KR101277896B1 - Ｐｍｍｏｖ 내성 고추 식물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고추 속 식물의 게놈에서 L4 내성 대립형질의 존재로 인해, 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물에 관한 것이고, 여기서 SNFD 표현형의 원인이 되는 유전적 정보가 부재하거나 또는 적어도 SNFD 표현형이 발현되지 않는 정도와 같이 억제된다. 본 발명은 a) PMMoV 병원형 1.2.3 또는 그것의 일부에 감수성인 고추 속의 수용체 식물을 제공하고, 그리고 b) 상기 수용체 식물 또는 그것의 일부 또는 그것의 자손 식물, 절단된 L4 대립형질을 포함하는 게놈 영역의 게놈으로 도입의 단계를 포함하는 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물의 생산방법을 제공하고, 여기서 상기 대립형질은 상기 식물 또는 식물의 일부 또는 자손 식물에서 발현될 수 있고 그로 인해 상기 식물 또는 식물의 일부 또는 자손 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 부여할 수 있는 유전적 정보를 포함하고, 그리고 여기서 SNFD 표현형을 부여하는 유전적 정보는 적어도 SNFD 표현형이 발현되지 않는 정도로 상기 대립형질에서 존재하지 않는다.
PMMoV 내성, 고추 식물

Description

ＰＭＭＯＶ 내성 고추 식물 {PMMOV RESISTANT CAPSICUM PLANTS}
본 발명은 질환-내성 식물에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (Pepper mild mottle virus, PMMoV)의 특이적 병원형에 내성인 고추 식물 및 그러한 식물의 생산방법에 관한 것이다.
고추(Capsicum) (Solanaceae 또는 가지속 식물 군)는 그것의 달고 향기로운 과실이 향신료, 야채, 및 약제로서 사용되는 식물 속이다. 상기 속은 약 40 종을 포함한다. 대부분의 품종은 입 안에서 강한 타는 듯한 감각을 만들고 그리고 약제에서 순환 흥분제 및 및 통증 경감제로서 사용될 수 있는 자극성 화학 물질인 캅사이신 (메틸 바닐릴 논엔아미드)을 함유한다. 상기 식물들은 중앙 및 남 아메리카에서 비롯되었지만, 이들은 거의 모든 기후에서 견딜 수 있기 때문에 상기 과실은 전세계에서 생산된다. 시판되는 고추는 우선적으로 카프시쿰 아늄(Capsicum annuum) (종고추, 카옌 고추, 할라피뇨 고추, 애너하임 고추), 카푸시쿰 프르테스켄스(Capsicum frutescens) (타바스코 고추) 및 카푸시쿰 치넨세(Capsicum chinense) (하바네로 고추) 종이다.
파프리카 또는 피망으로도 알려진, 카프시쿰 아늄은 재배종에 따라 길이, 색깔 및 매움의 정도가 변화하는 과실의 1년생 초본 종이다. 상기 종은 전-세계적으로, 예를 들어 서부 유럽 및 미국 (USA)에서 재배된다. 카프시쿰 프르테스켄스 및 카푸시쿰 치넨세는 극도로 매운 작은 과실을 갖고 그리고 타바스코 및 다른 매운 고추 제품에 사용된다. 강한 향을 위해 상당히 온난한 기후가 요구되기 때문에, 상기 종은 열대 지역 및 미국의 보다 온난한 지역에서 우선적으로 재배된다.
Capsicum spp.(고추 속 식물)의 작물들은 재배 동안에 많은 토바모바이러스 (Tobamovirus)들에 의해 손상된다. 토바모바이러스 속은 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 모식종, 혈청학적으로 관계된 토마토 모자이크 바이러스 (ToMV), 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 및 다수의 다른 식물 바이러스들을 포함한다. 상기 바이러스 감염은 식물의 생기를 감소시킬 수는 있지만, 일반적으로 식물을 말려 죽이지는 않는다. 예를 들어, 고추, 토마토 및 가지를 포함하는 넓은 범위의 식물에 영향을 미치는 TMV는 고추 과실에서 괴사를 유발하여 대부분의 과실이 시판가능하지 못하게 한다. TMV는 수년 동안 토양에서 생존할 수 있기 때문에, 상당히 잠복기간이 높은 질환이다.
PMMoV는 TMV 및 ToMV에 내성을 갖는 재배종을 포함하여 모든 Capsicum spp.를 전신적으로 감염시킨다. 종고추 식물에서 질환의 증상은 어린 식물의 발육을 저지하고, 잎을 오그라들게 하고 그리고 노란 반점이 생기게 하는 것을 포함한다. 과실들은 기형 (울퉁불퉁하고 얼룩덜룩한)이 되고 그리고 크기도 약간 작아진다.
1980년대에 그 당시 알려진 PMMoV-내성 고추 계통을 감염시킬 수 있는 TMV-같은 바이러스 (tm-3)의 바이러스성 균주 (strain)가 분리되었다 (Boukema et al., 1980). 분리된 균주는 TMV의 균주 P14라고 명명되었다. 균주 P14의 발견 후에, 이 새로운 바이러스에 내성을 나타내는 식물 종 C. chacoense의 계통 (PI 260429 계통)이 발견되었다 (Boukema, 1980). 후에 이 식물에서 상기 내성은 L-유전자 자리의 L4 대립형질(allele)에 의해 부여되었고 (Boukema, 1984) 그리고 균주 P14는 L3 대립형질에 의해 부여된 이전의 내성을 극복할 수 있었지만, L4 대립형질에 의해 부여된 내성을 깰 수는 없었다는 것이 확인되었다. 원래 TMV로서 분류된, 이러한 L3-부여된 내성-파괴 균주는 후에 특이적 PMMoV 병원형으로 재분류되었고 그리고 병원형은 병원형 1.2.3으로 지정되었다.
육종가들 사이에서, PMMoV 병원형 1.2.3뿐만 아니라 그것으로부터 유래된, 시판되는 고추 계통에 내성을 보이는 C. chacoense 계통은 일반적으로 Tm3-내성 계통으로 언급된다. 수많은 육종 회사는 상업적으로 유리한 특성을 갖는 내성 고추 식물을 얻기 위해, L4 대립형질을 포함하는 이러한 C. chacoense 계통의 유전적 물질을 주로 그들의 육종 계통으로 유전질 침투를 시켜왔다.
이제 L4 대립형질이 ToMV, TMV, 및 PMMoV 병원형 1, 1.2, 및 1.2.3을 포함하는 다수의 바이러스에 내성을 부여한다는 것이 알려졌다. L4 대립형질에 의해 부여된 내성은 상기와 같이, 비록 엄밀하게는 더 넓은 내성을 부여하는 것을 말하지만, 여기서 "PMMoV 내성"이라고 지칭된다.
토바모바이러스(Tobamoviruses)의 학명은 1980년과 2004년 사이 동안 수차례의 수정 대상이었다. 여기서, 1994년 4월 11일에 Union for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV)에 의해 발행된 단고추 (C. annuun L.)에 대한 "Guidelines for the conduct of Tests for Distinctness, Uniformity and Stability" (TG/76/7)의 학명이 사용된다. 이들 지침서에서 고추 토바모바이러스 병원형에 대한 유전적 내성은 동일한 유전자 자리 (L-유전자 자리)에 위치한 5개의 대립형질 (L-, L1, L2, L3, 및 L4)에 의해 조절되는 것으로 간주된다. 여기서, 고추에서 다양한 바이러스 병원형에 대항하는 내성 및 내성-부여 대립형질성 조성물 사이의 관계를 나타내는 상기의 UPOV 지침서 TG/76/7의 21-22 페이지의 표로 명백하게 참조가 이루어졌다. C. annuum의 동형접합성(homozygous) L3L3 유전형은 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 토마토 모자이크 바이러스 (ToMV), 종고추 모자이크 바이러스 (BePMV), 담배 마일드 그린 모자이크 바이러스 (TMGMV), 둘카마라 옐로우 플렉 바이러스 (Dulcamara Yellow Fleck Virus, DYFV), 및 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1,2에 대해 내성을 부여하지만, 동형접합성 L4L4 유전형은 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3에 추가적인 내성을 제공한다.
UPOV 학명은 바이러스학의 과학 문헌에서 보통 채택된 학명과는 다소 차이가 있다. 일반적으로 과학 문헌에서 학명은 종명 및 단리주 (isolate)의 지정에 한정된다. 병원형 명칭은 오직 매우 가끔씩만 기술된다. 예를 들어, PMMoV의 병원형 1.2.3은 The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)에 병합되지 않는다. 학명 및 시간에 걸친 그것의 확장에 관하여, 주어진 토바모바이러스는 두 개 이상의 관용명을 획득할 수 있고 그리고 하기에 더욱 상세히 설명될 것처럼 추가로 재분류될 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 본 발명은 바이러스 단리주의 어떠한 새로운 지정과는 관계없이, L4 대립형질에 의해 부여된 어떠한 바이러스 균주에 대한 식물의 내성에 관한 것이다.
상기 지적한 것처럼, 토바모바이러스에 대한 Capsicum spp.의 내성은 L-유전자의 병원형-특이적 대립형질 (L1, L2, L3, L4)에 의해 부여되고, 그리고 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성은 L4 대립형질에 의해 부여된다. L-유전자 자리가 위치한 영역은 염색체 11 남부의 텔로미어 (telomere)상에 위치된다 (Lefebvre et al., 2002), 내성 대립형질들은 과민성 반응 (HR)의 유발을 통해 작용한다.
C. chacoense에서 다른 고추속 열매 종으로 유전질 침투될 때 L4 대립형질에 의해 부여된 내성의 주목할만한 그리고 바람직하지 않은 특성은, 새로운 식물 계통에서 내성이 비-멘델식으로 유전된다는 것이다. 멘델의 분리 법칙은 대립형질쌍이 생식 세포의 형성 동안에 분리되고, 그리고 수정에서 임의로 통합되는 것을 말한다. 각각의 형질에서, 이배체 유기체는 각각의 어버이로부터 두 개의 대립형질을 유전한다. 만약 두 대립형질이 다르다면, 한 개의 우성 대립형질이 유기체의 표현형에서 충분하게 발현되고; 다른 열성 대립형질은 표현형에서 눈에 띄는 효과를 갖지 않는다. 보통의 멘델 법칙의 유전에 따르면, 동형접합성의 우성 대립형질을 갖는 식물과 동형접합성 열성 대립형질을 갖는 식물의 이종교배(crossing)는 둘 다 유전학적 (전체 개체군이 이형접합인) 일뿐 아니라 표현형적인 (전체 개체군이 우성 형질을 발현하는) F1, 또는 균일한 잡종 제 1 개체군을 생성할 것이다. 그러한 F1 개체군은 우성 형질에 대해서는 비-분리성이라고 말해진다 (물론 F2 개체군에서도 분리가 발생할 것이다). 따라서, 어버이 중 적어도 하나가 그러한 형질에 동형접합성일 때 F1 개체군은 우성 형질을 분리하지 않는다. 마찬가지로, 비-분리성 F1 의 존재는 어버이 계통의 하나에서 우성 형질의 동형접합성을 확인한다. 그러나 이것은 L4 대립형질이 유전질 침투된 상업적인 식물 계통을 갖는 경우는 아니다.
식물 육종자를 위해서, 육종 결과가 바람직하게 예생식력가능할 수 있어야 하기 때문에, 육종 계통이 동형접합성 (순수 육종)라는 것이 중요하다. 예를 들어, 시판되는 잡종이 두 개의 동종교배(inbred) 계통으로부터 생산될 때, 생성된 이형접합성 F1 식물들이 잡종 강세 또는 헤테로시스의 결과로서 그들의 동종교배 어버이보다 더 적합하다. 식물 육종자들은 더욱 건강한 자손(자손; progeny)를 얻기 위해 그러한 이형성 이종 교배를 의도적으로 활용하고 그리고 동형 접합성 동종 교배는 높은 경제적 가치를 갖는 생산자 계통으로서 작용한다. 따라서 육종 실행에서, 식물 계통을 자가 수정하고(selfing) 그리고 비-분리를 위해 그것의 자손들을 스크리닝함에 의해, 식물 계통이 단일 유전자(즉, 단성 우성 형질)에 의해 부여된 우성 내성 형질에 동형접합성인지 여부를 평가하는 것이 관습화되었다. 대안으로, 기대되는 동형접합성 우성 식물 계통은 동형접합성 열성 계통과 이종 교배될 수 있고, 이로 인해 분리 F1은 검사된 "우성(dominant)" 어버이가 동형접합성이 아니라는 것을 나타낸다.
L4 내성 대립형질은 정상적인 단성 우성 내성 대립형질로 믿어진다 (Boukema, 1983; Van Duin, 1998). 그러나, L4 열성 대립형질에 의해 부여된 PMMoV-내성의 경우에는, 육종자들은 일반적으로 동형접합성 계통으로부터의 이종 교배의 예생식력 가능성 및 그러한 계통의 안정성의 문제를 주시한다. 그러나 기대되는 동형접합성 (L4L4) 내성 식물의 자가 수정은 균일한 내성 표현형 (그로 인해 어버이 식물의 동형접합성을 확신하는)의 자손을 생성하는 반면에, 그러한 동형접합성 내성 모체 식물과 감수성의 모체 식물 (즉, L4 대립형질이 부족한)과의 이종 교배는 종종 내성과 감수성을 둘 다 갖는 식물을 포함하는 F1, 즉, 분리 F1을 생성한다. 식물의 감수성은 예를 들어, PMMoV 병원형 1.2.3으로 접종 한 후 전신 모자이크의 존재에 의해 검출될 수 있다. 내성이 놀랍게도 어떠한 F1 자손 식물에서 없어지는 이러한 현상은, 상기 개요한 이유로 육종자들에게 상당히 불편한 것이다. 육종자들은 그러한 예생식력 불가능한 동형접합성 모체를, 엄밀히 말하자면, 그들의 F1 자손이 분리되는 것이지만, 종종 "분리(segregating)" 식물로 언급한다.
개선된 PMMoV- 내성 동종 교배의 발생에서, 그리고 종래의 식물 선택 및 검정 교배를 사용하여, 육종자들은 최근에 보통의 비-분리 F1 (즉, 멘델의 법칙을 따르는)를 생산하고, 그로 인해 그 계통에서 L4 대립형질에 의해 부여된 고정된 내성을 갖는 동형접합성 식물을 얻을 수 있다는 것을 보였다. 현재, 이것이 어떻게 얻어졌는지는 명백하지 않다. 그러나, 이러한 "비-분리(non-segregating)" 식물의 주요한 문제는 그들이 감소된 생식력 (fertility) 및 왜소 성장을 나타낸다는 것이다. 감소된 생식력의 중요한 결과는 그러한 식물이 제한된 양의 종자 및/또는 제한된 양의 화분을 생성한다는 것이다. 따라서, 비록 그러한 식물들은 내성을 갖고 그리고 "비-분리"적이지만, 그들은 상업적인 종자 생산에는 바람직하지 않은 낮은 생식력 및 왜소 성장을 나타낸다. 예를 들어, 왜소 성장은 종자의 늦은 성숙 (즉, 느린 성장)에 의해 또는 식물의 감소된 (속도의) 생장에 의해 지적될 수 있다. 더욱이 이러한 표현형은 본 출원서에서 생식력없는 왜소 분리의 뜻으로, "SNFD리(Segregating Non-Fertile Dwarf) 표현형"이라 지정될 것이다. 현재, 성장, 생식력 및 불생식력의 문제를 포함하는 이러한 부정적 형질과 C. chacoense에서 Capsicum 계통으로의 L4 대립형질의 유전질 침투 (예를 들어, Van Duin, 1998 참조) 사이의 관련성에 대한 설명은 없다.
L-유전자의 L1, L2 및 L3의 어느것의 Capsicum spp.의 유전질 침투(introgression)는 항상 동형접합성 내성 식물에서 SNFD를 나타내지 않는 멘델 법칙으로 유전된 개체군을 생산한다는 것이 발견되었다. C. chacoense에서 L4 유전질 침투는 이제 비로소 상기 문제들을 초래한다.
오늘날에는 L4 대립형질에 의해 부여된 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성이고, "비-분리"적이고, 보통 (속도의) 생장을 보이고 그리고 적절한 양의 종자를 생산하는 고추 식물이 필요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 L4 대립형질에 의해 부여된 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성과 우수한 성장 및 보통의 종자 생산과 같은 작물학상으로 또는 상업적으로 우수한 형질을 조합하여, 따라서 SNFD 표현형의 바람직하지 않은 특성을 갖지 않는 고추 속 식물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
이러한 목적은 본 발명에 의해 달성된다. 본 발명에 따라서, 상기와 같이, 동형접합성 식물에서 관찰된 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성 및 SNFD 표현형 사이의 연결(link)을, L4 대립형질(allele)을 포함하는 게놈성 유전질 침투의 크기를 감소시켜서 끊을 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, L4 대립형질의 PMMoV-내성 부여 부위의 바로 옆에 놓인 L4 내성으로부터의 유전자 정보를 제거함에 의해 달성된다. 그것의 결과는 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성이 SNFD 표현형-부여 부분의 이동 없이 한 식물에서 다른 식물로 이동할 수 있고 그리고 그로 인해 SNFD 표현형을 나타내지 않는 PMMoV-내성의 및 작물학적으로 가치를 갖는 식물을 생산하는 것이 가능해졌다는 것이다.
이론에 얽매임 없이, SNFD 표현형의 부정적 부작용의 특징은, L4 대립형질이 위치된 C. Chacoense 염색체 단편에 의해 유발되고, 그리고 C. Chacoense 염색체 단편이 예를 들어 C. annuum 게놈에 삽입될 때, SNFD 표현형은 L4 대립형질 그 자체에 유전학적으로 연결되고 그리고 수용체(recipient) 식물의 게놈의 염색체적 유기체를 분열시키는 L4 대립형질의 내성-부여 부위의 부근의 열성 유전자에 의해 유발된다고 믿어진다. 따라서, SNFD 표현형은 오로지 완전한 L4 대립형질의 C. Chacoense 염색체적 유전질 침투를 위해 동형접합성인 식물에서만 발현된다.
이제 획득된 L4 대립형질에 의해 부여된 바람직한 및 바람직하지 않은 표현형 사이의 결합을 끊을 수 있는 가능성에 대한 중요한 통찰력으로, SNFD 표현형에 대한 유전적 정보가 L4 대립형질의 내성-부여 부위의 근처에서 제거되거나 또는 동형접합성 식물에서 SNFD 표현형이 더이상 조합되어 발현되지 않는 정도로 변화되는 식물을 선택하는 것이 가능해졌다.
이제 본 발명은 첫 번째 양상에서 고추 속의 식물의 게놈에서 L4 내성 대립형질의 존재로 인해, 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물을 제공하고, 여기서 상기 L4 대립형질은 절단된(truncated) 것이다. 상기 절단은 길이가 줄어든 대립형질을 제공하고 그리고 번식력이 있고 그리고 정상적인 성장, 즉 SNFD 표현형의 부재(absence)를 나타내는 비-분리형 식물을 생성한다.
SNFD 표현형의 원인이 되는 유전적 정보의 부재는 SNFD 표현형을 가져오는 L4 대립형질의 부근에서 유전적 정보를 제거하거나 또는 변화시킴에 의해 초래될 것이고, 그리고 바람직하기는 L4 대립형질의 부근에서 재조합 현상(들)에 의해 야기된다. SNFD 정보가 대립형질의 한 방향에서만 존재할 때, 단일의 재조합 현상은 이 정보를 제거하기에 충분하다. SNFD 표현형에 대한 유전적 정보가 내성 대립형질의 두 방향에 놓여지면, 이 유전적 정보의 두 부분이 바람직하게 변화되거나 또는 제거된다. 비록 텔로미성 부위에서 절단이 또한 가능하지만, 본 발명의 바람직한 구현예에 따라서, 식물들이 선택되고 여기서, 적어도 한 번의 재조합 현상, 바람직하기는 염색체 11의 남쪽에서 L4 대립형질의 북쪽 (동원체 측(side))상에서의 재조합 현상이 발생된다. 이중 재조합의 경우에서, 재조합 현상은 하나의 세대에서 발생될 필요는 없고, 연속적인 세대로부터의 재조합 현상은 내성 대립형질의 하나 또는 두 생식력면에서 유전자 정보의 우발적인 제거 또는 변화를 같이 초래할 수 있다. 내성 부여의 원인이 되는 유전적 정보가 제거되지 않고, 따라서 L4 내성 대립형질의 내성-부여 부분의 존재를 유지하도록 적어도 한 번의 재조합 현상이 수행되어야 한다.
본 발명의 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 L4 내성 대립형질은 C. chacoense의 게놈으로부터 유래된다.
적절한 유전적 정보가 제거되는지 또는 변화되는지를 평가하기 위해, 당업자 는 유전적 마커(marker)를 적절하게 사용할 수 있다. 이제 본 발명은 예를 들어, 재조합체 식물의 마커 보조 선택에서 사용될 수 있는 다수의 유전적 마커를 기술한다. 그러한 사용은 당해 분야에서 공지되어 있고 그리고 하기에서 보다 상세히 언급될 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 L4 대립형질에 결합된 적어도 하나의 마커의 부재에 의해 나타난 바와 같이 SNFD 표현형의 원인이 되는 유전적 정보가 부재하는 식물을 제공하고, 여기서 상기 마커는 그룹 2 마커들 (E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600 및 Tm3-DRS), 그룹 3마커들 (E60/M54-F-447) 및 그룹 1/3 마커들 (E63/M61-F-501, E66/M43-F-387, E66/M49-F-387, E66/M61-F-99, E67/M50-F-150, E67/M62-F-214, E70/M54-F-133, E71/M47-F-550, E74/M61-F-385)로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하기는 그룹 3및 그룹 2 마커들, 보다 바람직하기는 그룹 2 마커들 (E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600 및 Tm3-DRS)이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 L4 내성 대립형질의 존재가 그룹 1의 마커들 (E58/M50-F-580, E39/M58-F-95, E58/M60-F-255 및 E54/M55-F-101), 및 그룹 1/3 (E63/M61-F-501, E66/M43-F-387, E66/M49-F-387, E66/M61-F-99, E67/M50-F-150, E67/M62-F-214, E70/M54-F-133, E71/M47-F-550, E74/M61-F-385)로부터 선택되고, 바람직하기는 그룹 1 마커들로부터 선택되고, 보다 바람직하기는 E58/M50-F-580 및 E54/M55-F-101 마커들로부터 선택되는 L4 내성 대립형질에 연결된 적어도 하나의 마커의 존재에 의해 나타나는 식물을 제공한다.
상기 언급한 마커들은 제한 효소 EcoRI (E로 코드화된) 및 MseI (M으로 코드화된)의 제한 부위에 각각 상응하는 "코어 프라이머 (core primers)" (5'-GACTGCGTACCAATTC-3' 및 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3')와, 프라이머 코드에 의해 나타난 3개의 추가적인 선택적 뉴클레오티드들로 이루어진 AFLP-프라이머에 기초한다. 프라이머 코드는 http://www.keygene.com/publications/index.htm에서 그리고 특히 그곳에서 "KF Nomenclature Primer Enzyme Combinations.pdf"로 공개된 문서에서 찾을 수 있었다. 증폭된 단편의 크기는 (염기쌍에서) 프라이머 효소 결합을 본따서 기록되었다. 예를 들어 마커 E58/M60-255는 프라이머 효소 조합 [EcoRI+프라이머 코드 58/MsdI+프라이머 코드 60]으로 DNA를 절단한 후에 얻어지는 255 염기쌍의 증폭된 단편을 나타낸다.
프라이머 코드는 다음과 같다: 35:ACA; 39:AGA; 43:ATA 47:CAA; 49:CAG; 50:CAT; 51:CCA; 54:CCT; 55:CGA; 58:CGT; 60:CTC; 61:CTG; 62:CTT; 63:GAA; 66:GAT; 67:GCA; 70:GCT; 71:GGA; 74:GGT. 프라이머 효소 조합 코드 E63/M61-F-501의 예는: EcoRI + GAA (=E63)/ MseI + GTC (=M61)이다.
마커 TG036으로부터 유래된 마커 Tm3-DRS (Lefebvre et al., 2002)는 PCT 프라이머 쌍 P118 (서열 5'-AATCCTTCAACTGCCATTTC-3') 및 프라이머 P119 (서열 5-'ATTGGGACATGAGGTGTGTA-3')에 의해 정의되고 프라이머 P118 및 프라이머 P119로 PCR을 수행함에 의해 검출될 수 있고, 그 후 PCR-생성물이 Tru1I (제한 부위 TTAA)로 소화된다. 대략 350 염기쌍의 증폭된 단편의 존재는 L4 대립형질의 존재를 나타낸다.
SNFD 표현형의 원인이 되는 유전적 정보가 없거나 또는 제거된 식물의 제공은 또한 하기에서 보다 상세히 언급할 것처럼 절단된 L4 대립형질의 식물을 제공하는 관점에서 기술될 수 있다. 그러한 절단에 관한 양상은 상기한 바와 같이 유전적 정보의 제거 또는 변화와 유사하게 적용한다.
본 발명의 식물의 다른 바람직한 구현예에서, 식물은 C. annuum 종의 식물이다.
본 발명의 식물의 또 다른 바람직한 구현예에서, 식물은 L4 내성 대립형질에 동형접합성이고, 그리고 동형접합성 식물은 바람직하기는 동종 교배 식물이다.
다른 양상에서, 본 발명은 고추 속 식물의 게놈에서 L4 내성 대립형질의 존재로 인해 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3에 내성을 나타내고, 여기서 상기 L4 대립형질은 절단되고, 그리고 여기서 상기 절단은 텔로미어 및/또는 동원체 측의 약 0.001 내지 10cM, 바람직하기는 대립형질의 동원체 측으로부터 0.001 내지 10cM의 유전적 거리에 걸친 뉴클레오티드 서열의 제거를 포함하는 고추 속 식물을 제공한다. 상기 언급한 바람직한 구현예는 또한 본 발명의 이러한 양상에 따른 식물에도 적용된다.
코어 TM-3 내성 유전자(들)을 포함하는 그룹 1의 마커들과 그룹 3의 마커들 사이에서 관찰된 재조합 빈도는 약 2cM의 거리와 동등했다. 그룹 1의 마커들과 그룹 2의 마커들 사이에서 관찰된 재조합 빈도 또한 약 2cM의 거리와 동등했다. 재조합의 부재로 인해, 여기에서 확인된 마커 그룹 내에서 어떠한 마커들 사이에서도 거리는 측정될 수 없었다. 따라서 여기서 언급한 대로, 절단은 바람직하기는 그룹 1 마커들 중 어느 것의 위치로부터 동원체 (그룹 2) 또는 텔로미어 (그룹 3)에 위치된 마커들 중 어느 것으로부터의 2cM보다 더 짧은 거리에 걸친 유전적 결실 (deletion)을 나타낸다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 동형접합, 바람직하기는 동종 교배 식물과 상업적으로 바람직한 특성을 나타내는 다른 동형접합, 바람직하기는 동종 교배의 고추식물을 이종 교배함에 의해 얻을 수 있는, PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 잡종 고추 식물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 절단된 L4 대립형질을 포함하는 분리된 핵산 서열을 제공하고, 여기서 상기 절단된 L4 대립형질은 고추 속 식물에서 발현될 수 있고 따라서 상기 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여하는 유전적 정보를 포함하고, 그리고 여기서 SNFD 표현형을 부여하는 유전적 정보는 상기 대립형질에는 존재하지 않는다.
그러한 분리된 핵산 서열의 바람직한 구현예에서, 상기 내성-부여 유전적 정보는 E39/M58-F-95, E54/M55-F-101, E58/M60-F-255 및 E58/M50-F-580 마커들을 포함하는 군에서 선택되고, 바람직하기는 E39/M58-F-95, E54/M55-F-101, E58/M60-F-255 및 E58/M50-F-580 마커들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커, 보다 바람직하기는 E54/M55-F-101 및 E58/M50-F-580으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커를 포함하고, 상기 내성-부여 유전적 정보는 SNFD 표현형을 부여하는 유전적 정보를 추가로 포함하고 그리고 그룹 2 마커들 및 그룹 3마커들로 이루어진 군, 바람직하기는 그룹 2 마커에서 선택된 하나 이상의 마커의 상기 L4 내성 대립형질이 없는 것을 포함한다. 가장 바람직한 구현예에서, 본 발명의 분리된 핵산 서열에 포함된 L4내성 대립형질은 C. chacoenes 속으로부터 유래된다.
다른 양상에서, 본 발명은 PMMoV 병원형 1.2.3에 대해 내성을 나타내는 고추 속 식물의 생산방법을 제공하고, 여기서 상기 발명은 a) PMMoV 병원형 1.2.3 또는 그것의 일부에 민감한 고추 속의 수용체 식물을 제공하는 단계, 그리고 b) 상기 수용체 식물 또는 그것의 일부 또는 그것의 자손 식물에, 절단된 L4 대립형질을 포함하는 게놈 영역을 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 대립형질은 상기 식물 또는 식물의 일부 또는 자손 식물에서 발현될 수 있고 그로 인해 상기 식물 또는 식물의 일부 또는 자손 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 부여할 수 있는 유전적 정보를 포함하고, 그리고 여기서 SNFD 표현형을 부여하는 유전적 정보는 적어도 SNFD 표현형이 발현되지 않는 정도로 상기 대립형질에서 존재하지 않는다. 단계 b)는 예를 들어 여기에서 개시한 대로 L4 내성 대립형질의 절단된 형태를 갖는 재조합체 공여자(donor) 식물의 형태로, 또는 삽입물로서 상기 게놈영역을 포함하는 벡터의 형태로, 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하는 상기 게놈 영역을 제공함에 의해 선행될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용된 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하는 게놈 영역은, SNFD 표현형을 갖는 식물을 생성하는 L4 대립형질과 비교하여 크기가 감소된 L4 내성 대립형질을 포함한다. L4 내성 대립형질의 크기는 감소되었지만, 그러한 크기의 감소는 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성 부여의 원인이 되는 유전적 정보에는 영향을 끼치지 않는다.
절단된 L4 내성 대립형질을 포함하는 게놈 영역의 도입을 실현하기에 가장 적절한 방법은, 수용체 식물과 PMMoV 병원형 1.2.3-내성인 L4 내성 대립형질을 포함하는 고추 속의 공여자 식물 사이의 이종 교배로부터 유래된 자손 식물로의 게놈 유전질 침투에 의해 행해졌다. 유전질 침투 과정은 당업자에게 잘 알려져 있고 그리고 일반적으로 그것의 어버이 중 하나와 종간 잡종의 반복된 여교잡(backcrossing)을 통해 한 종의 하나 이상의 유전자를 다른 것의 유전자 풀 (pool)로 도입하는 것을 수반한다.
당업자는 상기 유전질 침투가, L4 내성 대립형질 또는 L4 내성 대립형질을 포함하는 게놈 영역이 식물의 게놈으로 도입될 수 있는 유일한 방법이 아니라는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 다른 방법은 예를 들어 반수 세포 융합, 식물 형질 변환 및 그와 유사한 방법과 같은 유전자 이식 기술의 사용을 수반할 것이다. 따라서 상기 게놈 영역의 도입은 또한 인 비트로 배양 기술에 의해, 원형질체 융합에 의해, 형질 전환에 의해 또는 배가 반수체(doubled haploid) 기술에 의해 행해질 수 있다. 그러한 기술들은 종종 무손상 식물이 아닌, 식물 일부, 일반적으로 단일 세포 또는 원형질체의 배양된 조직과 같은 상기 식물의 재생산 물질로 행해진다. 따라서, 본 발명의 식물을 얻기 위한 그와 같은 방법들은 상기 식물 부분이 고추 식물로 성장하는 추가적 단계를 임의로 포함할 수 있다. 일반적으로 이것은 동형접합성 DNA로 형질 전환된 식물 부분 또는 조직으로부터 식물 또는 상기 식물의 재생산 물질 또는 둘 다를 재생하고 그리고 임의로, 생물학적으로 상기 식물 또는 재생산 물질 또는 둘 다를 복제하는 것을 수반할 것이다.
유전질 침투 과정에 의해 절단된 L4 내성 대립형질이 고추 속의 수용체 식물로 도입되는 본 발명의 방법은, 그것의 게놈으로 유전질 침투된 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하는 게놈 영역을 갖는 자손 식물을 생성한다. 절단된 L4 내성 대립형질을 갖는 자손 식물을 얻는 과정이 재조합을 수반하기 때문에, 분리 개체군은 자손 식물의 표현형 또는 유전자형에 기초한 어떠한 선택을 수행하기 전에 생산되는 것이 바람직하다. 따라서, 생산되기 위한 그리고 그것의 게놈에 절단된 L4 내성 유전자를 갖는 상기 자손 식물은 바람직하기는 분리 개체군의 식물이고, 예를 들어 상기 언급한 이종 교배로부터 얻어진 F1 식물을 자가-교배함에 의해, 또는 상기 교잡로부터 얻어진 F1 식물과 다른 고추 식물을 교잡함에 의해 생산된다.
본 발명의 방법에서, 상기 게놈 지역은 바람직하기는 C. chacoense의 게놈으로부터 도입되고 그리고 그러한 방법에서 사용된 수용체 식물은 바람직하기는 C. annuum 식물이다.
비록 본 발명의 식물의 생산 방법의 기초 성분이 이제까지 기술되었지만, 본 발명의 방법은 추가 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 c) PMMoV 병원형 1.2.3-내성 식물 또는 그것의 PMMoV 병원형 1.2.3-내성 자손 식물을 선택하는 단계, 및 d) SNFD 표현형을 발현하지 않는 내성 식물 또는 내성 자손 식물을 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
PMMoV 병원형 1.2.3-내성 식물 또는 자손 식물의 선택 단계는 내성 생물학적 검정, 예를 들어 식물의 잎에 PMMoV 병원형 1.2.3의 현탁액을 접종하고 감염의 발생을 평가하는 것과 같은 표현형 결정에 기초한 방법에 의해 행해진다. 그러나 바람직한 구현예에서, PMMoV 병원형 1.2.3-내성 식물의 선택 단계는 상기 식물에서 L4 대립형질의 내성-부여 부분의 존재를 나타내는 그룹 1의 또는 그룹 1/3의 마커들을 포함하는 군에서 선택된 L4 내성 대립형질의 하나 이상의 마커의 존재를 위해 상기 식물 또는 자손 식물의 게놈을 스크리닝하는 과정을 포함한다. 그룹 1의 적절한 마커들은 E39/M58-F-95, E54/M55-F-101, E58/M60-F-255 및 E58/M50-F-580 마커들을 포함하고, 바람직하기는 E54/M55-F-101 및 E58/M50-F-580 마커들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 존재가 결정된다. 내성 형질의 존재를 평가하기에 적절한 그룹 1/3의 마커들은 당업자가 내성 식물에서 그 존재를 확립한 이들 마커들을 포함한다. 그룹 1/3의 마커들은 L4 내성 대립형질을 나타내는 마커 뿐 아니라, 그 대립형질에서 SNFD 표현형-부여 부분을 나타내는 마커를 포함한다. 따라서, 그룹 1/3의 어떠한 마커들은 L4 내성 대립형질에서 SNFD 표현형-부여 부분을 제거하고 그룹 3마커들과 유사한, 적절한 절단을 나타내고, 반면에 다른 그룹 1/3 마커들은 그룹 1 마커들과 유사한 코어 내성 유전자 또는 조절 서열의 존재를 나타낸다.
상기 PMMoV 병원형 1.2.3-내성 식물들 중에서 SNFD 표현형을 발현하지 않는 식물 또는 자손 식물의 선택 단계 (상기 언급한 d 단계)는 본 발명에 의해 개시된 마커-보조의 육종 과정의 핵심을 구성한다. SNFD 표현형을 발현하지 않는 내성 식물 또는 자손 식물의 선택은 바람직하기는, 그룹 2 마커들 및 그룹 3 마커들 (임의로 또한 그룹 1/3 마커들로부터 선택된), 바람직하기는 그룹 2 마커들로 이루어진 군에서 선택된 L4 내성 대립형질의 적어도 하나의 마커를 위한 내성 식물 또는 자손 식물의 게놈에서 절단된 L4 내성 대립형질의 스크리닝, 및 상기 마커들의 적어도 하나가 없고 그로 인해 절단을 나타내는 식물 또는 자손 식물의 선택을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 상기한 바와 같이 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물의 생산방법을 수행하고, 그리고 추가로 e) 선택된 식물을 자가 수정하는 단계; f) 상기 자가 수정로부터 얻어진 종자를 재배하고 그리고 상기 종자를 식물로 성장시키는 단계; g) PMMoV 병원형 1.2.3 내성을 나타내고 그리고 상업적으로 바람직한 특징을 갖는 단계 g)로부터 식물들을 확인하는 단계, 및; h) PMMoV 병원형 1.2.3 내성을 나타내고 그리고 상업적으로 바람직한 특징을 갖는 동종 교배의 고추 식물이 생산될 때까지 e)-g) 단계를 반복하는 단계를 수행하는 것을 포함하는, PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속의 동종 교배 식물의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 문맥에서 상업적으로 바람직한 특징은 예를 들어 개선된 외관, 더 높은 종자 산출, 개선된 생식력, 더 높은 과실 산출, 더 크거나 더 작은 과실, 또는 개선된 과실의 색 또는 맛과 같은 과실의 특징; 또는 예를 들어 개선된 줄기 강도, 개선된 뿌리 계통, 개선된 스트레스 내성, 개선된 질병 내성, 등과 같은 특징에 관한 것일 수 있다. 실제로, 상업적으로 바람직한 특징은 야생-형 식물보다 식물을 더욱 상업적으로 가치있도록 만들 수 있는 어떠한 특징이 될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 상기 언급한 본 발명의 방법 중 하나에 의해 얻어질 수 있는 PMMoV 병원형 1.2.3 내성을 나타내는 고추 속 식물 또는 동종 교배 식물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 식물의 자손, 잎, 줄기, 뿌리, 뿌리 끝, 뿌리 줄기, 발아, 과실 및 유사체 또는 본 발명에 따른 식물의 세포, 원형질체, 칼리(calli), 세포 덩어리, (체세포) 배, 꽃밥, 잎자루, 화분, 밑씨, 꽃, 배양세포, 종자 및 유사체와 같은 부분에 관한 것이다. 그러한 부분들은 바람직하기는 (유기체) 조직 배양에 의한 증식을 위해 적절할 것이고, 또는 그들은 과실과 같이, 섭취에 적절할 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 고추 식물을 재배하여 생산된 고추 종자를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내고, 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 본 발명의 동종 교배 고추 식물, 바람직하기는 상업적으로 바람직한 특성을 나타내는 동종 교배 고추 식물을 이종 교배함에 의해 얻을 수 있는 잡종 고추 식물, 또는 그것의 일부를 제공한다.
정의
여기서 제공된 전반부는 명세서에 대한 전체적인 참조가 될 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예를 제한하지 않는다. 따라서, 하기에 직접적으로 정의된 용어들은 명세서에 대한 전체적인 참조에 의해 보다 완전하게 정의된다.
용어 "L4 내성 대립형질" 또는 "L4 대립형질"는 Boukema (1984)에 의해 처음에 기술된 것처럼, 이들 식물에 토마토 모자이크 바이러스 (ToMV) 및 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1, 1.2, 및 1.2.3에 내성을 제공하고, 그리고 유전자는 L-유전자 자리의 일부인 Capsicum spp .의 L-유전자의 병원형-특이적 내성 대립형질을 언급한다. L-유전자 자리가 위치된 영역은 염색체 11의 남쪽의 텔로미어에 위치된다. 비-절단된 형태의 L4 대립형질은 마커 Tm3-DRS와 관련이 있다. 따라서 L4 대립형질은, 여기에서 정의된 바와 같이 하나 이상의 그룹 2 마커들 (E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600 및 Tm3-DRS), 및 하나 이상의 그룹 3마커들 또는 그룹 1/3마커들 (E60/M54-F-447, E63/M61-F-501, E66/M43-F-387, E66/M49-F-387, E66/M61-F-99, E67/M50-F-150, E67/M62-F-214, E70/M54-F-133, E71/M47-F-550, E74/M61-F-385)에 의해 경계가 지어진, 예를 들어 C. chacoense 수집종 PI 260429로부터 유래될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 그리고 이 뉴클레오티드 서열은 PMMoV 병원형 1.2.3에 대하여 내성을 부여한다.
여기에서 사용된, 용어 "페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3"은 L3 대립형질에 의해 부여된 내성을 극복할 수 있는 고추속 열매-감염 마일드 모틀 바이러스의 균주를 나타낸다. 문헌에서, 그러한 균주는 일반적으로 용어 'PMMoV의 내성-파괴 균주'로 나타나있다. ICTV 공인 약어 PMMoV 및 PMMV둘 다 페퍼 마일드 모틀 바이러스를 나타내는데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 문헌에서 마주칠 수 있는 PMMoV의 동의어는 다음과 같다: 담배 모자이크 마이러스의 Samsun 잠복 균주 (SL-EMV), 고추 모자이크 바이러스 및 고추속 열매 모자이크 열매. 바이러스 분류의 급속한 발전으로, 어떠한 균주 그 중에서도 처음에 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV; ICTV 십진 코드 71.0.1.0.007)로 분류된 초기의 네덜란드 균주 (Dutch strain, Tobias et al., 1982)들은 이제 파프리카 마일드 모틀 바이러스 (PaMMV; ICTV 십진 코드 71.0.1.0.006)으로 분류된다. 따라서 여기에서 사용된 용어 "페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3"은 또한 고추식물에서 L3 대립형질에 의해 부여된 내성을 극복할 수 있는 PaMMV 균주를 포함한다. 일반적으로, 여기에서 사용된 용어 "페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3"은 다음의 균주를 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다: TMV의 단리주 P14 (Boukema, 1982; Tobias et al., 1982; Rast, 1998); PMMoV-I로 표시된 이탈리아 균주 (Wetter et al., 1984; Rodrigeuz-Cerezo et al., 1989; Velasco et al., 2002; Berzal-Herranz et al., 1995; Garcia-Luque et al., 1993); PMMoV-S로 표시된 스페인 균주 (Tenllado et al., 1997; Velasco et al., 2002; Tenllado et al., 1996; Berzal-Herranz et al., 1995; Garcia-Luque et al., 1993; Alonso et al., 1991; Avila-Rincon et al., 1989; Rodrigeuz-Cerezo et al., 1989); PMMoV-J 및 PMMoV-Ij로 표시된 일본 균주 (Tsuda et al., 1998; Hagiwara et al., 2002; Kirita et al., 1997); PMMoV-k로 표시된 한국 균주 (Lim et al., 1997); 및 PaMMV (Garcia-Luque et al., 1993; Ruiz del Pino et al., 2003; Gilardi et al., 2004). 페퍼 마일드 모틀 바이러스 및 파프리카 마일드 모틀 바이러스의 기술에 대한 문헌적 참조는 즉, Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J., Watson, L. and Zurcher, E.J. (eds.) (1996 이후)이다. "Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 16th January 1997" 및 "The Universal Virus Database of the International Committee in Taxonomy of Viruses" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/index.htm).
여기서 "절단된 대립형질(truncated allele)"은 유전적 거리에 기초하여, 완전한 대립형질보다 크기가 더 작은 대립형질로서 정의된다. 예를 들어 크기 감소는 SNFD 표현형의 본 경우에서, 적어도 하나의 결합된 마커의 부재 및/또는 식별가능한 표현형의 부재에 의해 나타날 수 있다.
여기에서 사용된, 용어 "대립형질(들)"은 유전자의 하나 이상의 대안적 형태 중 어느 것, 대립형질이 적어도 하나의 형질 또는 특징에 관한 것인 모두를 의미한다. 배수 세포에서, 주어진 유전자의 두 대립형질은 동형 접합 염색체 쌍에서 상응하는 유전자 자리들을 점유한다. 본 발명이 QTLs, 즉, 하나 이상의 유전자 또는 조절 서열을 포함할 수 있는 게놈성 영역에 관한 것이기 때문에, 어떠한 경우에서는 "대립형질" 대신에 "일배체형" (즉, 염색체적 구획의 대립형질)라고 언급하는 것이 보다 정확할 것이지만, 이러한 경우, 용어 "대립형질"는 용어 "일배체형"으로 이해되어야 한다. 대립형질은, 이들이 유사한 표현형을 발현할 때 동일한 것으로 간주된다. 서열에서의 상이성은 가능할 수 있지만 그들이 표현형에 영향을 끼치지 않는 한 중요하지 않다.
여기에서 "게놈 영역 (genomic region)"은 유전자들 및 조절 요소 영역들과 같은 다양한 게놈성 기능의 서열을 포함할 수 있는 뉴클레오티드 서열, 바람직하기는 DNA 서열로서 정의된다. 게놈성 영역은 뉴클레오티드 구조물일 수 있고 그리고 벡터에 포함될 수 있다. 대안으로, 게놈성 영역은 상기 식물을 이종 교배한 후 염색체적 재조합에 의해 하나의 식물에서 다른 것으로 이동될 수 있다. 원칙적으로 게놈성 영역은 하나 이상의 종으로부터 비롯된 유전적 물질을 포함할 것이다.
여기에서 "유전자"는 염색체 상에서의 특이적 위치를 점유하고 그리고 유기체에서 특수한 특징 또는 형질을 위한 유전적 지시를 포함하는 DNA 서열으로 이루어진 유전적 단위로서 정의된다.
여기에서 "유전자 자리(locus)"는 주어진 유전자가 주어진 종의 염색체를 점유하는 유전자 지도상에서의 위치로서 정의된다.
여기에서 사용된, 용어 "이형접합성(heterozygous)"는 다른 대립형질이 이형접합 염색체 상의 상응하는 유전자 자리들에서 존재할 때, 나타나는 유전적 조건을 의미한다.
여기에서 사용된, 용어 "동형접합성(homozygous)"는 동일한 대립형질이 동형접합 염색체상의 상응하는 유전자 자리들에서 존재할 때, 나타나는 유전적 조건을 의미한다. 동형접합성은 개별적 식물의 자가 수정 후에 분리의 부재로서 또는, 만약 감수성으로 이종 교배된다면, F1에서의 분리의 부재로서 정의된다.
여기에서 사용된, 용어 "잡종(hybrid)"은 유전적으로 다른 두 개체군들 사이의 이종 교배에 따른 어떠한 자손을 의미한다 (Rieger et al., 1968).
여기에서 사용된, 용어 "동종교배(inbred)"는 실질적인 개별적 동형접합성 또는 동형접합주를 의미한다.
본 명세서에서 "재조합 현상(recombination event)"은 (생식적) 이종 교배를 의미하는 것으로 이해된다.
여기에서 사용된, 용어 "유전질 침투(introgression)", "유전질 침투된" 및 "유전질 침투의"는 하나의 종의 유전자들, 품종 또는 재배종의 게놈이 이들 종을 이종 교배시킴에 의해 다른 종, 품종 또는 재배종의 게놈으로 이동되는 과정을 언급한다. 상기 이종 교배는 천연적이거나 또는 인공적일 수 있다. 상기 과정은 재발성 어버이로 역 교배함에 의해 임의로 완성될 것이고, 이 경우 유전질 침투는 이종간 잡종과 그것의 어버이 중 하나로 반복적인 여교잡을 통해 한 종의 유전자에서 다른 것의 유전자 풀로의 침투를 언급한다. 유전질 침투는 또한 수용체 식물의 게놈에서 안정하게 통합된 이형접합 유전적 물질로서 언급될 수 있다.
"유전자 공학", "형질 전환(transformation)" 및 "유전자 변형(genetic modification)"은 모두 어떤 종류의 유전적 정보를 표적 식물의 DNA로, 통상적으로 다른 유기체의 염색체 DNA 또는 게놈으로의 전달과 동의어로 사용되었다. 유전자 공학은 수용체 식물의 게놈에서 이형접합 유전 물질을 안정하게 통합하는 하나의 방법이고, 그리고 식물 세포 또는 조직에서 이형접합 DNA의 안정한 통합을 유발하고 그리고 식물 세포 또는 식물 조직에서 외래 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능케하는 이들 중에서 선택된 유전자 또는 그것의 대립형질성 변형뿐만 아니라 조절 요소를 코드화하는 외래 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이형접합 DNA를 함유하는 DNA 재조합체로 식물의 세포 또는 조직을 변형시키는 것을 포함하는 과정을 포함할 것이다.
여기에서 사용된, 용어 "분자 마커(molecular marker)"는 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 마커들, 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP) 마커들, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 마커들, 미소 부수체 (microsatellite) 마커, 서열 특성화된 반복 증폭된 (SCAR) 마커 또는 동질효소 마커 또는 여기에서 개시된 상기 마커들의 조합과 같은, 특이적 유전자 및 염색체 위치를 정의하고 그리고 두 대립형질들 사이의 다형성을 검출하는 어느 기술을 사용하여 얻을 수 있는 마커를 의미한다. 여기에서 제공된 그룹 1, 2, 3 및 1/3의 마커들은, 상기 프라이머 서열들 및/또는 그들의 보충물의 측면 방향으로 배치된 고추속 열매-특이 뉴클레오티드 서열 및/또는 그것의 보충물로 이루어진 이중 스트랜드된 또는 단일 스트랜드된 뉴클레오티드 서열을 제공하기 위해, 주형으로서 고추속 열매 게놈 DNA를 사용하고 그리고 증폭 프라이머들의 한 쌍의 첫 번째 및 두 번째 프라이머로서 도 3에서 나타낸 프라이머 서열을 사용하는 핵산 증폭 반응을 수행함에 의해 얻어지는 이중 스트랜드된 또는 단일 스트랜드된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 마커들 (특히 AFLP 마커들)을 나타낸다. 용어 고추속 열매 특이적 뉴클레오티드 서열은 주형으로서 C. chancoense 수집종 PI 260429의 게놈 DNA 및 적어도 90%, 바람직하기는 95%, 보다 바람직하기는 97%, 더욱 더 바람직하기는 98% 이상의 그것의 서열 유사성을 갖는 서열들을 사용할 때, 얻어지는 서열을 나타내기 위해 사용된다.
여기에서 사용된, 용어 "제한 단편 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism)" 또는 "RFLP"는 개체들 사이의 특이적 제한 효소에 의해 잘려진 DNA 단편 크기의 변이를 의미한다. RFLP들을 생성하는 다형성 서열은 유전자 연관 지도 상에서 마커들로서 사용된다.
여기에서 사용된, 용어 "개체군(population)"은 공통의 유전적 유래를 공유하는 식물들의 동형접학적 또는 이형접합적 모음을 의미한다.
여기에서 사용된, 용어 "품종(varity)" 또는 "재배종(cultivar)"은 구조적 특징들 및 성능에 의해, 같은 종 내의 다른 품종으로부터 확인될 수 있는 유사한 식물들의 군을 의미한다. 여기에서 사용된 용어 "품종"은 1972년 11월 10일, 1978년 10월 23일, 및 1991년 3월 19일에 제노바에서 개정된, 1961년 12월 2일의 International Convention for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV 조약)에서의 정의에 상응하는 동일한 의미를 갖는다. 따라서, "품종"은 공지된 가장 하위 등급의 단일의 식물분류군 내의 식물 분류를 의미하고, 이 분류는 육종자의 권리 부여를 위한 조건이 충족하는 것과는 관계없이, i) 주어진 유전형 또는 유전형의 조합으로부터 발생된 특징의 발현으로서 정의되고, ⅱ) 상기 특징들 중 적어도 하나를 발현함에 의해 분류하는 다른 식물들로부터 구별되고 그리고 ⅲ) 그것의 불변하는 증식된 적응성에 관한 단위로서 간주될 수 있다.
여기에서 사용된, 용어 "고추(papper)" 또는 "캡시쿰(Capsicum)"은 고추 속의 어떠한 종, 품종, 재배종, 또는 개체군을 의미한다.
본 발명은 하나의 양상에서 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물을 제공한다. 본 발명에 따른 고추 속 식물은 고추 속의 어느 종이 될 수 있고, C. annuum, C. baccatum, C. cardenasei, C. chacoense, C. chinese, C. eximium, C. frutescens, C. microcarpum, C. minimum, C. pendulum, C. praetermissum 및 C. pubescens를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하기는, 본 발명의 식물은 흰 꽃의 Capsicum 종, 바람직하기는 C. annuum, C. frutescens, C. chinense, 또는 C. chacoense 식물, 보다 바람직하기는 C. annuum, C. frutescens 식물, 가장 바람직하기는 C. annuum 이다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 작물학적으로 또는 상업적으로 바람직한 특징을 갖는 C. annuum을 제공한다.
여기에서 사용된, 용어 "C. annuum"은 고추 속의 고추 식물을 의미하고, 그 식물의 게놈은 유전적 배경으로서 C. annuum 게놈을 포함한다. 그러한 식물은 필수적으로 C. annuum 게놈을 가질 것이고, 여기서, 재조합, 형질 변환 또는 다른 과정들의 결과로서 다른 종들의 DNA가 통합되었다. 당업자는 두 식물 종 사이의 육종이 어버이의 특징과 유전적 물질을 갖는 식물을 생성할 것이고, 그리하여 종들 사이의 경계선을 모호하게 할 것이라는 것을 이해할 것이다. 그러한 식물들은 여기에서 모두 C. annuum 식물이라고 명칭된다.
토바모바이러스 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV)는 1952년 미국, 사우쓰 캐롤라이나에서 처음으로 C. annuum로 보고되었다 (McKinney, 1952). 증상들은 특히, 만약 식물이 어렸을 때 감염되었다면, 가벼운 백화 및 성장 부진을 포함한다. 과실들은 작고, 기형이고, 반점이 생길 수 있고 그리고 괴사성 기능저하를 가질 것이고, 따라서 식물들이 시판될 수 없게 한다. PMMoV는 식물들 사이의 밀접한 접촉에 의해, 종자 표면의 비리온 (virion)에 의해, 그리고 접목에 의해 전염된다. 상기 바이러스는 많은 나라들 (아르헨티나, 호주, 캐나다, 덴마크, 프랑스, 헝가리, 아이슬란드, 이탈리아, 일본, 한국, 네덜란드, 스페인, 영국, 및 미국)에서 보고되었다. 질환의 억제는 내성 재배종의 사용에 의해 가장 잘 달성되었다. L4 대립형질에 의해 부여된 내성을 극복할 수 있는 신규한 균주가 보고되었다 (Antignus et al., 2000).
본 발명의 식물에서 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3에 대한 내성은, 식물의 게놈의 L4 내성 대립형질의 존재에 의한 것이다. PMMoV 병원형 1,2,3에 대한 내성을 부여하는, 본 발명의 식물의 게놈에 존재하는 L4 내성 대립형질은 어느 공급원으로부터 비롯될 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따라서, L4 내성 대립형질은 C. chacoense로부터, 보다 바람직하기는 수집종 PI 260429 및 SA 185로부터 비롯된다 (Boukema, 1983).
본 발명의 식물들은 자손로 PMMoV 내성을 전이시킬 수 있고 그리고 L4 내성 대립형질에 대해 이형접합성일 수 있지만, 바람직하기는 L4 내성 대립형질에 대해 동형접합성이다. L4 내성 대립형질에 대해 동형접합성인 본 발명의 식물들은 감소된 생식력 및/또는 왜소 성장을 보이지 않는다.
식물이 감소된 생식력 및/또는 왜소 성장을 나타내지 않을 때, SNFD 표현형을 유발하는 충분한 유전적 정보가 부재하거나, 또는 이러한 유전적 정보가 충분하게 비활성화된 것으로 추측된다. SNFD의 원인이 되는 유전적 정보의 부재는 적어도 SNFD 표현형이 발현되지 않는 정도이다.
본 발명의 발명자들은 AFLP에 의해 L4 대립형질에 인접한 다양한 유전적 마커들의 존재를 확인했고, 그리고 마커들 사이의 또는 마커와 L4-대립형질 사이의 재조합에 기초하여 이들 마커들이 각각 다른 그룹으로 나뉠 수 있다는 것을 발견하였다 (실시예의 표 1 참조). L4-유전자 자리에 연결된 다른 군의 위치가 도 1에 나타나있다. PMMoV 병원형 1.2.3 생물학적 분석에서 L4-대립형질의 존재를 나타내는, 마커들과 내성 점수 사이에서 재조합이 발견되지 않는 한, 그룹 1 마커들이 L4-대립형질 자체에 가장 근접한 것으로 생각된다. 그룹 2 및 그룹 3 마커들은 각각의 방향에서 그룹 1 마커들을 측면에 배치한다. 4 번째 그룹 1 및 그룹 3 둘 다 스패닝(spanning)하는 영역에 위치된 마커들로 구성된다. 마커들의 이들 그룹은 여기서 그룹 1/3 마커들로 언급된다.
그룹 1/3에 존재하는 마커들은 이들 마커들의 각각 주어진 마커와 그룹 1 마커들 사이에 또는 주어진 마커와 그룹 3마커들 사이에서 재조합이 관찰되지 않은 것처럼, 그룹 1 또는 그룹 3내에 배치될 수 없다는 점에서 구별된다. 그룹 1/3마커들 및 그룹 2 마커들 사이에서 재조합이 관찰되는 것처럼, 이들 두 그룹으로부터의 마커들은 그들의 유전적 위치에서 명백하게 다르고, 그리고 이들 마커들의 실질적 위치는 그룹 1 또는 그룹 3이다.
따라서, 각각의 군들에서 재조합은 관찰되지 않았다.
염색체의 잔기를 향한 도 1의 지도의 정위 (orientation)는, 그룹 2 마커들은 동원체에 위치되고, 그리고 그룹 3 마커들은 염색체 11의 사우스 상의 텔로미어에 (말단부를 향한) 위치되도록 된다. 즉, 대립형질의 주요부는 Lefebvre et al., 2002의 도 1에서 공개된 것처럼 고추의 종 내 일치된 연결 지도에서 나타낸 대로, 분리된 개체 PY에 대한 염색체 11 (Chr. P11 (brun)) 상의 마커 TG036의 아래에 위치된다.
L4 대립형질에 내성이고 동형접합이고 그리고 그룹 2, 그룹 3 또는 그룹 1/3, 및 특히 그룹 2의 마커들 중 일부가 유실된 식물에서, SNFD를 나타내지 않는다는 것을 발견하였다. 따라서, 통상적으로 L4 대립형질에 연결되는 특정 게놈 영역은 내성에 영향을 주지 않지만 생장 및 생식력, 뿐만 아니라 자손 식물들로의 내성 형질의 유전 양식에 강하게 영향을 주는 다른 유전형의 상동 기관으로 치환될 것이다.
SNFD 표현형이 부재하는 식물들은 예를 들어, 종래의 이종 교배 (식물 교잡) 기술로 얻어질 수 있다. 그러나 조건은 정확한 선택 기준이 사용되는 것이다. 본 발명에 따라서 적절한 선택 기준 즉, L4 내성 대립형질에 인접한 유전적 정보의 한 조각의 완전한 또는 부분적인 부재 또는 비활성이 정의되었다. 본 발명에 따르면, 얼마나 많은 내성 대립형질을 둘러싼 유전적 정보가 부재하는지 또는 재조합체에서 억제되는지 또는 어떠한 방식으로 SNFD 표현형을 부여하는 유전자(들)이 비활성화되는지, SNFD 표현형이 식물 및 그것의 자손로부터 부재하는지에 대해서는 서로 관련성이 없다.
L4 대립형질과 SNFD 표현형을 유발하는 유전자 사이에서 재조합이 발생된 식물을 발견하기 위해서, 분리된 개체군, 또는 그러한 개체군의 자손를 재조합체 표현형, 즉 비-SNFD 표현형과 결합된 PMMoV P 1.2.3에 동형접합적 내성을 갖는 식물에 실질적으로 스크린하였다.
비록 이러한 방식으로 적절한 재조합체를 발견하는 것이 가능하지만, 작물학상으로 가치가 있는 재조합체를 발견하는 것이 복잡해지는 것에는 수많은 이유가 있다. 상기 언급한 것처럼, 동형접합성는 SNFD 표현형을 나타낸다. 그러나, 만약 그러한 동형접합성가 감수성 식물 (즉, L4 대립형질을 포함하지 않는)로 이종 교배 되면, F1은 내성을 보이고 SNFD를 보이지 않는다는 것이 발견되었다. 이것은 L4 내성 대립형질이 우성인 반면에, SNFD 표현형의 원인이 되는 유전자는 열성이라는 사실 때문에 나타난다.
따라서 식물의 자손와 C. chacoense 염색체 단편의 단일 카피 (copy)는 내성과 보통의 (비-SNFD) 표현형을 조합할 것이다. 그러나, 그들의 F1 자손은 내성 표현형을 분리할 것이고, 상업적인 Capsicum 품종은 유통되기 위해 유전적 균일성에 대한 엄격한 요구사항을 반드시 따라야만 하기 때문에 그러한 식물들은 상업적으로 사용될 수 없다.
발생할 수 있는 상기 언급한 난점들에도 불구하고, SNFD 표현형에 대한 유전적 정보가 부재하는 바람직한 식물의 선택은 종래의 방식으로도 충분히 가능하다는 것이 명백할 것이다. 그러나 이러한 선택 방식은 확인을 위해 상대적으로 큰 분리 개체군 또는 다수의 교배를 요구한다.
그러므로 적절한 식물의 선택에서 분자 생물학적 도구를 사용하는 것이 더욱 효율적일 것이다. Vos et al., 1995에 의해 기술된 것처럼, 유용한 기술은 AFLP 기술이다.
본 발명에 적용될 때, 이 기술은 유전적으로 L4 대립형질에 연결되는 DNA 마커들의 맵핑에 기초하고, 그 후 교배 실험의 자손에서 대립형질에 인접하여 발생되는 상대적으로 단순한 방식으로 재조합 현상을 측정할 수 있다. SNFD 표현형이 부재하는 L4 대립형질을 위한 동형접합성을 조합하는 식물들의 선택의 효율성은 분자 마커들을 사용함에 의해 상당히 증가될 수 있다. L4-연결된 마커가 유실될 때, (따라서) L4 대립형질과 그 마커 사이의 이종 교배가 발생하였다. 대립형질로부터 다양한 유전적 거리에서 마커들을 선택함에 의해, 재조합의 위치가 한정될 수 있고 따라서 대립형질의 부근에서 다량의 또는 소량이 소실되는지가 결정될 수 있다. 따라서 연결된 마커들 중 하나 이상이 없는 자손는 대립형질의 바람직하지 않은 부근의 하나 이상의 조각이 부족할 것이고, 그리고 따라서 L4 대립형질을 갖는 염색체가 존재하는 평균 이상의 기회를 가지며, 여기서 SNFD 표현형을 생성하는 유전적 정보는 존재하지 않는다.
대립형질에 인접한 유전적 마커들의 맵핑은, 통상의 당업자가 분자-생물학적 기술, 예를 들어 Lefebvre and Chevre, 1995; Michelmore, 1995; Winter and Kahl, 1995에서 기술되어 있는 기술들을 사용하여 매우 용이하게 수행될 수 있다. AFLP 기술에 관한 일반적인 정보는 (상기의)Vow et al. 에서 발견될 수 있다.
L4 내성 대립형질이 동형접합 조건에서 존재하고 그리고 SNFD 표현형을 발현하지 않는 본 발명의 구현예에 따른 식물들은, PMMoV P1.2.3 내성을 다른 작물학적으로 가치가 있는 Capsicum 형으로 전이시키기 위해 적절하게 사용될 수 있다. 따라서 잡종 고추 식물들은 동형접합 식물, 바람직하기는 동종 교배주와 다른 고추 식물을 이종 교배함에 의해 생산될 수 있다. 다른 고추 식물은 PMMoV P1.2.3에 내성이거나 또는 아닐 수 있고, 바람직하기는 동형접합이고 그리고 보다 더 바람직하기는 동종 교배주이다.
L4 내성 대립형질이 동형접합 조건에서 존재하고 그리고 SNFD 표현형을 발현하지 않는 본 발명의 구현예에 따른 식물들은, 또한 PMMoV P1.2.3 내성을 다른 작물학적으로 가치가 있는 Capsicum 형으로 고정시키기 위해 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 적어도 2 세대 동안의 식물들의 자가-수분 및 내성 대립형질에 동형접합이고 그리고 SNFD 표현형을 발현하지 않는 주의 선택이 뒤따르는 표준적인 여교잡 과정 (예를 들어 Briggs and Knowles, 1967 참조)에 의해 발생될 수 있다.
선택 프로그램의 특정 단계에서, 이종 교배-수분이 사용된다. 그러나 자가-수분 식물의 이종 교배-수분은 모계로서 사용되는 식물에서 자가 생식이 방지되는 것을 요구로 한다. 이것은 생식기관에서 부계를 수동적으로(manually) 제거함에 의해 달성될 수 있다. 이것은 그들의 물리적 제거에 의해 또는 화학 약품에 의해 및/또는 꽃에 물을 사용함에 의해 수행될 수 있다. 생식기관에서 부계를 제거하거나 또는 기능부전이 되게 하는 이러한 모든 방법은 기술분야에서 잘 알려져 있다. 교배의 자손는 교배의 모계가 종자를 생산하도록 유발함에 의해, F1 또는 여교잡 종자를 수집함에 의해, 그리고 새로운 식물을 얻기 위해 그것을 파종함에 의해, 얻어질 수 있다. F1 식물들은 F2 세대를 생산하기 위해 자가-수분화되거나 또는 여교잡 개략도의 반복 어버이 (recurrent parent)로 여교잡될 수 있다. 여교잡된 식물들은 그 후의 세대에서 식물들의 작물학적 가치를 개선하기 위해 (반복) 어버이와 추가로 이종 교배될 수 있고 또는 L4 대립형질에 동형접합인 그리고 SNFD 표현형을 발현하지 않는 식물들을 생산하기 위해 자가-수분화될 수 있다.
본 발명은 Capsicum annuum에 대한 이러한 적용에서 설명된다. 마찬가지로 본 발명의 원칙은 고추 속의 다른 종에, 더욱 일반적으로는 L4 대립형질이 PMMoV 내성을 부여하기 위해 도입될 수 있는 가지과 군의 식물들에 적용가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 원칙적으로, 본 발명의 바람직한 양상들은 PMMoV에 의해 영향을 받을 수 있는 모든 식물들에 관련될 것이고, 그리고 본 발명의 원칙은 마찬가지로 PMMoV의 숙주 범위 내에 있는 어떠한 식물 종들에 적용가능하다. 이 문맥에서, "Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J., Watson, L. and Zurcher, E.J. (eds.) (1996 이후) 'Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th August 1996.' URL:http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/"의해 공식적으로 인용된 웹사이트 공개에서 기술되었지만, 즉 http://image.fs.uidaho.edu/vide/refs.htm에서 발견된 것처럼, PMMoV의 숙주 범위에 대해 특별한 참조가 이루어졌다. 이 문맥에서, Dallwitz, 1980 및 Dallwitz et al., 1993 역시 인용되어야 한다. 그렇지만 C. annuum에 대한 참조는 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
Capsicum 식물 자체, 및 과실과 같은 섭취에 적절한 식물의 부분들에 더하여, 본 발명은 증식에 적합한 식물의 부분을 포함한다. 상기한 바와 같이, 본 발명은 Capsicum 식물의 식물부에 제한되는 것은 아니고, PMMoV의 숙주 범위 내의 어떠한 식물부에 관한 것이다. 증식에 적합한 부분의 예는 재배종 및 유사체에서 종자, 잎, 줄기, 뿌리, 발아 및 유사체, 원형질체, 체세포 배, 꽃밥, 잎자루, 배양 세포와 같은 기관 조직이다. 본 발명에 따른 식물들은 종래의 방식에 의해, 그러나 또한 식물부로부터 조직 배양 기술에 의해 재배되거나 또는 증식될 수 있다.
PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물을 생산하기 위한 본 발명의 방법은 PMMoV 병원형 1.2.3에 감수성인 고추 속의 적절한 수용체 식물을 제공하는 단계를 포함한다.
PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물을 생산하기 위한 본 발명의 방법은 예를 들어 공여자 식물에서 상기 수용체 식물로의 도입단계를 추가로 포함하고, 그리고 L4 내성 대립형질은 상기 수용체 식물로 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여한다.
PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물을 생산하기 위한 본 발명의 방법은 상기 내성 식물로부터의 분리 개체군의 생산단계를 추가로 포함할 것이다.
PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물을 생산하기 위한 본 발명의 방법은 상기 분리 개체군의 각각의 식물의 자손의 실질적인 생산단계를 추가로 포함할 것이다. 자손 또는 자손은 상기 식물이 종자를 생산하게 함에 의해, 예를 들어, 상기 식물을 이종 교배하거나 자가 수정하고, 그리고 상기 종자를 신규한 식물로 생장시킴에 의해 생산될 수 있다. 그러한 대안은 식물 육종의 분야에서 상당히 일반적인 것이다.
PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물을 생산하기 위한 본 발명의 방법은 상기 적어도 하나의 자손들 중에서, 그것의 게놈에 L4 내성 대립형질이 존재하고, 그리고 게놈에 적어도 SNFD 표현형이 발현되지 않는 정도로 SNFD 표현형의 원인이 되는 유전적 정보가 존재하지 않는 식물을 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 식물들의 게놈에서 L4 내성 대립형질의 존재는 어떠한 천연적 또는 인공적 원인의 결과일 수 있고, 그리고 예를 들어 유전질 침투 유전자 공학 (형질 전환) 또는 원형질체 융합의 결과일 수 있다.
공여자 식물로부터 비-내성이고 또는 PMMoV에 낮은 수준의 내성을 갖는 수용체 식물로의 L4 내성을 코드화하는 하나 이상의 유전자의 유전질 침투는 종래의 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, PMMoV 내성을 코드화하는 하나 이상의 유전자들, 즉, L4 대립형질을 전통적인 육종 기술, 임의로 예를 들어 마커들을 사용한 분자 스크리닝 방법과 결합하여 사용하여, 비-내성인 수용체 고추 식물로 또는 PMMoV에 대해 낮은 수준의 내성을 갖는 식물에 유전질 침투시킬 수 있다.
PMMoV 내성을 코드화하는 하나 이상의 유전자를, 공여자 식물에서 비-내성인 또는 PMMoV에 대한 낮은 수준의 내성을 갖는 수용체 식물로 유전질 침투시키기 위해 전통적인 육종 기술이 적절하게 사용될 수 있다. 이들 방법은 만약 그러한 종, 품종 또는 재배종들이 다른 것으로 이종 교배된다면, 종, 품종 또는 재배종의 전통적인 이종 교배를 수반한다. 계획된 공여자 및 수용체 종이 제한된 함량으로만 다른 것과 이종 교배될 수 있을 때, 가교종 (bridge species)이 사용될 수 있다
계통 육종(pedigree breeding)으로 언급되는, 하나의 전통적인 육종 방법에서, PMMoV에 내성을 나타내고 그리고 PMMoV 내성을 코드화하는 L4 대립형질을 함유하는 첫 번째 고추 식물은, PMMoV에 대해 내성이 없거나 또는 PMMoV에 대해 낮은 수준의 내성을 갖고 그리고 질환에 대한 내성, 곤충에 대한 내성, 가치있는 과실 특징, 등과 같은 작물학적으로 또는 상업적으로 바람직한 특징을 나타내는 두 번째 고추 식물로 이종 교배되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 그 후, 결과의 식물 개체군 (즉, F1)은 자가-수분되고 그리고 파종된다 (F2 종자).
F2 종자로부터 재배된 F2 식물들은 PMMoV에 대한 내성에 대해 스크린된다. 개체군은 수많은 다양한 방법으로 스크린될 수 있다. 첫 번째로, 개체군은 또한 여기에서 내성 생물학적 검정으로 언급된 전통적인 병리학적 질환 스크린을 사용하여 스크린될 수 있다. PMMoV에 대한 그러한 생물학적 검정은 본 분야에서 공지되었다. 특히, 개별적인 식물들 또는 그것의 부분들은 배양기 또는 온실에서 PMMoV로 공격 (challenge)될 수 있고 그리고 각각의 식물의 발생된 내성적 또는 감수성 표현형이 점수로 기록된다. 예를 들어, 식물들은 다음과 같이 온실에서 스크린될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 고추 식물들은 일반적으로 그들의 배양을 위해 적용된 그리고 당업자에게 알려진, 예를 들어, 보통의 여름-광 조건하에서 낮에는 22℃ 및 밤에는 20℃의 생장 조건하에서 온실에서 F2 종자로부터 성장될 수 있다. F2 식물들은 또한 하나 이상의 내성 식물 및 하나 이상의 감수성 식물과 같은 대조군 식물들을 포함하는 트레이에서 성장될 수 있다. 접종원 감염된 잎이 사용될 수 있고, 그리고 냉동 상태로 보관될 것이다. 검사 바이러스를 포함하는 접종원은 감염된 잎을 물로 분쇄하고 (예를 들어 물 100ml에 냉동 잎 1g) 그리고 카보런덤 (탄화규소)를 첨가함에 의해 제조될 것이다. 검사 식물의 접목은 예를 들어 스폰지를 사용하여 식물의 첫 번째의 순종의 (true) 잎의 (예를 들어 최소 3.5 x 2cm) 표면 영역에 접종원을 문질러서 행해질 수 있다. 첫 번째 관할 후에 명백하게 감염된 (명백한 증상들은 전신 모자이크이다) 식물들이 제거될 것이다. 일주일 후 2차 관찰 동안에, 감염된 내성 식물들의 수를 세었다. 잎-검사 동안에, 잎들 (식물의 정상부에서 4-5cm 잎들)은 젖은 여과지를 함유하는 트레이에 배치될 것이고 그리고 잎들은 여과지 위에 배치될 것이다. 감염된 그리고 내성의 대조군들이 트레이에 첨가되고 그리고 트레이는 플라스틱으로 덮여질 것이고 그리고 16시간/일의 광선 조건에서 20에서 배양될 수 있다. 상기 기술한 대로, 접종은 스폰지를 사용하여 행해질 것이고 평가는 6-8일 후에 발생할 것이다.
대안적으로, 전통적인 육종 방법이 분자 스크리닝 방법과 결합하여 행해질 수 있다. 그러한 방법들은 일반적으로 마커-보조 선택 또는 마커-보조적 육종으로서 언급되고 그리고 바람직한 형질 (즉, L4 대립형질, 또는 그것의 절단된 형태)을 코드하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 이들 자손 식물들을 확인하기 위해 하나 이상의 분자 마커의 사용을 수반한다. 게놈의 유전적 구조는 식물의 표현형 및 장황한 생물학적 검정이 불필요해 질 것임을 예측한다. 마커 보조적 선택은 또한 생물학적 검정 스크린으로부터 얻은 결과를 확인하기 위해 사용될 것이다. PMMoV 내성 표현형을 나타내는 F2 잡종 식물들은 PMMoV 내성을 코드화하는 바람직한 유전자, 및 상업적으로 바람직한 특징을 추가적으로 갖고 그리고 선택되고 그리고 상기 고추 식물이 동종 교배가 될 수 있게 하기 위해 다수의 세대들을 자가 수정하는 것들을 포함한다. 그러한 육종 및 선택의 결과는 PMMoV 내성과 결합된 유전자뿐만 아니라 상업적으로 중요한 형질과 결합된 다른 유전자에 유전적으로 동형접합인 주의 생산이다.
본 발명은 이제 다음의 단계를 포함하는, PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물의 생산방법을 제공한다:
a) PMMoV 병원형 1.2.3 또는 그것의 일부로 감염될 수 있는 고추 속의 첫 번째 식물을 제공하는 단계;
b) 상기 식물의 게놈에서 L4 내성 대립형질의 존재로 인해 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 나타내는 고추 속의 두 번째 식물을 제공하는 단계;
c) PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 자손 식물을 생산하기 위해 상기 첫 번째 및 두 번째 식물을 이종 교배하는 단계, 그리고
d) 상기 대립형질은 상기 자손 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 부여하는 유전적 정보를 포함하고, 그리고 SNFD를 부여하는 유전적 정보는 적어도 SNFD 표현형이 발현되지 않는 정도로 상기 대립형질로부터 부재하는, 절단된 L4 내성 대립형질의 존재에 관하여 상기 내성 자손 식물들의 게놈들 추가로 스크리닝하는 단계.
이 방법의 바람직한 구현예에서, 단계 d)의 스크리닝은 도 3에서 나타낸 바와 같이 그룹 2 마커들, 그룹 1/3마커들 및 그룹 3마커들, 바람직하기는 도 3에서 나타낸 바와 같이 그룹 2 마커들로 이루어진 군에서 선택된 L4 내성 대립형질의 적어도 하나의 마커의 부재를 평가함에 의해 행해진다.
본 발명의 방법에 따르면, 선택된 상업적으로 바람직한 특징들은 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 갖지 않는 상업적인 Capsicum 품종과 비교하여, 상기 식물이 비-분리성이고, 생식력이 있고 그리고 정상적인 성장을 나타내는 것을 의미하는 SNFD 표현형의 부재를 포함한다. 이들 특징은 적절한 방법에 의해 식물에서 확인될 수 있다. 예를 들어 정상적인 성장 특징들은 성장 현상의 시각적 검사에 의해 확인될 수 있고, 왜소 성장이 없는 것은 정상적인 성장을 나타낸다. 생식력은 종자 및/또는 화분의 양의 시각적 검사를 통해 평가될 수 있다. 비-분리 표현형은 상기 기술한 대로 이종 교배 (내성 x 감수성)의 F1 종자 상에서 내성 스크린을 행한 검사결과의 평가에 의해 평가될 것이다.
대안적으로, SNFD 표현형의 부재는 특이적 마커들이 없는 식물들을 스크리닝함에 의해 평가될 것이다. 본 발명의 방법 및 식물의 특히 바람직한 하나의 구현예에는, 여기에서 기술한 바와 같이 하나 이상의 그룹 2 마커들이 없다. 따라서, PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물의 생산방법을 위한 본 발명의 방법은 하나의 구현예에서, 내성 식물로부터의 분리 개체군의 적어도 하나의 자손로부터, 여기에서 기술된 그룹 1의 하나 이상의 마커, 바람직하기는 모든 마커가 존재하는 게놈에서, 그리고 여기에서 기술된 그룹 2의 하나 이상의 마커에서 부재하는 게놈에서 식물을 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 식물의 다른 구현예에는, 여기에서 기술된 그룹 3의 하나 이상의 마커들이 부재한다. 본 발명의 또 다른 구현예에는, 여기에서 기술된 그룹 1/3의 하나 이상의 마커들이 부재한다. 이 문맥에서 그룹 1/3의 하나 이상의 마커들의 부재는, 그러한 정보의 부재가 식물의 게놈에서 L4 내성 대립형질의 존재로 인해 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 식물을 생성하지 않을 것이기 때문에, 단지 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성의 원인이 되는 게놈성 영역에 위치되지 않는 마커에 관한 것이라고 이해되어야 한다. 따라서 그룹 1/3의 하나 이상의 마커들의 부재는 바람직하기는 이들 마커들이 바람직하기는 그룹 1 마커들의 그것이 아닌, 그룹 3마커들의 그것에 상응하는 영역에만 위치하는 것에 관한 것이다. 가장 바람직한 구현예에서 L4 대립형질은 하나 이상의 그룹 2 마커들이 부재하도록 절단된다. 이 경우, 절단은 동원체서 일어나고, 반면에 그룹 3마커 절단의 경우에 절단은 텔로미어에서 일어난다. 다른 가장 바람직한 구현예에서 절단은 TG036 (Lefebvre et al., 2002; Ben-Chaim et al, 2001) 마커 (그룹 2 마커들의 일부)가 부재하도록 일어난다.
따라서, L4 대립형질이 제공된 식물에서 SNFD 표현형의 부재는 L4 대립형질을 포함하는 C. chacoense 유전질 침투의 절단된 형태 (여기서는 또한 절단된 L4 대립형질라고 언급됨)를 식물로 도입함에 의해 달성될 수 있다. 절단의 정도는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 절단의 적절한 수준은 만약 그룹 1/3 마커들을 포함하는 영역이 제거될 때, PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성의 원인이 되는 정보를 저장하고 있지 않은 이들 부분들만이 제거되는 조건으로, 유전자 이식 과정에 의해 또는 그룹 2, 그룹 3, 및/또는 그룹 1/3마커들을 포함하는 유전질 침투의 이들 영역 중 어느 하나의 재조합 및 선택 과정에 의한 부분적 또는 완전한 제거에 의해 달성될 수 있다. 바람직하기는 상기 절단은 그룹 2 마커들을 포함하는 L4 대립형질을 포함하는 C. chacoense 유전질 침투의 영역의 부분적 또는 완전한 제거를 수반한다. 따라서, 유전자 이식 과정 또는 재조합 및 선택의 과정에 의한, 하나 이상의 그룹 2 마커들을 포함하는 영역의 제거는 더이상 SNFD 표현형을 발현하지 않는 식물을 생성할 것이다. 가장 바람직하기는 이러한 절단은 TG036 마커 (Lefebvre et al., 2002; Ben-Chaim et al, 2001)의 제거를 도출할 것이다.
절단의 정도는 또한 유전적 거리로서 정의될 수 있다. 유전적 거리는 동일한 염색체 상의 유전자 자리들 사이에서 이종 교배의 빈도수로 측정된다. 두 유전자로부터 더 멀리 떨어질수록, 그들 사이에 이종 교배가 더 많이 발생할 것이다. 역으로, 만약 두 유전자 자리가 서로 가까워지면, 그들 사이에 이종 교배는 더 적게 발생할 것이다. 유전자 자리들은 여기에서 정의된 다양한 마커 그룹의 마커들에 의해 나타날 수 있다. 원칙적으로, 1 센티모건(cM)은 유전자 자리들 (마커들) 사이의 1% 재조합과 동일하다. 그룹 2, 그룹 3 및/또는 그룹 1/3의 하나 이상의 마커의 부재를 발생시키는 절단의 수준은 적절하게는 0.001-10cM, 보다 바람직하기는 0.01-10cM일 것이다. 대안적으로, 유전질 침투의 존재 (예를 들어, 그룹 1의 하나 이상의 마커들)를 나타내는 마커와 절단된 마커들 사이의 유전적 거리는 적절하게는 0.001-10cM, 보다 바람직하기는 0.01-10cM일 것이다.
새로운 그리고 더 우수한 PMMoV 내성 동종 교배 고추 식물주는 또한 반복 선택 및 여교잡의 기술을 사용하여 개발될 수 있다. 이 방법에서, 반복 어버이와 첫 번째 공여자 식물 (반복 어버이와는 다르고 여기에서 "비-반복 어버이"로서 언급되는)을 이종 교배 함에 의해 L4 내성이 표적 수용체 식물 (반복 어버이라고 명칭되는)로 유전질 침투될 수 있다. 반복 어버이는 내성을 갖지않거나 또는 PMMoV에 대해 낮은 수준의 내성을 갖고 그리고 질환에 대한 내성, 곤충에 대한 내성, 가치있는 과실 특징, 등과 같은 작물학적으로 또는 상업적으로 바람직한 특징을 나타내고, 그리고 여기서 SNFD 표현형은 존재하지 않는 식물이지만, 이에 제한되지 않는다. 여교잡 과정은 "공여자 어버이"로부터의 유전자를 작물학적으로 높은 가치의 유전 배경으로 이종 교배하는데 널리 적용된다. 일반적으로 작물학적으로 허용가능한 표현형으로의 우성 유전자의 유전질 침투는 작물학적 가치에 대한 모든 선택 단계가 행해지는, 예를 들어 2-3 자가 수분이 뒤따르는, 3-5 여교잡에 의해 달성될 수 있다. 비-반복 어버이는 PMMoV 내성을 나타내고 그리고 L4 내성 대립형질을 함유한다. 비-반복 어버이 또는 공여자 식물은 반복 어버이 또는 표적 수용체 식물과 타화-수정되는 어떠한 식물 품종 또는 동종 교배주일 수 있다. 반복 어버이 및 비-반복 어버이 사이의 이종 교배로부터 생성된 자손는 반복 어버이로 여교잡된다. 그 후 결과의 식물 개체군이 여교잡된다. 개체군은 다수의 다양한 방법으로 스크린될 수 있다. 첫 번째로, 개체군은 상기 언급된 전통적인 병리학적 스크린을 사용하여 스크린될 수 있다.
두번째로, L4 내성 대립형질을 포함하고 그리고 SNFD 표현형과 결합된 하나 이상의 마커들이 부재하는 이들 자손들을 확인하기 위해, 상기 언급된 하나 이상의 분자 마커를 사용하여 마커-보조 선택이 행해질 수 있다. 대안으로, 마커-보조 선택은 내성 생물학적 검정 스크린으로부터 얻어진 결과를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
일단 적절한 선택이 이루어지면, 상기 과정은 반복된다. 반복 어버이에 대한 여교잡 및 PMMoV 내성 및 SNFD 표현형 (또는 그것과 결합된 마커들)의 부재에 대한 선택 과정이 적어도 5대 이상의 세대에 대해 반복된다. 이러한 과정으로부터 얻어지는 자손들은 L4 대립형질에 대해 이형접합성이다. 그 후, L4 대립형질-부여 PMMoV 내성을 포함하고 그리고 SNFD 표현형이 부재하는 동형접합성 순수한 육종 자손를 제공하기 위해 마지막 여교잡 세대가 자가 수정된다.
L4 대립형질에 대해 동형접합성이고 그리고 SNFD 표현형을 발현하지 않는 여기에서 기술된 PMMoV 내성 동계교배 고추 주들은 PMMoV 내성 잡종 식물을 발생시키기 위한 추가적 이종 교배에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 PMMoV 내성 동종 교배 고추 식물은 질환에 대한 내성, 곤충에 대한 내성, 가치있는 과실 특징, 등과 같은 작물학적으로 또는 상업적으로 바람직한 특징을 나타내지만, 이에 제한되지 않는 두 번째 동종 교배 고추 식물로 이종 교배될 수 있다. 이러한 두 번째 동종 교배 고추 주는 PMMoV에 내성이거나 또는 아닐 수 있다.
본 발명의 양상에서 사용된 선택 과정들은 기술 분야에서 공지된 핵산 분리 과정을 사용하여, 그리고 마커의 존재 또는 부재에 관하여 상기 핵산의 서열을 검사함에 의해 얻어질 수 있는 것과 같이, 식물로부터의 핵산 시료, 바람직하기는 DNA의 공급을 수반할 것이다. 여기에서 정의된 마커들은 그들의 정의로 도출되는 AFLP 반응을 수행함에 의해, 또는 대안적으로 상기 프라이머들이 그들의 특이적 주형을 어닐링(anneal)할 수 있는 조건하에서, 특이적 증폭 생산물을 생산할 수 있는 마커-특이 프라이머들의 하나 이상의 세트로 PCR과 같은 증폭 반응을 수행함에 의해 검출될 수 있는 AFLP 마커들이다. 그 후 특이적 증폭 생산물의 존재는 주형 서열에서 마커의 존재를 나타내는 반면에, 증폭 생산물의 부재는 마커의 부재를 나타낸다. L4 유전질 침투 (L4 대립형질)의 존재를 확인하기 위해, 그룹 1 마커들의 하나 이상, 바람직하기는 모든 마커들, 가장 바람직하기는 여기에서 기술된 마커 E58/M50-F-580 및/또는 마커 E54/M55-F-101이 핵산 시료에서 검출된다. 적당하게 절단된 대립형질의 존재를 확인하기 위해, 바람직하기는, 여기에서 기술된, 그룹 2의 하나 이상의 마커들은 존재하지 않는다. 어떠한 AFLP 마커들은 또한 서열 꼬리표 부위 (sequence tagged cite) 마커들로 전환될 수 있고, 그리고 이종 교배의 자손의 빠르고 유리한 스크리닝을 허용한다 (Werner et al., 2001).
대안적으로, 식물 시료의 게놈에서 L4 마커들의 존재 또는 부재에 대한 스크리닝 방법은 하나 이상의 마커 서열들을 포함하는 염색체적 영역 상에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 선택적으로 결합하는 프로브 (prove)와 식물로부터의 핵산 시료를 접촉하고, 여기서 상기 프로브는 프로브가 안정한 잡종 복합체를 형성하기 위한 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 선택적으로 결합하는 조건 하에서 시료와 접촉하고; 그리고 잡종 복합체의 존재 또는 부재를 탐지하고, 그것에 의해 식물에서 상기 마커들의 존재 또는 부재를 스크리닝하는 것을 포함한다.
여기에서 언급된 방법에서 사용된 마커-보조 선택은 예를 들어, 단계적으로 행해질 수 있고, 그리하여 L4 대립형질의 존재 및 SNFD 표현형의 부재가 하나 이상의 세대에서 선택된다. L4 대립형질-부여된 내성에 대한 마커-보조 선택은 검사 및 질환에 대한 내성, 곤충에 대한 내성, 가치있는 과실 특징, 등과 같은 상업적으로 바람직한 형질에 대한 선택 전에, 그것과 함께, 또는 후에 행해질 것이다. 마찬가지로 PMMoV 내성 또는 SNFD 표현형의 부재를 평가하는 순서는 특별히 제한적이지는 않다. SNFD 표현형을 부여하는 유전적 정보를 포함하는 식물의 배제 (바람직하기는 마커-보조적)는 PMMoV 내성 식물들의 선택 (바람직하기는 마커-보조적) 전에, 또는 동시에 행해질 것이다.
L4 대립형질이 그것의 천연적인 주위 환경으로부터 분리될 수 있고, 따라서 SNFD 표현형을 부여하는 유전적 정보가 아닌 L4 내성을 부여하는 유전적 정보만을 얻는 재료의 공급원은 예를 들어 C. chacoense 수집종 PI 260429 또는 SA 185 (Boukema, 1983)의 식물으로부터 유래된다. 그러한 수집종은 예를 들어 Plant Genetic Resources (PGR) cluster of the Centre for Genetic Resources, the Netherlans (CGN), Wageningen, The Netherlands로부터 입수가능하다.
본 발명에 따른 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하는 분리된 핵산 서열은 예를 들어 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성인 식물로부터 DNA를 분리하고 그리고 상기 DNA로부터 L4 내성 대립형질을 분리함에 의해 생산될 수 있다. 그러한 분리는 예를 들어, 상기 L4 대립형질의 PMMoV 내성-부여 부분을 포함하는 게놈 영역을, 예를 들어, 전방의 및 반대의 적절한 프라이머를 사용함에 의해 증폭하여 달성될 수 있다. 적절한 프라이머는 예를 들어 그룹 2의 마커들의 정의에 사용된 것들과 그룹 3의 마커들의 정의에 사용된 마커들이다. 증폭 단편의 크기는 C. chaconese 게놈의 위치를 어닐링하고, 보다 덜 멀리 떨어진, 예를 들어 그룹 1의 마커들의 위치와 더 가까운, 다른 프라이머들을 사용하거나 또는 개발함에 의해 감소될 수 있다. 이런식으로, L4 대립형질로부터 부재인 SNFD 표현형을 부여하는 유전적 정보가 달성될 수 있다. 당업자는 고추 속 식물에서 발현되기 위해 그러한 핵산 내에 존재해야만 하고, 그로 인해 상기 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 부여하는 다양한 조절 효소들을 잘 알고 있다.
예를 들어 L4 대립형질 또는 L4 유전자는 또한 기술 분야에서 공지된 표준 DNA 분리 방법을 사용하여 Capsicum 식물로부터 게놈성 DNA의 시료를 제공함에 의해 분리될 수 있다. 큰 DNA 단편들을 회수하기 위해, 단리주의 품질이 상대적으로 높고, 즉, 게놈성 DNA의 심각한 분해를 본질적으로 피하는 것이 요구된다. 일반적으로, 만약 고 분자량 (HMW) DNA 제조를 얻기 위한 분리 기술들이 채용될 때, 충분한 길이의 DNA가 얻어질 것이다. HMW DNA는 제조화 동안에 물리적 전단으로부터 보호되어 얻어진 DNA이다. 고추속 열매 식물 조직의 HMW DNA 제조는 예를 들어 세포 벽 가수분해를 사용한 원형질체의 분리 및 아카로스에서 원형질체를 임베딩 (embedding)하는 것을 수반할 것이다. 대안적 방법은 식물 핵으로부터 HMW DNA를 제조하는 것이다. 다수의 식물종에 대해 메가베이스 DNA의 분리가 성공적으로 수행되었고, 그리고 그러한 방법들은 이제 박테리아 인공 염색체 (BAC) 및 효모 인공 염색체 (YAC) 벡터에서 큰 삽입 DNA 라이브러리(library)를 구성하기에 적절한 메가베이스-크기의 DNA를 제공하기 위해 통상적으로 적용된다. 게놈성 DNA가 분리되면, 그것은 예를 들어 제한 효소를 사용하여 처리될 것이고, PCR 증폭 반응에서 사용되거나 또는 여기에서 제공된 마커 서열들 중 어느 것과 클론되거나 또는 프로브될 것이다.
본 발명은 PMMoV 감염에 대한 내성을 나타내는 유전자 이식 식물을 제공하기 위해 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여, 고추 또는 다른 식물들로의 그러한 분리된 및 정제된 유전자들 (또는 대립형질들)의 삽입을 추가로 고찰한다. 식물 형질 전환은 식물 세포에서 작용할 것인 발현벡터의 구성을 수반한다. 본 발명에서, 그러한 벡터는 조절하에 있거나 또는 프로모터와 같은, 조절 요소에 기능적으로 연결된 PMMoV 내성을 코드화하는 유전자를 포함하는 DNA를 포함한다. 만약 적어도 하나의 유전자가 PMMoV 내성을 코드화하는 조합들에 포함된다면, 발현 벡터는 하나 이상의 그러한 기능적으로 연결된 유전자/조절 요소 조합들을 함유할 것이다. 벡터(들)은 플라스미드의 형태일 수 있고, 그리고 PMMoV에 내성인 유전자 이식 식물을 제공하기 위해, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 형질 전환 시스템과 같은, 기술 분야에서 공지된 형질 전환 방법을 사용하여, 단독으로 또는 다른 플라스미와 결합하여 사용될 수 있다.
발현 벡터들은, 마커를 포함하는 형질 전환된 세포가 음성적 선택 (선택가능한 마커 유전자를 포함하지 않는 세포의 성장을 억제)에 의해, 또는 양성적 선택에 의해 (유전적 마커에 의해 코드화되는 생산물을 스크리닝)에 의해 회복될 수 있도록 하는 조절 요소 (프로모터와 같은)에 기능적으로 결합된 적어도 하나의 유전적 마커를 포함할 수 있다. 통상적으로 사용되는 다수의 선택가능한 식물 형질 전환 용 마커 유전자들은 기술 분야에서 공지되어 있고, 그리고 예를 들어, 항생 물질적 또는 제초제적일 수 있는 선택적인 화학 약품의 독성을 대사적으로 제거하는 효소를 코드화하는 유전자, 또는 억제제에 영향을 받지 않는 변형된 표적을 코드화하는 유전자들을 포함한다. 대안적으로, 상기의 마커 유전자, 기술 분야에서 공지된 기술 없이 식물을 얻기 위해, 더 적은 마커-형질 전환이 사용될 수 있다.
발현 벡터를 식물로 도입하는 하나의 방법은 아그로박테리움의 천연적 형질 전환 시스템에 기초한다 (예를 들어, Horsh et al., 1985 참조). A. tumefaciens 및 A. rhizogenes는 유전적으로 식물 세포를 형질 전환하는 병원성 토양 박테리아이다. A. tumefaciens 및 A. rhizogenes , 각각의 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전적 형질 전환의 원인이 되는 유전자를 운반한다 (예를들어, Kado, 1991 참조). 발현 벡터를 식물 조직으로 도입하는 방법은 직접적 감염 또는 식물 세포와 A. tumifaciens의 공-배양을 포함한다 (Horsh et al., 1985). Agrobacterium 벡터 시스템의 정의 및 Agrobacterium-매개 유전자 전이 방법은 Gruber and Crosby, 1993 and Moloney et al., 1989에 의해 제공된다. 또한 미국 특허 No. 5,591,616을 참조하라. 식물 발현 벡터 및 리포터 유전자 및 형질 전환 프로토콜의 일반적 기술 및Agrobacterium 벡터 시스템 및 Agrobacterium-매개 유전자 전이 방법은 Gruber and Crosby, 1993에 의해 참조될 수 있다. 식물 조직을 배양하는 일반적인 방법은 예를 들어 Miki et al., 1993에 의해 그리고 Phillips et al., 1988에 의해 제공된다. 분자 클로닝 기술 및 적절한 발현 벡터에 대한 적당한 참조 핸드북은 Sambrook. J., EF. Fritsch, and T.Maniatis. Molecular Cloning: a Laboratory Manual (3판). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y., 2000.
발현 벡터를 식물로 도입하는 다른 방법은, 여기서 DNA가 미세발사물 (microprojectile)의 표면 상에서 운반되는 미세발사물-매개 형질 전환에 기초한다. 식물 세포 벽 및 막조직을 관통하기에 충분한 300 내지 600m/s의 속도로 미세 발사물을 가속화하는 바이오리스틱 (biolistic) 장치로, 발현 벡터가 식물조직으로 도입된다 (Sanford et al., 1987, 1993; Sanford, 1988, 1990; Klein et al., 1988, 1992 참조). DNA를 식물로 도입하는 다른 방법은 표적 세포의 초음파 분해 (Zhang et al., 1991 참조)를 통한 것이다. 대안적으로, 리포솜 및 스페로플라스트 융합이 발현 벡터를 식물들로 도입하기 위해 사용되었다 (예를 들어 Deshayes et al., 1985 and Christou et al., 1987). CaCl2 침전물, 폴리비닐 알콜 또는 폴리-L-오르니틴을 사용한 원형질체로의 DNA의 직접적 흡수가 또한 보고되었다 (예를 들어, Hain et al., 1985 and Draper et al., 1982 참조). 원형질체들 및 전체 세포들 및 조직들의 전기 천공법 또한 기술되었다 (D'Halluin et al., 1992 and Laursen et al., 1994).
고추 표적 조직의 형질 전환 후에, 상기의 선택가능한 마커 유전자의 발현은 본 분야에 잘 알려져 있는 재생 및 선택 방법을 사용하여 형질 전환된 세포, 조직 및/또는 식물들을 우선 선택한다.
형절전환에 대한 상기 방법은 유전자이식 고추 식물 또는 다른 식물 종을 생산하기 위해 사용될 수 있지만, 그러나 가지과 ( Solanaceae ) 종에 한정되지는 않는다. 이 전에 기술한대로, 본 발명의 다양한 양상은 원칙적으로 PMMoV에 의해 영향을 받을 수 있는 모든 식물들에 관한 것일 것이고, 따라서 본 발명에 따른 유전자 이식 식물은 PMMoV 숙주 범위 내의 어떠한 식물 종으로 생산될 수 있다.
그리고 나서, 고추의 유전자 이식 잡종 또는 PMMoV 감염에 내성인 다른 식물 종을 생산하기 위해, 그러한 유전자 이식 식물들은 다른 식물 (형질 전환되지 않은 또는 형질 전환된)과 이종 교배 될 수 있다. 대안으로, 유전자 이식 고추에서 PMMoV 내성에 대한 외래 유전자 (이형 접합적) 또는 여기에서 기술된 형질 전환 기술을 사용하여 PMMoV 내성을 코드화하는 외래 (이형 접합적 또는 동형 접합적) 유전자(들)을 포함하기로 설계된 다른 식물 종들은 기술분야에서 공지된, (여교잡와 같은) 전통적인 육종 기술을 사용하여 다른 식물로 이동될 수 있다. 예를 들어, 그리고 여기에서 미리 논의된 바와 같이, 여교잡은 유전자 이식 PMMoV 내성 동종 교배 고추 또는 PMMoV 내성을 코드화하고 그리고 비-내성 고추 식물 또는 유전자를 포함하지 않는 다른 작물에 대한 SNFD 표현형의 원인이 되는 유전적 정보를 포함하지 않는 외래 (이형 접합적) 유전자를 포함하는 다른 식물주로부터, 또는 유전자 이식 잡종 PMMoV 내성 고추 식물 또는 PMMoV 내성을 그 유전자를 포함하지 않는 주(들)로 코드화하는 외래 유전자를 포함하는 다른 식물로부터 PMMoV 내성을 유전자 이식하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 원형질체 융합은 더 우수한 신규한 PMMoV 내성 식물들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 더욱 상세히는, 첫 번째 원형질체는 고추 식물 또는 PMMoV에 의한 감염에 내성을 나타내고 그리고 SNFD 표현형의 원인이 되는 유전적 정보를 포함하지 않는 다른 식물주로부터 얻어질 수 있다. 두 번째 원형질체는 두 번째 고추 또는 질환에 대한 내성, 곤충에 대한 내성, 가치있는 과실 특징, 등과 같은 작물학적으로 또는 상업적으로 바람직한 특징을 나타내는 두 번째 고추 품종으로부터 얻어질 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 후 원형질체는 기술 분야에서 공지된 전통적인 원형질체 융합 과정을 사용하여 융합된다. 예를 들어, 원형질체 융합은 막조직의 융합을 촉진하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액을 사용함에 의해 달성될 수 있다. 그러한 체내 교배는 이종 간의 잡종 및 그것의 변형물을 생산하기 위해 Sundlberg et al., 1986에 의해 개시된 조건하에서 효율적일 수 있다. 그러나, 당업자는 원형질체 융합이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 사용하지 않은 다른 방법에 의해서도 달성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 원형질체는 Koop and Spangenberg, 1989에 의해 기술된 전기장-유도된 융합 기술을 사용함에 의해 융합될 수 있다. 추가적으로, 원형질체 융합은 덱스트란 및 폴리비닐 알코올로 달성될 수 있다. 원형질체 융합에 대한 추가적인 방법은 Gleba et al., 1984 and Dodds and Roberts, 1995에서 발견될 것이다.
예시의 방법으로, 제한 없이, 본 발명의 실시예가 이제 주어질 것이다.
도 1은 마커들의 다른 그룹 (1, 2, 3, 1/3 그룹)을 표시하고, 실시예 1에서 나타낸 표 1에 나열된 이들 그룹의 각각에 존재하는 이들 유전자 자리 마커들에 결합된 L4 유전자 자리의 미세지도를 나타낸다.
도 2는 개별적 마커들이 표시된 동일한 미세지도를 나타낸다.
도 3은 여기서 사용된 마커들에 관한, 특히 뉴클레오티드 서열 정보 및 마커 길이의 상세한 정보를 제공한다. 마커 길이는, 표시된 프라이머와 PCR 반응을 수행하고, 주형 DNA로서 C. chacoense 수집종 PI 260429로부터 분리된 게놈 DNA를 사용함에 의해 증폭된 DNA 단편의 염기 쌍에서의 대략적인 길이이다.
Sylvia의 부계 어버이 (S&G 품종 "Cuby"의 동종 교배 계통) 및 Manito의 부계 어버이 (S&G 품종 "Tasty"의 동종 교배 계통)로 명명된 2개의 동종 교배 어버이 계통들이 생산되었다. Sylvia 및 Manito 품종 양쪽 모두 초기에는 PMMoV 내성에 대해서 분리되었다. 식물 선택 및 이종 교배 테스트에 의해, 양쪽 품종에서 내성이 고정되는 것이 가능해졌다. 그러나 비-안정성 부계 불생식력/불량한 생식력 및 왜소 성장 같은 형질들은 양쪽 품종의 부계 어버이에서 나타나는 것으로 알려졌다.
본 실시예들에서 사용된 PMMoV 병원형 1.2.3은 1982년 Boukema에 의해 기재된 단리주 P14와 같은 유사한 특성을 갖는 바이러스 단리주이다. 하기의 실시예에서, 다양한 실험에서 사용된 바이러스 단리주는 현재는 네덜란드, 날드위크에 위치한 PPO인 PTG (Proefstation voor Tuinbouw onder Glas)로부터 받았고, 기계적으로 번식시켰다.
실시예 1. 동일한 품종 내에서 내성 및 감수성 있는 고추 식물들 중의 L4 내성 마커들 .
L4-유전자 자리의 연관 지도는 Keygene (Wageningen, The Netherlands)에 의해 제조되었다. L-유전자 자리가 염색체상에 위치한 영역은 염색체 11-south의 텔로미어 상에 위치하였다(Lefebvre et al., 2002).
이 유전자 자리 주위의 마커들은 4개의 그룹으로 나눌 수 있었다. L4 유전자 자리에 연관된 상이한 그룹의 위치를 도 1에 나타내었다. 각각의 그룹에서 재조합이 발견되지 않는 범위 내에서, 각 그룹은 많은 수의 마커들을 포함하였다. 염색체의 나머지 부분에 대한 연관 지도의 정위 (orientation)는 알려지지 않았다. 각각의 그룹 내에 존재하는 마커들은 표1에 나타냈다.
표 1: 각각의 그룹 내의 마커들에 대한 개요
Figure 112007032522599-pct00001
분리되는 품종 Manito 및 Sylvia로부터, 내성 어버이 계통과 마찬가지로 F1 식물들을 상기 기재된 것과 상당히 유사하게 생물학적 검정 (bioassay)에서 테스트하였다. 통틀어, 트레이는 하나의 감수성 대조군과 하나의 내성 대조군을 포함하여, 35개의 테스트 식물들로 이루어졌다. 줄기 및 잎 테스트 생물학적 검정은 본질적으로 상기 기재에 따라 수행되었다. 생물학적 검정의 결과를 표 2에 나타냈다.
표 2: 품종 Sylvia 및 Manito 및 그것들의 내성 어버이 계통에 대한 생물학적 검정의 결과
Figure 112007032522599-pct00002
표 2에서 나타낸 생물학적 검정으로부터, 분리되는 품종 Manito 및 Sylvia 양쪽 모두의 F1 식물들로부터 3개의 내성 및 3개의 감수성 식물들을 임의로 선택하 였고, 마찬가지로, 그것들의 상응하는 내성 부계 어버이로부터 5개의 식물들을 임의로 선택하였다. 선택된 식물들은 L4 유전자 자리와 연결된 표 1에 실려있는, 4개의 마커로 추가로 분석하였다. 표 1에 실려있는 모든 마커들이 테스트시에 동시에 확인된 것은 아니다. 각각의 품종의, 3개의 내성 및 3개의 감수성 식물들을 다양한 마커의 존재하에 테스트하여 분석하였다. 유사한 내성 어버이로부터, 5개의 식물들을 분석하였다. 마커 분석의 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3: 생물학적 검정으로부터 선택된 식물들의 마커 점수 (우성, 내용을 참고)
Figure 112007032522599-pct00003
숫자는 마커 테스트에서 테스트 횟수에 해당한다; R, 내성; S, 감수성; +, 존재; -, 부재
표 3으로부터 나타낸 것과 같이, L4 대립형질에 연관된 모든 마커들이 생물학적 검정 (R)에서 표현형의 내성을 나타내는 F1-식물들에 존재하였다. 그러나, 감수성 식물들(S)에서는, L4 마커들의 어느 것도 존재하지 않았다. Manito (번호. 29-33) 및 Sylvia (번호. 40-44)의 내성 부계 어버이들은 생물학적 검정에서 분리를 나타내지 않았고, L4 대립형질에 연관된 모든 마커들은 이들 식물체에 존재하였다. 마커들이 오직 존재 또는 부재(우성)로 기록되기 때문에, 유전질 침투 (introgression) 단편이 동형접합성로 또는 이형접합성로 존재하는지를 결론 지을 수 없었다. F1에서 감수성은 L4 유전질 침투의 부재에 의해 야기된다고 결론 지어졌다. 추가의 시험은 L4 내성의 유전에서 모계(maternal) 효과가 없다는 것을 나타낸다.
실시예 2. 비-분리된 Sylvia 품종의 생육
비-분리된 품종 Sylvia를 발육시키기 위해, 내성 어버이 계통 (4578 계통)의 개개의 식물들을 감수성 어버이의 식물들과 이종 교배시켰다. L4 내성의 분리의 발생을 결과의 개개의 F1 개체군에서 평가하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
6636 계통을 식물 번호 4578-8을 자가 수정(selfing)함으로서 얻었다. 이들 식물들은 상이한 (하지만 관련있는) 감수성 모계통에 대해 부계로서 사용되므로, 6636 계통의 개개의 식물들은 1회 이상 수록되었다.
4578 계통의 식물 중 어떤 것도 완전한 내성 F1을 일으키지 않았다. 그러나 4578 계통(6636 계통 참조)을 자가 수정함으로서 내성 유전자를 100%를 전이시킨 계통을 발견하는 것이 가능해졌다. 10개 중 4개에서, 완전한 내성 F1을 가져왔다. 식물 번호 6636-4로부터 유래된 F1의 분리는 다른 계통과는 상이한 패턴을 나타냈다. 표 4에서 나타낸 것처럼, 분리된 F1 개체군 (2R/3S - 3R/2S)중의 내성 식물들의 수가 변화하였다. 분리된 F1 개체군 중의 내성 및 감수성 식물들의 수가 합쳐질 경우, 분리는 더욱 신뢰할 수 있는 것으로 예상된다. 내성의 동일한 원인이 모든 F1 개체군에서 사용되었기 때문에 비-안정성(분리) 내성의 원인은 동일하다. 표 8은 표 4에서 언급된 3개의 이종 교배의 각각의 집계된 결과를 나타낸다 (4578, 6636 이종 교배 1회 및 6636 이종 교배 2회; 두 번의 6636 이종 교배들은 동일한 내성 식물과 함께 이종 교배하고 있는 두 개의 다른 감수성 어버이의 결과이다).
표 4: 개개의 식물들로부터 유래한 Sylvia의 F1 분리
Figure 112007032522599-pct00004
표 4에서 F1 개체군을 생산하기 위해 사용된 6636 계통의 각각의 식물의 자 가 수정을 PMMoV 내성에 대해 또한 테스트하였다. 모든 자가 수정된 계통들은 완전한 내성을 나타냈다. 결과는 표 5에 나타내었다.
표 5: 어버이 계통으로부터 자가 수정된 결과
Figure 112007032522599-pct00005
이 실험으로부터, L4 대립형질의 원하지 않은 특성은, 비-분리된 자손을 생기게 하는 개개의 식물들의 자가 수정은 비-분리된 자손을 생기게 하고 동형 접합(homozygosity)을 확인하는 반면, 감수성 식물에 개개의 내성 식물들을 이종 교배시키는 것은 분리된 F1 자손들을 생기게 하고 이형 접합(heterozygosity)을 확인한다고 결론지을 수 있을 만큼 명확해졌다.
실시예 3. 비-분리된 Manito 품종의 생육
실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식을 비-분리된 Manito 계통을 발육시키기 위해 수행하였다. 내성 어버이 계통의 식물들을 개별적으로 감수성 어버이 계통의 식물들과 이종 교배시켰고, 개개의 F1 개체군에서 분리를 평가하였다. 결과는 표 6에 나타내었다. 낮은 생식력 (SNFD 표현형)을 나타낸 모든 식물들은 이종 교배 전에 제거되었고, 이들 식물들은 표 6에 "테스트 되지 않음"으로 나타냈다. 낮은 생식력은 식물 번호 0025-5에서 처음에는 관찰되지 않았지만 후에 존재하는 것으로 나타났다.
표 6: 개개의 식물들로부터 유래한 Manito의 F1 분리 (1차 감별)
Figure 112007032522599-pct00006
단지 0025-5호 식물만이 비-분리된 잡종을 생기게 했다. 전체 60개 중의 14개의 계통이 낮은 생식력(SNFD 표현형)을 기록했다. 이 표 중의 F1 개체군의 분리는 표 8에서 또한 집계되었다.
비-분리된 F1을 가져오는, 내성 식물들의 수를 증가시키기 위해 두 번째 테스트를 수행하였다. 낮은 생식력을 기록한 식물들은 이종 교배 전에 제거되지 않았다. 결과는 표 7에 나타내었고, 분리는 또한 표 8에 집계하였다. 전체 50개 중의 12개의 계통 (25%)이 완전한 내성 F1 개체군을 생기게 했다.
표 7: 개개의 식물들로부터 유래한 Manito의 F1 분리 (2차 감별)
Figure 112007032522599-pct00007
표 8: 실시예 2 및 3에서 분리된 F1의 집계 결과
Figure 112007032522599-pct00008
모든 경우에서 유사한 것은 감수성 식물들보다 내성인 식물이 더 많다는 것이다. 4578과 6636-이종 교배 1회의 분리는 내성 어버이가 이형접합성인 단일 유전자 모델에 적합한 1:1에 가까웠다. 6636-이종 교배 2회와 2825-2834의 분리는 9:7에 더욱 가까웠다. 9:7 분리는 F2 개체군으로부터 유래하였다. 두 개의 이형접합성 계통들이 이종 교배함으로써(상기 계통들은 내성에 대한 분리가 아니다), F1에서 9:7 분리를 얻기는 불가능해졌다. 아마도 여기에도 1:1 분리가 존재할 것이다. 0021-0026의 분리는 3:1 분리에 가장 적합한 다른 것들과는 상이하다. 아마도 이러한 차이점은, 식물들은 생식력에 의해 선택되고 낮은 수정 능력을 가진 식물들은 이종 교배가 일으켜지기 전에 제거된다는 사실에 의해 기인할 것이다.
실시예 4. L4 대립형질의 관찰된 비-멘델 유전을 설명하기 위한 연관 끌림 부 (linkage drag)
도입
표 8에서 이종 교배에 이용되는 식물들의 생식력과 왜소 성장 (dwarf growth)을 (SNFD 표현형) 기록하였다. 비-분리된 F1을 가져오는 모든 식물들은 낮은 생식력을 나타낸다. 이것은 낮은 생식력과 비-분리의 연관을 나타냈다. 표 7에서 나타낸 결과는 식물들의 약 25%가 비-분리된 잡종을 생기게 함을 나타냈다. 표 6에서, 식물들의 25%는 낮은 수정 능력을 가진 것으로서 기록되었고 F1의 평가 전에 제거되었다. 낮은 수정 능력을 가진 식물들이 우수한 내성 전이 어버이로서 고려되는 경우, 이후 표 6 및 표 7 사이의 결과들은 비교할 수 있다. 이후에 언급되는 바와 같이, 동종 교배 (inbred) 계통은 이들 비-분리된 식물들로부터 유래하고, 실제로는 왜소 성장을 나타낸다. 이것으로부터, 음성 형질 (비-안정성 대립, 낮은 생식력, 왜소 성장)들은 L4 대립형질에 근접하게 연관되었거나 또는 다면 발현성 (pleiotropic)인 것으로 결론지을 수 있다.
F1에서 분리의 성질에 대해 실시예 1 내지 3에서 관찰의 가능한 설명은 명확하게 설명되었고 테스트되었다. 치사 (lethal) 유전자가 감수성 있는 대립형질에 연관되어 있거나 치사 유전자가 내성 대립형질에 연관되어 있을 가능성이 테스트되었지만, 받아들여지지 않았다. L4 대립형질의 발현을 위한 제2 유전자의 요건 또는 L4 대립형질의 전이를 위한 제2 유전자의 요건인, 유전자 침묵화 (gene silencing)의 가능성도 또한 받아들여지지 않았다. 게다가, 존재하는 트랜스포존 (transposons) 또는 날인 (imprintings) (유전자들은 종자 생육 동안 특이적 조건에 의해 침묵화된다)에 대한 증거도 발견되지 않았다. 더욱이, 내성 형질은 단일 유전자가 아닐 가능성은 정교한 테스팅 계획 이후에 제외되었다. C. chacoense의 유전질 침투 단편이 C. annuum 염색체의 염색체 접힘 문제에 기인하는지 여부를 추가적으로 테스트하였다. 동형접합성 (L4L4) 식물의 감수 분열에서 문제를 일으키는, 불규칙한 접힘은 불균형한 염색체의 원인이 된다. 2개의 상동 염색체의 배열 동안에, 염색체 중 하나는 "-" 대립형질이라고 불리는, 불완전한 대립형질의 원인이 되는 손상을 그 후에 입을 수 있다. 이것은 차례로, 내성의 손실을 일으킨다. 분리된 F1에서 마커들이 감수성 식물에서 발견되지 않았다는 것을 설명하기 위해 염색체의 파괴가 가장 있음직한 것으로 고려된다. 불완전한 대립형질의 존재하는 동형접합성가 치명적인 경우, L4-유전자형의 자가 수정은 생물학적 검정에서 실제로 완전한 내성 계통을 생기게 한다. 또한, 비-분리된 F1은 이러한 방식으로 유도해낼 수 있고, L4-유전자형이 감수성 계통과 이종 교배되는 경우에는, F1은 1:1의 비로 분리될 것이다. 동형접합성의 L4 유전자형(L4L4)을 갖는 식물들은 L4-유전자형의 자가 수정 후에 발견될 수 있지만, 그러나 이들 식물들은 감수 분열시 문제에 직면할 수 있다고 예상되었다. 이것은 생물학적 검정에서 테스트 될 때 계통이 완전한 내성(즉, 모든 테스트된 식물들은 내성이 있다)이고, 감수성 어버이로 이종 교배 될 경우 분리된 F1 개체군을 여전히 일으키는 것으로 밝혀진 이유를 설명한다. 그것은 또한 마커를 감수성인 F1 개체군의 식물에서 반대로 얻을 수 없는 것을 설명한다.
이러한 설명은 비-분리된 F1을 일으키는 L4L4 유전자형이 염색체 접힘의 재배열(re-arrangement)의 결과라는 것을 예상한다. 이러한 재-배열된 접힘 현상에서, 2개의 상동 염색체 배열은 염색체 팔 (chromosome arm)의 파괴를 일으키지 않을 수 있다. 그러나, 식물 내의 다른 과정들은 아마도 낮은 생식력과 감소된 성장 (왜소 성장)을 일으키는 것을 중단할 수 있다. 오직 제한된 양의 화분만이 이들 식물들로부터 유래된다는 것이 알려져있다. 또한, 종자의 적은 양은 이러한 계통으로부터 유래되었다고 알려져있다.
따라서, 상기 실험들로부터 L4 대립형질을 포함하는 C.chacoense의 게놈의 단편은 너무 크고 F1 개체군들의 분리를 일으키는 것으로 결론지어진다. 따라서 이들 단편의 크기의 감소는 상기 문제를 해결할 수 있다.
실험 장치
L4 유전자 자리의 다양한 마커들의 존재를, 다수의 고추 계통에서 평가하였다. 첫째로, 두 개의 내성 C.annuum 계통인, M-873 및 M-3751은 유전질 침투 단편의 크기에 관해 평가하였다. 이들 계통들은 비-분리된 F1 및 정상 생식력을 일으킬 수 있는 것으로 알려졌다. 단편의 크기는 L4 대립형질의 측면 마커를 스크리닝하는 것에 의해 S&G 동종 교배 계통 (Manito의 부계)에 존재하는 유전질 침투와 비교하였다. 마커의 위치에 대해서는, 도 2를 참조하라. 결과를 표 9에 나타내었다.
계통들을 L4-유전자 자리와 연관된 4개의 마커에 대하여 테스트하였고, L4 대립형질에 대한 마커의 위치를 표 1에 나타냈다. 표 9에 실린 마커들은 동형접합성 존재, 이형접합성 존재 또는 부재로 기록되었다. 또한 내성 어버이 계통의 생식력 및 F1의 내성을 기재하였다. 생식력의 평가는 화분의 양을 "화분의 제한된 양" (-; 불량한 생식력), "화분의 중간 양" (+/-; 중간 생식력), 및 "비-내성과 유사한 화분의 양, 생식력 대조 식물" (+; 우수한 생식력)으로 평가함으로서 시각적으로 수행하였다.
계통 M-873 및 M-3751에서의 내성은 네덜란드, 버그쉔허크, 드루이터 시즈의 고추 육종 계통으로부터 기원하였다. 모든 다른 원료들은 L4 공여자로서 S&G 동종 교배 계통을 공유하였다. 우수하고 중간 생식력을 갖는 M-873 및 M-3751 계통의 식물들은 마커의 존재 또는 부재에 관해 분류되었다. 중간 생식력은 모든 경우에서 Manito 계통의 부계에서의 생식력보다 우수하였다. 다른 계통들은 생식력에 기초해서 선택된 육종 계통이었는데, 그것들은 비-분리된 잡종을 일으키기 때문이었다.
표 9: 다수의 고추 계통에서의 C.chacoense의 유전질 침투의 평가
Figure 112007032522599-pct00009
++: 동형접합성가 존재하는 마커, 내성; -: 동형접합성가 없는 마커, 감수성; +/-: 이형접합성가 존재하는 마커, 내성; +: 마커가 존재함, 대립형질의 차이점은 테스트 되지 않음; ?, 테스트 되지 않음.
결과는 M-873 및 M-3751 계통에서 소량의 유전질 침투 단편이 존재하는 것으 로 나타났다. 그룹 2의 마커 (E39/M58-F-65)는 존재하지 않았다. 이들 계통들의 가계도를 평가함에 의해, 양쪽 모두는 공통으로 vp-nr 91Pa0424, F3T13 7310을 공유하였다.
8972, 8609 및 8613 계통의 식물들은, 생물학적 검정에서 완전한 내성임에도 불구하고 이형접합성를 기록했다. 8972 계통의 이종 교배가 일어났다. 결과는 표 10에 나타냈다.
표 10: 표 9의 이형접합성로 기록된 계통 8972로부터 유래된 F1 개체군의 결과.
Figure 112007032522599-pct00010
8972 계통으로부터 얻어진 F1 개체군의 결과는 예상에 따랐다. 추가로 재조합체를 확인하기 위해, 분리된 계통들은 L4-유전자 자리의 마커의 존재하에서 분석하였다. F3-분리에 기초해서 선택된 계통들은 대부분 3:1에 근접하였다. F1에서 F2까지 자가 수정 동안에 발생했어야 하는 재조합으로, 각각의 F3 개체군의 식물들을 모았다. 재조합이 발생하는 경우, F3 개체군은 재조합에 대해 반드시 동형접합성이어야 한다. 선택된 계통들은 표 11에 나타내었다.
표 11: 재조합 확인을 위해 선택된 계통
Figure 112007032522599-pct00011
이들 식물들에 대한 마커 분석의 결과는 표 12에 수록되었다. L4 유전자 자리의 마커들은 표 1에서 나타낸 것과 같이 나타냈다. 마커 점수인 "+"는 마커의 존재를 나타냈고, 마커 점수인 "-"는 마커가 없음을 나타냈다.
표 12: 선택된 L4 내성 및 비-SNFD 표현형 계통의 마커 점수
Figure 112007032522599-pct00012
L4 내성 대립형질(그룹 1의 마커)에 대한 마커를 함유하지만, 그러나 그룹 2의 마커들의 위치를 포함하는 유전 물질은 함유하지 않는 이들 선택된 계통 내에서는 신규한 재조합체가 발견되지 않았다고 결론지을 수 있다. 이들 계통들은 내성이 있는 반면, SNFD 표현형은 관찰되지 않는 것으로 발견되었다. 따라서, 그룹 2의 마커 또는 그룹 2와 그룹 3의 마커들의 위치를 포함하는 유전 물질의 손실을 가져오는 재조합은 SNFD 표현형의 손실을 일으킨다고 결론지을 수 있다.
참고 문헌
Figure 112007032522599-pct00013
Figure 112007032522599-pct00014
Figure 112007032522599-pct00015
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Figure 112007032522599-pct00017

Claims (42)

  1. 식물의 게놈에서의 L4 내성 대립형질의 존재로 인해 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (PMMoV) 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추(Capsicum) 속 식물로,
    상기 L4 대립형질은 절단되고(truncated), 상기 절단은 E58/M50-F580, E39/M58-F-95, E58/M60-F-255, 및 E54/M55-F-101로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 1 마커를 포함하고,
    상기 절단은 추가로, E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, 또는 TG036인 그룹 2 마커의 부재(absence)를 포함하여, 그룹 2 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하거나, 또는 상기 절단은, E60/M54-F-447의 그룹 3 마커의 부재를 포함하여, 그룹 3 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하는 고추 속 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 L4 내성 대립형질은 카프시쿰 차코엔세(C.chacoense)의 게놈으로부터 유래된 것인 고추 속 식물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 식물은 흰색 꽃이 피는 고추인 것인 고추 속 식물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 흰색 꽃이 피는 고추 식물은 카프시쿰 아늄(C.annuum) 인 것인 고추 속 식물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 L4 내성 대립형질은 E39/M58-F-95, E54/M55-F-101, E58/M60-F-255 및 E58/M50-F-580 마커들을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 고추 속 식물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 식물은 L4 내성 대립형질에 대해 동형접합성인 것인 고추 속 식물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물은 동종교배 식물인 것인 고추 속 식물.
  10. 제1항 또는 제2항에 따른 식물을, 개선된 과실 외관, 더 높은 종자 산출, 개선된 생식력, 더 높은 과실 산출, 더 크거나 더 작은 과실, 개선된 과실의 색 또는 맛, 개선된 줄기 강도, 개선된 뿌리 계통, 개선된 스트레스 내성, 개선된 질병 내성, 및 개선된 곤충에 대한 내성으로 이루어지는 군에서 선택되는 상업적으로 요구되는 특성을 나타내는 동형접합성 고추 식물과 이종 교배시킴에 의해 얻을 수 있는 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 나타내는 잡종 고추 식물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제7항에 있어서, L4 내성 대립형질은 E54/M55-F-101 및 E58/M50-F-580 마커들로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 고추 속 식물.
  14. PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 나타내는 고추 속 식물을 생산하는 방법으로, 상기 방법은:
    a) PMMoV 병원형 1.2.3 또는 그것들의 일부에 감수성이 있는 고추 속의 수용체 식물을 제공하는 단계;
    b) 상기 식물의 게놈에서의 L4 내성 대립형질의 존재로 인해 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 나타내는 고추 속의 공여자 식물을 제공하는 단계;
    c) 상기 수용체 식물과 공여자 식물을 이종 교배시켜 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 자손 식물을 생산하는 단계;
    d) M35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, TG036, E60/M54-F-447, E63/M61-F-501, E66/M43-F-387, M66/M49-F-387, E66/M61-F-99, E67/M50-F-150, E67/M62-F-214, E70/M54-F-133, E71/M47-F-550, 및 E74/M61-F-385 마커들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 L4 대립형질의 마커의 부재에 대해 상기 자손 식물의 게놈을 스크리닝함에 의해, 절단된 L4 내성 대립형질의 존재에 대해 내성 자손 식물들의 게놈을 스크리닝하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 절단된 L4 내성 대립형질은 E58/M50-F580, E39/M58-F-95, E58/M60-F-255, 및 E54/M55-F-101로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 1 마커를 포함하고, 상기 절단은 추가로, E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, 또는 TG036인 그룹 2 마커의 부재(absence)를 포함하여, 그룹 2 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하거나, 또는 상기 절단은, E60/M54-F-447의 그룹 3 마커의 부재를 포함하여, 그룹 3 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하며,
    여기서 상기 절단된 L4 내성 대립형질은 상기 자손 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여하는 유전적 정보를 포함하고, 여기서 SNFD(Segregating Non-Fertile Dwarf) 표현형을 제공하는 유전적 정보는 최소한 SNFD 표현형이 발현되지 않을 정도로 상기 대립형질에 존재하지 않고; 그리고,
    e) 상기 절단된 L4 내성 대립형질을 갖는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서, 단계 d)에서의 스크리닝은 상기 자손 식물의 게놈을 E39/M58-F-95, E54/M55-F-101, E58/M60-F-255 및 E58/M50-F-580 마커들을 포함하는 군으로부터 선택된 L4 내성 대립형질의 마커 중 하나 이상이 존재하는지에 대해 스크리닝하는 것으로 수행되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 단계 c)는 내성 생물학적 검정을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 자손 식물은 단계 c)에서의 상기 이종 교배로부터 얻어진 F1 식물의 자가-수분에 의해, 또는 상기 이종 교배로부터 얻어진 F1 식물과 다른 고추 식물의 이종 교배에 의해 생산된 분리 개체군(segregating population)의 식물인 것인 방법.
  19. PMMoV 병원형 1.2.3에 대해 내성을 나타내는 고추 속 식물을 생산하는 방법으로, 상기 방법은:
    a) PMMoV 병원형 1.2.3 또는 그것들의 일부에 감수성이 있는 고추 속의 수용체 식물을 제공하는 단계;
    b) 상기 수용체 식물의 게놈 또는 그것들의 일부 또는 그것들의 자손 식물에 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하는 게놈의 영역을 도입시키는 단계;
    c) PMMoV 병원형 1.2.3-내성 식물 또는 자손 식물을 선택하는 단계; 및
    d) SNFD(Segregating Non-Fertile Dwarf) 표현형을 발현시키지 않는 내성 식물 또는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 절단된 L4 내성 대립형질은 E58/M50-F580, E39/M58-F-95, E58/M60-F-255, 및 E54/M55-F-101로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 1 마커를 포함하고, 추가로 E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, 또는 TG036인 그룹 2 마커의 부재(absence)를 포함하여, 그룹 2 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하거나, 또는 E60/M54-F-447의 그룹 3 마커의 부재를 포함하여, 그룹 3 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하며,
    여기서 상기 대립형질은 상기 식물 또는 식물 일부 또는 자손 식물에서 발현될 수 있는 유전적 정보를 포함하고 그것에 의하여 상기 식물 또는 식물 일부 또는 자손 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여하고,
    그리고 여기서 SNFD 표현형을 제공하는 유전적 정보는 최소한 SNFD 표현형이 발현되지 않을 정도로 상기 대립형질에 존재하지 않고, 그리고 여기서 상기 게놈의 영역의 상기 도입은 인 비트로 배양 기술, 교배, 원형질체 융합, 형질 전환 또는 배가 반수체 기술에 의해 수행되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 식물 일부를 고추 식물로 성장시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 삭제
  22. 제19항에 있어서, 상기 단계 c)는 상기 식물 또는 자손 식물의 게놈을 E39/M58-F-95, E54/M55-F-101, E58/M60-F-255 및 E58/M50-F-580 마커들을 포함하는 군으로부터 선택된 L4 내성 대립형질의 마커 중 하나 이상이 존재하는지에 대해 스크리닝하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 단계 c)는 내성 생물학적 검정을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 단계 d)는 M35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, TG036, E60/M54-F-447, E63/M61-F-501, E66/M43-F-387, M66/M49-F-387, E66/M61-F-99, E67/M50-F-150, E67/M62-F-214, E70/M54-F-133, E71/M47-F-550, 및 E74/M61-F-385 마커들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 L4 대립형질의 부재에 대해 상기 내성 식물 또는 자손 식물의 게놈에서 절단된 L4 내성 대립형질을 스크리닝하고, 상기 마커 중 하나 이상이 부재인 식물 또는 자손 식물을 선택하는 것을 포함하는 방법.
  25. PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 나타내는 고추 속의 동종 교배 식물을 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은 제14항에 따른 방법을 수행하는 것을 포함하고, 추가로:
    e) 선택된 식물들을 자가 수정하는 단계;
    f) 상기 자가 수정으로부터 얻어진 종자를 심고 그리고 상기 종자를 식물로 성장시키는 단계;
    g) PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 나타내고 상업적으로 요구되는 특성을 갖는 식물을 확인하는 단계; 및
    h) PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 나타내고 상업적으로 요구되는 특성을 갖는 동종 교배 고추 식물이 생산될 때까지 단계 e)-g)를 반복하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 상업적으로 요구되는 특성은 개선된 외관, 더 높은 종자 산출, 개선된 생식력, 더 높은 과실 산출, 더 크거나 더 작은 과실, 개선된 과실의 색 또는 맛, 개선된 줄기 강도, 개선된 뿌리 계통, 개선된 스트레스 내성, 개선된 질병 내성, 및 개선된 곤충에 대한 내성으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  26. 제14항에 있어서, 상기 공여자 식물은 C.chacoense 식물이거나 또는 상기 절단된 L4 내성 대립형질은 C.chacoense의 게놈으로부터 유래된 것인 방법.
  27. 제14항에 있어서, 상기 수용체 식물은 C. annuum 식물인 방법.
  28. 제14항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 PMMoV 병원형 1.2.3에 내성을 나타내는 고추 속 식물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 식물은 동종 교배 식물인 고추 속 식물.
  30. 제1항, 제2항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 따른 식물의 자손 식물로,
    여기서 상기 자손 식물은 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하고, 여기서 상기 절단된 L4 내성 대립형질은 E58/M50-F580, E39/M58-F-95, E58/M60-F-255, 및 E54/M55-F-101로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 1 마커를 포함하고,
    여기서 상기 절단은 추가로, E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, 또는 TG036인 그룹 2 마커의 부재(absence)를 포함하여, 그룹 2 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하거나, 또는 상기 절단은, E60/M54-F-447의 그룹 3 마커의 부재를 포함하여, 그룹 3 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하며,
    상기 절단된 L4 대립형질은 상기 자손 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여하는 유전적 정보를 포함하고, 여기서 SNFD(Segregating Non-Fertile Dwarf) 표현형을 제공하는 유전적 정보는 상기 대립형질에 존재하지 않는 것인 자손 식물.
  31. 제1항, 제2항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 따른 식물의 일부로,
    상기 일부는 증식을 위한 잎, 줄기, 뿌리, 발아, 과실, 원형질체, 체세포 배, 꽃밥, 잎꼭지, 배양된 세포, 종자로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 일부는 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하고,
    여기서 상기 절단된 L4 내성 대립형질은 E58/M50-F580, E39/M58-F-95, E58/M60-F-255, 및 E54/M55-F-101로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 1 마커를 포함하고,
    여기서 상기 절단은 추가로, E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, 또는 TG036인 그룹 2 마커의 부재(absence)를 포함하여, 그룹 2 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하거나, 또는 상기 절단은, E60/M54-F-447의 그룹 3 마커의 부재를 포함하여, 그룹 3 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하며,
    상기 절단된 L4 대립형질은 상기 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여하는 유전적 정보를 포함하고, SNFD(Segregating Non-Fertile Dwarf) 표현형을 제공하는 유전적 정보는 상기 대립형질에는 존재하지 않는 것인 식물의 일부.
  32. 제1항, 제2항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 따른 식물의 일부로,
    여기서 상기 일부는 소비용이고, 상기 일부는 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하고,
    여기서 상기 절단된 L4 내성 대립형질은 E58/M50-F580, E39/M58-F-95, E58/M60-F-255, 및 E54/M55-F-101로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 1 마커를 포함하고,
    여기서 상기 절단은 추가로, E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, 또는 TG036인 그룹 2 마커의 부재(absence)를 포함하여, 그룹 2 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하거나, 또는 상기 절단은, E60/M54-F-447의 그룹 3 마커의 부재를 포함하여, 그룹 3 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하며,
    상기 절단된 L4 대립형질은 상기 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여하는 유전적 정보를 포함하고, 여기서 SNFD(Segregating Non-Fertile Dwarf) 표현형을 제공하는 유전적 정보는 상기 대립형질에는 존재하지 않는 것인 식물의 일부.
  33. 제1항, 제2항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 따른 고추 식물의 재배에 의해 생산된 고추 종자로,
    상기 고추 종자는 절단된 L4 대립형질을 포함하고, 여기서 상기 절단된 L4 내성 대립형질은 E58/M50-F580, E39/M58-F-95, E58/M60-F-255, 및 E54/M55-F-101로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 1 마커를 포함하고,
    여기서 상기 절단은 추가로, E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, 또는 TG036인 그룹 2 마커의 부재(absence)를 포함하여, 그룹 2 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하거나, 또는 상기 절단은, E60/M54-F-447의 그룹 3 마커의 부재를 포함하여, 그룹 3 마커 및 그룹 1 마커 사이에서 2 cM(센티모건) 이하의 유전적 거리의 유전적 제거를 포함하며,
    상기 절단된 L4 대립형질은 상기 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여하는 유전적 정보를 포함하고, 여기서 SNFD(Segregating Non-Fertile Dwarf) 표현형을 제공하는 유전적 정보는 상기 대립형질에는 존재하지 않는 것인 고추 종자.
  34. 제29항의 식물을, 개선된 과실 외관, 더 높은 종자 산출, 개선된 생식력, 더 높은 과실 산출, 더 크거나 더 작은 과실, 개선된 과실의 색 또는 맛, 개선된 줄기 강도, 개선된 뿌리 계통, 개선된 스트레스 내성, 개선된 질병 내성, 및 개선된 곤충에 대한 내성으로 이루어지는 군에서 선택되는 상업적으로 요구되는 특성을 나타내는 동형접합성 고추 식물과 이종 교배시켜 얻을 수 있는 PMMoV 병원형 1.2.3에 대해 내성을 나타내는 잡종 고추 식물 또는 그것의 일부로,
    상기 잡종 고추 식물 또는 그것의 일부는 상기 식물에 PMMoV 병원형 1.2.3에 대한 내성을 부여하는 유전적 정보를 포함하는 절단된 L4 내성 대립형질을 포함하고, 그리고 SNFD(Segregating Non-Fertile Dwarf) 표현형을 제공하는 유전적 정보는 상기 대립형질에는 존재하지 않는 것인 잡종 고추 식물 또는 그것의 일부.
  35. 제10항에 있어서, 상기 동형접합성 고추 식물은 동종 교배된 고추 식물인 것인 고추 속 식물.
  36. 삭제
  37. 제14항에 있어서, 단계 d)에서의 스크리닝은 상기 자손 식물의 게놈을 E54/M55-F-101 및 E58/M50-F-580 마커들로 이루어지는 군으로부터 선택된 L4 내성 대립형질의 마커 중 하나 이상이 존재하는지에 대해 스크리닝하는 것으로 수행되는 것인 방법.
  38. 제19항에 있어서, 상기 단계 c)는 상기 식물 또는 자손 식물의 게놈을 E54/M55-F-101 및 E58/M50-F-580 마커들로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커가 존재하는지에 대해 스크리닝하는 것을 포함하는 방법.
  39. 제19항에 있어서, 상기 단계 d)는 상기 내성 식물 또는 자손 식물의 게놈 중의 절단된 L4 내성 대립형질을 E35/M49-F-90, E39/M58-F-65, E39/M51-F-380, E58/M62-F-168, E66/M54-F-600, Tm3 DRS, 또는 TG036 마커들로 이루어진 군으로부터 선택된 L4 내성 대립형질의 마커 중 하나 이상에 대해서 스크리닝하고, 그리고 상기 마커 중 하나 이상이 존재하지 않는 식물 또는 자손 식물을 선택하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제31항에 있어서, 기관 조직에 의한 증식을 위한 것인 식물의 일부.
  41. 제32항에 있어서, 상기 일부는 과일인 것인 식물의 일부.
  42. 제34항에 있어서, 상기 동형접합성 고추 식물은 동종 교배된 고추 식물인 것인 잡종 고추 식물.
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