociencia. Se ha demostrado claramente que la actividad de PS1 no se puede suprimir por completo, debido a que esta proteína se necesita para procesar el factor de transducción Notch-1 , un factor importante para la maduración de muchas células madre, como las que están involucradas en eritropoyésis.

La regulación de la expresión de genes por medio de la mutilación de ADN se puede estudiar exitosamente en un sistema de cultivo celular capaz d expresar los genes que están involucrados en la AD. Como resultado de nuestros estudios, se encontró una indicación muy interesante en los mecanismos reguladores que están involucrados en el envejecimiento, que consiste en un incremento gradual y global en la hipometilación de ADN en los pacientes de edad avanzada en los que se observa una acumulación de homocisteína, que sufren de demencia senil. La acumulación de homocisteína y la hipometilación de ADN están correlacionados metabólicamente, ya que la falla de la homocisteína que debe convertirse en metionina, invierte el metabolismo hacia la síntesis de S-adenosilhomocisteína, de la cual se sabe que es un fuerte inhibidor de ADN-metíltransferasa, y por lo tanto induce la hipometilación de ADN. De acuerdo con la teoría bien establecida de que muchos genes son expresados cuando las citosinas de secuencias específicas son desmetiladas, este patrón bioquímico puede llevar a la expresión de genes no expresados y a la sobreexpresión de genes normalmente expresados. Éste puede ser el caso de AD, ya que la sobreexpresión de PS1 , es decir gama-secretasa, puede exceder discontinuamente la actividad de alfa-secretasa, y por lo tanto producir el péptido ?ß, que se acumula, y puede causar la enfermedad después de muchos años. Otra indicación del posible papel de la metilación de ADN en la AD, es el hallazgo de que los pacientes de AD presentan niveles mucho más bajos post mortem donadores de metilo en el cerebro. La disponibilidad inferior de S-adenosilmetionina (SAM) podría llevar fácilmente a una expresión alterada o incrementada del os genes involucrados en el metabolismo de APP, produciendo eventualmente una acumulación del péptido ?ß en las placas seniles.

Se realizaron experimentos preliminares sobre una línea de neuroblastomas (SK-N-SH) que expresa APP, PS1 , PS2, BACE, alfa-secretasa, los otros componentes de gama-secretasa, y Notchl Los cultivos fueron tratados con un medio de cultivo que carecía de folato, vitamina B12 y vitamina B6 (para alterar el metabolismo de homocisteína), al cual se añadió SAM en varias concentraciones (para balancear los efectos de la falta de vitaminas). Encontramos un aumento en la expresión de PSI y BACE en el medio sin vitamina B, y una marcada reducción en la expresión de PSI y BACE después de la administración de SAM. En los experimentos que se llevaron a cabo con Hpall/PCR en promotores de APP y PS1 , encontramos una mayor diferencia en la metilación de uno de los sitios CpG del promotor de PS1. Concluimos que el gen PS1 puede ser silenciado parcialmente con la administración de SAM exógeno. La administración de SAM puede reducir la expresión PS1 , restaurando el balance metabólico a favor de alfa-secretasa. También se llevaron a cabo experimentos con ratones transgénicos de la cepa TgCRND8, y controles correspondientes; estos ratones se caracterizaron por la presencia del gen APP humano mutado, y por lo tanto pueden desarrollar placas amiloides en corto tiempo. Estos animales fueron alimentados con una dieta completa o con una dieta carente de vitaminas del grupo B; una vez más como sucede con las células, se observó un aumentó en la expresión de PSI y BACE.

En ambos modelos experimentales, la alteración de la expresión del gen tuvo el efecto de aumentar las actividades de gama - y beta-secretasa con la consecuente sobreproducción de ?ß, que se acumuló para formar placas seniles más rápidamente que en los animales tratados con la dieta de control.

Los datos resumidos arriba han sido reportados en las siguientes publicaciones: Fuso A., Nicolia V., Cavallaro R.A., Ricceri L, D'Anselmi F., Coluccia P., Calamandrei G. y Scarpa S. 2008. B-Vitamin Deprivation Induces Hyperhomocysteinemia and Brain S-adenosylhomocsyteine, Repletes Brain S-adenosylmethionina, and Enhances PSI and BACE Expression and Amyloid-ß Deposition in Mice. Mol. Cell. Neurosci. 37: 731-746.

Fuso A., Cavallaro R.A., Zampelli A., D'Anselmi F., Piscopo P., Confaloni A. y Scarpa S. 2007. ?-secretase is differentially modulated by alterations of Homocysteine cycle in neuroblastoma and glioblastoma cells. J. Alz. Dis. 11 : 275-290.

Cavallaro R. A., Fuso A., D'Anselmi F. y Scarpa S. 2006. The effect of S-adenosylmethyonine on CNS gene expression studied by cDNA mycroarrays analysis J. Alz. Disease. 9:415-419.

Scarpa S., Cavallaro RA, D'Anselmi F. y Fuso A. 2006. Gene silencing through methylation: an epigenetic intervention on Alzheimer Disease. J. Alz. Disease. 9: 407-414.

Fuso A., Seminara L, Cavallaro R.A., D'Anselmi F. y Scarpa S. 2004. Homocysteine/S-adenosylmethionina Cycle Alterations Unbalance DNA Methylation Status with Consequent Up-regulation of Beta-amyloid Production. Mol. Cell. Neurosci. 28(1):195-204.

Scarpa S., Fuso A., D' Anselmi F., Cavallaro R.A. 2003. Presenilin 1 gene silencing by S-adenosylmethionine: a treatment for Alzheimer disease? FEBS Letters 541 (1-3):145-148.

Fuso A., Cavallaro R. A., Orru L., Buttarelli F.R. y Scarpa S. 2001. Gene silencing by S-adenosylmethionine in muscle differentiation. FEBS Letters 508 (3): 337-340.

El uso de SAM para tratar la AD también fue propuesto en los documentos US 2002/025926 y US 2004/0048827. El último documento demostró la capacidad de SAM para interferir con la expresión del gen precursor de beta-secretasa, penicilina 1 y 2 y la proteina beta amiloide. Se llevaron a cabo estudios con SAMe marcada (tritiada) después de que dicha solicitud de patente demostró la capacidad de la molécula de alcanzar el sistema nervioso central después de la administración oral, como se reporta a continuación.

El efecto benéfico de SOD en el tratamiento de AD se sugiere en los documentos US 5519058 y en CN 1099224.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden SAM y SOD junto con un número de ingredientes activos, para usarlos en condiciones diferentes a AD, se describen en los documentos US 2003/129261 y en WO 2005/041996.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ahora se ha encontrado que la actividad de S-adenosilmetionina se puede mejorar sorprendentemente cuando se administra en combinación con superóxido dismutasa (SOD). Esta enzima no solamente ha demostrado ser capaz de facilitar el paso de S-adenosilmetionina a través de la barrera de sangre-cerebro, sino que también interactúa sinérgicamente con SAM en la reducción de la expresión de los genes PS1 y BACE que son sobreexpresados como resultado de la deficiencia de vitamina B.

Por lo tanto un aspecto de la invención se refiere a productos que contienen S-adenosilmetionina o un derivado de la misma y superóxido dismutasa en forma de una preparación combinada para la administración simultánea, separada o secuencial, en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La dosis puede variar en una amplia escala en vista de la muy baja toxicidad de SAM y SOD, y dependerá de varios factores, como el peso del paciente, el sexo y la edad. Sin embargo, hablando en forma general, serán de entre 200 y 2000 mg/día para SAM y de entre 50 y 1000 mg/día para SOD.

La SAM se puede administrar, de preferencia oralmente, ya sea tal como está o en forma de una sal estable de la misma, como tosilato, butanodisulfonato, bisulfato tosilato, disulfato ditosilato o disulfato monotosilato. Una forma ventajosa de administración es en células de Saccharomyces cerevisiae enriquecidas con SAM, que se describe en el documento WO 2006/131382.

La SOD, obtenida por la fermentación de cepas de Saccharomyces cerevisiae como se describe en el documento WO 2006/131382 presentado por el solicitante, también se puede administrar oralmente, apoyada en una película de gliadina, o usando otras técnicas de gastroprotección. Como alternativa a la ruta oral, las SAM y SOD se pueden administrar en forma parenteral, como por ejemplo, por medio de una inyección intramuscular.

Ejemplos de estas formulaciones incluyen tabletas revestidas con películas con polímeros acrílicos o metacrílicos, cápsulas gastrorresistentes, microcápsulas y similares.

Las SAM y SOD pueden estar presentes en la misma unidad de dosis o se pueden formular y administrar por separado: en este caso, se pueden proporcionar kits que comprenden los dos fármacos en formas de dosis separadas acompañadas por instructivos para su ' uso secuencial, simultáneo o separado.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y 1 B muestran el efecto de SAM y SOD en ratones, en la sobreexpresíón de PS1 y BASE inducida por una dieta carente de vitaminas B.

Las figuras 2A y 2B muestran el efecto de SOD y glutationa (GSH) en la sobreexpresión de PS1 y BASE en células de neuroblastoma de la línea SK-N-BE, solas o en combinación con SAM.

La figura 3 muestra los niveles de SAM tritiada en los cerebros de ratones después de la administración oral de SAM 400 µg/día.

La figura 4 muestra la medida de producción amiloide-beta en células de neuroblastoma humanas después de una semana de tratamiento.

Las figuras 5A y 5B muestran el efecto de SAM y SOD en estado oxidativo en eritrocitos y cerebro de ratones tratados con una dieta carente de vitamina B Ahora se describirá la invención con mayor detalle por medio de pruebas farmacológicas que se describen a continuación a manera de ejemplo.

EJEMPL0 1 Expresión de genes En particular, se probó el efecto de la SAM en concentraciones farmacológicas 400 µg/día en ratones TgCRND8 y los correspondientes controles de tipo silvestre.

Canales de expresión de genes Se extrajo ARN de cultivos celulares de cerebros homogenizados, y se sintetizó ADNc. Se utilizaron 0.5 µ9 del total de ADNc para cada reacción en tiempo real en una máquina Opticon2 DNA Engine (MJ Research) utilizando reactivos SYBR-Green. Se determinó previamente la eficiencia de amplificación para cada par de cebadores por medio de amplificación de una curva lineal estándar. Las muestras experimentales se compararon con una curva estándar de un gen específico para determinar la cantidad de ADNc específico presente en la reacción estándar. Los estándares se obtuvieron a partir de productos de PCR altamente purificados amplificados por controles positivos. Los niveles de ADNc totales se normalizaron al control de ß-actina (mantenimiento de genes).

Los resultados demuestran que SAM también invierte la sobreexpresión de PSI y BASE inducida por una dieta carente in vivo (figuras 1A y 1 B), e incluso lo reduce a los niveles más bajos que los de la dieta de control.

Como el metabolismo de homocisteina está involucrado en ambas reacciones de mutilación y óxidoreducción, nosotros probamos el efecto de varios antioxidantes sobre la expresión de los dos genes. Los primeros datos obtenidos con células de neuroblastoma de la línea SK-N-BE demostraron que tanto SOD como la glutationa (GSH) exhiben sobreexpresión de PSI y BACE inducida por la carencia de vitaminas, aunque en una menor extensión que SAM. Sin embargo, es interesante notar que cuando se administran SOD y SAM juntas, presentan un efecto sinérgico (figuras 2A y 2B) que reduce adicionalmente la expresión de los dos genes a niveles más bajos que los observados con SAM sola (15-20% menos).

EJEMPLO 2 Captación de SAM Se llevaron a cabo experimentos en células y ratones para demostrar que SAM cruza la barrera de sangre-cerebro.

Para los cultivos celulares, se añadieron 100 µ? de SAM al medio de cultivo de células F14 (completo o carente de vitamina B, de acuerdo con el diseño de ensayo) y se detuvieron los cultivos después de 96 horas.

Para los ratones, se administraron 400 µg/día de SAM oralmente por una aguja de sonda de alimentación, y los animales fueron sacrificados después de dos meses; los animales fueron alimentados con una dieta completa o con una dieta carente de vitamina B, de acuerdo con el diseño de ensayo. Se analizaron los niveles de SAM por HPLC con un sistema Varían HPLC. Las células y los cerebros homogenizados fueron lisados con agua destilada, y se precipitaron las macromoléculas con 1.5 M PCA. Se calcularon curvas de SAM estándar antes y después de las muestras experimentales. Para el análisis de SAM tritiada, las células fueron tratadas como se describió antes, mientras que los ratones fueron tratados durante 4 días para reducir al mínimo la exposición al fármaco radioactivo. Las células y los cerebros homogenizados fueron lisados con agua destilada. Una porción de los cerebros lisados fue sonicada y centrifugada para separar las membranas y los organelos de la célula; otra porción fue tratada con ácido perclórico (PCA) después de la sonicación para separar las macromoléculas. Se midió la captación de SAM radioactiva por cintilación con un contador beta.

Se encontró que los niveles intracelulares de SAM aumentaron de uno (control a 2.5-3µ?). Para establecer si el aumento se debió a la captación de SAM exógena en oposición con un aumento en las reservas endógenas en la presencia de concentraciones extracelulares elevadas de la molécula, se llevo a cabo una prueba con SAM radioactiva. Se agregaron 100 µ? de SAM tritiada SAM (SAM[3H]) a cultivos de células SK-N-BE y se evaluó la captación por medio de lisis de células y conteos de radioactividad. Se encontró un conteo de radioactividad de 1.5 µ? de SAM en lisados de células; este valor es comparable con el aumento de 1 a 2.5 veces encontrado en SAM, no tritiada, y claramente indica que el aumento intracelular se debe a la captación de SAM exógena.

Se encontró un aumento similar en los niveles de SAM en lisados de cerebro de los ratones tratados oralmente con 400 pg/día de SAM; una vez más, y se realizó una prueba adicional con SAM[3H] a una concentración de 400 y 800 pg/día. La radioactividad incrementada en los lisados de cerebro totales es comparada con 0.5 ng de SAM por cerebro en ratones tratados con 400 pg de SAM, y 1 ng por cerebro en ratones tratados con 800 µ?t? de SAM (Fig. 3).

Una porción de los lisados de cerebros totales también fue sometida a sonicación y centrifugado para obtener un lisado aclarado (citoplasma), y una porción adicional de este lisado aclarado fue precipitada con ácido perclórico (PCA) para eliminar las proteínas (lisado soluble). Resulta interesante notar que el lisado soluble proveniente de ratones tratados con 800 pg de SAM presenta un nivel de radioactividad comparable con 0.5 ng de SAM (mientras que los lisados totales y aclarados presentaron niveles más altos), indicando que la función de metilo en exceso unida a SAM erógena fue conjugada con otras moléculas de células.

EJEMPLO 3 Producción amiloide en líneas celulares de neuroblastoma Métodos Medios y cultivos celulares Se mantuvo una línea celular humana SK-N-BE de neuroblastoma en un medio F14 con 10% FCS y se cambio a un medio de diferenciación completo (medio de control con 1% FCS más 10 µ? de ácido retinoico) o a un medio de diferenciación deficiente de folato, vitamina B12 y vitamina B6 (deficiente en B). Los cultivos se volvieron alimentar cada segundo día y se detuvo después de 96.

Animales y dietas A aproximadamente tres semanas de edad, los ratones fueron asignados sistemáticamente a un grupo de dieta de control a un grupo de dieta deficiente, recibiendo alimento y agua Ad libitum. El control (AIN-93M; dieta A: folato mg 1.98; Vitamina B12 mg 0.025; Vitamina B6 mg 7) y las dietas experimentales (AIN-93M B; dieta B, deficiente en folato, vitamina B12 y vitamina B6) fueron adquiridos con Mucedola (Italia) Ambas dietas contenían 1 % de sulfatiasol para inhibir la formación de folato por medio de bacterias intestinales y asegurar que la única fuente de folato fuera de dieta. Además, otros tres grupos de animales recibieron SAM (800 pg/día) o SOD (10 U/día) o la combinación de ambos fármacos (SAM 400 pg/día y SOD 5 u/día). Después de una semana de tratamiento, los ratones fueron anestesiados y sacrificados para obtener cerebro y sangre. La sangre fue recogida por punción del corazón en un tubo de ensayo que contenía EDTA 2 g/dl e inmediatamente fue sometida a centrifugado para separar el plasma y los eritrocitos, después se almaceno a -80°C. Los cerebros fueron perfusionados con PBS y removidos.

Análisis amiloide Los cerebros homogeinizados fueron lisados con 50 mM TRIS-HCI pH 7.4, 150 mM NaCI, 0.2% Nonidet P-40, 1 % CHAPS, 2 mM EDTA, PMSF (200 µ?), Leupeptin (1 µ?), Pepstatin A (1 µ?) e inhibidor I de Calpain (5 µ?). Los extractos de proteína fueron utilizados para una prueba de ELISA con un kit de inmunoensayo ?ß 1-42 (BioSource International, Bélgica); el kit de ELISA garantizo una buena sensibilidad lineal hasta 10 pg/mL (1-42). Todas las mediciones se realizaron en triplicado.

Análisis estadístico Se llevó a acabo un computo de ANOVA de una sola vía y una prueba posterior de Bonferroni se utilizó para evaluar cualquier diferencia significativa (p<0.05) reportada.

Resultados A partir de los datos reportados en la figura 4, la sinergia entre SAM y SOD parece evidente y confirmada por el análisis estadístico reportado a continuación, siempre con referencia a la figura 4.

Def. en B vs. Ctrl.: pO.001 Def. en B+SAM y def. en B+SOD vs. def. en B: p<0.001 Def. en B +SAM+SOD vs. def. en B: p<0.001 Def. en B +SAM+SOD vs. def. en B + SAM y def. en B + SOD: p<0.001

Claims (5)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de S-adenos¡lmet¡onina (SAM) es combinación con superóxido dismutasa (SOD) para la preparación de medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento inhibe la sobreexpresión de PS1 y BACE.

3.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 ó 2, en donde los medicamentos se administran oralmente.

4. - Productos que contienen como únicos ingredientes activos: i) S-adenosilmetionina o un derivado de la misma, y ii) superóxido dismutasa, en la forma de una preparación combinada para la administración simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

5. - Los productos de conformidad con la reivindicación 4, caracterizados además porque la SAM tiene la forma de tosilato, butanodisulfonato, disulfato tosilato, bisulfato ditosilato o disulfato monotosiiato, o está contenida en células de Saccharomyces cerevisiae enriquecidas con SAM.