DE102013111980B3 - Vorhersage von Hybridmerkmalen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage von Hybridmerkmalen bei Pflanzen und Tieren, bei dem man sRNA-Moleküle, die mit einem Hybridmerkmal assoziiert sind, identifiziert und Elternlinien, die zur Herstellung von Hybriden geeignet sind, auf die Höhe einer Expression der identifizierten sRNA-Moleküle hin untersucht.
Die Erfindung dient der Selektion geeigneter Organismen zur Erzeugung von Hybriden bei Pflanzen und Tieren, die eine gesteigerte Hybridvitalität (hybrid vigor) bzw. Heterosis für ein oder mehrere Merkmale, wie z. B. dem Ertrag, der Fertilität, der Stress-Resistenz, etc. zeigen.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage von Hybridmerkmalen bei Pflanzen und Tieren.
• Unter einem Hybrid versteht man den Nachwuchs einer Kreuzung zweier Eltern, i. d. R. Inzuchtlinien, mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund. Inzuchtlinien, die z. B. in der kommerziellen Hybridzüchtung bei Mais eingesetzt werden (Duvick & Cassman 1999. Postgreen revolution trends in yield potential of temperate maize in the north-central United States. Crop Sci. 39: 1622–1630), sind Individuen ohne Heterozygotie, die durch beständige Rückkreuzung oder mit Hilfe von biotechnologischen Techniken als Doppelhaploide erzeugt werden (Geiger & Gordillo 2009. Doubled haploids in hybrid maize breeding. Maydica 54: 485–499).
• Viele Tier- und Pflanzenarten weisen, wenn sie als Hybride gezüchtet und durch die Kreuzung von zwei genetisch unterschiedlichen Eltern produziert werden, erhöhte Wachstumsraten auf, erreichen eine größere Biomasse und haben im Fall von Nutzpflanzen und Nutztieren einen höheren Ertrag bzw. Produktivität. Dieses Phänomen ist als Hybridvitalität oder Heterosis bekannt (Shull 1908. The composition of a field of maize. American Breeders' Association 4: 296–301) und kann auf nahezu alle Aspekte der Biologie und Merkmale eines pflanzlichen oder tierischen Lebewesens bezogen werden, wenn ein Hybrid die Eltern übertrifft.
• Das Ausmaß von Heterosis in Pflanzen und Tieren kann stark variieren und wird entweder als Zuwachs zum Mittel beider Eltern (mid-parent heterosis, MPH) oder als Zuwachs gegenüber dem Elter mit der höheren Leistung (best-parent heterosis, BPH) betrachtet.
• Heterosis ist in vielen landwirtschaftlich genutzten Pflanzen und in der Züchtung von Pflanzen und Tieren von enormer Bedeutung und die Produktion von Hybriden mit einem hohen Ausmaß an Heterosis wird in der Zucht angestrebt (Duvick 1986. Plant breeding: past achievements and expectations for the future. Econ. Bot. 40: 289–297). Trotz intensiver genetischer Analysen ist die molekulare Grundlage des Phänomens Heterosis nicht vollständig aufgeklärt. Zur Erklärung der Vorteile in Hybriden, die durch Komplementation, Kombination oder Interaktion von zwei unterschiedlichen Allelen entstehen, werden die nicht-exklusiven genetischen Modelle der Dominanz (Bruce 1910. The Mendelian theory of heredity and the augmentation of vigor. Science 32: 627–628; Davenport 1908. Degeneration, albinism and inbreeding. Science 28: 454–455), der Überdominanz (Shull 1908. The composition of a field of maize. American Breeders' Association 4: 296–301; East 1936. Heterosis. Genetics 21: 375–397) und der Epistasis (Stuber 1994. Heterosis in plant breeding. Plant Breed Rev 12: 227–251; Goodnight 1999. Epistasis and heterosis. In: Coors JG, Pandey S, editors. The Genetics and Exploitation of Heterosis in Crops. Madison: American Society of Agronomy. pp. 59–67) angeführt. Ebenfalls wurden hypothetische Modelle, die diese Interaktionen durch genregulatorische Netzwerke erklären, aufgestellt (Omholt et al. 2000. Gene regulatory networks generating the phenomena of additivity, dominance and epistasis. Genetics 155: 969–980). Dennoch sind insbesondere die Mechanismen von Heterosis komplexer, quantitativer Merkmale, wie Ertrag oder vegetatives Wachstum, wenig verstanden (Birchler et al. 2010. Heterosis. Plant Cell 22: 2105–2112).
• Die genetischen Erklärungen in den vorgeschlagenen Modellen für, zumindest, einen Teil der in Hybriden beobachteten Heterosis liefern keine quantitativen Aussagen über das Ausmaß an Heterosis.
• Daher wurde neben den genetischen Erklärungen ebenfalls auf molekularer Ebene versucht Heterosis zu charakterisieren. Die Annahme dabei war, dass quantitative Unterschiede im mRNA-Pool bestimmter Gene zwischen Eltern und ihren Hybriden zur molekularen Basis von Heterosis beitragen. Solch differentielle Genexpressionen in Hybriden relativ zu den Inzuchteltern konnten in der Vergangenheit in einer Vielzahl von Studien beobachtet werden. Diese Studien zeigten umfangreiche Transkriptom-Veränderungen in Hybriden im Vergleich zu ihren Eltern (Stupar et al. 2008. Gene expression analyses in maize inbreds and hybrids with varying levels of heterosis. BMC Plant Biol. 8: 33; Guo et al. 2006. Genome-wide transcript analysis of maize hybrids: allelic additive gene expression and yield heterosis. Theor. Appl. Genet. 113: 831–845; Swanson-Wagner et al. 2006. All possible modes of gene action are observed in a global comparison of gene expression in a maize F-1 hybrid and its inbred parents. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103: 6805–6810; Meyer et al. 2007. Heterosis associated gene expression in maize embryos 6 days after fertilization exhibits additive, dominant and overdominant pattern. Plant Mol. Biol. 63: 381–391; Jahnke et al. 2010. Heterosis in early seed development: a comparative study of F1 embryo and endosperm tissues 6 days after fertilization. Theor. Appl. Genet. 120: 389–400; Uzarowska et al. 2007. Comparative expression profiling in meristems of inbred-hybrid triplets of maize based on morphological investigations of heterosis for plant height. Plant Mol. Biol. 63: 21–34; Stupar & Springer 2006. Cis-transcriptional variation in maize inbred lines B73 and Mo17 leads to additive expression patterns in the F-1 hybrid. Genetics 173: 2199–2210), die entweder additiv oder nicht-additiv waren. Eine additive Genexpression beschreibt eine Hybridexpression dem Mittel der elterlichen Genexpression entsprechend. Eine additive Hybridexpression lässt sich durch eine differentielle cis-regulierte Genexpression erklären. Bei einer nicht-additiven Expression weicht die Hybridexpression von der mittleren Expression beider Eltern ab, was somit auf die differentielle Beteiligung von trans-Faktoren schließen lässt (Wittkopp et al. 2004. Evolutionary changes in cis and trans gene regulation. Nature 430: 85–88).
• Studien gehen daher sowohl von einer Beteiligung differentiell cis-regulierter, additiv exprimierter Gene (Guo et al. 2004. Allelic variation of gene expression in maize hybrids. Plant Cell 16: 1707–1716; Springer & Stupar 2007. Allelic variation and heterosis in maize: How do two halves make more than a whole? Genome Res. 17: 264–275; Thiemann et al. 2010. Correlation between parental transcriptome and field data for the characterization of heterosis in Zea mays L. Theor. Appl. Genet. 120: 401–413), als auch von einer Beteiligung differentiell trans-regulierter, nicht-additiver Gene aus. Mögliche trans-Effekte, die hierbei eine Rolle spielen können, sind kurze RNAs, welche unter anderem das Epigenom beeinflussen können (Ha et al. 2009. Small RNAs serve as a genetic buffer against genomic shock in Arabidopsis interspecific hybrids and allopolyploids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106: 17835–17840). Änderungen im Epigenom, auf Ebene der DNA-Methylierung, wurden zwischen Hybriden und Inzuchteltern von Arabidopsis und Reis beobachtet (Groszmann et al. 2011. Changes in 24-nt siRNA levels in Arabidopsis hybrids suggest an epigenetic contribution to hybrid vigor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 108: 2617–2622; He et al. 2010. Global Epigenetic and Transcriptional Trends among Two Rice Subspecies and Their Reciprocal Hybrids. Plant Cell 22: 17–33). Eine Verbindung zwischen DNA-Methylierungsmustern und der Genexpression in Hybriden konnte in Reis beobachtet werden (Chodavarapu et al. 2012. Transcriptome and methylome interactions in rice hybrids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109: 12040–12045). In Mais und der Zuckerrübe konnte gezeigt werden, dass Änderungen in der DNA-Methylierung nicht auf Transposons beschränkt sind, sondern ebenfalls in Gen-kodierenden Bereichen auftreten (Zhao et al. 2007. Epigenetic inheritance and variation of DNA methylation level and pattern in maize intra-specific hybrids. Plant Science 172: 930–938; Zhang et al. 2007. Endosperm-specific hypome-thylation, and meiotic inheritance and variation of DNA methylation level and pattern in sorghum (Sorghum bicolor L.) inter-strain hybrids. Theor. Appl. Genet. 115: 195–207).
• Kurze RNAs sind eng mit der DNA-Methylierung verbunden (Lister et al. 2008. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell 133: 523–36). Sie tragen zur Genomstabilität bei und sind wichtige Regulatoren der Genexpression (Van Wolfswinkel & Ketting 2010. The role of small non-coding RNAs in genome stability and chromatin organization. J. Cell Sci. 2010 123: 1825–39). Kurze RNAs sind zwischen 15-nt bis 40-nt lang und bewirken entweder ein transkriptionelles Gene Silencing (TGS) oder ein posttranskriptionelles Gene Silencing (PTGS). Sie werden in Abhängigkeit unterschiedlicher Biosynthesewege in siRNAs (small interfering RNAs) und miRNAs (micro RNAs) unterteilt (Bartel 2004. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 281–297). miRNAs stammen von sog. MIR-Genen ab, welche für einzelsträngige Transkripte kodieren, die dann eine Haarnadel-Struktur ausbilden und im Anschluss von Dicer-Proteinen in reife miRNAs prozessiert werden (Bartel 2004. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 281–297). siRNAs hingegen entstehen aus doppelsträngigen RNAs und haben unterschiedlichste Entstehungsorte und/oder Biogenesewege. Doppelsträngige RNAs, die zur Bildung von siRNAs führen können, stammen z. B. von revers komplementären Sequenzbereichen (inverted repeat) transkribierter RNA, natürlichen cis-antisense Transkriptpaaren, RNA-abhängigen RNA Polymerasen (RDRs), der Replikation von RNA Viren oder Retroelement-reichen Genomregionen ab (Khraiwesh et al. 2012. Role of miRNAs and siRNAs in biotic and abiotic stress responses of plants. Biochim. Biophys. Acta 1819: 137–48). Doppelsträngige RNAs werden über Dicer in kurze doppelsträngige siRNAs prozessiert. Sie sind u. a. wichtige Repressoren von Transposons und viralen Sequenzen (Mallory & Vaucheret 2006. Functions of microRNAs and related small RNAs in plants. Nat. Genet. 38: S31–S36).
• Erste Hinweise auf eine Beteiligung kurzer RNAs am Heterosiseffekt kamen aus Mais und Arabidopsis und zeigten eine differentielle Expression kurzer RNAs zwischen Hybriden und Inzuchtlinien (Barber et al. 2012. Repeat associated small RNAs vary among parents and following hybridization in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 106: 10444–10449; Groszmann et al. 2011. Changes in 24-nt siRNA levels in Arabidopsis hybrids suggest an epigenetic contribution to hybrid vigor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108: 2617–2622). In diesen Studien waren 24-nt siRNAs in den Hybriden reduziert und regulatorische miRNAs nicht-additiv exprimiert. Die reduzierten siRNAs waren größtenteils mit regulativen Genen und ihren flankierenden Regionen assoziiert und zeigten ebenfalls eine Assoziation mit der Genexpression in Hybriden. Es wurde vermutet, dass diese sog. epigenetisch regulierten epi-Allele über die Hybridvariation zu Heterosis beitragen könnten (Groszmann et al. 2011. Changes in 24-nt siRNA levels in Arabidopsis hybrids suggest an epigenetic contribution to hybrid vigor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108: 2617–2622). In Mais ist eine bestimmte Klasse differentiell exprimierter 22-nt langer siRNAs identifiziert worden (Nobuta et al. 2008. Distinct size distribution of endogeneous siRNAs in maize: Evidence from deep sequencing in the mop1-1 mutant. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105: 14958–14963). Eine Studie in zwei Inzuchtlinien und deren reziproken Hybriden ergab, dass die differentiell zwischen Inzuchtlinien und Hybriden exprimierten 22-nt siRNAs von bestimmten Retrotransposons stammen und über die Variabilität zu Heterosis beitragen könnten (Barber et al. 2012. Repeat associated small RNAs vary among parents and following hybridization in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106: 10444–10449). Eine weitere Studie mit reziproken Hybriden und ihren Eltern in Mais ergab komplexe epigenetische Veränderungen in Hybriden im Vergleich zu ihren Eltern bezogen auf DNA-Methylierung, Histonmodifizierung und kurze RNAs (Shen et al. 2012. Genome-Wide Analysis of DNA Methylation and Gene Expression Changes in Two Arabidopsis Ecotypes and Their Reciprocal Hybrids. The Plant Cell 24: 875–892).
• Die bisher gemachten Beobachtungen geben aber keinen Hinweis auf einen direkten und quantitativen Einfluss kurzer RNAs in Bezug auf Heterosis.
• Die Produktion von Hybriden mit starker Heterosis wird gegenwärtig vorwiegend auf der Basis von Versuch und Irrtum in Feldversuchen vorgenommen. Dazu werden genetisch unterschiedliche Eltern gekreuzt und die Nachkommen angezogen, um deren Eigenschaften zu testen (Windhausen et al. 2012. Effectiveness of genomic prediction of maize hybrid performance in different breeding populations and environments. G3 2: 1427–1436). Da wichtige Merkmale, wie Ertrag, erst spät im Lebenszyklus gemessen werden können, sind diese Versuche sehr zeitaufwändig. Hinzu kommt, dass die genetische Distanz zweier Eltern eine z. T. inkonsistente Korrelation zu Heterosis aufweist und daher nur unzureichend zur Vorhersage der Hybridleistung herangezogen werden kann (Melchinger 1999. Genetic diversity and heterosis. In: Coors JG, Pandey S (eds) The genetics and exploitation of heterosis in crops. ASA-CSSA, Madison, p 99–118). Durch diese Beschränkungen werden viele nicht geeignete Hybride in der Züchtung untersucht, wodurch hohe Kosten entstehen. Insbesondere durch die große Anzahl von Inzuchtlinien, die heute in kommerziellen Hybridzüchtungsprogrammen in jedem Züchtungszyklus erzeugt werden, können aufgrund der hohen Kosten für Feldversuche die möglichen Hybride nicht vollständig getestet werden, was zu erheblichen Verlusten von potentiell überragenden Kreuzungspartnern führt (Schrag et al. 2006. Prediction of single-cross hybrid performance for grain yield and grain dry matter content in maize using AFLP markers associated with QTL. Theor. Appl. Genet. 113: 1037–1047).
• Methoden, die eine Vorhersage von Hybridmerkmalen leisten, sind auf der Basis von genetischen Markern, die Polymorphismen der DNA-Sequenz zwischen Elternlinien abbilden, entwickelt worden (Schrag et al. 2006. Prediction of single-cross hybrid performance for grain yield and grain dry matter content in maize using AFLP markers associated with QTL. Theor. Appl. Genet. 113: 1037–1047; Schrag et al. 2009. Molecular marker-based prediction of hybrid performance in maize using unbalanced data from multiple experiments with factorial crosses. Theor. Appl. Genet. 118: 741–751). Die genaue und zuverlässige Vorhersage auf Basis von genetischen Markern bleibt eine Herausforderung (Windhausen et al. 2012. Effectiveness of Genomic Prediction of Maize Hybrid Performance in Different Breeding Population and Environments. G3 2: 1427–1436; Reif et al. 2012. Genomic prediction of sunflower hybrid performance. Plant Breed. 132: 107–114). Genetische Marker wurden auch in Kombination mit Metabolitdaten von Elternlinien zur Vorhersage von Hybridmerkmalen eingesetzt (Gärtner et al. 2009. Improved Heterosis Prediction by Combining Information on DNA- and Metabolic Markers. PLOS ONE 4: e5220; Riedelsheimer et al. 2012. Genomic and metabolic prediction of complex heterotic traits in hybrid maize. Nature Publishing Group 44: 217–220). Diese experimentellen Modelle zur Integration mehrerer Datenebenen zeigen den hohen Bedarf und das große Interesse an der Verbesserung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Methoden zur Vorhersage von Hybridmerkmalen auf.
• Über Studien in denen beobachtet wurde, dass die Genexpression in Hybriden gegenüber den Elternlinien verändert ist, wurde gefolgert, dass Hybrideffekte mit veränderten Genexpressionsmustern zusammenhängen (Hochholdinger & on 2007. Towards the molecular basis of heterosis. Trends in Plant Science 12: 427–432). Vorhersagen der Hybridleistung und Heterosis konnten auf der Basis von elterlichen Transkriptionsprofilen in Mais (Fu et al. 2012. Partial least squares regression, support vector machine regression, and transcriptome-based distances for prediction of maize hybrid performance with gene expression data. Theor. Appl. Genet. 124: 825-833; Frisch et al. 2010. Transcriptome-based distance measures for grouping of germplasm and prediction of hybrid performance in maize. Theor. Appl. Genet. 120: 441–450) und Arabidopsis (Stokes et al. 2010. An association transcriptomics approach to the prediction of hybrid performance. Mol. Breeding 26: 91–106) erreicht werden.
• Auch wurde kürzlich für Tomate (Shivaprasad et al. 2011. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal 31: 257–266), Arabidopsis (Groszmann et al. 2011. Changes in 24-nt siRNA levels in Arabidopsis hybrids suggest an epigenetic contribution to hybrid vigor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108: 2617–2622), Mais (Barber et al. 2012. Repeat associated small RNAs vary among parents and following hybridization in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109: 10444–10449) und Reis (Chodavarapu et al. 2012. Transcriptome and methylome interactions in rice hybrids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109: 12040–12045) beschrieben, dass sich die Expression von kurzen RNAs zwischen Eltern und deren Hybriden unterscheidet. Insbesondere die Unterschiede der Expression von 24-nt sRNAs führten zur Hypothese einer epigenetischen Komponente von Heterosis.
• Sämtliche bislang bekannten Verfahren sind jedoch ungeeignet, die Heterosis oder Leistung eines bestimmten Hybriden quantitativ vorherzusagen und somit die aussichtsreichen Elternlinien zu bestimmen. Ein Verfahren, das anhand der Elternlinien eine genaue Vorhersage über das Ausmaß der Heterosis oder Hybridleistung der resultierenden Hybride ermöglicht, ist bislang nicht bekannt. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein solches Verfahren bereitzustellen, das anhand der Elternlinien eine genaue Vorhersage über das Ausmaß der Heterosis oder Hybridleistung der resultierenden Hybride ermöglicht.
• Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe durch ein Verfahren, bei dem man sRNA-Moleküle, die mit einem Hybridmerkmal assoziiert sind, identifiziert und Elternlinien, die zur Herstellung von Hybriden geeignet sind, auf die Höhe einer Expression der identifizierten sRNA-Moleküle hin untersucht.
• Die Erfindung dient somit der Selektion geeigneter Organismen zur Erzeugung von Hybriden bei Pflanzen und Tieren, die eine gesteigerte Hybridvitalität (hybrid vigor) bzw. Heterosis für ein oder mehrere Hybridmerkmale, wie z. B. dem Ertrag, der Fertilität, der Stress-Resistenz, etc. zeigen.
• Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann von bereits identifizierten sRNA-Molekülen ausgegangen werden, so dass die aussichtsreichsten Elternlinien anhand der Expression dieser sRNA-Moleküle bestimmbar sind. Andererseits ist es möglich, sRNA-Moleküle neu zu identifizieren. Dies ist zum Beispiel dann erforderlich, wenn für bestimmte Organismen noch keine entsprechenden sRNA-Moleküle beschrieben wurden oder die Organismen noch nicht auf ein bestimmtes Merkmal hin untersucht wurden.
• Eine bevorzugte Ausgestaltung des Verfahrens sieht daher vor, dass die Identifikation der sRNA-Moleküle die folgenden Schritte umfasst:
• a) Anzucht von Pflanzen oder Tieren genetisch verschiedener Elternlinien;
• b) Kreuzen der Pflanzen oder Tiere zur Erzeugung von Hybriden;
• c) Bestimmung des Ausmaßes der Merkmalsausprägung bei verschiedenen Hybriden;
• d) Analyse der Elternlinien der untersuchten Hybriden auf ihre sRNA-Expression hin;
• Die Untersuchung der Elternlinien auf die Höhe einer Expression der identifizierten sRNA-Moleküle hin erfolgt zum Beispiel über eine Bestimmung der Anzahl von sRNA-Molekülen. Hierbei wird die differentielle sRNA-Expression zwischen den genetisch verschiedenen Elternlinien ermittelt.
• Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Expressionsprofile von so genannten kurzen (small) RNAs (sRNAs) mit einer Länge von 15 bis 40 Nukleotiden, die nicht für Proteine kodieren, Aussagen über Hybridmerkmale ermöglichen. Insbesondere können diese sRNAs dazu verwendet werden, Vorhersagen über das Ausmaß der Heterosis oder anderer Merkmale von Hybriden, die durch die Kreuzung dieser Pflanzen oder Tiere entstehen, zu machen. Damit bringt diese Erfindung erhebliche Vorteile für den Züchtungsprozess, da Aussagen über Hybridmerkmale bereits eine Generation im Voraus, ohne Felddaten für die tatsächlichen Genotypen erheben zu müssen, gemacht werden können. Im Vergleich zu einem Verfahren unter Verwendung von mRNA-Expressionsprofilen zeichnet sich die vorliegende Erfindung durch eine besonders hohe Genauigkeit der Vorhersage aus.
• Die Messung der sRNA-Expression in einzelnen Organismen oder einer Gruppe von Organismen, wie z. B. Inzuchtlinien oder Hybriden aus einem faktoriellen Kreuzungsschema einer Züchtungspopulation, wird bevorzugt über Hochdurchsatzsequenzierungen (z. B. Pyrosequenzierung, Sequenzierung durch Hybridisierung, Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierung, Sequenzierung mit Brückensynthese, Zwei-Basen-Sequenzierung, Sequenzierung mit gepaarten Enden) oder Hochdurchsatzsequenzierungen über die Messung der Reaktion einzelner Moleküle (z. B. Protonen, Fluorophore) oder klassische Verfahren (z. B. Methode von Maxam und Gilbert (Maxam & Gilbert 1977. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 74: 560–564), Didesoxymethode nach Sanger (Sanger & Coulson 1975. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology, 94: 441–448)) vorgenommen, um möglichst umfassend die vorhandenen individuellen sRNAs quantitativ zu erfassen. Soll ein festgelegter Satz von sRNAs zur Vorhersage verwendet werden, können die sRNA-Expressionsdaten über PCR Verfahren (z. B. quantitative RT-PCR (Varkonyi-Gasic et al. 2007. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods 3: 12)) oder Microarray-Experimente (Bowtell & Sambrook 2003. DNA microarrays: a molecular cloning manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) gemessen werden.
• Die sRNA-Expressionsdaten sollten vorzugsweise zur optimalen Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Messungen normalisiert werden. Dabei können verschiedene Methoden angewandt werden. Für Expressionsdaten aus Sequenzierungen können Expressionswerte z. B. über einen Skalierungsfaktor wie der Sequenziertiefe angepasst werden. Alternativ kann eine Normalisierung über endogene oder artifizielle spike-in Kontrollen erfolgen. Weitere mögliche Methoden sind quantil-, Mittelwert- oder Varianz-basierte Normalisierungen (McCormick et al. 2011. Experimental design, preprocessing, normalization, and differential expression analysis of small RNA sequencing experiments. Silence 2: 2).
• Merkmalsdaten, die zur Assoziation mit sRNA-Expressionsdaten verwendet werden, können in Feld-/Gewächshausversuchen und Laborexperimenten oder während des Zucht- oder Produktionsablaufes qualitativ und/oder quantitativ erhoben werden. Qualitative und/oder quantitative Merkmalsdaten können von Inzuchtlinien, Hybriden, transgenen oder anderen Genotypen erhoben werden.
• Die Korrelationsanalysen von sRNA mit Merkmalsdaten können entweder mit einem vorher definierten festen Satz von sRNAs oder einen durch eine Assoziationsstudie Hybridenspezifischen Satz von sRNAs durchgeführt werden.
• Die Assoziation von sRNA-Expressionsdaten mit qualitativen Merkmalsdaten erfolgt bevorzugt über einen binomialen Wahrscheinlichkeitstest. Dabei werden Individuen in zwei oder mehrere qualitativ, das Merkmal betreffend, Gruppen eingeteilt und die Wahrscheinlichkeit einer nicht-zufälligen Zuordnung bestimmter sRNA-Expressionsmuster untersucht (siehe Beispiel 1). sRNA-Expressionsmuster können z. B. differentielle Expressionen zwischen verschiedenen Individuen (z. B. Hybrideltern) als auch Unterschiede absoluter Expressionswerte sein. Die Ermittlung differentiell exprimierter sRNAs kann über die Festlegung einer Minimalexpression und einem minimalen relativen und/oder absoluten Expressionsunterschied erfolgen. Alternativ kann eine differentielle Expression über statistische Tests (z. B. F-Test, t-Test, Anova) ermittelt werden. Bevorzugt werden hierfür biologische und/oder technische Replikate herangezogen.
• Die Assoziation von sRNA-Expressionsdaten mit quantitativen Merkmalsdaten kann wie für qualitative Merkmalsdaten beschrieben erfolgen, hierzu werden die quantitativen Merkmalswerte vorzugsweise in qualitative Klassen (z. B. niedrige und hohe Merkmalswerte) eingeteilt. Alternativ zu einem binomialen Wahrscheinlichkeitstest lassen sich assoziierte sRNAs über parametrische/nicht-parametrische Regressionsmethoden (z. B. lineare Regression) oder anderen mathematischen Verfahren der Mustererkennung (z. B. SVM, Random Forest, Neuronale Netzwerke) identifizieren.
• Neben der quantitativen Betrachtung von Expressionsdaten einzelner sRNAs zur Assoziation mit Merkmalsdaten, können diese Expressionsdaten ebenfalls anhand von bestimmten Kriterien (z. B. genomische Sequenzbereiche/Annotationen) integriert werden. Eine weitere Möglichkeit ist die rein qualitative Betrachtung von sRNAs (z. B. Expression über einem bestimmten Level) zur Assoziation mit Merkmalsdaten über z. B. einen binomialen Wahrscheinlichkeitstest.
• Die Vorhersage von Merkmalsdaten kann über sRNA-Expressionsdaten eines Individuums erfolgen oder auf Basis der Expressionsdaten der Eltern eines Nachkommens. Für eine Vorhersage müssen in einem begrenzten Umfang sRNA-Expressions- und Merkmalsdaten von anderen Individuen (für Individuen-Merkmalsvorhersage) oder sRNA-Expressionsdaten von Eltern und Merkmalsdaten derer Nachkommen vorliegen. Die Vorhersage erfolgt durch das Ermitteln von Vorhersageparametern (z. B. Regressionsparameter) basierend auf bekannten Individuen und Anwenden dieser Parameter auf die sRNA-Expressionsdaten des Individuums mit dem zu vorhersagenden Merkmal.
• Die Vorhersageparameter können basierend auf den absoluten sRNA-Expressionsdaten oder alternativ über Distanzmaße (z. B. zwischen Eltern eines Nachkommens oder Individuen zu einem Referenzindividuum) ermittelt werden.
• Zusammengefasst beinhaltet die Erfindung die Verwendung von sRNA-Expressionsanalysen von Pflanzen oder Tieren, bzw. deren Hybriden und/oder Inzuchtlinien oder jeglicher anderer Genotypen, um (1) Vorhersagen über das Ausmaß von Heterosis oder anderer Merkmale in Pflanzen oder Tieren zu treffen und (2) Kreuzungspartner zu identifizieren, die bezüglich ihrer sRNA Profile vorteilhafte Kombinationen darstellen und deren Nachkommen verbesserte Eigenschaften bezüglich eines oder mehrerer Merkmale aufweisen. So lässt sich beispielsweise ein Satz von 11.272 sRNAs identifizieren, der die Vorhersage von Heterosis für Kornertrag in Mais ermöglicht und ebenfalls für die Vorhersage von analogen Merkmalen in anderen Pflanzenarten als vollständiger Satz oder in Auszügen herangezogen werden kann.
• Die Erfindung ermöglicht dem Züchter eine Vorhersage von Heterosis unterschiedlicher Merkmale sowie die Vorhersage nicht-heterotischer Merkmale durch die Untersuchung der sRNA-Expressionsprofile. Ebenfalls ermöglicht die Erfindung die Vorhersage von Merkmalen durch die Untersuchung sehr früher Stadien (z. B. Keimlinge) der gleichen oder nachfolgenden Generation. Das sRNA-Probenmaterial welches zur Erzeugung der sRNA-Expressionsdaten genutzt wird, kann sich in dem Entwicklungsstadium oder Gewebe der Merkmalsausprägung unterscheiden. Das bedeutet, die zur Untersuchung der sRNAs ausgewählten Gewebe müssen nicht identisch mit denen der Merkmalsmessung sein. Dies ermöglicht einen geringeren zeitlichen und finanziellen Aufwand bei der Anzucht als auch für den gesamten Selektionsprozess im Züchtungsverfahren. Des Weiteren gewährleistet eine Verwendung früher Entwicklungsstadien kontrollierte Anzuchtbedingungen (z. B. Gewächshaus, Anzuchtkammer) und somit eine reproduzierbare Vorhersage. Am Beispiel der Pflanzenzucht ermöglicht die Untersuchung von Keimlingen von Elternlinien oder Eltern-Genotypen, zur Vorhersage derer Nachkommen, die Vermeidung von Feldversuchen.
• Pflanzen im Sinne dieser Anmeldung umfassen z. B. Getreidearten wie z. B. Weizen, Gerste, Reis oder Mais, Gemüsepflanzen wie z. B. Paprika, Zwiebeln, Karotten oder Tomaten, Obstpflanzen wie z. B. Apfel, Birne, Kirsche oder Wein sowie weitere wirtschaftlich relevante Pflanzen wie z. B. Leguminosen, Gräser (z. B. Miscanthus) oder Algen zur Biomassegewinnung oder Bäume zur Holzgewinnung (z. B. Pappel).
• Eine Voraussetzung für Heterosis in Pflanzen ist die Züchtung von Inzuchtlinien oder gering heterozygoten Linien zur Erzeugung von Hybriden. Am einfachsten ist dies bei Pflanzen mit einer natürlich vorkommenden Allogamie (Fremdbestäubung). Des Weiteren gibt es die Möglichkeit, sich die männliche Sterilität, die in die sog. „Genische (nukleare) Männliche Sterilität” (GMS) und die „Cytoplasmatische Männliche Sterilität” (CMS) unterteilt wird, zunutze zu machen (Bruce 1910. The Mendelian theory of heredity and the augmentation of vigor. Science 32: 627–628).
• Andere Anwendungsbeispiele umfassen z. B. Tiere, den Menschen ausgenommen, wie z. B. Säugetiere, Vögel und Fische. Beispiele, bei denen Heterosis eine Rolle spielt umfassen wichtige Nutztiere, wie Rinder, Schweine, Schafe, Ziegen, Hühner oder Truthähne. Fische aus Zuchtbetrieben, bei denen Heterosis von Bedeutung ist, umfassen z. B. Lachs oder Karpfen. Denkbar ist auch eine Anwendung unserer Erfindung bei nicht-landwirtschaftlichen relevanten Zuchttieren, wie z. B. bei Rennpferden oder Hunden. Bei der hier dargestellten Erfindung wird eine direkte und quantitative Assoziation von sRNAs mit Heterosis oder anderen Merkmalen für die Vorhersage verwendet.
• In Untersuchungen konnten ebenfalls große Unterschiede in sRNA-Expressionsprofilen zwischen einzelnen Inzuchtlinien sowie zwischen Inzuchtlinien und deren Hybridnachkommen beobachtet werden. Die Untersuchung von sRNA Populationen mehrerer Inzuchtlinien und der entsprechenden umfangreichen Felddaten ermöglicht einen direkten Einfluss bestimmter sRNAs auf Heterosis zu bestimmen.
• Die Untersuchung von insgesamt 21 Inzuchtlinien zweier heterotischer Gruppen von Mais (Hart- und Zahnmais) führte zu der bereits erwähnten Identifizierung von insgesamt 11.272 sRNAs, deren differentielle parentale Expression mit der Heterosis von Kornertrag assoziiert sind. Davon sind 6.915 negativ und 4.357 positiv mit der Heterosis von Kornertrag assoziiert.
• Heterosis in Hybriden von Mais kann somit erfolgreich auf Basis der differentiellen parentalen sRNA-Expression vorhergesagt werden. Da Heterosis ein weit verbreitetes Phänomen ist, welches nicht auf Mais oder andere Getreide begrenzt ist, sondern ebenfalls in Tieren vorkommt, ist eine Verwendung der hier beschriebenen sRNAs als vollständiger Satz oder in Auszügen in anderen pflanzlichen und tierischen Arten durchaus denkbar, sofern diese konserviert sind und ein ähnliches heterotisches Merkmal entsprechend dem Kornertrag vorhergesagt werden soll. Andernfalls erfordert das erfindungsgemäße Verfahren, die Identifizierung neuer prädiktiver Sätze von sRNAs durch eine Assoziation von sRNA-Expressionsdaten und den zugehörigen Merkmalsdaten der Eltern und Hybride. Mit diesen prädiktiven sRNAs ist dann eine Heterosis-Vorhersage anderer Kreuzungspartner möglich.
• Die hier dargestellte Erfindung ist komplementär zu anderen Methoden der Vorhersage von Hybridmerkmalen und kann in integrierten Modellen mit anderen Datenebenen, wie genetischen Markern (z. B. SNPs und anderen DNA-Markern), mRNA-, Protein-, oder Metabolit-Daten, kombiniert werden (Riedelsheimer et al. 2012. Genomic and metabolic prediction of complex heterotic traits in hybrid maize. Nature Publishing Group 44: 217–220).
• Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von sRNA-Molekülen zur Vorhersage von Hybridmerkmalen bei Pflanzen und Tieren. Bei den sRNA-Molekülen handelt es sich insbesondere um differentiell parental exprimierte sRNA-Moleküle, die mit dem Ausmaß der Ausprägung des Hybridmerkmals assoziiert sind. Über die Anzahl von sRNA-Molekülen lässt sich eine gute Vorhersage über das Ausmaß an Heterosis treffen.
• Beispiel
• . Lineare Regression der kombinierten Binärdistanzen Db von 98 Hybriden
• : Genauigkeit der sRNA-basierten Vorhersage von Heterosis von Kornertrag.
• Es wurde die sRNA-Expression von Mais-Inzuchtlinien aus den zwei heterotischen Gruppen Hart- und Zahnmais gemessen. Mais eignet sich aufgrund der vergleichbar großen Spanne an Heterosisleveln für diese Studien.
• Insgesamt wurden 21 Inzuchtlinien eines 7 × 14 Kreuzungsschemas unter kontrollierten Bedingungen angezogen. Vier der sieben Hartmais-Linien besaßen einen europäischen Flint, die restlichen drei einen Flint/Lancester genetischen Hintergrund. Die Zahnmais-Linien setzten sich aus acht Linien mit einem Iowa Stiff Stalk Synthetic und 6 mit einem Iodent genetischen Hintergrund zusammen. Die Felddaten der 98 aus dem Kreuzungsschema stammenden Hybride und die der Inzuchtlinien wurden aus verschiedenen Standorten in Deutschland erhalten. Die Feldversuche wurden dabei in einer 2-Reihen Versuchsanordnung mit 2–3 biologischen Replikaten durchgeführt. Gemessen wurde der Kornertrag in Mg/ha bei 155 g/kg Kornfeuchte. Heterosis für jedes Inzuchtlinienpaar und dessen Hybrid wurde als MPH (mittlere parentale Heterosis) in Mg/ha bei 155 g/kg Kornfeuchte bestimmt.
• Fünf biologische Replikate von Keimlingen jeder Inzuchtlinie wurden 7 Tage nach der Aussaat vereint und aus dem gesamten biologischen Material RNA isoliert. Das sRNAom wurde über eine Illumina Tiefensequenzierung analysiert.
• Die Sequenzrohdaten wurden von den Sequenzieradaptern befreit und Sequenzbereiche mit niedriger Sequenzierqualität unter 99,9% entfernt. Alle redundanten Sequenzen mit einer Länge von 15-nt bis 40-nt wurden für die folgende Analyse zusammengefasst und deren Sequenzanzahl (sRNA-Expression) bestimmt.
• Die sRNA-Expressionsdaten wurden über eine Quantil-Normalisierung (Bolstad et al. 2003. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 19: 185–93) mit einer Modifikation, welche die Zuweisung normalisierter Expressionswerte zu nicht exprimierten sRNAs ausschließt, normalisiert.
• Die Quantil-normalisierten Expressionswerte wurden auf eine Sequenzanzahl pro Millionen Sequenzen pro Sequenzierungsbibliothek normalisiert (read count per million quantile normalized reads, rpmqn). Dies erlaubt den Vergleich unterschiedlicher Sequenzbibliotheken mit unterschiedlicher Sequenziertiefe.
• sRNAs mit einer minimalen Expression von 0,5 rpmqn wurden per Definition als exprimiert angenommen. Als differentiell exprimiert galten sRNAs mit einem minimalen Expressionsunterschied mit einem Faktor >= 2 oder wenn ein Elter unter der Minimalexpression lag, musste der andere Elter mindestens die minimale Expression multipliziert mit dem minimalen Expressionsunterschied (= 1 rpmqn) aufweisen.
• Die Assoziation parental differentiell exprimierter sRNAs mit Heterosis erfolgte in Anlehnung an die Methode von Frisch et al. (Frisch et al. 2010. Transcriptome-based distance measures for grouping of germplasm and prediction of hybrid performance in maize. Theor. Appl. Genet. 120: 441–450) mit der Erweiterung um negativ assoziierte sRNAs. Die 98 Hybride wurden dafür nach der Höhe der Heterosislevel in zwei Klassen (niedrige/hohe Heterosis) eingeteilt und für jede sRNA die Anzahl der Hybride mit differentieller parentaler Expression für beide Klassen bestimmt. Für jede sRNA wurde o_l bzw. o_h bestimmt, welche der Anzahl von Hybriden in der Klasse der niedrigen bzw. hohen Heterosis entsprechen, deren Eltern eine differentielle Expression der untersuchten sRNA aufweisen. Die im Anschluss berechnete binomiale Verteilungswahrscheinlichkeit gibt die Wahrscheinlichkeit wieder mit der die differentielle Expression in beiden Klassen ungleich verteilt ist, und damit mit MPH von Kornertrag assoziiert ist. Die Wahrscheinlichkeit wurde gemäß der Formel 3, in Abhängigkeit von der Anzahl der differentiellen Expression der sRNA in den definierten Klassen (Formel 1 bzw. 2), ermittelt:

  

  p-Werte < 0,05, nach erfolgter Benjamini-Hochberg FDR Korrektur (Benjamin & Hochberg 1995. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Statist. Soc. B 57: 289–300), lassen auf eine signifikante Assoziation der untersuchten sRNA mit MPH von Kornertrag schließen. Für jeden Hybrid konnte aus einem Untersuchungssatz von sRNAs der Anzahl n_f,pos entsprechend den positiv assoziierten sRNAs bzw. n_f,neg entsprechend den negativ assoziierter sRNAs sowie den Anzahlen von differentiell exprimierten sRNAs n_d,pos der positiv assoziierten sRNAs bzw. n_d,neg der negativ assoziierten sRNAs aus dem Untersuchungssatz die kombinierte Binärdistanz D_b (Formel 4) für alle positiv und negativ assoziierten sRNAs bestimmt werden:

  
• Aus den sRNA-Expressionsdaten der 21 Inzuchtlinien konnten insgesamt 11.272 signifikant mit Heterosis für Kornertrag assoziierte sRNAs identifiziert werden. 4.357 dieser sRNAs sind positiv bzw. 6.915 negativ mit Heterosis für Kornertrag assoziiert.
• Eine lineare Regression der kombinierten Binärdistanzen D_b, basierend auf den 11.272 signifikant mit Heterosis für Kornertrag assoziierten sRNAs, aller 98 untersuchten Hybride zeigte eine hohe Korrelation mit dem assoziierten Merkmal Heterosis für Kornertrag von r = 0,933 ( ).
• Diese hohe Korrelation lässt eine hohe Vorhersagegenauigkeit von sRNAs vermuten. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurden Typ-0 und Typ-2 Kreuzvalidierung wie von Frisch et al. (Frisch et al. 2010. Transcriptome-based distance measures for grouping of germplasm and prediction of hybrid performance in maize. Theor. Appl. Genet. 120: 441–450) beschrieben, mit insgesamt 100 Durchgangen durchgeführt. Hierfür wurden in jeder Validierung zwei nicht überlappende Sätze von Inzuchteltern definiert, der Bestimmungssatz, anhand dessen Vorhersageparameter bestimmt werden, und der Vorhersagesatz, für dessen Hybride Heterosis von Kornertrag vorhergesagt werden soll. Für jeden Kreuzvalidierungslauf werden auf Basis der möglichen Hybride des Bestimmungssatzes alle mit Heterosis von Kornertrag assoziierten sRNAs (p < 0,05 ohne Fehlerkorrektur) bestimmt. Auf Basis der ermittelten assoziierten sRNAs des Bestimmungssatzes, kann für die Eltern jedes Hybriden des Bestimmungssatzes die kombinierte Binärdistanz D_b ermittelt werden. Die Parameter a (y-Achsenabschnitt) und b (Steigung) der linearen Gleichung (Formel 5) können für den Bestimmungssatz über die Methode der kleinsten Quadrate (least square minimization) mittels der für die Hybride des Bestimmungssatzes bekannten Werte H und D_b berechnet werden. Die berechneten Vorhersageparameter (a und b) sowie die Binärdistanz D_b, individuell errechnet für jede Hybride des Vorhersagesatzes auf Basis der assoziierten sRNAs des Bestimmungssatzes, dienen nun der Vorhersage der Heterosis von Kornertrag H für jede dieser Hybride (Formel 5). H = a + b·D_b (5)
• In jedem Kreuzvalidierungsversuch wird für jeden Hybrid aus Inzuchtelternpaarungen des Vorhersagesatzes die kombinierte Binärdistanz D_b gemäß Formel 4 ermittelt und mit den über den Bestimmungssatz, wie zuvor beschrieben, ermittelten Regressionsparametern a und b der Merkmalswert für Heterosis von Kornertrag H über Formel 5 bestimmt. Über die Korrelationskoeffizienten der vorhergesagten und der bekannten Merkmalswerte für Heterosis von Kornertrag der Hybride des Vorhersagesatzes wird die Genauigkeit der Vorhersage bestimmt. Die Ergebnisse für Typ-0 und Typ-2 Kreuzvalidierungen sind in dargestellt.
• Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine hohe Vorhersagekraft für sRNA-Expressionsdaten mit Heterosis insbesondere für Kornertrag.

Claims (10)

1. Verfahren zur Vorhersage von Hybridmerkmalen bei Pflanzen und Tieren, bei dem man sRNA-Moleküle, die mit einem Hybridmerkmal assoziiert sind, identifiziert und Elternlinien, die zur Herstellung von Hybriden geeignet sind, auf die Höhe einer Expression der identifizierten sRNA-Moleküle hin untersucht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifikation der sRNA-Moleküle die folgenden Schritte umfasst: a) Anzucht von Pflanzen oder Tieren genetisch verschiedener Elternlinien; b) Kreuzen der Pflanzen oder Tiere zur Erzeugung von Hybriden; c) Bestimmung des Ausmaßes der Merkmalsausprägung bei verschiedenen Hybriden; e) Analyse der Elternlinien der untersuchten Hybride auf ihre sRNA-Expression hin;
3. Verfahren nach Anspruche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die sRNA-Moleküle eine Länge von 15 bis 40 Nukleotiden aufweisen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die sRNA-Moleküle nicht für Proteine kodieren.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ermittlung differentieller sRNA-Expression zwischen den genetisch verschiedenen Elternlinien erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Hybridmerkmal um Ertrag handelt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei Pflanzen eine Analyse der Elternlinien auf ihre sRNA-Expression hin an Pflanzenkeimlingen durchgeführt wird.
8. Verwendung von sRNA-Molekülen zur Vorhersage von Hybridmerkmalen bei Pflanzen und Tieren.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den sRNA-Molekülen um differentiell parental exprimierte sRNA-Moleküle handelt, die mit dem Ausmaß der Ausprägung der Hybridmerkmale assoziiert sind.
10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9 zur Vorhersage des Ausmaßes an Heterosis.

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