BR112016028663B1 - Método para identificar uma planta c. melo cultivada compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência ao myav - Google Patents

Método para identificar uma planta c. melo cultivada compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência ao myav Download PDF

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Abstract

MELOEIROS COM UM GENE DOMINANTE DE RESISTÊNCIA AO VÍRUS ASSOCIADO AO AMARENTO DO KLÃO (MYAV). A presente invenção se refere ao campo de meloeiros que tem um gene dominante de resistência ao Vírus Associado ao Amarelamento do Melão (MYaV) em seu genoma, introgredido a partir de acessos selvagens de melão.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere ao campo do cruzamento de plantas, em particular, melão. A invenção fornece o locus genético que confere resistência ao Vírus Associado ao Amarelamento do Melão (Melon Yellowing associated Virus) (MYaV) como encontrado nos acessos selvagens de melão ou em parentes silvestres do melão, e meloeiros cultivados compreendendo o dito locus genético (ou uma parte que confere resistência), que confere resistência às ditas plantas MYaV. Também são fornecidas sementes a partir das quais essas plantas podem ser cultivadas, partes de plantas, células, tecidos ou órgãos de tais plantas e métodos de cruzamento para transferir o locus de resistência do MYaV, ou uma parte que confere resistência ao mesmo, para outros meloeiros cultivados ou células de plantas, especialmente meloeiros susceptíveis ao MYaV. Também são fornecidos marcadores moleculares com os quais o dito locus genético pode ser identificado em plantas e células de plantas e/ou transferido para outros meloeiros ou células de plantas. Como a resistência MYaV presente no locus genético é dominante, as plantas resistentes a MYaV e/ou células da planta podem compreender o locus genético em forma homozigótica ou forma heterozigótica.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Desde 1999, uma nova doença que causa os sintomas descritos como “amarelamento dos meloeiros” foi relatada por causar dano no nordeste do Brasil, que é a região onde mais de 90 % da produção de melão brasileira ocorre. Os sintomas são sarapintação e amarelamento e são principalmente vistos em folhas mais velhas (Nagata et al. 2003, Plant Pathology 52, 797). O vírus que causa esta doença foi provisoriamente chamado de Vírus associado ao Amarelamento do Melão (MYaV) (Nagata et al., 2003, acima e Nagata et al., 2005, Arch. Virology Vol. 150(2):379-87). Em 2007, a detecção serológica (usando anticorpos policlonais desenvolvidos para detecção do MYaV, (veja Avila et al. 2008 Trop. Plant Pathol. v.33 n.3 Brasília maio/jun. 2008) revelou que uma grande porcentagem de meloeiros sintomáticos foi, de fato, infectada com MYaV (Lima et al. Hortic. Bras. vol. 27 n° 4 Brasília Oct./Dec. 2009). A região mais afetada foi o Estado do Rio Grande do Norte, em Mossoró, com 96,3 % dos melões infectados. Curiosamente, as concentrações de vírus foram maiores em extratos preparados a partir de caules de plantas sintomáticas do que de folhas.
Os sintomas típicos da doença aparecem como sarapintação e amarelamento das folhas, principalmente de folhas mais velhas, semelhantes a um distúrbio nutricional (ver Nagata et al, 2003, acima e a Fig. 1 de Nagata et al. 2010, Journal of General Plant Pathology Volume 76, N°. 4, páginas 268-272). No tecido foliar infectado apresentando sintomas de amarelamento, partículas de vírus filamentosas de 600-700 nm de comprimento podem ser vistas por microscopia eletrônica.
O vírus encontrado em plantas com sintomas de doença amarelamento é transmitido do melão para meloeiros por mosca- branca (Bemisia tabaci biótipo B). Também pode ser utilizado o enxerto para transmitir o vírus a outros meloeiros ou ao Cucumis anguria (maxixe). Por microscopia eletrônica, foram observadas partículas longas, filamentosas do tipo Carlavirus e corpos de inclusão em folhas infectadas, o que sugeriu que a presença de um vírus do gênero Carlavirus (Nagata et al. 2003, Plant Pathol 52:797). Nagata et al. 2005 (supra) sequenciou dois genes, a proteína de revestimento (ORF-A) e mais um quadro de leitura aberto (ORF-B), ver número de acesso do GenBank AY373028. Como o Cowpea mild mottle virus (CPMMV) foi a única espécie de carlavirus conhecida por ser transmitida por mosca-branca, as propriedades genéticas e sorológicas do MYaV foram esperadas semelhantes às do CPMMV. Contudo, o MYaV não reagiu de forma cruzada em um ensaio de imunofixação de pontos aos anticorpos de CPMMV (Nagata et al. 2003, acima), e os dados da sequência genômica mostraram que a proteína de revestimento (CP) de CPMMV não estava estreitamente relacionada com a do MYaV (Nagata et al. 2005, acima).
Inicialmente, não estava claro quando incluir MYaV dentro do gênero Carlavirus ou se deveria ser um novo gênero na família Flexiviridae (Nagata et al. 2005, acima). No entanto, em um estudo recente (Nagata et al. 2010, supra), estimou-se que 40 % (cerca de 3,1 kb) do genoma do MYaV foi clonado e sequenciado e com base nestes dados os autores sugerem que o vírus é efetivamente uma nova espécie dentro do gênero Carlavirus e sugerem mudar o nome deste vírus para Mellon Yellowing Virus (MYV). A sequência de 3,1 kb continha 5 quadros de leitura abertos (ORFs), codificando três proteínas do Bloco de Gene Triplo (TGB1, TGB2 e TGB3), a proteína de revestimento (CP) e a proteína de ligação ao ácido nucleico putativo (NABP), ver o número de acesso do GenBank AB510477. A sequência da proteína de revestimento (CP) neste estudo tinha 93 % de identidade de sequência com a sequência de ORF-A (AY373028).
Como não há plantas com resistência contra o vírus disponíveis, uma estratégia desenvolvida para limitar a infecção por MYaV é cobrir todo o campo com camada de tecido não tecido de fiação contínua desde a germinação até a floração, para evitar a transmissão do vírus pela mosca- branca. No entanto, as plantas tornaram-se sensíveis às larvas (leaf miners) (Liriomisa spp.), que se tornou generalizada e danificou fortemente a produção de frutos (Nagata et al. 2010, acima).
É um objeto da invenção fornecer fontes de resistência ao MYaV e uma região genética compreendendo o locus de resistência ou uma parte dele, que conferem resistência contra MYaV. Outro objeto da invenção é fornecer meloeiros cultivados (Cucumis melo L.) e células, tecidos, frutos e outras partes de tais plantas compreendendo no seu genoma um locus que confere resistência ao MYaV (ou uma parte que confere resistência do mesmo), quer em uma forma homozigótica ou heterozigótica, pelo qual os meloeiros são resistentes contra MYaV. Também as sementes a partir das quais os meloeiros resistentes ao MYaV podem ser cultivadas são uma modalidade da invenção.
Em um aspecto adicional são fornecidos marcadores moleculares que podem ser utilizados para detectar a presença e/ou para transferir o locus que confere resistência ao MYaV, ou uma parte que confere resistência, em/dentro de plantas ou células da planta de Cucumis melo L. Um ou mais dos marcadores podem, assim, por exemplo, ser utilizados para transferir o locus de resistência, ou uma parte que confere resistência, para meloeiros que são susceptíveis ao MYaV. Em uma modalidade, o locus de resistência, ou parte que confere resistência, é o locus no cromossoma 6 como encontrado em sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB 41966 ou NCIMB 41969. Em outra modalidade, o locus de resistência, ou parte que confere resistência, é o locus no cromossoma 6 como encontrado em sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB41967 (Local 2) ou NCIMB41968 (Papaya Netted). Em ainda uma outra modalidade, o locus de resistência ou parte que confere resistência é o locus no cromossoma 6, ou uma parte que confere resistência, como encontrado em outros meloeiros silvestres ou parentes silvestres de melão.
Um ou mais dos marcadores ligados ou associados ao locus de resistência ao MYaV, ou à sua parte que confere resistência, também podem ser utilizados para identificar novas fontes de resistência ao MYaV, como outros números de acesso silvestres de Cucumis melo ou parentes silvestres de melão compreendendo um locus de resistência ao MYaV no cromossoma 6 e para transferir (introgredir) o locus de resistência, ou uma parte que confere resistência ao MYaV, a partir de tais números de acesso em meloeiros cultivados. A resistência ao MYaV que confere o locus de traço quantitativo (QTL) no cromossoma 6 (equivalente ao Grupo de Ligação ICuGI VI, ou LG VI) foi denominada MYaV6.1.
A EP1962578B1 descreve um QTL de resistência ao CYSDV (Vírus do nanismo amarelo das cucurbitáceas - Cucurbit Yellow Stunting Disorder Virus) de PI313970 em um grupo de ligação que é ali designado arbitrariamente como “LG6” e reivindica meloeiros compreendendo uma introgressão a partir de PI313970, cuja introgressão compreende um QTSL de resistência ao CYSDV ligado a pelo menos um marcador localizado no cromossoma equivalente ao grupo de ligação (LG) 6 do número de acesso do melão PI313970. Observa-se que o documento EP1962578B1, designado arbitrariamente LG6, corresponde ao Grupo de Ligação ICuGI V (LG V). Em um aspecto, a planta da invenção, ou seja, uma planta de Cucumis melo cultivada compreendendo resistência contra o Vírus Associado ao Amarelamento do Melão (MYaV) em que a dita resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 na forma homozigótica ou heterozigótica e em que o dito fragmento de introgressão é de uma planta selvagem da espécie Cucumis melo, não compreende o QTL de resistência ao CYSDV como descrito em EP1962578B1. Em outro aspecto, a planta da invenção, ou seja, uma planta de Cucumis melo cultivada compreendendo resistência contra o Vírus Associado ao Amarelamento do Melão (MYaV) em que a dita resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 na forma homozigótica ou heterozigótica e em que o dito fragmento de introgressão é de uma planta selvagem da espécie Cucumis melo, não compreende o marcador E11/M49-239 como definido no parágrafo [0037] e reivindicação 1 da EP 1962578 B1. Ainda em outro aspecto da invenção a planta da invenção não compreende um ou mais ou todos os marcadores E11/M54-156, E14/M54-152, E14/M51-210, E14/M51-083, E11/M49-239, E11/M54- 169, E14/M50-262, E11/M57-278, E11/M54-163 e/ou E11/M49-072 como definido no parágrafo [0040] da EP1962578 B1. Ainda em outro aspecto da invenção a planta da invenção não compreende um ou mais ou todos os marcadores E11/M54-156, E14/M54-152, E14/M51-210, E14/M51-083, E11/M49-239, E11/M64-169, E14/M60- 262, E11/M67-278, E11/M64-163 e/ou E11/M49-072 como definido no parágrafo [0013] da EP 1962578 B1 ou conforme mostrado na Figura 1. As passagens citadas da EP1962578B1 são incluídas aqui a título de referência. Ainda em outro aspecto, as plantas da invenção, ou seja, uma planta de Cucumis melo cultivada compreendendo resistência contra o Vírus Associado ao Amarelamento do Melão (MYaV) em que a dita resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 na forma homozigótica ou heterozigótica e em que o dito fragmento de introgressão é de uma planta selvagem da espécie Cucumis melo, não tem um fenótipo de resistência ao CYSDV (ou seja, não é resistente ao CYSDV conforme descrito na EP 1962578B1).
DEFINIÇÕES GERAIS
O artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto exija claramente que haja um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido “um” ou “uma” geralmente significa “pelo menos um”.
Como utilizado aqui, o termo “planta” inclui a planta inteira ou quaisquer de suas partes ou derivados, como órgãos de plantas (por exemplo, órgãos de armazenamento, tubérculos, frutos, folhas, sementes, etc. colhidos ou não), células de plantas, protoplastos de plantas, célula de planta ou culturas de tecido a partir das quais plantas inteiras podem ser regeneradas, calos de plantas, nódulos de células vegetais e células de plantas que estão intactas em plantas ou partes de plantas, como embriões, pólen, óvulos, ovários e frutos (por exemplo, tecidos ou órgãos colhidos, como frutos de melão colhidos ou suas partes), flores, folhas, sementes, tubérculos, bulbos, plantas propagadas clonalmente, raízes, porta-enxertos caules, pontas de raiz e semelhantes. Também qualquer estágio de desenvolvimento é incluído, como mudas, imaturas e maduras, etc. Quando “sementes de uma planta” se referem a, estas ou referem-se às sementes das quais a planta pode ser cultivada ou as sementes produzidas na planta, depois da auto-fertilização ou fertilização cruzada.
“Variedade de planta” é um grupo de plantas pertencentes ao mesmo táxon botânico do grau mais baixo conhecido, que pode ser definido com base na expressão de características (independentemente de atenderem ou não as condições para o reconhecimento dos direitos do cultivador de planta) que resulta de um certo genótipo ou uma combinação de genótipos, pode ser distinguida de qualquer outro grupo de plantas pela expressão de pelo menos uma dessas características e pode ser considerada como uma entidade, porque pode ser multiplicada sem qualquer alteração. Por conseguinte, o termo “variedade de planta” não pode ser utilizado para denotar um grupo de plantas, mesmo que sejam do mesmo tipo, se todas elas forem caracterizadas pela presença de um ou dois loci ou genes (ou características fenotípicas devido a estes loci ou genes específicos), mas que de outra forma podem diferir uns dos outros enormemente no que se refere aos outros loci ou genes.
“F1, F2, F3, etc.” se refere às gerações consecutivas relacionadas a seguir a um cruzamento entre duas plantas precursoras ou linhagens precursoras. As plantas cultivadas a partir das sementes produzidas pelo cruzamento de duas plantas ou linhagens é chamada de geração F1. A autofecundação das plantas F1 resulta na geração F2, etc.
A planta “híbrida F1” (ou sementes híbridas F1) é a geração obtida a partir do cruzamento de duas linhagens parentais naturais. Assim, as sementes híbridas F1 são sementes a partir das quais as plantas híbridas F1 crescem. Os híbridos F1 são mais vigorosos e de maior rendimento, devido à heterose. As linhagens endogâmicas são essencialmente homozigóticas na maioria dos loci no genoma.
O termo “alelo(s)” significa qualquer uma de uma ou mais formas alternativas de um gene em um locus específico, todos estes alelos se referem a um traço ou característica em um locus específico. Em uma célula diploide de um organismo, os alelos de um determinado gene estão localizados em um local específico, ou locus (plural loci) em um cromossoma. Um alelo está presente em cada cromossoma do par de cromossomas homólogos. Uma espécie de planta diploide pode compreender um grande número de alelos diferentes em um locus específico. Estes podem ser alelos idênticos do gene (homozigótico) ou dois alelos diferentes (heterozigóticos). Assim, por exemplo, pode aqui ser feita referência a um alelo MYaV do locus de resistência ao MYaV MYaV6.1.
O termo “gene” significa uma sequência de DNA (genômica) compreendendo uma região (região transcrita), que é transcrita em uma molécula de RNA mensageiro (mRNA) em uma célula, e uma região reguladora operativamente ligada (por exemplo, um promotor). Diferentes alelos de um gene são assim diferentes formas alternativas do gene, que podem estar na forma de, por exemplo, diferenças em um ou mais nucleotídeos da sequência de DNA genômica (por exemplo, na sequência promotora, as sequências de éxon, sequências de íntron, etc.), a sequência de mRNA e/ou de aminoácido da proteína codificada.
O termo “locus” (plural loci) significa um local ou locais específicos ou um local em um cromossoma onde, por exemplo, se encontra um gene ou marcador genético. O locus de resistência ao MYaV (ou locus que confere resistência ao MYaV) é, assim, a localização no genoma do melão, onde se encontra o gene de resistência ao MYaV. No melão cultivado o locus de resistência ao MYaV encontra-se no cromossoma 6 (utilizando a nomenclatura ICuGI para cromossomas ou Grupos de Ligação, isto é LG VI) e é preferencialmente introgredido no genoma do melão cultivado (ou seja, no cromossoma 6 ou LG VI) a partir dos números de acesso do melão selvagem, como (mas não se limitando aos) números de acesso do melão selvagem depositados sob os números de acesso NCIMB 41966 e NCIMB41969 e NCIMB41967 e NCIMB41968 ou de outros melões silvestres ou parentes silvestres do melão que são passíveis de cruzamento com C. melo e a partir dos quais descendentes férteis dos cruzamentos podem ser produzidos.
Um “locus de traço quantitativo” ou “QTL” é um locus cromossômico que codifica um ou mais alelos que afetam a expressividade de um fenótipo distribuído continuamente (quantitativo). O locus de traço quantitativo que confere resistência ao MYaV chama-se aqui MYaV6.1.
“ICuGI” se refere à International Cucurbit Genomics Initiative, que publica mapas genéticos de, por exemplo, Cucumis melo (http://www.icugi.org/cgi- bin/cmap/map_set_info?species_acc=CM). A versão atual do mapa do genoma de C. melo é de 4 de março de 2012 e o mapa do cromossoma 6 é dito como ICuGI_VI (ou LG VI ou Grupo de Ligação VI) e contém 124 marcadores (11 marcadores AFLP, 1 ISSR, 19 RAPD, 17 RFLP, 31 SNP, 45 SSR) em um grupo de ligação que varia de 0,00 a 98,00 cM. Aqui, o cromossoma 6 do melão e o LG VI são utilizados indistintamente.
A “distância genética” entre os loci (por exemplo, entre marcadores moleculares e/ou entre marcadores fenotípicos) no mesmo cromossoma é medida pela frequência de cruzamento, ou frequência de recombinação (RF) e é indicada em centiMorgans (cM). Um cM corresponde a uma frequência de recombinação de 1 %. Se nenhum recombinante pode ser encontrado, a RF é zero e os loci são extremamente próximos fisicamente ou são idênticos. Quanto mais separados forem os dois loci, maior será a RF.
A “distância física” entre os loci (por exemplo, entre marcadores moleculares e/ou entre marcadores fenotípicos) no mesmo cromossoma é a distância realmente física expressa em pares de bases (bp), quilos pares de bases (kb) ou pares de megabase (Mb). C. melo tem um tamanho de genoma haploide total de cerca de 450 Mb, dividido em 12 pares de cromossomas, ver Garcia-Mas et al, PNAS de 2 de julho de 2012, p1-6 e Gonzales et al. 2010, BMC Genomics 11:339, p113.
“Fragmento de introgressão” ou “região de introgressão” se refere a um fragmento de cromossoma (ou parte ou região do cromossoma) que foi introduzido em outra planta da mesma espécie ou de espécies afins por cruzamento ou técnicas de reprodução tradicionais, como retrocruzamento, ou seja, o fragmento introgredido é o resultado de métodos de cruzamento ditos pelo verbo “introgredir” (como retrocruzamento). No melão, os números de acesso do melão selvagem ou parentes silvestres do melão são frequentemente utilizados para introduzir fragmentos do genoma selvagem no genoma do melão cultivado, Cucumis melo. Essa meloeiro cultivada tem assim um “genoma do C. melo cultivado”, mas compreende no genoma um fragmento de um melão selvagem ou de um parente selvagem do melão, por exemplo, um fragmento de introgressão de um genoma de Cucumis selvagem relacionado, como Cucumis melo ssp. agrestis, C. melo ssp. melo, C. melo ssp. acidulous, C. callosus, C. trigonus, C. picrocarpus, ou outro melão selvagem ou parente selvagem do melão. Entende-se que o termo “fragmento de introgressão” nunca inclui um cromossoma inteiro, mas apenas uma parte de um cromossoma. O fragmento de introgressão pode ser grande, po exemplo, mesmo metade de um cromossoma, mas é de preferência, menor, como cerca de 15 Mb ou menos, como cerca de 10 Mb ou menos, cerca de 9 Mb ou menos, cerca de 8 Mb ou menos, cerca de 7 Mb ou menos, cerca de 6 Mb ou menos , cerca de 5 Mb ou menos, cerca de 4 Mb ou menos, cerca de 3 Mb ou menos, cerca de 2 Mb ou menos, cerca de 1 Mb (igual a 1.000.000 pares de bases) ou menos, ou cerca de 0,5 Mb (igual a 500.000 pares de bases) como cerca de 200.000 pb (igual a 200 Kg de pares de bases) ou menos, cerca de 100.000 pb (100 kb) ou menos, cerca de 50.000 pb (50 kb) ou menos, cerca de 25.000 pb (25 kb) ou menos.
O “alelo MYaV” se refere a um alelo que confere resistência ao MYaV encontrado no locus MYaV6.1 que confere resistência ao MYaV, ou na parte que confere resistência do locus, introgredido no melão cultivado (no cromossoma 6 do C. melo cultivado) de um melão selvagem ou de um parente selvagem do melão, por exemplo, a partir de plantas das quais uma amostra representativa de sementes foi depositada sob o número de acesso NCIMB 41966 ou NCIMB 41969 ou NCIMB41967 ou NCIMB41968. O termo “alelo MYaV”alelo MYaV”, assim, engloba também alelos MYaV obtidos a partir de outros números de acesso do Cucumis resistentes ao MYaV, como alelos ortólogos MYaV (ver abaixo). Quando um ou dois alelos MYaV estão presentes no locus que confere resistência ao MYaV no genoma (isto é, na forma heterozigótica ou homozigótica), a planta é resistente contra MYaV, isto é, tem um fenótipo de resistência ao MYaV. Na meloeiro cultivada sem o fragmento de introgressão, o alelo de C. melo encontrado no mesmo locus no cromossoma 6 é aqui dito como alelo “myav”myav” (ou alelo susceptível ao MYaV). Como a resistência é dominante, as plantas myav/myav apresentam um fenótipo susceptível ao MYaV, enquanto que as plantas MYaV/myav e MYaV/MYaV são plantas que possuem o fenótipo resistente ao MYaV conferido pelo alelo MYaV (isto é, são resistentes ao MYaV).
Os “alelos ortólogos MYaV” ou “ortólogos MYaV” ou “ortólogos de MYaV” são alelos de genes de resistência ao MYaV presentes em outros melões silvestres ou parentes silvestres do melão, nos cromossomas ortólogos 6. Esses alelos ortólogos podem assim ser encontrados no cromossoma 6 ortólogo do melão selvagem ou parentes silvestres de C. melo (como C. callosus, C. trigonus, C. picrocarpus e outros) e são transferíveis, por introgressão, para o cromossoma 6 do C. melo cultivado. Assim, um alelo “ortólogo” (também dito como “alelo variante”) se refere a um alelo, ou a um fragmento de introgressão compreendendo o alelo, que é derivado de diferentes melões silvestres ou de parente selvagem da meloeiro do que um presente em qualquer dos depósitos de semente feitos aqui, mas que a variante compreende um ou mais dos SNPs ligados ao QTL (genótipo SNP resistente) e em que a sequência genômica variante compreende uma identidade de sequência substancial com a SEQ ID NO: que compreende o SNP (qualquer uma das SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12), isto é, pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência ou mais. Dessa forma, quando referência da presente invenção é feita a um genótipo de SNP resistente em uma sequência genômica específica (selecionado dentre as SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12), esta também engloba o genótipo resistente ao SNP nas variantes da sequência genômica, ou seja, o genótipo SNP em uma sequência genômica que compreende pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência ou mais à sequência dita a (selecionada dentre a SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12). Dessa forma, qualquer referência da presente invenção a qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 em um aspecto que também engloba uma variante de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, a dita variante compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência ou mais em relação à dita sequência e compreendendo o genótipo de SNP resistente.
“Uniformidade” ou “uniforme” se refere às características genéticas e fenotípicas de uma linhagem ou variedade de plantas. Linhagens endogâmicas são geneticamente muito uniformes já que elas são produzidas por várias gerações de endogamia. Do mesmo modo, e os híbridos F1 que são produzidos a partir de tais linhagens endogâmicas são altamente uniformes nas suas características genotípicas e fenotípicas e no seu desempenho.
Diz-se que um elemento genético, um fragmento de introgressão ou um gene ou alelo que confere uma característica (como resistência contra MYaV) é “obtido a partir de” ou pode ser “obtido a partir de” ou “derivável de” ou pode ser “derivado de” ou “como presente em” ou “como se encontra em” uma planta ou semente ou tecido ou célula se ele puder ser transferido da planta ou da semente em que está presente para outra planta ou semente na qual não está presente (como uma linhagem ou variedade) utilizando técnicas de reprodução tradicionais sem resultar em uma mudança fenotípica da planta receptora além da adição da característica conferida pelo elemento genético, locus, fragmento de introgressão, gene ou alelo. Os termos são utilizados indistintamente e o elemento genético, locus, fragmento de introgressão, gene ou alelo pode assim ser transferido para qualquer outro fundo genético sem a característica. Não só as sementes depositadas e compreendendo o elemento genético, locus, fragmento de introgressão, gene ou alelo podem ser usadas, mas também progênia/descendentes de tais sementes que foram selecionadas para reter o elemento genético, locus, fragmento de introgressão, gene ou alelo, podem ser utilizados e são aqui englobados, como variedades comerciais desenvolvidas a partir das sementes depositadas ou dos seus descendentes. Se uma planta (ou DNA genômico, célula ou tecido de uma planta) compreende o mesmo elemento genético, locus, fragmento de introgressão, gene ou alelo que pode ser obtido a partir das sementes depositadas, pode ser determinado por uma pessoa versada na técnica utilizando uma ou mais técnicas conhecidas na técnica, como ensaios fenotípicos, sequenciamento de genoma completo, análise de marcadores moleculares, mapeamento de traços, pintura de cromossomas, testes de alelismo e semelhantes.
Um “fenótipo de resistência ao MYaV” ou “resistência ao MYaV” ou “plantas resistentes ao MYaV” se refere à resistência contra MYaV conferida pelo alelo MYaV (ou pelo alelo ortólogo MaYV) quando presente no genoma de C. melo em duas cópias (na forma homozigótica) ou em uma cópia (na forma heterozigótica). O fenótipo de resistência ao MYaV e a presença do alelo MYaV e/ou ortólogos de MYaV podem ser testados utilizando o “ensaio de resistência ao MYaV” e/ou ensaios do marcador MYaV. Em um aspecto, o termo “resistência ao MYaV” engloba adicionalmente, ou alternativamente, resistência contra um vírus de amarelamento transmitido por Bemisia tabaci biotipo B, presente nos mesmos locais como MYaV (por exemplo, Nordeste do Brasil), o que resulta nos mesmos sintomas ou essencialmente semelhantes como infecção por MYaV e contra os quais o alelo MYaV (ou pelo alelo ortólogo de MaYV) da invenção confere resistência quando presente no genoma de C. melo em duas cópias (na forma homozigótica) ou em uma cópia (na forma heterozigótica). Este fenótipo de resistência ao vírus de amarelamento e/ou a presença do alelo MYaV e/ou ortólogos de MYaV podem ser testados utilizando o “ensaio de resistência ao MYaV” e/ou ensaios do marcador MYaV como descrito.
Um “ensaio de resistência ao MYaV” pode ser realizado de diferentes formas, ou pelo enxerto ou, de preferência, como um teste de campo, como também descrito em outro lugar aqui. De preferência, um ensaio de campo é usado em uma área de alta incidência natural de Bemisia tabaci niotipo B que carrega o MYaV, como o nordeste do Brasil, ou outras áreas onde uma alta indicêndia da doença de MYaV está presente (ou seja, uma área infestada de MYaV). Uma planta de um genótipo específico é considerada como resistente ao MYaV se a pontuação média de resistência a doença de uma pluralidade de plantas (pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, de preferência, pelo menos duas ou três repetições) desse genótipo é significativamente mais elevada em comparação com os controles susceptíveis (plantas que não possuem um fragmento de introgressão que compreende um alelo MYaV ou um ortólogo MYaV, como variedades de melão Gália Amaregal F1 (Nunhems) ou Glory (Origene Seeds); ou variedades de melão pele-de-sapo Medellin (Nunhems) ou Sancho (Syngenta)), quando cultivadas no mesmo ambiente. Assim, por exemplo, meloeiros de uma linhagem compreendendo a introgressão do locus que confere resistência ao MYaV, ou uma parte que confere resistência da mesma, em uma forma heterozigótica ou homozigótica podem ser cultivadas em conjunto com meloeiros de controle adequado (especialmente meloeiros susceptíveis ao MYaV) em um campo aberto no nordeste do Brasil e quando todas as plantas de controles susceptíveis exibem sintomas claros de amarelamento (ver Figura 2), todas as plantas são fenotipadas em uma escala de resistência à doença de 1 (folhas totalmente amarelas, ou seja, folhas no primeiro 1/3 da planta estão 100 % amarelas) a 9 (folhas totalmente verdes; folhas no primeiro 1/3 da planta estão 100 % verdes), com o que 2 = cerca de 81 % a 99 % da área da folha no primeiro 1/3 da planta é amarela, 3 = cerca de 65 % a 80 % da área da folha no primeiro 1/3 da planta é amarela, 4 = cerca de 49 % a 64 % da área da folha no primeiro 1/3 da planta é amarela, 5 = cerca de 33 % a 48 % da área da folha no primeiro 1/3 da planta é amarela, 6 = cerca de 17 % a 32 % da área da folha no primeiro 1/3 da planta é amarela, 7 = até cerca de 17 % da área da folha no primeiro 1/3 da planta é amarela, 8 = poucas folhas no primeiro 1/3 da planta começam a mostra sombras/pintas amarelas. O primeiro 1/3 da planta se refere às folhas mais velhas no primeiro 1/3 da área da planta, conforme determinado a partir do sistema tronco/raiz principal da planta e como visto na Figura 2 (retângulo preto). As folhas mais jovens das videiras, mais para a ponta das vinhas, não são fenotipadas, uma vez que estas são geralmente verdes no momento da fenotipagem e ficam amarelas apenas em plantas susceptíveis após vários dias, por exemplo, 7 a 10 dias mais tarde (embora já contenham o vírus no momento da fenotipagem). Plantas com uma pontuação média de resistência à doença significativamente superior à pontuação média da doença dos controles sensíveis, po exemplo, uma pontuação média de pelo menos 3,0, preferencialmente pelo menos 4,0, mais preferencialmente pelo menos 5,0, pelo menos 6,0, pelo menos 7,0, pelo menos 8,0, mais preferencialmente 9,0, são aqui plantas resistentes ao MYaV ou plantas com uma resistência ao MYaV.
O “ensaio do marcador de MYaV” é um ensaio de marcador molecular que pode ser utilizado para testar se no cromossoma 6 de C. melo existe uma introgressão de um melão selvagem, ou um parente selvagem do melão, compreendendo o alelo MYaV (ou um alelo ortólogos) está presente no genoma (ou se em melão selvagem ou parentes silvestres do melão compreendem a região compreendendo QTL de MYaV6.1 no seu genoma), determinando o genótipo de qualquer um ou mais marcadores ligados ao QTL, por exemplo, o genótipo dos marcadores SNP mME15090 e/ou mME12135 (em um aspecto preferencialmente ambos mME15090 e mME12135), e/ou qualquer marcador selvagem do melão ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre os marcadores SNP mME15090 e mME12135 e/ou dentro de 7cM uu dentro de 5cM de qualquer um destes marcadores, e/ou dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb ou 1 Mb ou menos de qualquer um destes marcadores, e/ou opcionalmente A) de um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo mME40332, mME28908, mME9692 , MME50656, ou qualquer genoma de C. Melo selvagem ou marcador específico do genoma do parente do melão selvagem entre mME1509 e mME50656 e/ou B) de um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo mME21377, mME36533, mME13585 ou qualquer marcador específico do genoma de C. melo selvagem ou específico do genoma do parente do melão selvagem entre mME21377 e mME13585 e/ou C) de um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo mME21377, mME13585 ou qualquer marcador específico do genoma de C. melo selvagem ou específico do genoma do parente do melão selvagem entre mME21377 e mME13585, especialmente entre mME21377 e mME12135.
“Melão” ou “melão almiscarado” se refere aqui às plantas da espécie Cucumis melo. Melões ou “melões almiscarados”, Cucumis melo, podem ser classificados em: C. melo cantalupensis, C. melo inodorous e C. melo reticulatus. C. melo cantalupensis também são ditos como melão Cantaloupe e são principalmente de formato redondo com nervuras proeminentes e quase nenhuma reticulação. A maioria tem carne laranja, doce e eles são geralmente muito perfumados. Em contraste com o cantaloupe europeu, o “Cantaloupe” norte- americano não é deste tipo, mas pertence aos verdadeiros melões almiscarados. C. melo inodorous (ou melões de inverno) podem ser subdivididos em diferentes tipos, como o melão Honeydew, pele-de-spo, melão açúcar, melão japonês, etc. C. melo reticulatus é o verdadeiro melão almiscarado, com pele reticulada (com rede) e inclui Melões Gália, melões Sharlyn e o melão norte-americano.
“Melão cultivado” se refere às plantas de Cucumis melo, isto é, variedades, linhagens de reprodução ou cultivares da espécie C. melo, cultivadas por seres humanos e com boas características agronômicas, produzindo especialmente frutos comestíveis e comercializáveis de bom tamanho e qualidade e uniformidade; preferencialmente essas plantas não são “plantas silvestres”, isto é, plantas que geralmente têm rendimentos muito mais pobres e características agronômicas mais fracas do que plantas cultivadas e, por exemplo, crescem naturalmente em populações silvestres. “Plantas silvestres” incluem, por exemplo, ecotipos, linhagens PI (Introdução de Plantas), variedades locais ou números de acesso silvestres ou parentes silvestres de uma espécie.
O melão e os parentes silvestres do melão são diploides e possuem 12 pares de cromossomas homólogos, numerados de 1 a 12. “Cromossoma 6 de melão” se refere ao cromossoma 6 de C. melo, como é conhecido na técnica e como dito pela nomenclatura ICuGI. “Cromossoma Ortólogo 6” se refere ao cromossoma 6 de parentes silvestres de melão, partes das quais podem ser introgredidas no cromossoma 6 do melão cultivados.
“Melão selvagem” inclui plantas silvestres da espécie Cucumis melo, por exemplo, C. melo ssp agrestis, C. melo ssp. melo, C. melo var. texanus, C. melo var. acidulous, sementes depositadas sob NCIMB 41966, NCIMB 41969, NCIMB41962, NCIMB41968, e outros números de acesso de C. melo selvagem, como por exemplo, raças locais ou números de acesso PI encontrados em http://www.ars-grin.gov ou outras coleções de semente. As sementes depositadas sob NCIMB 41966 foram obtidas a partir da coleção ARS-GRIN nos EUA e têm como origem designada “Índia”. As sementes depositadas sob NCIMB 41969 foram obtidas da Espanha e têm como origem o Uzbequistão. As sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB 41967 e sementes depositadas sob NCIMB 41968 foram obtidas nos EUA e têm origem desconhecida.
“Parentes silvestres do melão” incluem plantas silvestres de outras espécies de Cucumis, mas que podem ser cruzadas com Cucumis melo para produzir descendência fértil (opcionalmente com o auxílio do resgate de embriões, aumento do crescimento do tubo polínico dependente da temperatura ou técnicas semelhantes para superar barreiras reprodutivas) e a partir dos quais os fragmentos cromossômicos podem ser obtidos e transferidos para Cucumis melo (por cruzamentos interespecíficos com C. melo ou através de cruzamentos com uma espécie ponte). Exemplos de parentes silvestres do melão são C. anguria, C. metuliferus, Cucumis callosus, Cucumis trigonus, Cucumis ficifolius, C. picocarpus, C. zeyheri, C. africanus, C. meeusei, C. prophetarum, C. hystrix, C. queenslandicus, e outras espécies de Cucumis (ver, por exemplo, Sebastian et al. 2010, PNAS Vol 107, n°. 32, 14269-14273).
“Média (average ou mean)” se refere aqui à média aritmética e ambos os termos são utilizados de forma intercambiável. O termo “média (average ou mean)” se refere assim à média aritmética de várias medições. O versado na técnica entende que o fenótipo de uma linhagem ou variedade da planta depende em certa medida das condições de crescimento e que, por conseguinte, média aritmética de pelo menos 10, 15, 20, 30 ou mais plantas (ou partes de plantas) são medidas, de preferência, em designs experimentais randomizados com várias repetições e plantas de controle adequadas cultivadas sob as mesmas condições na mesma experiência. Diferente “estatisticamente significativo” ou “estatisticamente significativamente” ou diferente “significativamente” se refere a uma característica de uma linhagem ou variedade de planta que, quando comparada com um controle adequado mostra uma diferença estatisticamente significativa nessa característica (por exemplo, p <0,05 utilizando ANOVA) a partir do (média do) controle.
Um “cromossoma recombinante” se refere a um cromossoma com uma nova constituição genética que surge através do cruzamento entre os cromossomas homólogos, por exemplo, um “cromossoma recombinante 6”, isto é, um cromossoma 6 que não está presente em nenhuma das plantas precursoras e surgiu através de um raro evento de cruzamento entre cromossomas homólogos de um par de cromossomas 6. Aqui, por exemplo, é fornecido um cromossoma 6 de melão recombinante compreendendo um locus que confere resistência ao MYaV, ou uma parte que confere resistência (compreendendo um alelo de resistência ao MYaV).
O termo “técnicas de reprodução tradicionais” abrange aqui o cruzamento, retrocruzamento, autofecundação, seleção, produção de haploide duplo, resgate de embriões, fusão de protoplastos, seleção assistida por marcadores, reprodução por mutação, etc. como conhecido pelo podutor (ou seja, métodos que nos os métodos de modificação genética/transformação/transgênicos), através dos quais, por exemplo, um cromossoma recombinante 6 pode ser obtido, identificado e/ou transferido.
“Retrocruzamento” se refere a um método de reprodução através do qual um traço (único), como a resistência ao MYaV, pode ser transferido de um fundo genético inferior (por exemplo, um melão selvagem ou um parente selvagem do melão; também dito como “doador”) para um fundo genético superior (também dito como “precursor recorrente”), por exemplo, melão cultivado. Uma progênia de um cruzamento (por exemplo, uma planta F1 obtida cruzando um melão selvagem, resistente ao MYaV com um melão cultivado, suscetível ao MYaV, ou uma planta F2 ou planta F3, etc., obtida por autofecundação da F1) é “retrocruzada” com o precursor com o fundo genético superior, por exemplo, com a fonte cultivada, suscetível ao MYaV. Após repetido retrocruzamento, o traço do fundo genético inferior terá sido incorporado no fundo genético superior.
“Seleção assistida por marcadores” ou “MAS” é um processo de utilização da presença de marcadores moleculares, que estão geneticamente ligados a um locus específico ou a uma região cromossômica específica (por exemplo, fragmento de introgressão), para selecionar as plantas para a presença do locus específico ou região (fragmento de introgressão). Por exemplo, um marcador molecular geneticamente ligado a um locus de resistência ao MYaV, pode ser utilizado para detectar e/ou selecionar meloeiros compreendendo o locus de resistência ao MYaV. Quanto mais próxima a ligação genética do marcador molecular ao locus (por exemplo, cerca de 7cM, 6cM, 5cM, 4cM, 3cM, 2cM, 1cM, 0,5cM ou menos), menor é a probabilidade do marcador se dissociar do locus através da recombinação meiótica. Da mesma forma, quanto mais próximos dois marcadores estiverem ligados uns aos outros (por exemplo, dentro de 7cM ou 5cM, 4cM, 3cM, 2cM, 1cM ou menos), menos provável é que os dois marcadores sejam separados uns dos outros (e mais provavelmente eles irão co-segregar como uma unidade).
Um marcador “dentro de 7cM ou dentro de 5cM” de outro marcador se refere a um marcador que mapeia geneticamente para dentro da região de 7cM ou 5cM que flanqueia o marcador (isto é, qualquer lado do marcador). De forma semelhante, um marcador dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb, 1 Mb ou menos de outro marcador se refere a um marcador que está fisicamente localizado dentro dos 5Mb, 3Mb, 2Mb ou 1 Mb, ou menos, da região de DNA genômico que flanqueia o marcador (ou seja, qualquer lado do marcador).
“Pontuação LOD” (logaritmo (base 10) de probabilidades) se refere a um teste estatístico frequentemente utilizado para análise de ligação em populações de animais e plantas. A pontuação de LOD compara a probabilidade de obtenção dos dados de teste se os dois loci (loci de marcadores moleculares e/ou um locus de traço fenotípico) estiverem realmente ligados, à probabilidade de observar os mesmos dados puramente por acaso. As pontuações LOD positivas favorecem a presença de ligação e uma pontuação LOD superior a 3,0 é considerada evidência de ligação. Uma pontuação LOD de +3 indica 1000 para 1 probabilidades de que a ligação sendo observada não ocorresse por acaso.
“Propagação vegetativa”, “reprodução vegetativa” ou “propagação clonal” são usadas indiferentemente neste documento e significam o método de tomar parte de uma planta e permitir que essa parte de planta forme pelo menos raízes onde a parte de planta é, por exemplo, definida como ou derivada de (por exemplo, por corte de) folha, pólen, embrião, cotilédone, hipocótilo, células, protoplastos, célula meristemática, raiz, ponta de raiz, pistilo, antera, flor, ponta de broto, broto, caule, fruta, pecíolo etc. Quando uma planta completa é regenerada por propagação vegetativa, é também dita como uma propagação vegetativa.
“Cultura celular” ou “cultura de tecidos” se refere à cultura in vitro de células ou tecidos de uma planta.
“Regeneração” se refere ao desenvolvimento de uma planta a partir de cultura celular ou cultura de tecidos ou propagação vegetativa.
“Transgene” ou “gene quimérico” se refere a um locus genético compreendendo uma sequência de DNA, como um gene recombinante ou um cromossoma recombinante ou parte dele, que foi introduzido no genoma de um meloeiro por transformação, como a transformação mediada por Agrobacterium. Uma planta compreendendo um transgene integrado de forma estável no seu genoma é dita como “planta transgênica". Um transgene ou planta transgênica também pode conter um cromossoma recombinante completo ou parte de um cromossoma recombinante, por exemplo, a parte que compreende o alelo MYaV, introduzida no genoma por transformação.
Uma “sequência de ácido nucleico isolada” ou “DNA isolado” se refere a uma sequência de ácido nucleico que não está mais no ambiente natural a partir do qual foi isolado, por exemplo, a sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira bacteriana ou no genoma nuclear ou plastídico da planta.
Uma “célula hospedeira” ou uma “célula hospedeira recombinante” ou “célula transformada” são termos que se referem a uma nova célula individual (ou organismo) que surge como resultado de pelo menos uma molécula de ácido nucleico, tendo sido introduzida na dita célula. A célula hospedeira é de preferência, uma célula vegetal ou uma célula bacteriana. A célula hospedeira pode conter o ácido nucleico como uma molécula de replicação extra-cromossômica (epissomal), ou compreende o ácido nucleico integrado no genoma nuclear ou do plastídeo da célula hospedeira, ou como cromossoma introduzido, por exemplo, minicromossoma.
A “identidade de sequência” e a “similaridade de sequência” podem ser determinadas por alinhamento de dois peptídeos ou de duas sequências de nucleotídeo utilizando algoritmos de alinhamento global ou local. As sequências podem então ser ditas como “substancialmente idênticas” ou “essencialmente semelhantes” quando são idealmente alinhadas, por exemplo, pelos programas GAP ou BESTFIT ou o programa Emboss “Needle” parâmetros padrão, ver abaixo) compartilham pelo menos uma percentagem mínima de identidade de sequência (como definido mais adiante). Esses programas usam o algoritmo de alinhamento global Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências ao longo de todo seu comprimento, maximizando o número de correspondências e minimizando o número de lacunas. Geralmente, os parâmetros padrão são usados, com uma penalidade por criação de lacuna = 10 e penalidade por extensão de lacuna = 0,5 (ambos para alinhamentos de nucleotídeos e proteínas). Para os nucleotídeos, a matriz da pontuação padrão utilizada é DNAFULL e para as proteínas a matriz de pontuação padrão Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919). Os alinhamentos de sequência e as pontuações para a percentagem de identidade de sequência podem, por exemplo, ser determinados utilizando programas de computador, como EMBOSS como disponíveis na rede mundial de computadores sob ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/). Alternativamente, a similaridade ou identidade de sequência pode ser determinada pesquisando bases de dados como FASTA, BLAST, etc., mas os acertos devem ser recuperados e alinhados em pares para comparar a identidade de sequência. Duas proteínas ou dois domínios de proteína ou duas sequências de ácido nucleico têm
“identidade de sequência substancial” se a percentagem de identidade de sequência for pelo menos de 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais (ex., pelo menos 99,1, 99,2 99,3 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 ou mais (como determinado pela “agulha” Emboss usando parâmetros padrão, isto é penalidade por criação de lacuna = 10, penalidade por extensão de lacuna = 0,5, usando matriz de pontuação DNAFULL para ácidos nucleicos um Blosum62 para proteínas).
Quando se faz referência a uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou DNA genômico) possuindo “identidade de sequência substancial” com uma sequência de referência ou possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 80 %, por exemplo, uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,2 %, 99,5 %, 99,9 % a uma sequência de referência, em uma modalidade a dita sequência de nucleotídeos é considerada substancialmente idêntica à dada sequência de nucleotídeos e pode ser identificada utilizando condições de hibridização rigorosas. Em outra modalidade, a sequência de ácido nucleico compreende uma ou mais mutações em comparação com a dada sequência de nucleotídeos, mas ainda pode ser identificada utilizando condições de hibridização rigorosas.
As “condições de hibridização rigorosas” podem ser utilizadas para identificar sequências de nucleotídeos, que são substancialmente idênticas a uma dada sequência de nucleotídeos. As condições rigorosas dependem da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5 °C inferiores ao ponto de fusão térmica (Tm) para as sequências específicas com uma força iônica e um pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50 % da sequência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. As condições tipicamente rigorosas serão escolhidas em que a concentração de sal é de cerca de 0,02 molar a pH 7 e a temperatura é de pelo menos 60 °C. A diminuição da concentração de sal e/ou o aumento da temperatura aumentam as estringências. As condições rigorosas para hibridização de RNA-DNA (Northern blots utilizando uma sonda de, por exemplo, 100nt) são, por exemplo, aquelas que incluem pelo menos uma lavagem em 0,2X SSC a 63°C durante 20 min, ou condições equivalentes. As condições rigorosas para hibridização de DNA-RNA (Southern blots utilizando uma sonda de, por exemplo, 100nt) são, por exemplo, aquelas que incluem pelo menos uma lavagem (normalmente 2) em 0,2X SSC a uma temperatura de 50°C, normalmente cerca de 55°C durante 20 min, ou condições equivalentes. Veja também Sambrook et al. (1989) e Sambrook e Russell (2001).
“Mapeamento fino” se refere aos métodos pelos quais a posição de um QTL pode ser determinada com mais precisão (estreitada) e pelo qual o tamanho do fragmento de introgressão que compreende o QTL é reduzido. Por exemplo, podem-se fazer Linhas Quase-Isogênicas para o QTL (QTL-NILs), que contêm fragmentos diferentes, sobrepostos do fragmento de introgressão dentro de um fundo genético, de outro modo uniforme, do precursor recorrente. Essas linhagens podem então ser utilizadas para mapear sobre qual fragmento o QTL está localizado e para identificar uma linhagem possuindo um fragmento de introgressão mais curto compreendendo o QTL.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a uma planta de Cucumis melo cultivada que compreende resistência contra o vírus associado ao amarelamento do melão (MYaV). Em particular, a resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 do melão, em que o dito fragmento de introgressão é de uma planta selvagem da espécie Cucumis melo ou de um parente selvagem do melão.
Os presentes inventores cruzaram dois números de acesso do C. melo selvagem diferentes, cujas sementes representativas foram depositadas sob NCIMB 41966 e NCIMB 41969, em uma linhagem de cruzamento de melão suscetível ao MYaV e em uma variedade do melão suscetível, respectivamente, e realizaram mapeamento de QTL, com base nos dados de fenotipagem obtidos de campos infestados de MYaV perto de Mossoró (Rio Grande do Norte, Brasil).
Surpreendentemente, em ambas as populações de mapeamento, foi encontrado um QTL altamente significativo para a resistência ao MYaV no cromossoma 6 do melão, indicando que diferentes números de acesso do Cucumis melo selvagem compreendem um locus de resistência ao MYaV no cromossoma 6, o qual foi transferido para C. melo cultivado e conferiu resistência ao MYaV sobre a planta cultivada do melão. Nas duas populações do mapeamento, o QTL, que foi denominado MYaV6.1, explicou 32,6 % e 91,7 % da variação fenotípica observada para a resistência ao MYaV, e é por isso altamente significativo.
Observa-se que quando se faz referência a um (um) QTL (MYaV6.1) ou a um locus que confere resistência ao MYaV (ou a uma parte que confere resistência ao mesmo) no cromossoma 6 do genoma de C. melo, pode ser que haja de fato dois (ou mais) QTL ligados entre si no cromossoma 6, uma vez que a pontuação LOD tem dois picos em ambas as populações de mapeamento (ver Figura 1). Assim, a referência a um QTL ou a um locus engloba a possibilidade de haver dois (ou mais) QTL ou dois (ou mais) loci acoplados um ao outro no cromossoma 6. Igualmente referência aqui a um fragmento de introgressão no cromossoma 6 possuindo um QTL ou um locus que confere resistência ao MYaV (ou parte que confere resistência ao mesmo) abrange que o fragmento de introgressão compreende todos os loci que conferem resistência ou, no caso de fragmentos de introgressão menores, pelo menos uma região de introgressão suficientemente grande (com um, dois ou mais QTLs) de modo que a resistência ao MYaV é conferida pelo fragmento de introgressão quando o fragmento de introgressão está na forma heterozigótica ou homozigótica no genoma de C. melo. Assim, no caso de fragmentos de introgressão menores, o fragmento de introgressão compreende preferencialmente pelo menos o QTL principal (isto é, o maior dos dois picos LOD na Figura 1). Em um aspecto, o fragmento de introgressão compreende o genótipo de resistência de pelo menos um ou ambos marcadores selecionados dos marcadores comuns mME15090 e mME12135. Especialmente a presença do genótipo de resistência do marcador mME12135 é indicativa da presença do QTL. Em um aspecto, o fragmento de introgressão compreende o genótipo de resistência de pelo menos um ou ambos marcadores selecionados a partir dos marcadores comuns mME15090 e mME12135 e/ou qualquer melão selvagem ou parente selvagem do melão de marcador específico do genoma do melão entre os marcadores SNP d mME15090 e mME12135, e/ou dentro de 7cM ou dentro de 5cM de qualquer destes marcadores, e/ou dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb ou 1 Mb ou menos de qualquer um destes marcadores.
Os dois marcadores mME15090 e mME12135 também foram encontrados em outros dois números de acessos silvestres, NCIMB 41967 e NCIMB 41968 e foi confirmado que estes dois números de acesso silvestres de C. melo contém o QTL no cromossoma 6. Ambos os números de acesso foram resistentes contra MYaV (com uma pontuação média de amarelamento de 9) e ambos os números de acesso foram cruzados com a cultivar de melão suscetível Amaregal (melão Gália) para produzir, por retrocruzamento, um melão cultivado com um fragmento de introgressão de NCIMB41967 ou NCIMB41968 no cromossoma 6. O QTL para a resistência ao MYaV herdado como um gene dominante monogênico. Também os melões cultivados compreendendo a introgressão no cromossoma 6, como indicativo pela presença do genótipo de resistência do marcador mME12135 e/ou mME15090, eram resistentes contra MYaV. Veja também os Exemplos.
Deste modo, em um aspecto, verificou-se que um Loci de traços quantitativos (QTL) (QTL MYaV6.1) que confere resistência ao MYaV está presente no cromossoma 6 de melões silvestres e que este QTL, quando transferido (introgredido) para uma variedade de melão ou linhagem de reprodução suscetível ao MYaV cultivada, e quando presente na forma heterozigótica ou homozigótica, confere resistência ao MYaV à meloeiro cultivada. O QTL, ou o fragmento de introgressão compreendendo o QTL (que compreende o alelo de resistência ao MYaV), é assim dominante, isto é, é suficiente ter o fragmento de introgressão em um dos cromossomas 6 (um cromossoma recombinante 6), enquanto que o cromossoma homólogo 6 do par pode ser um cromossoma 6 (não recombinante) de C. melo cultivado sem o fragmento de introgressão.
Embora as fontes presentes de introgressões de alelos de resistência ao MYaV sejam duas fontes silvestres (NCIMB 41966 e NCIMB 41969, da Índia e do Uzbequistão, respectivamente), existem provavelmente outros números de acesso de Cucumis silvestres que compreendem alelos MYaV ou alelos ortólogos MYaV no mesmo locus no cromossoma 6. Esses alelos MYaV ou alelos ortólogos MYaV também podem ser identificados e introgredidos no C. melo cultivado como aqui descrito, para gerar uma planta cultivada de C. melo compreendendo um genoma de C. melo e um cromossoma recombinante 6, pelo que o cromossoma recombinante 6 compreende um fragmento de introgressão da espécie Cucumis selvagem, que confere um fenótipo de resistência ao MYaV à planta cultivada de C. melo quando presente na forma homozigótica ou heterozigótica.
Em um aspecto, os inventores encontraram dois números de acesso silvestres adicionais, NCIMB41967 e NCIMB41968, que compreendem o QTL no cromossoma 6 e que compreendem o genótipo de resistência do marcador mME12135 e/ou mME15090, ou seja, o genoma da planta compreende pelo menos uma A (genótipo AA ou AG) no nucleotídeo 71 de SEQ ID NO: 3 e/ou pelo menos uma C (genótipo CC ou AC) no nucleotídeo 71 de SEQ ID NO: 1, respectivamente. Estes dois números de acesso silvestres também foram utilizados para fazer um melão cultivado (por retrocruzamento) compreendendo um fenótipo de resistência ao MYaV conferido por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 compreendendo o QTL de NCIMB41967 ou NCIMB41968, como indicado pela presença do genótipo de resistência do marcador MME12135 e/ou mME15090.
Outros números de acesso de melões silvestres e parentes silvestres do melão, como números de acesso obtidos a partir da coleção do Sistema Nacional de Germoplasma de Plantas do USDA ou outras coleções de sementes, podem ser triados quanto à resistência ao MYaV utilizando ensaios de marcador fenotípico e/ou MYaV e números de acesso resistentes podem ser cruzados com uma planta de Cucumis melo sem resistência ao MYaV. A geração F2 (ou outra geração, como a F3 ou uma geração de retrocruzamento) pode então ser triada para plantas recombinantes possuindo o fenótipo de resistência ao MYaV e/ou o fragmento de introgressão ou uma parte dele, utilizando os ensaios de marcadores moleculares aqui descritos.
Plantas, sementes e partes de planta de acordo com a invenção
Assim, em uma primeira modalidade uma planta de Cucumis melo cultivada que compreende resistência contra o Vírus Associado ao Amarelamento do Melão (MYaV) é fornecida.
A presença de um fenótipo de resistência ao MYaV pode ser determinada usando o ensaio de resistência ao MYaV, pelo qual as plantas são testadas quanto à resistência em condições de campo natural em uma ou mais áreas onde a incidência de MYaV é alta, como no nordeste do Brasil. As plantas de acordo com a invenção têm resistência ao MYaV se a sua pontuação média da doença, em uma escala de 9 = folhas totalmente verdes (no primeiro 1/3 da planta) a 1 = folhas totalmente amarelas (no primeiro 1/3 da planta ), é significativamente superior à pontuação média da doença de variedades susceptíveis a MYaV, quando cultivadas sob as mesmas condições ambientais. A pontuação média da doença dos meloeiros cultivados resistentes ao MYaV é, em uma modalidade, pelo menos 3, de preferência, pelo menos 4, em uma escala de 1 = folhas totalmente amarelas a 9 = folhas totalmente verdes, quando cultivadas no campo no nordeste Brasil, ou em qualquer outro campo onde a incidência de MYaV é alta. Em outra modalidade, a pontuação média da doença é pelo menos 5, 6, 7, 8 ou 9. Se a incidência de MYaV é alta pode ser ou visto devido aos severos sintomas de amarelamento (pontuação média da doença = 1) desenvolvidos nas plantas de controle susceptíveis, como as cultivares Sancho, Amaregal ou outros. Alternativa ou adicionalmente os níveis de vírus MYaV podem ser determinados no tecido do melão, por exemplo, usando anticorpos policlonais desenvolvidos para detecção de MYaV.
As pontuações médias da doença são de preferência, calculadas com base em pelo menos quatro plantas de uma linhagem ou variedade, de preferência, pelo menos 5, 10, 15, 20 ou mais plantas cultivadas sob as mesmas condições ambientais.
A resistência contra MYaV é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o fragmento de introgressão é derivado de um genoma de melão selvagem ou de um parente selvagem do melão. O fragmento de introgressão compreende o locus de traço quantitativo (QTL) aqui dito como MYaV6.1, cujo locus, por sua vez, compreende um alelo de resistência ao MYaV, ou um alelo de resistência ortológica MYaV, do gene de resistência ao MYaV.
Os meloeiros cultivados de acordo com a invenção têm assim um cromossoma recombinante 6 que compreende um fragmento de introgressão de um cromossoma 6 de melão selvagem ou um cromossoma 6 ortólogo de um parente selvagem do melão.
Como a resistência é dominante, o fenótipo de resistência é visto quando o alelo de resistência (e o SNP ligado ao alelo) está na forma heterozigótica ou homozigótica, os meloeiros cultivados de acordo com a invenção têm o fragmento de introgressão, ou a parte que confere resistência do mesmo, no cromossoma 6 na forma heterozigótica ou homozigótica.
Em um aspecto o fragmento de introgressão é identificável por pelo menos um marcador selecionado dentre: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 9), ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 (ou à SEQ ID NO: 9). b) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3 (ou SEQ ID NO: 10) ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 (ou à SEQ ID NO: 10).
Em um aspecto adicional, o fragmento de introgressão compreende o genótipo de resistência de pelo menos um ou ambos marcadores selecionados a partir dos marcadores comuns mME15090 e mME12135 e/ou qualquer melão selvagem ou parente selvagem do melão de marcador específico do genoma do melão entre os marcadores SNP d mME15090 e mME12135, e/ou dentro de 7cM ou dentro de 5cM de qualquer destes marcadores, e/ou dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb ou 1 Mb ou menos de qualquer um destes marcadores.
O fragmento de introgressão derivável de (ou derivado de) ou pode ser obtido de (ou obtido de ou como presente em) uma planta selvagem da espécie Cucumis melo, que compreende o MYaV QTL (MYaV6.1) no cromossoma 6. Alternativamente, o fragmento de introgressão é derivável de (ou derivado de) ou obtido a partir de (obtido de ou como presente em) um parente selvagem de Cucumis melo, que pode ser cruzado com Cucumis melo (opcionalmente usando resgate de embriões ou outras técnicas para auxiliar a produção da descendência viável), de modo que o fragmento do cromossoma 6 ortólogo possa ser introgredido no cromossoma 6 de C. melo, especialmente C. melo cultivado.
Em uma modalidade específica, o fragmento de introgressão compreendendo o locus de resistência ao MYaV é derivável de (ou derivado de) ou obtido de (ou obtido a partir de ou como presente em) plantas silvestres de C. melo, uma amostra representativa das sementes que foi depositada sob o número de acesso NCIMB 41966 ou NCIMB41969 ou NCIMB41967 ou NCIMB 41968, ou de outros números de acesso do melão selvagem ou parentes silvestres de melão. Em uma modalidade o fragmento de introgressão é identificável por um ou mais dos marcadores descritos aqui neste documento, especialmente a presença do genótipo de resistência dos marcadores mME12135 e/ou mME15090. Em um aspecto, o fragmento de introgressão é identificável pelo genótipo de resistência de pelo menos um ou ambos marcadores selecionados a partir dos marcadores comuns mME15090 e mME12135 e/ou qualquer melão selvagem ou parente selvagem do melão de marcador específico do genoma do melão entre os marcadores SNP d mME15090 e mME12135, e/ou dentro de 7cM ou dentro de 5cM de qualquer destes marcadores, e/ou dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb ou 1 Mb ou menos de qualquer um destes marcadores.
Em um aspecto, a invenção fornece uma planta de C. melo cultivada que compreende resistência contra MYaV, em que a resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 do melão, em que o dito fragmento de introgressão (conferindo a dita resistência ao MYaV) é obtido por (ou pode ser obtido por) cruzamento de uma planta selvagem de C. melo que compreende um ou mais marcadores aqui revelados (ligados ao QTL, especialmente marcador mME15090 e/ou mME12135) e que compreende um fenótipo de resistência ao MYaV com um meloeiro cultivado.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de C. melo cultivada que compreende resistência contra MYaV, em que a resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 do melão, em que o dito fragmento de introgressão (conferindo a dita resistência ao MYaV) é obtido por (ou pode ser obtido por) cruzamento de uma planta da qual as sementes foram depositadas sob o número de acesso NCIMB 41966 ou NCIMB41969 ou NCIMB 41967 ou NCIMB 41968 com um meloeiro cultivado. Esses números de acesso do C. melo tem um fenótipo de resistência ao MYaV, com uma pontuação média de doença de 9,0 (folhas permanecem verdes), em comparação com uma pontuação média de doença de abaixo de 2,0 ou abaixo de 1,5, para as variedades de melão suscetíveis, como Amaregal F1. O fragmento de introgressão também pode ser derivado de (ou obtido a partir de) outras plantas silvestres de C. melo ou outros parentes silvestres do melão, que têm uma pontuação média da doença MYaV de pelo menos 7, de preferência, pelo menos 8, mais preferencialmente 9, determinada no ensaio de resistência ao MYaV.
Em outra modalidade, a invenção se refere a uma planta da invenção, ou seja, uma planta de Cucumis melo cultivada compreendendo resistência contra o Vírus Associado ao Amarelamento de Melão (MYaV) em que a dita resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 na forma homozigótica ou heterozigótica e em que o dito fragmento de introgressão é de uma planta selvagem da espécie Cucumis melo em que o fragmento de introgressão é em um aspecto “como em”/é “idêntico a” /é “o mesmo que em” o fragmento que confere resistência ao MYaV no cromossoma 6 como presente em sementes depositadas sob números NCIMB 41967, NCIMB 41968, NCIMB 41966, NCIMB 41969, NCIMB 42113 ou NCIMB 42198. Como os números de acesso silvestres serão geneticamente divergentes, a sequência genética do fragmento de introgressão provavelmente não será idêntica, e mesmo o gene que confere resistência (compreendendo um promotor, íntrons e éxons) pode ser divergente na sequência nucleotídica, mas a função será a mesma, isto é, conferir resistência ao MYaV. A divergência também pode ser vista aqui, pelo fato de certos marcadores ligados ao MYaV6.1 QTL não serem “marcadores comuns” (como os marcadores comuns mME12135 e mME15090 que são encontrados em todos os 4 números de acesso), mas são específicos para o MYaV6.1 QTL como encontrado em um número de acesso específico. Assim, por exemplo (além dos marcadores comuns) foram encontrados marcadores mME21377, mME36533 e/ou mME13585 ligados ao QTL em NCIMB41969; marcadores mME40332, mME28908, mME9692 e/ou mME50656 foram encontrados ligados ao QTL no número de acesso NCIMB41966; marcadores mME21377 e/ou mME13585 foram encontrados ligados ao QTL em NCIMB41968 e NCIMB41967.
A pessoa versada na técnica é capaz de identificar e introgredir a região compreendendo QTL de MYaV6.1 que se encontra em outros acessos selvagens de melão ou outros parentes silvestres de melão no C. melo cultivado como será explicado mais adiante. O versado na técnica também é capaz de identificar outros marcadores moleculares ligados (associados ao) QTL, que podem ser utilizados para identificar a presença de um fragmento de introgressão de outros melões silvestres ou parentes silvestres do melão no cromossoma 6 de C. melo. Verificou-se que dois dos marcadores moleculares aqui fornecidos estavam associados com o QTL de resistência ao MYaV, em que o fragmento de introgressão foi obtido a partir de quatro fontes silvestres diferentes. Estes dois marcadores também podem estar ligados à (associados com) resistência ao MYaV no cromossoma 6 ou aos cromossomas ortólogos 6 e podem assim ser úteis para derivar o QTL de diferentes fontes. Alternativamente, o versado na técnica pode identificar outros marcadores moleculares utilizando métodos conhecidos.
Em uma modalidade a presença do fragmento de introgressão, ou a região do cromossoma 6 (ou região do cromossoma 6 ortóloga), compreendendo o locus de resistência ao MYaV, é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um, de preferência, ao menos os dois marcadores de Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) a seguir: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 9) ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 (ou à SEQ ID NO: 9). b) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3 (ou SEQ ID NO: 10) ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 (ou à SEQ ID NO: 10).
Em outro aspecto a presença do fragmento de introgressão, ou a região do cromossoma 6 (ou região do cromossoma 6 ortóloga), compreendendo o locus de resistência ao MYaV, é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um, de preferência, ao menos dois ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: marcador mME15090, marcador mME12135, qualquer melão selvagem ou marcador específico do genoma do parente selvagem do melão dentre os marcadores SNP mME15090 e mME12135, qualquer melão selvagem ou marcador específico do genoma do parente selvagem do melão dentro 7cM ou dentro de 5cM do mME15090 ou mME12135, qualquer melão selvagem ou marcador específico do genoma do parente selvagem do melão dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb ou 1 Mb ou menos de mME15090 ou mME12135.
Como mencionado, os dois marcadores SNP mME15090 e mME12135 foram encontrados por estarem geneticamente ligados a (ou associados com) o fragmento de introgressão no cromossoma 6 compreendendo o QTL MYaV6.1 em ambas as populações do mapeamento, ou seja, nas plantas compreendendo o QTL de resistência de dois números de acesso do melão selvagem diferentes e também em dois outros números de acesso do melão selvagem, isto é, NCIMB41967 e NCIMB41968 que foram resistentes ao MYaV. Esses dois marcadores são ditos como marcadores comuns, já que eles foram encontrados por estarem ligados ao QTL em quatro números de acesso.
Dessa forma, em uma modalidade as plantas resistentes ao MYaV de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma Citosina (C) (ou seja, o genótipo CC ou AC) ao invés de duas Adeninas (AA) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO:1 (ou SEQ ID NO:9) ou de uma sequência essencialmente similar que compreende pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 (ou a SEQ ID NO: 9) (referida como marcador SNP mME15090) e/ou elas compreendem pelo menos uma Adenina (A) (ou seja, genótipo de AA ou AG) em vez de duas Guaninas (GG) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO: 3 (ou SEQ ID NO: 10) ou de uma sequência essencialmente similar compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 (ou à SEQ ID NO: 10) (referido como marcador de SNP mME12135). O genótipo SNP se refere a dois nucleotídeos, e sequências genômicas compreendendo um destes dois nucleotídeos, um em cada cromossoma 6. Assim, uma planta com um genótipo CC para mME15090 tem um nucleotídeo idêntico (C) em ambos os cromossomas, enquanto uma planta com um genótipo AC para mME15090 tem um cromossoma com um A no nucleotídeo 71 de SEQ ID NO: 1 e um cromossoma com um C no nucleotídeo 71 de SEQ ID NO: 1. O “genótipo SNP resistente” se refere ao genótipo da planta ou parte de planta para o fabricante de SNP, pelo que o genótipo SNP é indicativo da presença da resistência (e fragmento de introgressão compreendendo o alelo de resistência), po exemplo, o genótipo SNP resistente para o marcador de SNP mME15090 é CC (homozigótico) ou AC (heterozigótico).
Em uma modalidade adicional, o fragmento de introgressão, ou a região do cromossoma 6 (ou região do cromossoma 6 ortóloga), compreendendo o locus de resistência ao MYaV, é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta ainda pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou todos os oito marcadores de Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo GG ou AG para o marcador de SNP mME40332 na SEQ ID NO: 2, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 b) o genótipo TT ou AT para o marcador de SNP mME28908 na SEQ ID NO: 4, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 c) o genótipo AA ou AT para o marcador de SNP mME9692 na SEQ ID NO: 6, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6 d) o genótipo CC ou CT para o marcador de SNP mME50656 na SEQ ID NO: 7, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:7 e) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME21377 na SEQ ID NO: 8, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:8 f) o genótipo TT ou GT para o marcador de SNP mME36533 na SEQ ID NO: 11, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:11 g) o genótipo TT ou CT para o marcador de SNP mME13585 na SEQ ID NO: 12, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12
Deste modo, em um aspecto, o meloeiro resistente ao MYaV de acordo com a invenção compreende ainda pelo menos uma Guanina (G) (isto é, o genótipo GG ou AG) em vez de duas Adeninas (AA) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 (referida como marcador SNP mME40332) e/ou pelo menos uma Timina (T) (ou seja, genótipo TT ou AT) em vez de duas Adeninas (AA) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO: 4 ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4 (referida como marcador SNP mME28908) e/ou pelo menos uma Adenina (A) (ou seja, genótipo de TT ou AT) em vez de duas Adeninas (AA) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO: 6 ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 (referida como marcador SNP mME9692) e/ou pelo menos uma Citosina (C) (ou seja, genótipo de CC ou CT) em vez de duas Timinas (TT) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO: 7 ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7 (referida como marcador SNP mME50656) e/ou pelo menos uma Adenina (A) (ou seja, genótipo de AA ou AG) em vez de duas Guaninas (GG) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO: 8 ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8 (referida como marcador SNP mME21377) e/ou pelo menos uma Timina (T) (ou seja, genótipo TT ou GT) em vez de duas Guaninas (GG) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO: 11 ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 11 (referida como marcador SNP mME36533) e/ou pelo menos uma Timina (T) (ou seja, genótipo TT ou CT) em vez de duas Citosinas (CC) no nucleotídeo 71 da SEQ ID NO: 12, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12 (referida como marcador de SNP mME13585).
Em um aspecto, o fragmento de introgressão, ou a região do cromossoma 6 (ou região do cromossoma 6 ortólogo) compreendendo o locus de resistência ao MYaV, que é detectável pelos um ou mais marcadores acima é a prtir de uma planta selvagem da espécie Cucumis melo e em um aspecto é a partir de uma planta da qual uma amostra representativa de sementes foi depositada sob os números de acesso NCIMB 41966, NCIMB 41969, NCIMB41967 ou NCIMB 41968, assim o QTL e a região do cromossoma 6 compreendendo o QTL está em um aspecto o QTL como encontrado em NCIMB 41966 ou em NCIMB 41969 ou em NCIMB41967 ou em NCIMB41968. Em um aspecto, o fragmento de introgressão, ou o cromossoma recombinante 6, é obtido atravessando uma planta cultivada a partir de sementes depositadas sob os números de acesso NCIMB 41966 ou NCIMB 41969 ou NCIMB 41967 ou NCIMB41968 com outro meloeiro, especialmente um meloeiro cultivado da espécie C Melo.
Deste modo, em um aspecto, o meloeiro resistente ao MYaV de acordo com a invenção compreende um fragmento de introgressão no cromossoma 6, que pode ser obtido a partir de sementes das quais uma amostra representativa foi depositada sob NCIMB 41966 e em que o dito fragmento de introgressão compreende pelo menos um, de preferência, pelo menos dois, opcionalmente pelo menos 3, 4, 5, 6 ou 7, marcadores SNP selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1; b) o genótipo GG ou AG para o marcador de SNP mME40332 na SEQ ID NO: 2; c) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3. d) o genótipo TT ou AT para o marcador de SNP mME28908 na SEQ ID NO: 4; e) o genótipo AA ou AT para o marcador de SNP mME9692 na SEQ ID NO: 6; f) o genótipo CC ou CT para o marcador de SNP mME50656 na SEQ ID NO: 7.
De preferência, o dito pelo menos um marcador é selecionado dentre mME21377 e/ou mME15090.
Em outro aspecto, o meloeiro resistente ao MYaV de acordo com a invenção compreende um fragmento de introgressão no cromossoma 6, que pode ser obtido a partir de sementes das quais uma amostra representativa foi depositada sob NCIMB 41969 e em que o dito fragmento de introgressão compreende pelo menos um, de preferência, pelo menos dois, opcionalmente pelo menos 3, 4 ou 5, marcadores SNP selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME21377 na SEQ ID NO: 8; b) o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 9; c) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 10; d) o genótipo TT ou GT para o marcador de SNP mME36533 na SEQ ID NO: 11; e) o genótipo TT ou CT para o marcador de SNP mME13585 na SEQ ID NO: 12.
De preferência, o dito pelo menos um marcador é selecionado dentre mME21377 e/ou mME15090.
Ainda em outro aspecto, o meloeiro resistente ao MYaV de acordo com a invenção compreende um fragmento de introgressão no cromossoma 6, que pode ser obtido a partir de sementes das quais uma amostra representativa foi depositada sob NCIMB 41968 e/ou NCIMB 41967 e em que o dito fragmento de introgressão compreende pelo menos um, de preferência, pelo menos dois, opcionalmente pelo menos 3 ou 4, marcadores SNP selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME21377 na SEQ ID NO: 8; b) o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 9; c) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 10; d) o genótipo TT ou CT para o marcador de SNP mME13585 na SEQ ID NO: 12.
De preferência, o dito pelo menos um marcador é selecionado dentre mME21377 e/ou mME15090.
Em um aspecto o fragmento de introgressão ou cromossoma 6, que é possível de ser obtido a partir de sementes das quais uma amostra representativa foi depositada sob NCIMB 41968 ou NCIMB41967, não comprometem o genotipo TT or GT na SEQ ID NO: 11. Ainda em um aspecto adicional, o fragmento de introgressão não compreende adicionalmente pelo menos um marcador SNP selecionado a partir do grupo que consiste em: - o genótipo GG ou AG para o marcador de SNP mME40332 na SEQ ID NO: 2; - o genótipo TT ou AT para o marcador de SNP mME28908 na SEQ ID NO: 4; - o genótipo AA ou AT para o marcador de SNP mME9692 na SEQ ID NO: 6; e - o genótipo CC ou CT para o marcador de SNP mME50656 na SEQ ID NO: 7.
Para obter o fragmento de introgressão das sementes depositadas, uma planta é cultivada a partir da semente e a planta é cruzada com uma planta C. melo suscetível para obter sementes F1. A semente híbrida F1 e as plantas cultivadas a partir daí, contêm um cromossoma 6 do precursor suscetível (sem QTL MYaV6.1) e um cromossoma 6 do precursor resistente ao MYaV selvagem. Para gerar eventos de recombinação entre estes dois cromossomas homólogos 6, a meiose precisa ocorrer e as plantas compreendendo os cromossomas recombinantes 6 precisam ser identificadas. Por exemplo, o F1 pode ser autofecundado para produzir plantas F2, e/ou plantas F2 resistentes ou plantas F3, etc., podem ser retrocruzadas com o precursor suscetível. As plantas que são resistentes ao MYaV podem ser triadas e selecionadas para a presença de um ou mais dos marcadores SNP acima para identificar plantas compreendendo um cromossoma recombinante 6, compreendendo um fragmento de introversão que confere resistência ao MYaV a partir das sementes depositadas.
De modo semelhante, os meloeiros cultivados compreendendo resistência contra MYaV, pelas quais a resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6, podem ser geradas e/ou identificadas utilizando diferentes métodos. Por exemplo, para se obter um meloeiro cultivado compreendendo um fragmento de introgressão que confere resistência ao MYaV de um melão selvagem ou um parente selvagem de melão, identifica-se primeiro um melão selvagem ou um parente selvagem do melão que tem um fenótipo de resistência MYaV e/ou que compreende um ou mais dos marcadores de SNP associados com a resistência ao MYaV aqui descritos, por exemplo, qualquer um, ou mais, ou todos os marcadores acima. Podem ser utilizados especialmente marcadores mME12135 e mME15090, ou qualquer marcador entre estes dois, ou dentro de 7 cM ou dentro de 5cM de qualquer destes marcadores (mas também outros marcadores ligados ao QTL podem ser utilizados). A planta identificada é cruzada com uma planta de C. melo suscetível para obter sementes F1.
A semente híbrida F1 e as plantas cultivadas a partir daí, contêm um cromossoma 6 do precursor suscetível (sem QTL MYaV6.1) e um cromossoma 6 do precursor resistente ao MYaV selvagem. Para gerar eventos de recombinação entre estes dois cromossomas homólogos 6, a meiose precisa ocorrer e as plantas compreendendo os cromossomas recombinantes 6 precisam ser identificadas. Por exemplo, o F1 pode ser autofecundado para produzir plantas F2, e/ou plantas F2 resistentes ou plantas F3, etc., podem ser retrocruzadas com o precursor suscetível. As plantas que são resistentes ao MYaV podem ser triadas e/ou selecionadas para a presença de um ou mais dos marcadores SNP e/ou triadas para, e/ou selecionadas para, a presença do fenótipo de resistência ao MYaV, para identificar plantas compreendendo um cromossoma recombinante 6, compreendendo um fragmento de introversão que confere resistência ao MYaV a partir do melão selvagem ou parente selvagem do melão. Alternativa ou adicionalmente, o mapeamento de QTL pode ser realizado para identificar outros marcadores moleculares ligados ao QTL MYaV6.1 e/ou para gerar plantas C. melo cultivadas compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6 que confere resistência ao MYaV.
Em uma modalidade a presença do fragmento de introgressão em um meloeiro cultivado, ou a região do cromossoma 6 (ou região do cromossoma 6 ortóloga), compreendendo o locus de resistência ao MYaV, é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 9) ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; b) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3 (ou SEQ ID NO: 10) ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3; c) qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre os marcadores de a) e b); d) qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão que geneticamente se ligou dentro de 7 cM do marcador mME15090 ou mME12135; e e) qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão que é fisicamente ligado dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb ou 1Mb do marcador mME15090 ou mME12135;
Em um aspecto, pelo menos um, dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais marcadores são detectados a partir dos marcadores de a), b) ou c) acima. Em outro aspecto, pelo menos um, dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais marcadores são detectados a partir dos marcadores de a), b), c), d) ou e) acima. Em uma modalidade pelo menos o marcador de a) e/ou b) é detectado e opcionalmente pelo menos um, dois, três ou mais marcadores de c), d) e/ou e) são detectados.
Qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador de a) e b) se refere a qualquer marcador molecular que mapeia geneticamente a região do cromossoma 6 entre o marcador mME15090 e mME12135 (ver Figura 1) e/ou que fique fisicamente entre o marcador mME15090 e mME12135, e que seja indicativo da região do cromossoma 6 do melão selvagem ou do parente selvagem do melão da região do cromossoma 6 do melão. Isto significa que o marcador é polimórfico entre o genoma do melão cultivado e o melão selvagem ou parente selvagem do genoma do melão. Em um aspecto, o marcador é um Polimorfismo de Nucleotídeo Único, mas também podem ser utilizados outros marcadores moleculares como RFLP, AFLP, RAPD, sequenciamento de DNA, etc.
Em outra modalidade a presença do fragmento de introgressão, ou a região do cromossoma 6 (ou região do cromossoma 6 ortóloga), compreendendo o locus de resistência ao MYaV, é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 9) ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1; b) o genótipo CC ou CT para o marcador de SNP mME50656 na SEQ ID NO: 7, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:7; e c) qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador de a) e b);
Em um aspecto, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais marcadores são detectados a partir dos marcadores de a), b) ou c) acima. Em uma modalidade pelo menos o marcador de a) e b) é detectado e opcionalmente pelo menos um, dois, três ou mais marcadores de c) são detectados.
Qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador de a) e b) se refere a qualquer marcador molecular que mapeia geneticamente a região do cromossoma 6 entre o marcador mME15090 e mME50656 (ver Figura 1) e/ou que fique fisicamente entre o marcador mME15090 e mME50656, e que seja indicativo da região do cromossoma 6 do melão selvagem ou do parente selvagem do melão da região do cromossoma 6 do melão. Isto significa que o marcador é polimórfico entre o genoma do melão cultivado e o melão selvagem ou parente selvagem do genoma do melão. Em um aspecto, o marcador é um Polimorfismo de Nucleotídeo Único, mas também podem ser utilizados outros marcadores moleculares como RFLP, AFLP, RAPD, sequenciamento de DNA, etc.
Em um aspecto os marcadores entre o marcador mME5090 e mME50656 são um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo: o genótipo GG ou AG para o marcador de SNP mME40332 na SEQ ID NO: 2, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; o genótipo TT ou AT para o marcador de SNP mME28908 na SEQ ID NO: 4, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 e o genótipo AA ou AT para o marcador SNP mME9692 na SEQ ID NO: 6, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6
Ainda em outra modalidade a presença do fragmento de introgressão, ou a região do cromossoma 6 (ou região do cromossoma 6 ortóloga), compreendendo o locus de resistência ao MYaV, é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME21377 na SEQ ID NO: 8, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:8 b) o genótipo TT ou CT para o marcador de SNP mME13585 na SEQ ID NO: 12, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12; e c) qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador de a) e b);
Em um aspecto, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais marcadores são detectados a partir dos marcadores de a), b) ou c) acima. Em uma modalidade pelo menos o marcador de a) e b) é detectado e opcionalmente pelo menos um, dois, três ou mais marcadores de c) são detectados.
Qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador de a) e b) se refere a qualquer marcador molecular que mapeia geneticamente a região do cromossoma 6 entre o marcador mME21377 e mME13585 (ver Figura 1) e/ou que fique fisicamente entre o marcador mME21377 e mME13585, e que seja indicativo da região do cromossoma 6 do melão selvagem ou do parente selvagem do melão da região do cromossoma 6 do melão. Isto significa que o marcador é polimórfico entre o genoma do melão cultivado e o melão selvagem ou parente selvagem do genoma do melão. Em um aspecto, o marcador é um Polimorfismo de Nucleotídeo Único, mas também podem ser utilizados outros marcadores moleculares como marcadores RFLP, AFLP, RAPD, CASP, sequenciamento de DNA, etc.
Em um aspecto os marcadores entre o marcador mME21377 e mME13585 são um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo: - o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 9, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:9; o genótipo AA ou AG para o marcador SNP mME12135 na SEQ ID NO: 10, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:10 e o genótipo TT ou GT para o marcador SNP mME36533 na SEQ ID NO: 11, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:11
Ainda em outra modalidade a presença do fragmento de introgressão, ou a região do cromossoma 6 (ou região do cromossoma 6 ortóloga), compreendendo o locus de resistência ao MYaV, é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME21377 na SEQ ID NO: 8, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:8 b) o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3; e c) qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador de a) e b);
Em um aspecto, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais marcadores são detectados a partir dos marcadores de a), b) ou c) acima. Em uma modalidade pelo menos o marcador de a) e b) é detectado e opcionalmente pelo menos um, dois, três ou mais marcadores de c) são detectados.
Qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador de a) e b) se refere a qualquer marcador molecular que mapeia geneticamente a região do cromossoma 6 entre o marcador mME21377 e mME12135 (ver Figura 1) e/ou que fique fisicamente entre o marcador mME21377 e mME12135, e que seja indicativo da região do cromossoma 6 do melão selvagem ou do parente selvagem do melão da região do cromossoma 6 do melão. Isto significa que o marcador é polimórfico entre o genoma do melão cultivado e o melão selvagem ou parente selvagem do genoma do melão. Em um aspecto, o marcador é um Polimorfismo de Nucleotídeo Único, mas também podem ser utilizados outros marcadores moleculares como marcadores RFLP, AFLP, RAPD, CASP, sequenciamento de DNA, etc.
Dessa forma, é fornecida aqui uma planta Cucumis melo cultivada compreendendo resistência contra o vírus associado ao “amarelamento do meloeira” (Melon Yellowing associated Virus) (MYaV), sendo que a dita resistência é conferida por um fragmento de introgressão no cromossoma 6 na forma homozigota ou heterozigota e sendo que o fragmento de introgressão é de um identificador de sequência selvagem das espécies Cucumis melo, uma amostra representativa das sementes do dito identificador de sequência selvagem foi depositada sob o número de identificador de sequência NCIMB 41967 e NCIMB41968.
A planta acima tem uma pontuação média da doença de MYaV de pelo menos 3 em uma escala de 1 = folhas totalmente amarelas a 9 = folhas totalmente verdes quando cultivadas em uma área infestada com MYaV, como no campo no nordeste do Brasil.
Na planta o dito fragmento de introgressão é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo Único mME15090 na SEQ ID NO: 1; b) o genótipo AA ou AG para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo Único mME12135 na SEQ ID NO: 3; c) qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador mME15090 e mME12135; d) qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão dentro de 1 cM de mME15090 ou mME12135; e e) qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão dentro de 5 Mb, 3 Mb, 2 Mb ou 1 Mb ou menos de mME15090 ou mME12135.
Em outro aspecto, na planta o dito fragmento de introgressão é detectável por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo Único mME15090 na SEQ ID NO: 1; b) o genótipo AA ou AG para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo Único mME12135 na SEQ ID NO: 3; c) o genótipo AA ou AG para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo Único mME21377 na SEQ ID NO: 8; e d) o genótipo TT ou CT para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo Único mME13585 na SEQ ID NO: 12.
Em um aspecto específico o dito fragmento de introgressão é detectável na planta por um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um dos marcadores de Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo Único mME15090 na SEQ ID NO: 1; e b) o genótipo AA ou AG para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo Único mME12135 na SEQ ID NO: 3;
Em um aspecto a planta de acordo com a invenção não compreende os seguintes marcadores de Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP): a) o genótipo TT ou GT para o marcador de SNP mME36533 na SEQ ID NO: 11; e b) pelo menos um marcador selecionado a partir do grupo que consiste em: - o genótipo GG ou AG para o marcador de SNP mME40332 na SEQ ID NO: 2; - o genótipo TT ou AT para o marcador de SNP mME28908 na SEQ ID NO: 4; - o genótipo AA ou AT para o marcador de SNP mME9692 na SEQ ID NO: 6; e - o genótipo CC ou CT para o marcador de SNP mME50656 na SEQ ID NO: 7.
O fragmento de introgressão nas plantas da invenção é em um aspecto um fragmento do cromossoma 6 que está presente em sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB41967 ou NCIMB41968.
A planta pode ser um híbrido F1.
O fragmento de introgressão é em um aspecto igual ou inferior a 10 Mb em tamanho, de preferência, igual ou inferior a 8 Mb.
Também são fornecidas sementes a partir das quais uma planta da invenção pode ser cultivada, como são as frutas melão colhidas a partir de uma planta da invenção e compreendendo o cromossoma recombinante 6 em seus genomas. De modo similar, uma célula de planta, tecido ou parte de planta de uma planta ou de uma semente é fornecida compreendendo pelo menos um cromossoma recombinante 6, em que o dito cromossoma recombinante 6 compreende um fragmento de introgressão de uma planta selvagem C. melo e em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo que confere resistência a MYaV.
Os marcadores moleculares descritos aqui podem ser detectados de acordo com o método padronizado. Por exemplo, marcadores SNP podem facilmente ser detectados usando um ensaio KASP (ver www.kpbioscience.co.uk) ou outros ensaios. Um ensaio KASP foi desenvolvido para um número de SNPs no Exemplo 3. Para desenvolver o ensaio KASP 70 pares de base a montante e 70 pares de base a jusante do SNP foram selecionados e dois primers diretos específicos do alelo e um primer reverso específico do alelo foi concebido. Veja, por exemplo, Allen et al. 2011, Plant Biotechnology J. 9, 1086-1099, especialmente p097-1098 para método de ensaio de KASP.
Deste modo, em um aspecto, os marcadores SNP e a presença/ausência do marcador associado ao alelo de resistência ao MYaV são determinados utilizando um ensaio KASP, mas também outros ensaios podem ser utilizados. Por exemplo, pode opcionalmente ser utilizado o sequenciamento de DNA.
O mapeamento físico utilizando BACs (Cromossomas Artificiais Bacterianos) e o desenvolvimento de marcadores para os BACs podem ser realizados para mapear a localização física de MYaV6.1 no cromossoma 6 e para desenvolver marcadores que ficam fisicamente entre qualquer dos marcadores mencionados e para determinar distâncias físicas entre os marcadores e/ou determinar o tamanho da introgressão.
O tamanho de um fragmento de introgressão pode, por exemplo, também ser determinado pela visualização da introgressão utilizando imagens de hibridização in situ fluorescentes (FISH) (Verlaan et al. 2011, Plant Journal 68: 1093-1103).
Em uma modalidade da invenção, o fragmento de introgressão que confere resistência ao MYaV é igual ou inferior a 10 Mb em tamanho, de preferência, igual ou inferior a 8 Mb, igual ou inferior a 7, 6, 5, 4, 3 , 2 ou 1 Mb, mais preferencialmente ainda menor, como igual ou inferior a 500kb, 400kb, 300kb, 200kb, 100kb, 50kb, 25kb, 20kb, 15kb ou menos, mas ainda compreende o alelo de resistência ao MYaV ou ortólogos) e ainda confere resistência ao MYaV a uma planta de C. melo, de outro modo suscetível. A resistência é conferida pelo cromossoma recombinante 6 e o fragmento de introgressão que compreende o alelo MYaV quando o fragmento de introgressão está na forma heterozigótica ou homozigótica. As plantas com fragmentos de introgressão menores no cromossoma 6 podem ser geradas gerando novas plantas recombinantes a partir de uma população de plantas derivadas de um cruzamento entre uma planta suscetível cultivada MYaV e um melão resistente ao MYaV selvagem ou um parente do melão. Alternativamente, quando uma planta de C. melo cultivada com um fragmento de introgressão que confere resistência ao MYaV é identificada, o tamanho da introgressão pode ser reduzido, por exemplo, pela autofecundação daquela planta e seleção de progênia recombinante com tamanhos de introgressão menores.
No tomate, por exemplo, o fragmento de introgressão de S. chilense grandes no cromossoma 6 (cerca de 27cM) que compreende o alelo Ty-3 foi reduzido pela seleção de uma linha de progênia recombinante (LA1931-AL-F2), que compreende um fragmento de introgressão de S. chilense muito menor (cerca de 6 cM) compreendendo Ty-3 (ver Ji et al. 2007, Mol. Breeding 20: 271-284 ).
O meloeiro cultivado de acordo com a invenção pode ser uma linha endogâmica, uma OP (variedade polinizada aberta) ou um híbrido F1. Em um aspecto, o híbrido F1 compreende o fragmento de introgressão na forma heterozigótica, isto é, produzido pelo cruzamento de duas linhas parentais endogâmicas, uma das quais possui o fragmento de introgressão (preferencialmente na forma homozigótica, embora não necessariamente) e colheira das sementes híbridas F1 do dito cruzamento. O híbrido F1 também pode compreender o fragmento de introgressão na forma homozigótica, isto é, produzido atravessando duas linhas parentais endogâmicas, compreendendo cada uma o fragmento de introgressão na forma homozigótica ou heterozigótica.
O meloeiro cultivado pode ser de qualquer tipo. De preferência, ela tem boas características agronômicas e boa qualidade da fruta, como tamanho médio do fruto grande (pelo menos 500g, 600g, 700g, 800g, 900g, 1000g ou mais), brix médio elevado dos frutos (por exemplo, uma % de sólidos solúveis totais de refratômetro médio de pelo menos 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 % ou mais), muitos frutos sendo produzidos por planta, polpa de fruta firme, etc. O melão cultivado pode ser um C. melo cantalupensis, C. melo inodoro e C. melo reticulatus. C. melo cantalupensis também são ditos como melão Cantaloupe e são principalmente de formato redondo com nervuras proeminentes e quase nenhuma reticulação. A maioria tem carne laranja, doce e eles são geralmente muito perfumados. Em contraste com o cantaloupe europeu, o “Cantaloupe” norte-americano não é deste tipo, mas pertence aos verdadeiros melões almiscarados. C. melo inodorous (ou melões de inverno) podem ser subdivididos em diferentes tipos, como o melão Honeydew, pele-de-spo, melão açúcar, melão japonês, etc. C. melo reticulatus é o verdadeiro melão almiscarado, com pele reticulada (com rede) e inclui Melões Gália, melões Sharlyn e o melão norte-americano. Melões vêm em muitos tamanhos e formas, incluindo redondo, oval e cilíndrico. A carne é geralmente laranja e muito doce, mas algumas variedades de melão e, especificamente, os melões persas, podem ter carne verde ou branca. Alguns melões de pele verde são bastante doces, mas a maioria dos melões de carne verde e branca têm um sabor menos doce, mas muito refrescante.
Também podem ser introduzidas outras resistências nos meloeiros da invenção, como resistência a uma ou mais das seguintes doenças: Murcha-bacteriana, Podridão das Raízes, Crown Blight, Melon Rust, Oídio (Powdery Mildew), verticiliose (Verticillum Wilt), Queimadura por Enxofre, Sarna, vírus do mosaico da melancia (Watermelon Mosaic), oídio (Downy Mildew), Fusarium oxysporum f.sp. melonis (Fom) raça 0, Fusarium oxysporum f.sp. melonis (Fom) raça 1, Fusarium oxysporum f.sp. melonis (Fom) raça 2, Fusarium oxysporum f.sp. melonis (Fom) raça 1.2, fusariose (Fusarium Wilt) R2, nemátodos dos nódulos radiculares, Anthracnose, vírus do mosaico do pepino (Cucumber Mosiac), e vírus do mosaico da abóbora (Squash Mosaic), e/ou resistência a uma ou mais das seguintes pestes: resistência ao Afídeo, minhoca (Pickle Worm), besouro (Darkling Ground Beetle), besouro manchado do pepino (Banded Cucumber Beetle), Ácaro, besouro (Western Spotted Cucumber Beetle), cigarrinha do melão, larva do melão (Melon Worm), besouro (Western Striped Cucumber Beetle) ou mosca minadora do melão (Melon Leafminer). Também podem ser introduzidos outros genes de resistência, contra vírus patogênicos, fungos, bactérias ou pragas.
Em um aspecto, são fornecidas sementes a partir das quais as plantas da invenção podem ser cultivadas. Em um aspecto as sementes são sementes híbridas F1, que compreendem o cromossoma recombinante 6 na forma homozigótica ou heterozigótica e que têm um fenótipo de resistência ao MYaV quando cultivadas no campo.
Também são aqui fornecidos recipientes e embalagens contendo ou compreendendo sementes a partir das quais as plantas da invenção podem ser cultivadas. Estes podem ser rotulados como contendo sementes de melão cultivadas com resistência ao MYaV.
Também são fornecidas sementes de progênia e plantas de progênia de plantas da invenção que retêm a resistência ao MYaV conferindo introgressão ao cromossoma 6, ou uma introgressão menor, isto é, uma parte que confere resistência do fragmento de introgressão. A progênia pode ser qualquer geração obtida por autofecundação de um meloeiro de acordo com a invenção e/ou cruzamento de um meloeiro de acordo com a invenção com outro meloeiro uma ou mais vezes. A progênia é, portanto, a geração (sementes) produzida a partir do primeiro cruzamento (F1) ou autofecundação (S1), ou qualquer outra geração produzida por cruzamento e/ou autofecundação (F2, F3, etc.) e/ou retrocruzamento, BC2, etc.) uma ou mais plantas selecionadas da geração F1 e/ou S1 e/ou BC1 (ou plantas de qualquer outra geração, por exemplo, a F2) com outro meloeiro (e/ou com um parente selvagem de melão). A progênia é de preferência, selecionada para reter o cromossoma recombinante 6 compreendendo o fragmento de introgressão a partir de melão selvagem ou de um parente selvagem do melão. Assim, a progênia também tem o fenótipo de resistência ao MYaV, de preferência, o mesmo nível de resistência ao MYaV que a planta utilizada no cruzamento inicial ou autofecundação. A presença de (ou retenção) do fragmento de introgressão compreendendo o QTL MYaV6.1 pode ser determinada no ensaio de resistência ao MYaV, fenotipicamente e/ou no(s) ensaio(s) de marcador molecular aqui descrito. Em relação à avaliação fenotípica, é claro que é necessário considerar a dominância do alelo MYaV.
Em um aspecto adicional, são fornecidas partes dos meloeiros de acordo com a invenção. As partes incluem, por exemplo, células e culturas de células, culturas de tecidos, tecidos de plantas vegetais (folhas, raízes, etc.), flores, pólen, embriões, frutos, partes de frutos, etc. As partes de plantas compreendem o fragmento de introgressão no cromossoma 6, como descrito, e como pode ser detectado utilizando um ou mais dos ensaios de marcador MYaV descritos. Além disso, quando plantas inteiras são regeneradas a partir de tais partes de melão, como células, culturas de células ou de tecidos, as plantas regeneradas compreendem o cromossoma recombinante 6 e o fenótipo de resistência ao MYaV.
Dessa forma, também é fornecida uma célula de planta, tecido ou parte de planta de uma planta ou de uma semente de acordo com a invenção compreendendo pelo menos um cromossoma recombinante 6, em que o dito cromossoma recombinante 6 compreende um fragmento de introgressão de uma planta selvagem C. melo e em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo que confere resistência a MYaV.
Também as culturas de células in vitro e as culturas de tecidos in vitro são aqui englobadas, de células ou tecidos compreendendo um cromossoma recombinante 6 descrito. De preferência, as células ou tecidos podem ser regenerados em um meloeiro inteiro, isto é, as células são células regeneráveis e os tecidos compreendem células regeneráveis. Assim, também as propagações vegetativas das plantas de acordo com a invenção são uma modalidade aqui. Assim, é fornecida um meloeiro cultivado de propagação vegetativa que compreende o fenótipo de resistência ao MYaV e um cromossoma recombinante 6 como aqui descrito.
Em um aspecto específico, é fornecida uma fruta de melão colhida a partir de uma planta de acordo com a invenção. Os frutos de melão comercializáveis são geralmente classificados por tamanho e qualidade após a colheita. Também são fornecidos recipientes ou embalagens compreendendo ou consistindo em frutos de melão colhidos. Mais uma vez, as células dos frutos são distinguíveis de outros melões pela presença do cromossoma recombinante 6 (como determinável em um ou mais dos ensaios de marcadores moleculares e/ou em um ensaio de resistência ao MYaV, por exemplo, cultivando as sementes presentes nos frutos, ou progênia obtida por autofecundação das plantas cultivadas a partir das sementes).
A invenção também fornece um produto alimentar ou alimento que compreende ou consiste em uma parte de planta aqui descrita preferencialmente um fruto de melão ou parte dele e/ou um extrato de uma parte de planta aqui descrita. O alimento ou produto alimentar pode ser fresco ou processado, por exemplo, enlatados, cozidos no vapor, cozidos, fritos, escaldados e/ou congelados. Por exemplo, recipientes como latas, caixas, engradados, sacos, caixas de papelão, Embalagens de Atmosfera Modificada, filmes (por exemplo, filmes biodegradáveis), etc., compreendendo partes das plantas como frutas ou partes da fruta (frescas e/ou processadas) aqui descritas.
Métodos e usos de acordo com a invenção
Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método de produção de um novo meloeiro cultivado que compreende um fragmento de introgressão que confere resistência ao MYaV quando na forma homozigótica ou heterozigótica, como descrito. O método compreende cruzar uma planta da invenção, ou uma planta de sua progênia, quer como precursor macho ou fêmea, com um segundo meloeiro (ou um parente selvagem do melão) uma ou mais vezes, e/ou autofecundar um meloeiro de acordo com a invenção, ou uma progênia da mesma, uma ou mais vezes, e selecionar a progênia a partir do dito cruzamento e/ou autofecundação. O primeiro e/ou o segundo meloeiro podem ser, por exemplo, uma linhagem ou variedade das espécies C. melo cantalupensis, C. melo inodorous ou C. melo reticulatus.
Assim, é fornecido um método para transferir o cromossoma recombinante 6, compreendendo o locus conferidor de resistência ao MYaV (MYaV6.1), de um meloeiro (cultivada) para outro meloeiro (cultivada), especialmente em variedades suscetíveis ao MYaV ou linhagens de reprodução.
O método compreende as etapas de: a) fornecer um primeiro meloeiro compreendendo pelo menos um cromossoma recombinante 6 possuindo um fragmento de introgressão compreendendo um alelo que confere resistência ao MYaV na forma homozigótica, b) fornecer um segundo meloeiro, especialmente um meloeiro suscetível ao MYaV, c) cruzar o dito meloeiro de a) com o dito meloeiro de b), d) colher de sementes híbridas F1 a partir do dito cruzamento e opcionalmente e) autofecundar a planta cultivada a partir das ditas sementes híbridas F1 para produzir sementes F2 e opcionalmente selecionar as sementes F2 possuindo o cromossoma recombinante 6 e opcionalmente f) cruzar ainda com plantas cultivadas a partir das ditas sementes F2 para produzir um meloeiro com boas características agronômicas e compreendendo o fragmento de introgressão na forma homozigótica ou heterozigótica. A presença ou ausência do cromossoma recombinante 6 e do fragmento de introgressão pode ser determinada por um ou mais dos ensaios de marcadores moleculares aqui descritos e/ou por ensaios de resistência ao MYaV. O cruzamento adicional na fase f) pode compreender autofecundação, cruzamento, produção de haploides duplos, retrocruzamento, etc. As plantas e sementes que podem ser obtidas pelo método acima são incluídas aqui.
Também é fornecido um método de produção de plantas híbridas C. melo F1 compreendendo um fenótipo de resistência ao MYaV, o dito método compreendendo: a) fornecer um primeiro meloeiro endogâmico compreendendo pelo menos um cromossoma recombinante 6 possuindo um fragmento de introgressão compreendendo um alelo que confere resistência ao MYaV, b) fornecer um segundo meloeiro endogâmico com ou sem o cromossoma recombinante 6 possuindo um fragmento de introgressão compreendendo um alelo que confere resistência ao MYaV, c) cruzar o dito meloeiro de a) com o dito meloeiro de b), d) colher de sementes híbridas F1 a partir do dito cruzamento.
O meloeiro endogâmico de a) e b) pode ser homozigótico e/ou heterozigótico para o fragmento de introgressão, podendo conter fragmentos de introgressão de diferentes tamanhos e/ou de origem diferente, isto é, de diferentes melões silvestres ou parentes silvestres de melão. Assim, por exemplo, o fragmento de introgressão em a) pode ser o mesmo ou um fragmento de introgressão diferente do que em b). Por exemplo, em a) pode ser de qualquer um dos quatro números de acesso selvagem aqui revelados (NCIMB 41966, NCIMB41969, NCIMB41967, NCIMB41968) e em b) pode ser de qualquer dos outros três números de acesso aqui revelados ou de qualquer outra fonte selvagem.
As sementes híbridas F1 preferencialmente compreendem pelo menos um cromossoma recombinante 6 e as plantas F1 produzidas a partir das sementes são, portanto, resistentes ao MYaV no seu fenótipo.
A presença ou ausência do cromossoma recombinante 6 e do fragmento de introgressão pode ser determinada por um ou mais dos ensaios de marcadores moleculares aqui descritos e/ou por ensaios de resistência ao MYaV. As plantas e sementes que podem ser obtidas pelo método acima estão aqui incluídas.
Em um aspecto diferente um método para produzir uma planta C. melo cultivada compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência a MYaV, é fornecido, o dito método compreendendo as etapas: a) fornecer um primeiro meloeiro cultivada susceptível a MYaV, b) fornecer um segundo meloeiro selvagem sendo resistente ao MYaV, c) cruzar o dito meloeiro de a) com o dito meloeiro de b), d) colheita de sementes F1 a partir do dito cruzamento e retrocruzamento de uma planta F1 para o meloeiro de a) para produzir uma população de retrocruzamento (BC1), ou autofecundação das ditas plantas F1 uma ou mais vezes para produzir uma população autofecundante de geração F2 ou F3 ou superior, e) opcionalmente retrocruzar uma planta de d) uma ou mais vezes com o meloeiro de a) para produzir uma população de retrocruzamento de geração superior, e f) identificar uma autofecundação de F2, F3 ou de geração superior, ou planta de retrocruzamento BC1 ou de geração superior que compreende uma introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência ao MYaV.
Quando se refere às populações de retrocruzamento no método, as populações de retrocruzamento também podem ser autofecundadas, isto é, BC1S1, BC1S2, BC2S1, BC2S2 ou outras.
Em uma ou mais das etapas b) a f) pode ser testada a presença do alelo de resistência ao MYaV (ou o fragmento de introgressão ou a região do cromossoma 6 selvagem compreendendo o alelo) (e as plantas podem ser selecionadas) realizando um ensaio de marcador molecular como aqui descrito em outra parte, por exemplo determinando se a planta compreende o genótipo CC ou AC para o marcador SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 (ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1) e/ou o genótipo AA ou AG para o marcador SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3 ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e/ou o qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador mME15090 e mME12135.
Com o uso deste método, pode-se gerar e/ou selecionar novos meloeiros cultivados que compreendem uma introgressão com QTL MYaV6.1 a partir de uma fonte selvagem, como um melão selvagem ou parente selvagem do melão (como de NCIMB 41966 ou NCIMB 41969 ou NCIMB41967 ou NCIMB41968 ou outros melões silvestres ou parentes silvestres do melão).
Em um aspecto, o método para produzir uma planta C. melo cultivada compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência a MYaV, compreende as etapas: a) fornecer um primeiro meloeiro cultivada susceptível a MYaV, b) fornecer um segundo meloeiro selvagem sendo resistente ao MYaV, c) cruzar o dito meloeiro de a) com o dito meloeiro de b), d) colheira de sementes F1 a partir do dito cruzamento e retrocruzamento de uma planta F1 para o meloeiro de a) para produzir uma população de retrocruzamento (BC1), ou autofecundação das ditas plantas F1 uma ou mais vezes para produzir uma população F2 ou F3, e) opcionalmente autofecundar a população de retrocruzamento para produzir, por exemplo, uma população BC1S1 ou BC1S2, f) identificar uma planta F2, F3, BC1, BC1S1 ou BC1S2 que compreende o genótipo CC ou AC para o marcador SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 e/ou o genótipo AA ou AG para o marcador SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3 ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e/ou o qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador mME15090 e mME12135.
Também é fornecido um método para identificar um meloeiro selvagem que compreende resistência ao MYaV no cromossoma 6, o dito método compreendendo: a) fornecer um número de acesso do melão selvagem ou vários números de acesso do melão selvagem; b) triar o dito identificador(es) de sequência utilizando um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um marcador de SNP selecionado a partir do grupo que consiste em: marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 e/ou marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3; e c) identificar e/ou selecionar um meloeiro selvagem compreendendo pelo menos o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 e/ou o genótipo AA ou AG para o marcador SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3 ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e/ou o qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador mME15090 e mME12135; e opcionalmente d) confirmar a resistência ao MYaV em um ensaio de resistência ao MYaV; e opcionalmente e) introgredir a dita resistência ao MYaV a partir do dito acesso selvagem no melão cultivado.
Na etapa c) também outros testes de marcador molecular descritos em outro lugar aqui podem ser usados. Com este método uma pessoa pode, dessa forma, triar os números de acesso do melão selvagem ou parentes silvestres do melão para a presença de um ou mais marcadores e, dessa forma, a presença de QTL MYaV6.1 e introgredir a parte que confere resistência destas novas fontes de resistência nos meloeiros suscetíveis ao MYaV cultivadas. As plantas e sementes obtidas por este método também são uma modalidade da invenção.
Ainda em outro aspecto, o método para identificar uma planta C. melo cultivada compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência ao MYaV, é fornecido, o dito método compreendendo: a) fornecer uma população de plantas C. melo recombinantes, cultivadas (como uma população de autofecundação F2, F3 ou de geração superior, população de retrocruzamento de BC1, BC2, BC1S1 ou geração superior), b) triar a dita população utilizando um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um marcador de SNP selecionado a partir do grupo que consiste em: marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 e/ou marcador SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 e/ou qualquer melão selvagem ou relativo a selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador mME15090 e mME12135; e c) identificar e/ou selecionar uma planta compreendendo pelo menos o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 e/ou o genótipo AA ou AG para o marcador SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3 ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e/ou o qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador mME15090 e mME12135.
Neste método também outros testes de marcador molecular descritos em outro lugar aqui podem ser usados. Dessa forma, usando este método uma pessoa pode detectar a presença de um fragmento de introgressão no cromossoma 6 compreendendo QTL MYaV6.1 em meloeiros cultivados ou partes da planta.
Ainda em outro aspecto, um método para detectar se uma planta C. melo cultivada compreende um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência ao MYaV, é fornecido, o dito método compreendendo: a) fornecer a planta C. melo cultivada, b) triar a dita planta utilizando um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um marcador de SNP selecionado a partir do grupo que consiste em: marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1, ou em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 e/ou marcador SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3 ou um em uma sequência compreendendo pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e/ou o qualquer melão selvagem ou parente selvagem do marcador específico do genoma do melão entre o marcador mME15090 e mME12135.
A triagem de marcador molecular envolve obviamente obter material da planta e analisar o DNA genômico do material para o genótipo de marcador.
Neste método também outros testes de marcador molecular descritos em outro lugar aqui podem ser usados. Dessa forma, usando este método uma pessoa pode detectar a presença de um fragmento de introgressão no cromossoma 6 compreendendo QTL MYaV6.1 em meloeiros cultivados ou partes da planta. Se um ou mais marcadores que são ligados ao QTL estão presentes, uma pessoa pode concluir que a planta compreende um fragmento de introgressão que confere resistência ao MYaV no cromossoma 6.
Também englobado aqui está o método para produzir uma planta C. melo cultivada compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência ao MYaV, compreendendo: a) fornecer um primeiro meloeiro cultivada susceptível a MYaV, b) fornecer um segundo meloeiro selvagem que seja resistente ao MYaV, selecionada a partir de plantas cultivadas a partir de sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB41967, NCIMB41968 ou progênia resistente ao MYaV de qualquer um destes; c) cruzar o dito meloeiro de a) com o dito meloeiro de b), d) colher sementes F1 a partir do dito cruzamento e opcionalmente autofecundar as ditas plantas F1 uma ou mais vezes para produzir um F2 ou F3 ou outra população autofecundante, e) opcionalmente retrocruzar a planta de F1 ou uma F2 ou F3 ou outra planta autofecundante com o meloeiro de a) para produzir uma população de retrocruzamento, f) opcionalmente autofecundar a população de retrocruzamento uma ou mais vezes, g) identificar uma F2, F3, planta autofecundante ou de retrocruzamento adicional que compreende o genótipo CC ou AC para o marcador SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 e/ou o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3.
Em outro aspecto, um método para identificar uma planta C. melo cultivada compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6 é fornecido, sendo que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência ao MYaV e sendo que o dito fragmento de introgressão é um fragmento do cromossoma 6 como encontrado em NCIMB41967 ou NCIMB41968, compreendendo: a) fornecer uma população de plantas C. melo recombinantes, cultivadas (como uma população F2, F3, BC1, BC2, BC1S1), b) triar a dita população utilizando um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um marcador de SNP selecionado a partir do grupo que consiste em: marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 e marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3; e c) identificar e/ou selecionar uma planta compreendendo pelo menos o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 e/ou o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3.
Em um aspecto adicional um método de produção de plantas híbridas C. melo F1 compreendendo um fenótipo de resistência ao MYaV é fornecido compreendendo: a) fornecer um primeiro meloeiro endogâmico compreendendo pelo menos um cromossoma recombinante 6 possuindo um fragmento de introgressão compreendendo um alelo que confere resistência ao MYaV, em que o dito fragmento de introgressão é de NCIMB41967, NCIMB41968 ou progênia resistente ao MYaV de qualquer um destes, b) fornecer um segundo meloeiro endogâmico com ou sem o cromossoma recombinante 6 possuindo um fragmento de introgressão compreendendo um alelo que confere resistência ao MYaV, c) cruzar o dito meloeiro de a) com o dito meloeiro de b), d) colher de sementes híbridas F1 a partir do dito cruzamento.
Em outro aspecto, um método para gerar progênia resistente ao MYaV de NCIMB41967 ou NCIMB41968, o dito método compreendendo: a) cultivar uma planta a partir das sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB41967 ou NCIMB41968; b) autofecundar a dita planta uma ou mais vezes ou cruzar a dita planta uma ou mais vezes com outro meloeiro para gerar sementes de progênia; c) triar as ditas sementes de progênia ou plantas cultivadas a partir das ditas sementes ou partes das sementes ou plantas utilizando um ensaio de marcador molecular que detecta pelo menos um marcador SNP selecionado a partir do grupo que consiste em: marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 e marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3; e d) identificar e/ou selecionar uma planta de progênia compreendendo pelo menos o genótipo CC ou AC para o marcador de SNP mME15090 na SEQ ID NO: 1 e/ou o genótipo AA ou AG para o marcador de SNP mME12135 na SEQ ID NO: 3, e opcionalmente e) confirmar a resistência ao MYaV da planta de progênia em um ensaio de resistência ao MYaV.
Pode-se também utilizar os métodos e os marcadores aqui descritos para reduzir o tamanho do fragmento de introgressão selvagem compreendendo o QTL MYaV6.1, isto é, para gerar e selecionar recombinantes com um fragmento de introgressão menor no cromossoma 6, mas que retêm a parte que confere resistência ao MYaV do fragmento de introgressão. Podem igualmente desenvolver marcadores moleculares alternativos ligados ao MYaV6.1 para utilização em qualquer dos métodos acima mencionados.
Em um aspecto, a invenção abrange o uso de um cromossoma recombinante 6 compreendendo um fragmento de introgressão a partir de uma planta de C. melo selvagem, o dito fragmento de introgressão compreendendo um alelo que confere resistência ao MYaV para a reprodução de variedades de melão com resistência ao MYaV.
Em um aspecto a invenção abrange o uso de um cromossoma recombinante 6, compreendendo um fragmento de introgressão de uma planta C. melo selvagem, o dito fragmento de introgressão compreendendo um alelo que confere resistência ao MYaV, para reprodução de variedades de melão com resistência ao MYaV, em que os ditos cromossomas recombinantes 6 são o cromossoma recombinante 6, como encontrado nas sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB 42113 ou NCIMB 42198, ou é derivada do dito cromossoma recombinante 6. Deste modo, em um aspecto, um meloeiro cultivado de acordo com a invenção compreendendo um cromossoma recombinante 6 obtido por (passível de ser obtido) cruzamento de uma planta cultivada a partir de sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB 42113 ou NCIMB 42198 ou da sua progênia que retém o cromossoma recombinante 6, com outro meloeiro.
Assim, o cruzamento tradicional pode ser utilizado para gerar um meloeiro cultivado compreendendo QTL MYaV6.1 a partir de um melão selvagem ou um parente selvagem do melão, o qual compreende o QTL, como indicativo pela presença dos marcadores SNP, especialmente pelo menos SNP mME12135 e/ou mME15090 no acesso selvagem e o fenótipo de resistência ao MYaV.
Observa-se que pelo menos um dos marcadores (ou dois ou mais) ligados ao QTL nos números de acesso selvagens são em um aspecto também transferidos em conjunto com o fragmento de introgressão compreendendo o QTL no melão cultivado, de modo que o ensaio de marcador nas linhagens de cruzamento (por exemplo, populações de retrocruzamento) e meloeiros cultivados resultantes pode ser utilizado para selecionar plantas compreendendo o QTL pela seleção de plantas que têm o genótipo resistente dos marcadores ligados, especialmente SNP mME12135 e/ou mME15090.
Em um aspecto, as plantas, células, tecidos e partes de plantas de acordo com a invenção não compreendem o fragmento de introgressão a partir de PI313970, fragmento de introgressão que compreende uma resistência ao CYSDV QTL ligado a pelo menos um marcador localizado no cromossoma equivalente ao grupo de ligação (LG) 6 do número de acesso do melão PI313970 como descrito e reivindicado na EP1962578B1. Como mencionado, na EP1962578B1 arbitrariamente designada LG6, mas corresponde ao Grupo de Ligação ICuGI V (LG V). Em um aspecto, os meloeiros cultivados, de acordo com a invenção compreendem um cromossoma 5 (ICuGI LG V) e o dito cromossoma 5 não compreende a introgressão a partir de PI313970, esse introgressão compreende um QTL de resistência ao CYSDV ligado a pelo menos um marcador localizado no cromossoma equivalente ao grupo de ligação (LG) 6 do número de acesso do melão PI313970 como descrito e reivindicado na EP1962578B1.
Em outro aspecto, um meloeiro cultivado compreendendo um cromossoma recombinante 6 de acordo com a invenção e compreendendo ainda um cromossoma 5 recombinante que compreende uma introgressão a partir de PI313970, cuja introgressão compreende um QTL de resistência ao CYSDV ligado a pelo menos um marcador localizado no cromossoma equivalente ao grupo de ligação (LG) 6 do número de acesso do melão PI313970 como descrito e reivindicado na EP1962578B1 é aqui englobada, isto é, um meloeiro cultivado, partes e células da mesma, compreendendo pelo menos dois fragmentos de introgressão de melão selvagem, conferindo uma resistência ao MYaV ao cromossoma 6 (como descrito ao longo da especificação) e um que confere resistência ao CYSDV no cromossoma 5 (ICuGI LG V).
Sâo fornecidos usos aqui, como o uso de um cromossoma recombinante 6 compreendendo um fragmento de introgressão a partir de uma planta de C. melo selvagem, o dito fragmento de introgressão compreendendo um alelo que confere resistência ao MYaV para a reprodução de variedades de melão com resistência ao MYaV.
Em um aspecto, no uso acima dos ditos cromossomas recombinantes 6 está o cromossoma recombinante 6 como encontrado nas sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB 41967 ou NCIMB 41968, ou é derivado do dito cromossoma recombinante 6.
Também é fornecido o uso de um cromossoma 6 como encontrado nas sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB 41967 ou NCIMB 41968 ou na progênia resistente a MYaV de qualquer um destes para gerar um meloeiro cultivado resistente a MYaV compreendendo um fragmento de introgressão do dito cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão confere resistência ao MYaV.
Também é fornecido o uso de plantas cultivadas a partir de sementes depositadas sob o número de acesso NCIMB 41967 ou NCIMB 41968 ou progênia resistente a MYaV de qualquer um destes para gerar um meloeiro cultivado compreendendo resistência ao MYaV, em que a dita resistência ao MYaV é conferida por um fragmento de introgressão obtido a partir de cromossoma 6 das ditas plantas ou progênia.
DNA e cromossomas de acordo com a invenção
Em um aspecto, é fornecido um cromossoma 6 de C. melo cultivado modificado (recombinante), que compreende um fragmento de introgressão de um melão selvagem ou um parente selvagem do melão, como descrito ao longo da especificação. Em um aspecto, o cromossoma recombinante 6 é isolado do seu ambiente natural. Em outro aspecto está em uma célula de planta, especialmente em uma célula de melão, especialmente em uma célula cultivada de C. melo. Também é aqui fornecida uma parte isolada do cromossoma recombinante 6 compreendendo o alelo MYaV.
Em um aspecto adicional, uma molécula de ácido nucleico recombinante, especialmente uma molécula de DNA recombinante, é fornecida que compreende um alelo MYaV de acordo com a invenção. Num aspecto, o alelo MYaV é detectável por um ou mais dos ensaios de marcadores moleculares aqui descritos. É também fornecido um vetor de DNA que compreende o DNA recombinante. A molécula de DNA recombinante ou vetor de DNA pode ser uma molécula de ácido nucleico isolada. O DNA compreendendo o alelo MYaV pode estar em um microrganismo, como uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium).
O uso dessa molécula de ácido nucleico (isolada ou extraída) e/ou de tal cromossoma recombinante 6 ou parte dele para gerar células vegetais e plantas (especialmente células de meloeiros e meloeiros) compreendendo um alelo de MYaV está englobado aqui. Em um aspecto, pode ser utilizado para gerar células de melão transgênicas, meloeiros e partes de melão (por exemplo, frutos) compreendendo o alelo de MYaV e a planta compreende um fenótipo de resistência ao MYaV.
Assim, as células de plantas transgênicas, por exemplo, células de melão transgênicas, compreendendo no seu genoma um cromossoma recombinante 6 como descrito e/ou uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um alelo MYaV também são uma modalidade da invenção. Em um aspecto, a molécula de DNA compreendendo o alelo MYaV está integrada de forma estável no genoma do melão.
O alelo MYaV também pode ser clonado e um gene quimérico pode ser feito, por exemplo, ligando operativamente um promotor expressível de planta ao alelo MYaV. Tal gene quimérico pode ser introduzido em uma célula vegetal e a célula da planta pode ser regenerada em uma planta completa para produzir uma planta transgênica. Em um aspecto, a planta transgênica é um meloeiro.
Dessa forma, plantas transgênicas, especialmente meloeiros cultivados transgênicas que compreendem um alelo de resistência ao MYaV e possuindo um fenótipo de resistência ao MYaV são aqui fornecidas.
Especialmente, células ou culturas de células compreendendo um cromossoma recombinante 6 de acordo com a invenção são uma modalidade, independente se o cromossoma recombinante 6 é introduzido por métodos transgênicos ou por métodos de reprodução. As células estão, por exemplo, in vitro e são regeneráveis em meloeiros compreendendo o cromossoma recombinante 6 da invenção.
Também as sequências de marcador molecular (e moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo a sequência) aqui descritas e marcadores moleculares entre qualquer dos marcadores moleculares mencionados aqui descritos e representados na Figura 1, ligados ao QTL que confere resistência ao MYaV e a seu uso na detecção e/ou geração de meloeiros resistentes ao MYaV são abrangidas aqui
LEGENDAS DAS FIGURAS
Figura 1: O perfil LOD de MYaV6.1, um QTL no grupo de ligação do melão VI (LGVI) conferindo resistência ao MYaV. Os mapas de ligação de LGVI para os dois cruzamentos [(990631-2) -Q-1-K x NCIMB41966 e Amaregal x NCIMB41969] são representados por barras sólidas, e os marcadores SNP e as distâncias em cM (centiMorgan) estão nos lados direito e esquerdo das barras, respectivamente. Os marcadores SNP comuns entre os dois mapas são indicados com linhas de conexão. O perfil LOD no mapa (990631-2) -Q-1-K x NCIMB41966 mostra resultados de avaliações de campo de famílias F3 replicadas em 2010 enquanto que de Amaregal x NCIMB41969 mostra resultados de 2011 de avaliações de campo de plantas F2. O LOD pico para o cruzamento (990631-2) -Q-1-K x NCIMB41966 foi de 6,3, explicando 32,6 % da variação observada em 2010. O LOD pico do cruzamento Amaregal x NCIMB41969 foi de 50,3, explicando 91,7 % da variação observada em 2011.
Figura 2: Fotografia tirada no Brasil da variedade de melão suscetível Hibrix (fileira do meio) que mostra os sintomas do MYaV. O retângulo mostra a parte da planta do melão que é fenotipada para os sintomas. Depósitos de Semente
Uma amostra representativa das sementes dos números de acesso do melão selvagem compreendendo o QTL (designado MYaV6.1) para a resistência ao MYaV no cromossoma 6 foi depositada por Nunhems B. V. em 2 de maio de 2012 no NCIMB Ltd. (Edifício Ferguson, Estado de Craibstone, Bucksburn Aberdeen, Escócia AB21 9YA, Reino Unido) de acordo com o Tratado de Budapeste, sob a Solução de Peritos (EPC 2000, Regra 32 (1)). As sementes receberam os seguintes números de depósito: NCIMB 41966 e NCIMB 41969 e NCIMB41967 e NCIMB41968.
Uma amostra representativa (2600) das sementes (BC1S2) de um meloeiro cultivado compreendendo o QTL para a resistência ao MYaV no cromossoma 6 na forma homozigótica (designada MYaV6.1) foi depositada por Nunhems B. V. em 15 de fevereiro de 2013 no NCIMB Ltd. (Edifício Ferguson, Estado de Craibstone, Bucksburn Aberdeen, Escócia AB21 9YA, Reino Unido) de acordo com o Tratado de Budapeste, sob a Solução de Peritos (EPC 2000, Regra 32 (1)). As sementes receberam o seguinte número de depósito: NCIMB 42113.
Uma amostra representativa das sementes (BC4F2) de um meloeiro cultivado compreendendo o QTL para a resistência ao MYaV no cromossoma 6 na forma homozigótica (designada MYaV6.1) foi depositada por Nunhems B. V. em 12 de dezembro de 2013 no NCIMB Ltd. (Edifício Ferguson, Estado de Craibstone, Bucksburn Aberdeen, Escócia AB21 9YA, Reino Unido) de acordo com o Tratado de Budapeste, sob a Solução de Peritos (EPC 2000, Regra 32 (1)). As sementes receberam o seguinte número de depósito: NCIMB 42198.
O requerente solicita que amostras do material biológico e qualquer material dele derivado sejam liberadas somente a um perito designado de acordo com a Regra 32(1) EPC ou legislação relacionada de países ou tratados com regras e regulamentos semelhantes, até a menção da concessão da patente, ou durante 20 anos a partir da data do depósito, se o pedido for recusado, retirado ou considerado retirado.
O acesso ao depósito estará disponível durante a pendência deste pedido para pessoas determinadas pelo Diretor do Escritório de Patentes dos Estados Unidos a ter direito a ele mediante pedido. Sujeito a 37 C.F.R. § 1.808 (b), todas as restrições impostas pelo depositante sobre a disponibilidade ao público do material depositado serão irrevogavelmente removidas após a concessão da patente. O depósito será mantido por um período de 30 anos, ou 5 anos após o pedido mais recente, ou para a vida executiva da patente, o que for mais longo, e será substituído se tornar- se inviável durante esse período. O requerente não renuncia a quaisquer direitos concedidos ao abrigo desta patente sobre este pedido ou sob a Lei de Proteção de Variedades de Planta (7 USC 2321 et seq.).
Os seguintes Exemplos não limitativos descrevem como se pode obter plantas de acordo com a invenção, compreendendo um cromossoma recombinante 6. Salvo indicação em contrário nos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padrão como descrito em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiais e métodos padronizados para o trabalho molecular da planta são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, conjuntamente publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Métodos de reprodução padronizados são descritos em ‘Principles of Plant breeding’, Second Edition, Robert W. Allard (ISBN 0-471-02309-4).
EXEMPLO 1 - Resistência no cromossoma 6 de NCIMB 41966 1. 1. Materiais e Métodos 1.1.1 Desenvolvimento da população F2 e F3
Foi feito um cruzamento entre a linhagem de reprodução (990631-2) -Q-1-K, que é susceptível ao MYaV, e um número de acesso do melão selvagem, Cucumis melo ssp. agrestis, obtido dos EUA, mas originalmente originário da Índia, cujas sementes foram depositadas por Nunhems B.V. sob o número de acesso NCIMB 41966.
A progênia F1 obtida a partir do cruzamento foi autofecundada para se obter uma população F2, que foi utilizada para a genotipagem (96 plantas F2 foram genotipadas). As plantas F2 foram autofecundadas para obter famílias F3, as quais foram fenotipadas em um ensaio de resistência ao MYaV no campo, próximo a Mossoró, Brasil em 2010, conforme descrito abaixo.
1.1.2 Ensaio de resistência ao MYaV das famílias F3
Os ensaios de resistência ao MYaV foram conduzidos em 2010 no campo aberto perto de Mossoró, sob alta incidência natural de MYaV. Cada família F3 foi plantada em três repetições de 20 plantas por repetição em 2010, juntamente com controles susceptíveis (4 plantas, 3 repetições) e controle resistente NCIMB41966 (20 plantas). Foi utilizado um design inteiramente selecionado aleatoriamente, uma vez que a pressão da doença foi uniforme em todo o campo.
Os controles suscetíveis foram Glory F1 (Origene Seeds), Ruidera F1, Amaregal F1, Guapore, Goldex, DRY9150 e Sancho (Syngenta).
A fenotipagem para os sintomas de MYaV foi realizada visualmente, quando os controles susceptíveis mostraram sintomas claros de amarelamento.
Cada planta recebeu uma pontuação da doença na seguinte escala, onde apenas as folhas mais antigas, isto é, o primeiro terço (1/3) da planta em torno do tronco principal e do sistema radicular, são usadas. Assim, ao se referir aqui a “todas as folhas” ou “poucas folhas” ou uma certa percentagem da área foliar total, apenas as folhas no 1/3 mais antigo da planta são ditas, ver também a Figura 2, onde o retângulo preto indica o 1/3 da planta que é marcado de acordo com a seguinte escala:
Figure img0001
Figure img0002
A pontuação média da doença foi calculada por família F3 e por controle.
1.1.3 Genotipagem das famílias F2
A genotipagem das famílias F2 foi feita usando o Ensaio Illumina Infinium de SNP (Polimorfismos de nucleotídeo único), contendo 4600 SNPs. Alguns marcadores ICuGI SSR (Sequência simples repetida) também foram analisados e serviram como marcadores âncora junto com outros poucos marcadores SNP para determinar o número do grupo de ligação e orientação.
1.1.4 Análise de Dados dos dados do genótipo F2 e fenótipo F3
O mapeamento da ligação foi realizado usando JoinMap v4 e a análise de QTL foi realizada com o software MapQTL v5.
1.2 Resultados 1.2.1 Resultados do ensaio de resistência ao MYaV em 2010
Os resultados para as verificações suscetíveis e resistentes são mostrados abaixo:
Figure img0003
1.2.2 Resultads do mapeamento de QTL das famílias F2 e F3
Os marcadores SNP mapeados para 12 grupos de ligação, correspondendo ao número do cromossoma haploide do melão.
Para os dados de fenótipo de 2010 um QTL significativo para resistência ao MYaV foi encontrado no grupo de ligação VI (com base na nomenclatura ICuGI), com uma pontuação de LOD de 6,3 eexplicando 32,6 % da variação fenotípica observada para resistência ao MYaV.
Os resultados são mostrados na Figura 1.
Os marcadores SNP a seguir foram associados com o fenótipo de resistência ao MYaV. O genótipo SNP do parente resistente e suscetível no locus do marcador também é indicado na Tabela.Tabela 1
Figure img0004
* corresponde ao marcador EST A_38-F04 (Número de Acesso ao GenBank AM730270), que foi usado para ligar o mapa genético do grupo de ligação VI ao mapa físico (scaffold 00021). Ver Garcia-Mas et al. Junho de 2012, PNAS Early Edition, página 1-6, Supplementary Information Anexo - Figura S2. ** apesar da pontuação de LOD estar abaixo de 3.0, estes marcadores são ainda considerados significativos, como confirmado usando dados de fenotipagem separados obtidos em 2009 (resultados não mostrados)
EXEMPLO 2 - Resistência no cromossoma 6 de NCIMB 41969 2. 1. Materiais e Métodos 2.1.1 Desenvolvimento da população F2
Foi feito um cruzamento entre a variedade do melão Gália híbrida Amaregal F1, que é susceptível ao MYaV, e um número de acesso do melão selvagem, obtido das Espanha, mas originalmente originário do Uzbequistão, cujas sementes foram depositadas por Nunhems B.V. sob o número de acesso NCIMB 41969.
A progênia F1 obtida a partir do cruzamento foi autofecundada para se obter uma população F2, que foi utilizada para a genotipagem (181 plantas F2). As plantas F2 foram fenotipadas em um ensaio de resistência ao MYaV no campo, próximo a Mossoró, Brasil em 2011, conforme descrito abaixo.
2.1.2 Ensaio de resistência ao MYaV das plantas F2
Os ensaios de resistência ao MYaV foram conduzidos em 2011 no campo aberto perto de Mossoró, sob alta incidência natural de MYaV.
Controles suscetíveis (10 plantas por gráfico) foram Amaregal (Nunhems), Sancho (Syngenta) e Caribbean Gold. Também NCIMB 41969 foi incluída como verificação resistente (20 plantas por gráfico).
A fenotipagem para os sintomas de MYaV foi realizada visualmente, quando os controles susceptíveis mostraram sintomas claros de amarelamento.
A cada planta foi dada uma pontuação da doença na escala descrita acima sob 1.1.2.
A pontuação média da doença foi calculada por linhagem de planta ou variedade.
2.1.3 Genotipagem das famílias F2
A genotipagem das plantas F2 foi feita usando um conjunto amplo do genoma de 96 marcadores em uma plataforma KASP para o mapa de armação inicial. Alguns marcadores ICuGI SSR (Sequência simples repetida) também foram analisados e serviram como marcadores âncora junto com outros poucos marcadores SNP para determinar o número do grupo de ligação e orientação.
2.1.4 Análise de Dados dos dados do genótipo F2 e fenótipo F2
O mapeamento da ligação foi realizado usando JoinMap v4 e a análise de QTL foi realizada com o software MapQTL v5.
2.2 Resultados 2.2.1 Resultados do ensaio de resistência ao MYaV em 2011
Os resultados para as verificações suscetíveis e resistentes são mostrados abaixo:
Figure img0005
2.2.2 Resultados do mapeamento de QTL das plantas F2
Os marcadores SNP mapeados para 12 grupos de ligação, correspondendo ao número do cromossoma haploide do melão.
Um QTL significativo para resistência ao MYaV foi encontrado no grupo de ligação VI (com base na nomenclatura ICuGI), com uma pontuação de LOD de 50,3 eexplicando 91,7 % da variação fenotípica observada para resistência ao MYaV.
Os resultados são mostrados na Figura 1.
Os marcadores SNP a seguir foram associados com o QTL. O genótipo SNP do parente resistente e suscetível no locus do marcador também é indicado na Tabela.Tabela 2
Figure img0006
Figure img0007
Os Exemplos 1 e 2 acima mostram que um fragmento de introgressão de melões silvestres, compreendendo um locus que confere resistência ao MYaV, confere resistência ao MYaV quando transferido para melão cultivado. Como o QTL mapeado para o grupo de ligação 6, o QTL foi denominado MYaV6.1. As sementes de tais meloeiros cultivados compreendendo o QTL denominado MYaV6.1, foram depositadas sob o número de depósito NCIMB 42113 (compreendendo o fragmento de introgressão de NCIMB 41969) e NCIMB 42198 (compreendendo o fragmento de introgressão de NCIMB 41966).
O QTL MYaV6.1 foi encontrado em dois números de acessos de melão selvagem, de diferentes origens (Índia e Uzbequistão), e dois marcadores SNP (mME12135 e ME15090) foram comumente ligados ao QTL em ambas as populações, enquanto quatro marcadores SNP (mME40332, MME28908, mME9692 e mME50656) e três marcadores SNP (mME21377, mME36533 e mME13585) foram associados (ligados a) ao QTL derivado de NCIMB41966 e NCIMB41969, respectivamente.
Um ou mais (pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais) ou todos os marcadores SNP associados a MYaV6.1 aqui fornecidos, podem ser utilizados para vários fins, como a) para detectar a presença de um fragmento de introgressão no cromossoma 6 compreendendo QTL MYaV6.1 em meloeiros cultivados ou partes da planta; b) para transferir o cromossoma recombinante 6, compreendendo o locus conferidor de resistência ao MYaV (MYaV6.1), de um meloeiro cultivado para outros meloeiros cultivados, especialmente em variedades suscetíveis ao MYaV ou linhagens de reprodução; c) para gerar e/ou selecionar novos meloeiros cultivados que compreendem uma introgressão com QTL MYaV6.1 a partir de uma fonte selvagem, como um melão selvagem ou parente selvagem do melão (como de NCIMB 41966 ou NCIMB 41969 ou outros melões silvestres ou parentes silvestres do melão). d) para reduzir o tamanho do fragmento de introgressão selvagem compreendendo o QTL MYaV6.1, isto é, para gerar e selecionar recombinantes com um fragmento de introgressão menor no cromossoma 6, mas que retêm a parte que confere resistência ao MYaV do fragmento de introgressão. e) Para desenvolver marcadores moleculares alternativos para qualquer dos propósitos mencionados acima, ligados ao MYaV6.1; f) para triar os números de acesso do melão selvagem ou parentes silvestres do melão para a presença de um ou mais marcadores e, dessa forma, a presença de QTL MYaV6.1 e introgredir a parte que confere resistência destas novas fontes de resistência nos meloeiros suscetíveis ao MYaV cultivadas.
EXEMPLO 3 - Ensaios de SNP (ensaio de KASP) ou “ensaio do marcador de MYaV”
Para triar as plantas quanto à presença de um ou mais dos marcadores moleculares acima, ligados ao fragmento de introgressão que confere resistência ao MYaV, foi desenvolvido um ensaio KASP (um ensaio de genotipagem de SNP ou ensaio de genotipagem de PCR Específico de Alelo da KBioscience) para marcadores SNP mME21377, mME1590, mME12135, mME36533 e mME13585.
Com base nas sequências genômicas que compreendem o SNP (ver Tabela 3 abaixo e listagem de Sequência), para cada marcador SNP dois primers diretos específicos de alelos (isto é, detectando ou o nucleotídeo do parente susceptível ou resistente no locus SNP) e um primer reverso comum (em itálico) foram desenvolvidos, indicados nas Tabelas 3 e 4 (todas as sequências são dadas na direção 5’ para 3’).Tabela 3
Figure img0008
Tabela 4
Figure img0009
Figure img0010
Utilizando os primers acima, os ensaios KASP podem ser realizados de acordo com protocolos padrão desenvolvidos por KBioscience.co.uk (ver www.kbioscience.co.uk), de modo a detectar a presença do genótipo SNP resistente ou suscetível na forma homozigótica ou heterozigótica no DNA de uma planta derivada de células ou tecidos de melão. Se o genótipo de um dado SNP for homozigótico, apenas um sinal fluorescente será detectado. Se o genótipo da planta de um dado SNP for heterozigótico, um sinal fluorescente misto será detectado.
Para qualquer dos outros marcadores de SNP, por exemplo, MME40332, mME28908, mME9692 e mME50656, podem ser desenvolvidos ensaios de genotipagem SNP semelhantes para detectar o genótipo SNP.
EXEMPLO 4 - Resistência no cromossoma 6 de NCIMB 41967 e NCIMB 41968
Dois outros números de acesso de C. melo, ditos como Papaya netted (NCIMB 41968) e Local 2 (NCIMB 41967), foram triados para ambas a resistência ao MYaV usando o mesmo ensaio da doença como descrito acima e para a presença dos marcadores SNP que são ligados ao QTL MYaV6.1.
Os resultados são mostrados abaixo:
Figure img0011
Os resultados dos ensaios do marcador são mostrados abaixo:
Figure img0012
Deste modo, tanto NCIMB41968 como NCIMB41967 compreendem o genótipo de resistência de quatro marcadores, incluindo os dois marcadores comuns. Este número de acesso compreende, portanto, o QTL MYaV6.1 no cromossoma 6.
EXEMPLO 5 - Introgressão do QTL MYaV6. 1 a partir de NCIMB 41967 e NCIMB 41968 no melão cultivado
Tanto NCIMB41967 como NCIMB41968 foram cruzados com o cultivar suscetível ao MYaV Amaregal (Gália). A população F2 foi fenotipada para a resistência ao MYaV e as plantas F2 resistentes (pontuação média de amarelamento de 9) foram retrocruzadas várias vezes para gerar uma geração BC4 e BC5 compreendendo o QTL MYaV6.1 no cromossoma 6. A análise de marcadores usando os marcadores acima foi feita para selecionar indivíduos portadores do genótipo de resistência dos marcadores SNP e, portanto, também o QTL.

Claims (2)

1. Método para identificar uma planta C. melo cultivada compreendendo um fragmento de introgressão no cromossoma 6, em que o dito fragmento de introgressão compreende um alelo de resistência ao MYaV e em que o dito fragmento de introgressão é um fragmento do cromossoma 6 como encontrado em NCIMB41967 ou NCIMB41968 caracterizado pelo fato de que o método compreende detectar o dito fragmento de introgressão detectando em um ensaio de marcador molecular a presença de pelo menos um dos marcadores selecionados do grupo que consiste em: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo único mME15090 no nucleotídeo 71 na SEQ ID NO: 1; b) o genótipo AA ou AG para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo único mME12135 no nucleotídeo 71 na SEQ ID NO: 3; c) o genótipo AA ou AG para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo único mME21377 no nucleotídeo 71 na SEQ ID NO: 8; e d) o genótipo TT ou CT para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo único mME13585 no nucleotídeo 71 na SEQ ID NO: 12 e a ausência do genótipo TT ou GT para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo único mM36533 na SEQ ID NO: 11; e a ausência de pelo menos um marcador selecionado do grupo que consiste em: e) o genótipo GG ou AG para o marcador SNP mME40332 na SEQ ID NO: 2; f) o genótipo TT ou AT para o marcador SNP mME28908 na SEQ ID NO: 4; g) o genótipo AA ou AT para o marcador SNP mME9692 na SEQ ID NO: 6; e h) o genótipo CC ou CT para o marcador SNP mME50656 na SEQ ID NO: 7.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a detecção do referido fragmento de introgressão pela detecção de pelo menos um dos marcadores de Polimorfismo de Nucleotídeo único (SNP) selecionados a partir do grupo que consiste em: a) o genótipo CC ou AC para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo único mME15090 no nucleotídeo 71 na SEQ ID NO: 1; e b) o genótipo AA ou AG para o marcador de Polimorfismo de Nucleotídeo único mME12135 no nucleotídeo 71 na SEQ ID NO: 3.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11064668B2 (en) 2018-11-26 2021-07-20 Nunhems B.V. Melon variety NUN 76307 MEM
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CN114763579B (zh) * 2021-01-13 2023-08-08 北京市农林科学院 一种与甜瓜果形相关的分子标记及其方法与应用
CN112941217A (zh) * 2021-01-26 2021-06-11 新疆农业科学院哈密瓜研究中心 甜瓜抗霜霉病InDel标记物及其应用
CN117512203B (zh) * 2024-01-04 2024-03-22 中国热带农业科学院三亚研究院 一种与番木瓜果实宽度相关的分子标记、方法及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1800535A1 (en) 2005-12-21 2007-06-27 De Ruiter Seeds R&D B.V. Closterovirus-resistant melon plants
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