ES2897766T3 - Plantas de melón con un gen dominante de resistencia al virus asociado al amarilleamiento del melón (MYAV) - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para identificar una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV), en el que dicha resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 en forma homocigota o heterocigota y en el que dicho fragmento de introgresión procede de una accesión silvestre de la especie Cucumis melo, una muestra representativa de semillas de dicha accesión silvestre que ha sido depositada con el número de acceso NCIMB 41967 y NCIMB 41968, en el que dicho procedimiento comprende la detección de dicho fragmento de introgresión mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta la presencia de al menos uno de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en: a) el genotipo CC o AC para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME15090 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 1; b) el genotipo AA o AG para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME12135 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 3; c) el genotipo AA o AG para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME21377 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 8; y d) el genotipo TT o CT para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME13585 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 12, y la ausencia del genotipo TT o GT para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mM36533 en la SEQ ID NO: 11; y la ausencia de al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en: - el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2; - el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4; - el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6; y - el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7.

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas de melón con un gen dominante de resistencia al virus asociado al amarilleamiento del melón (MYAV)

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la mejora vegetal, en particular a la mejora del melón. Se divulga el locus genético que confiere resistencia al virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV), tal como se encuentra en las accesiones de melón silvestre o en los parientes silvestres del melón, y las plantas de melón cultivadas que comprenden dicho locus genético (o una parte que confiere resistencia), que confiere a dichas plantas resistencia al MYaV. También se divulgan las semillas a partir de las cuales se pueden cultivar dichas plantas, las partes de la planta, las células, los tejidos o los órganos de dichas plantas y los procedimientos de cultivo para transferir el locus de resistencia a MYaV, o una parte que confiere resistencia, a otras plantas de melón cultivadas o a células de plantas, especialmente a plantas de melón susceptibles a MYaV. Se proporcionan marcadores moleculares con los que dicho locus genético puede ser identificado en plantas y células vegetales y/o transferido a otras plantas de melón o células vegetales. Como la resistencia a MYaV presente en el locus genético es dominante, las plantas y/o células vegetales resistentes a MYaV pueden comprender el locus genético en forma homocigota o heterocigota.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Desde 1999, una nueva enfermedad que causa síntomas descritos como "amarilleamiento de las plantas de melón" fue reportada como causante de daños en el noreste de Brasil, que es la región donde se produce más del 90 % de la producción brasileña de melón. Los síntomas son el moteado y el amarilleamiento de las hojas y se observan principalmente en las hojas más viejas (Nagata et al. 2003, Plant Pathology 52, 797). El virus causante de esta enfermedad se denominó tentativamente Virus Asociado al Amarillamiento del Melón (MYaV) (Nagata et al ., 2003, supra y Nagata et al., 2005, Arch. Virología Vol. 150(2):379-87). En 2007 la detección serológica (utilizando un anticuerpo policlonal desarrollado para la detección del MYaV, (véase Avila et al. 2008 Trop. Plant Pathol. v.33 n.3 Brasilia maio/jun. 2008) revelaron que un gran porcentaje de plantas de melón sintomáticas estaban efectivamente infectadas por el MYaV (Lima et al. Hortic. Bras. vol. 27 no.4 Brasilia Oct./Dic. 2009). La región más afectada fue el estado de Rio Grande do Norte, en Mossoro, con el 96,3 % de los melones infectados. Curiosamente, las concentraciones de virus eran mayores en los extractos preparados a partir de los tallos de las plantas sintomáticas que de las hojas.

Los síntomas típicos de la enfermedad aparecen como un moteado y amarilleamiento de las hojas, principalmente de las más viejas, similar a un trastorno nutricional (véase Nagata et al, 2003, supra y la Fig. 1 de Nagata et al. 2010, Journal of General Plant Pathology Volumen 76, No. 4, página 268-272). En el tejido de la hoja infectada que muestra síntomas de amarilleamiento se pueden ver partículas de virus filamentosas de 600-700 nm de longitud mediante microscopía electrónica.

El virus que se encuentra en las plantas con síntomas de la enfermedad del amarilleamiento se transmite de melón a melón por medio de moscas blancas (Bemisia tabaci biotipo B). También se puede utilizar el injerto para transmitir el virus a otras plantas de melón o a Cucumis anguria (pepinillo antillano). Mediante microscopía electrónica, se observaron partículas largas y filamentosas del tipo Carlavirus y cuerpos de inclusión en las hojas infectadas, lo que sugería la presencia de un virus del género Carlavirus (Nagata et al. 2003, Plant Pathol 52:797). Nagata et al. 2005 (supra) secuenciaron dos genes, la proteína de la cubierta (ORF-A) y un marco de lectura abierto más (ORF-B), véase el número de acceso del GenBank AY373028. Dado que el virus del moteado suave del caupí (CPMMV) era la única especie de carlavirus que se conocía que era transmitida por las moscas blancas, se esperaba que las propiedades genéticas y serológicas del MYaV fueran similares a las del CPMMV. Sin embargo, el MYaV no reaccionó de forma cruzada en un ensayo de inmunofijación por puntos con el anticuerpo del CPMMV (Nagata et al. 2003, supra), y los datos de la secuencia genómica mostraron que la proteína de la cubierta (CP) del CPMMV no estaba estrechamente relacionada con la del MYaV (Nagata et al. 2005, supra).

Inicialmente no estaba claro si incluir el MYaV dentro del género Carlavirus o si debería ser un nuevo género en la familia Flexiviridae (Nagata et al. 2005, supra). Sin embargo, en un estudio reciente (Nagata et al. 2010, supra), se clonó y secuenció un 40 % (aprox. 3,1 kb) del genoma del MYaV y, sobre la base de estos datos, los autores sugieren que el virus es, de hecho, una nueva especie dentro del género Carlavirus y sugieren cambiar el nombre de este virus por el de Mellon Yellowing Virus (MYV). La secuencia de 3,1 kb contenía 5 marcos de lectura abiertos (ORF), que codificaban tres proteínas de triple bloqueo genético (TGB1, TGB2 y TGB3), la proteína de la cubierta (CP) y la proteína putativa de unión al ácido nucleico (NABP), véase el número de acceso del GenBank AB510477. La secuencia de la proteína de cubierta (CP) en este estudio tenía un 93 % de identidad con la secuencia del ORF-A (AY373028).

Como no se dispone de plantas con resistencia al virus, una estrategia desarrollada para limitar la infección por el MYaV es cubrir todo el campo con una capa de tela no tejida desde la germinación hasta la floración, para evitar la transmisión del virus por la mosca blanca. Sin embargo, las plantas se volvieron sensibles a los minadores de las hojas(Liriomisa spp.), que se extendieron y dañaron fuertemente la producción de frutos (Nagata et al. 2010, supra).

En el presente documento se divulgan fuentes de resistencia a MYaV y una región genética que comprende el locus de resistencia o una parte del mismo, que confiere resistencia contra MYaV. También se divulgan plantas de melón cultivadas (Cucumis melo L.) y células, tejidos, frutos y otras partes de dichas plantas que comprenden en su genoma un locus que confiere resistencia al MYaV (o una parte de éste que confiere resistencia), ya sea en forma homocigota o heterocigota, por lo que las plantas de melón son resistentes al MYaV. También se dan a conocer las semillas a partir de las cuales se pueden cultivar plantas de melón resistentes al MYaV.

En un aspecto, se proporcionan marcadores moleculares que pueden utilizarse para detectar la presencia y/o transferir el locus que confiere resistencia al MYaV, o una parte de éste que confiere resistencia, dentro de plantas o células vegetales de Cucumis melo L. Uno o más de los marcadores pueden, por ejemplo, utilizarse para transferir el locus de resistencia, o una parte de éste que confiere resistencia, a plantas de melón que son susceptibles al MYaV. En una divulgación, el locus de resistencia, o la parte que confiere resistencia, es el locus del cromosoma 6 que se encuentra en las semillas depositadas con el número de acceso NCIMB 41966 o NCIMB 41969. En otra divulgación, el locus de resistencia, o la parte que confiere resistencia, es el locus del cromosoma 6 que se encuentra en las semillas depositadas con el número de acceso NCIMB41967 (Local 2) o NCIMB41968 (Papaya Netted). En otra divulgación, el locus de resistencia o la parte que confiere resistencia es el locus del cromosoma 6, o una parte que confiere resistencia, tal como se encuentra en otras plantas de melón silvestres o parientes silvestres del melón.

Uno o más de los marcadores vinculados a, o asociados con, el locus de resistencia a MYaV, o la parte que confiere resistencia, también pueden utilizarse para identificar nuevas fuentes de resistencia a MYaV, como otras accesiones silvestres de Cucumis melo o parientes silvestres del melón que comprenden un locus de resistencia a MYaV en el cromosoma 6 y para transferir (introgresar) el locus de resistencia, o una parte que confiere resistencia a MYaV, de dichas accesiones a plantas de melón cultivadas. El locus de rasgo cuantitativo (QTL) que confiere la resistencia a MYaV en el cromosoma 6 (equivalente al Grupo de Vinculación VI de ICuGI, o LG VI) se denominó MYaV6.1.

El documento EP1962578B1 describe un QTL de resistencia al CYSDV (Cucurbit Yellow Stunting Disorder Virus) de PI313970 en un grupo de enlace que se designa arbitrariamente como "LG6" y reivindica plantas de melón que comprenden una introgresión a partir de PI313970, cuya introgresión comprende un QTL de resistencia al CYSDV ligado a al menos un marcador situado en el cromosoma equivalente al grupo de enlace (LG) 6 de la accesión de melón PI313970. Se observa que el en EP1962578B1 denominado arbitrariamente LG6 corresponde al Grupo de Enlace V de ICuGI (LG V). En un aspecto, la planta divulgada en el presente documento, es decir, una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV), en la que dicha resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 en forma homocigótica o heterocigótica y en la que dicho fragmento de introgresión procede de una planta silvestre de la especie Cucumis melo, no comprende el QTL de resistencia al CYSDV descrito en EP1962578B1. En otro aspecto, la planta divulgada en el presente documento, es decir, una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV), en la que dicha resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 en forma homocigótica o heterocigótica y en la que dicho fragmento de introgresión procede de una planta silvestre de la especie Cucumis melo no comprende el marcador E11/M49-239, tal como se define en el párrafo [0037] y en la reivindicación 1 de EP 1962578 B1. En otro aspecto, la planta divulgada en el presente documento no comprende uno o más o todos los marcadores E11/M54-156, E14/M54-152, E14/M51-210, E14/M51-083, E11/M49-239, E11/M54-169, E14/M50-262, E11/M57-278, E11/M54-163 y/o E11/M49-072, tal como se definen en el párrafo [0040] de EP1962578 B1. En otro aspecto más, la planta divulgada en el presente documento no comprende uno o más o todos los marcadores E11/M54-156, E14/M54-152, E14/M51-210, E14/M51-083, E11/M49-239, E11/M64-169, E14/M60-262, E11/M67-278, E11/M64-163 y/o E11/M49-072, tal como se definen en el párrafo [0013] de EP 1962578 B1 o como se muestra en la figura 1. En otro aspecto, las plantas divulgada en el presente documentos, es decir, una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV), en la que dicha resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 en forma homocigótica o heterocigótica y en la que dicho fragmento de introgresión procede de una planta silvestre de la especie Cucumis melo, no tiene un fenotipo de resistencia al CYSDV (es decir, no es resistente al CYSDV como se describe en EP 1962578B1).

DEFINICIONES GENERALES

El artículo indefinido "un" o "uno, una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto exija claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. Así, el artículo indefinido "un" o "uno, una" suele significar "al menos uno".

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "planta" incluye la planta entera o cualquier parte o derivado de la misma, como órganos vegetales (por ejemplo, órganos de almacenamiento cosechados o no, tubérculos, frutos, hojas, semillas, etc.), células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de células o tejidos vegetales a partir de los cuales pueden regenerarse plantas enteras, calos vegetales, grupos de células vegetales y células vegetales intactas en plantas, o partes de plantas, como embriones, polen, óvulos, ovarios, frutos (por ejemplo, tejidos u órganos cosechados, como frutos de melón cosechados o partes de ellos), flores, hojas, semillas, tubérculos, bulbos, plantas propagadas clonalmente, raíces, portainjertos, tallos, puntas de raíces y similares. También se incluye cualquier fase de desarrollo, como plántulas, inmaduras y maduras, etc. Cuando se habla de "semillas de una planta", se refiere a las semillas a partir de las cuales se puede cultivar la planta o a las semillas producidas en la planta, tras la autofecundación o la fecundación cruzada.

La "variedad vegetal" es un grupo de plantas dentro del mismo taxón botánico del grado más bajo conocido, que (independientemente de que se cumplan o no las condiciones para el reconocimiento de los derechos de obtentor) puede definirse sobre la base de la expresión de los caracteres que resultan de un determinado genotipo o de una combinación de genotipos, puede distinguirse de cualquier otro grupo de plantas por la expresión de al menos uno de esos caracteres, y puede considerarse como una entidad, porque puede multiplicarse sin ningún cambio. Por lo tanto, el término "variedad vegetal" no puede utilizarse para designar un grupo de plantas, aunque sean del mismo tipo, si todas se caracterizan por la presencia de uno o dos loci o genes (o de características fenotípicas debidas a estos loci o genes específicos), pero que, por lo demás, pueden diferir enormemente entre sí en cuanto a los demás loci o genes.

"F1, F2, F3, etc." se refiere a las generaciones emparentadas consecutivas que siguen a un cruce entre dos plantas parentales o líneas parentales. Las plantas cultivadas a partir de las semillas producidas por el cruce de dos plantas o líneas se denominan generación F1. La autofecundación de las plantas F1 da lugar a la generación F2, etc.

La planta "híbrida F1" (o semilla híbrida F1) es la generación obtenida del cruce de dos líneas parentales endogámicas. Por lo tanto, las semillas híbridas F1 son semillas de las que crecen plantas híbridas F1. Los híbridos F1 son más vigorosos y de mayor rendimiento, debido a la heterosis. Las líneas endógamas son esencialmente homocigóticas en la mayoría de los loci del genoma.

El término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular, todos los cuales alelos se relacionan con un rasgo o característica en un locus específico. En una célula diploide de un organismo, los alelos de un determinado gen se encuentran en un lugar específico, o locus (loci en plural) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie vegetal diploide puede comprender un gran número de alelos diferentes en un locus concreto. Pueden ser alelos idénticos del gen (homocigotos) o dos alelos diferentes (heterocigotos). Así, por ejemplo, se puede hacer referencia a un alelo deMYaV del locus de resistencia MYaV6.1.

El término "gen" se refiere a una secuencia de ADN (genómico) que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN mensajero (ARNm) en una célula, y una región reguladora vinculada operativamente (por ejemplo, un promotor). Los diferentes alelos de un gen son, por lo tanto, diferentes alternativas de forma del gen, que pueden ser en forma de, por ejemplo, diferencias en uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN genómico (por ejemplo, en la secuencia del promotor, las secuencias de los exones, las secuencias de los intrones, etc.), el ARNm y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.

El término "locus" (loci plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde, por ejemplo, se encuentra un gen o un marcador genético. El locus de resistencia a MYaV (o locus que confiere resistencia a MYaV) es, por tanto, el lugar del genoma del melón donde se encuentra el gen de resistencia a MYaV. En el melón cultivado, el locus de resistencia al MYaV se encuentra en el cromosoma 6 (utilizando la nomenclatura del ICuGI para cromosomas o grupos de enlace, es decir, LG VI) y se introgresa preferentemente en el genoma del melón cultivado (es decir en el cromosoma 6, o LG VI) a partir de accesiones de melón silvestre, tales como (pero no limitadas a) las accesiones de melón silvestre depositadas bajo los números de acceso NCIMB 41966 y NCIMB41969 y NCIMB41967 y NCIMB41968, o a partir de otros melones silvestres o parientes silvestres del melón que son cruzables con C. melo y de los cuales se puede producir una descendencia fértil.

Un "locus de rasgo cuantitativo", o "QTL" es un locus cromosómico que codifica para uno o más alelos que afectan a la expresividad de un fenotipo de distribución continua (cuantitativa). El locus de rasgo cuantitativo que confiere resistencia a MYaV se denomina en el presente documento MYaV6.1.

"ICuGI" se refiere a la Iniciativa Internacional de Genómica de Cucurbitáceas, que publica mapas genéticos de, por ejemplo, Cucumis melo (http://www.icugi.org/cgi-bin/cmap/map_set_info?species_acc=CM). La versión actual del mapa del genoma de C. melo es del4 de marzo de 2012 y el mapa del cromosoma 6 se denomina ICuGI_VI (o LG VI, o Grupo de Enlace VI) y contiene 124 marcadores (11 A f LP, 1 ISSR, 19 RAPD, 17 RFLP, 31 SNP, 45 marcadores SSR) en un grupo de enlace que abarca de 0,00 a 98,00 cM. En este documento, el cromosoma 6 del melón y el LG VI se utilizan indistintamente.

La "distancia genética" entre loci (por ejemplo, entre marcadores moleculares y/o entre marcadores fenotípicos) en el mismo cromosoma se mide por la frecuencia de cruce, o frecuencia de recombinación (RF) y se indica en centimorgans (cM). Un cM corresponde a una frecuencia de recombinación del 1 %. Si no se encuentran recombinantes, el RF es cero y los loci están muy cerca físicamente o son idénticos. Cuanto más separados estén dos loci, mayor será la RF.

La "distancia física" entre loci (por ejemplo, entre marcadores moleculares y/o entre marcadores fenotípicos) en el mismo cromosoma es la distancia física real expresada en pares de bases (pb), kilo pares de bases (kb) o pares de megabases (Mb). C. melo tiene un genoma haploide total de aproximadamente 450 Mb, dividido en 12 pares de cromosomas, véase García-Mas et al, PNAS 2 de julio de 2012, p1-6 y Gonzales et al. 2010, BMC Genomics 11:339, "Fragmento de introgresión" o "segmento de introgresión" o "región de introgresión" se refiere a un fragmento cromosómico (o parte o región cromosómica) que se ha introducido en otra planta de la misma especie o de una especie afín por medio de cruces o de técnicas tradicionales de reproducción, como el retrocruzamiento, es decir, el fragmento introgresado es el resultado de los procedimientos de reproducción a los que se refiere el verbo "introgresar" (como el retrocruzamiento). En el melón, las accesiones de melón silvestre o los parientes silvestres del melón se utilizan a menudo para introgresar fragmentos del genoma silvestre en el genoma del melón cultivado, Cucumis melo. Dicha planta de melón cultivada tiene por tanto un "genoma de C. melo cultivado", pero comprende en el genoma un fragmento de un melón silvestre o de un pariente silvestre del melón, por ejemplo un fragmento de introgresión de un genoma de Cucumis silvestre relacionado, como Cucumis melo ssp. agrestis, C. melo ssp. melo, C. melo ssp. acidulous, C. callosus, C. trigonus, C. picrocarpus, u otro melón silvestre o pariente silvestre del melón. Se entiende que el término "fragmento de introgresión" nunca incluye un cromosoma completo, sino sólo una parte de un cromosoma. El fragmento de introgresión puede ser grande, por ejemplo, incluso la mitad de un cromosoma, pero es preferentemente más pequeño, como aproximadamente 15 Mb o menos, como aproximadamente 10 Mb o menos, aproximadamente 9 Mb o menos, aproximadamente 8 Mb o menos, aproximadamente 7 Mb o menos, aproximadamente 6 Mb o menos, aproximadamente 5 Mb o menos, aproximadamente 4 Mb o menos, aproximadamente 3 Mb o menos, aproximadamente 2 Mb o menos, aproximadamente 1 Mb (equivale a 1.000.000 pares de bases) o menos, o aproximadamente 05 Mb (equivale a 500.000 pares de bases) o menos, como aproximadamente 200.000 pb (equivale a 200 pares de bases) o menos, aproximadamente 100.000 pb (100 kb) o menos, aproximadamente 50.000 pb (50 kb) o menos, aproximadamente 25.000 pb (25 kb) o menos.

El"alelo de MYaV' se refiere a un alelo que confiere resistencia a MYaV encontrado en el locus MYaV6. 1, o en la parte del locus que confiere resistencia, introducido en el melón cultivado (en el cromosoma 6 de C. melo ) a partir de un melón silvestre o de un pariente silvestre del melón, por ejemplo, de plantas de las que se haya depositado una muestra representativa de semillas con el número de acceso Nc IMB 41966 o NCIMB 41969 o NCIMB41967 o NCIMB41968. El término" alelo de MYaV', por lo tanto, también abarca los alelos de MYaVque se pueden obtener de otras accesiones de Cucumis resistentes a MYaV, como los alelos ortólogos de MYaV (véase más adelante). Cuando uno o dos alelos de MYaV están presentes en el locus que confiere resistencia a MYaV en el genoma (es decir, en forma heterocigota u homocigota), la planta es resistente a MYaV, es decir, tiene un fenotipo de resistencia a MYaV. En la planta de melón cultivada que carece del fragmento de introgresión, el alelo de C. melo que se encuentra en el mismo locus del cromosoma 6 se denomina en el presente documento alelo "myav" (o alelo susceptible a MYaV). Como la resistencia es dominante, las plantas myav/myav muestran un fenotipo susceptible al MYaV, mientras que las plantas MYaV/myavy MYaV/MYaV son plantas que poseen el fenotipo resistente al MYaV conferido por el alelo M YaV (es decir, son resistentes al MYaV).

Los "alelos ortólogos deMYaV" o "ortólogos de MYaV" u "ortólogos de MYaV" son alelos de los genes de resistencia a MYaV presentes en otros melones silvestres o parientes silvestres del melón, en los cromosomas ortólogos 6. Dichos alelos ortólogos pueden, por tanto, encontrarse en el cromosoma 6 ortólogo del melón silvestre o de parientes silvestres de C. m elo, (como C. callosus, C. trigonus, C. picrocarpus y otros) y son transferibles, por introgresión, al cromosoma 6 de C. melo cultivado. Así pues, un alelo "ortólogo" (también denominado "alelo variante") se refiere a un alelo, o a un fragmento de introgresión que comprende el alelo, que se deriva de melones silvestres o parientes silvestres de la planta de melón diferentes a los presentes en cualquiera de los depósitos de semillas realizados en el presente documento, pero cuya variante comprende uno o más de los SNP vinculados al QTL (genotipo SNP resistente) y en el que la secuencia genómica variante comprende una identidad de secuencia sustancial con el SEQ ID NO: que comprende el SNP (cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12), es decir, al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia o más. Así, cuando se hace referencia en el presente documento a un genotipo SNP resistente en una secuencia genómica específica (seleccionada de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12), esto abarca también el genotipo SNP resistente en variantes de la secuencia genómica, es decir, el genotipo SNP en una secuencia genómica que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia o más con la secuencia referida (seleccionada de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12). Por lo tanto, cualquier referencia en el presente documento a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 en un aspecto también abarca una variante de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, dicha variante comprende al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia o más a dicha secuencia y comprende el genotipo SNP resistente.

La "homogeneidad" o "uniforme" se refiere a las características genéticas y fenotípicas de una línea o variedad vegetal. Las líneas consanguíneas son genéticamente muy uniformes, ya que se producen por varias generaciones

de la endogamia. Asimismo, los híbridos F1 producidos a partir de estas líneas endógamas son muy uniformes en sus características genotípicas y fenotípicas y en su rendimiento.

Un elemento genético, un fragmento de introgresión o un gen o alelo que confiere un rasgo (como la resistencia al MYaV) se dice que es "obtenible de" o puede ser "obtenido de" o "derivable de" o puede ser "derivado de" o "como está presente en" o "como se encuentra en" una planta o semilla o tejido o célula si puede ser transferido de la planta o semilla en la que está presente a otra planta o semilla en la que no está presente (como una línea o variedad) utilizando técnicas tradicionales de mejora genética sin que se produzca un cambio fenotípico de la planta receptora aparte de la adición del rasgo conferido por el elemento genético, locus, fragmento de introgresión, gen o alelo. Los términos se utilizan indistintamente y el elemento genético, el locus, el fragmento de introgresión, el gen o el alelo pueden transferirse a cualquier otro fondo genético que carezca del rasgo. No sólo se pueden utilizar las semillas depositadas que comprenden el elemento genético, el locus, el fragmento de introgresión, el gen o el alelo, sino también la progenie/descendencia de dichas semillas que han sido seleccionadas para retener el elemento genético, el locus, el fragmento de introgresión, el gen o el alelo, y que se incluyen en el presente documento, como las variedades comerciales desarrolladas a partir de las semillas depositadas o de sus descendientes. El experto puede determinar si una planta (o el ADN genómico, la célula o el tejido de una planta) comprende el mismo elemento genético, locus, fragmento de introgresión, gen o alelo que se obtiene de las semillas depositadas, utilizando una o más técnicas conocidas en la técnica, como los ensayos fenotípicos, la secuenciación del genoma completo, el análisis de marcadores moleculares, el mapeo de rasgos, el pintado de cromosomas, las pruebas de alelismo y similares.

Un "fenotipo de resistencia a MYaV" o "resistencia a MYaV" o "plantas resistentes a MYaV" se refiere a la resistencia contra MYaV conferida por el alelo MYaV (o por el alelo ortólogo de M aYV ) cuando está presente en el genoma de C. melo en dos copias (en forma homocigota) o en una copia (en forma heterocigota). El fenotipo de resistencia a MYaV y la presencia del alelo de MYaV y/u ortólogos de MYaV pueden comprobarse mediante el "ensayo de resistencia a MYaV" y/o los ensayos de marcadores de MYaV . En un aspecto, el término "resistencia al MYaV" abarca adicionalmente, o alternativamente, la resistencia contra un virus del amarilleamiento transmitido por Bemisia tabaci biotipo B, presente en los mismos lugares que el MYaV (por ejemplo noreste de Brasil), que da lugar a los mismos síntomas, o esencialmente similares, que la infección por MYaV, y contra el cual el alelo MYaV (o por el alelo ortólogo M aYV ) de la invención confiere resistencia cuando está presente en el genoma de C. melo en dos copias (en forma homocigota) o en una copia (en forma heterocigota). Este fenotipo de resistencia al virus del amarilleamiento y/o la presencia del alelo MYaV y/o de los ortólogos de MYaV puede comprobarse mediante el "ensayo de resistencia a MYaV" y/o los ensayos de marcadores de MYaV , como se ha descrito.

Un "ensayo de resistencia a MYaV" puede llevarse a cabo de diferentes maneras, ya sea por injerto o, preferentemente, como una prueba de campo, como también se describe en otra parte del presente documento. Peferentemente, se utiliza un ensayo de campo en una zona de alta incidencia natural de Bemisia tabaci biotipo B portadora del MYaV, como el noreste de Brasil, u otras zonas en las que hay una alta incidencia de la enfermedad del MYaV (es decir, una zona infestada de MYaV). Se considera que una planta de un genotipo concreto es resistente al MYaVsi la puntuación media de resistencia a la enfermedad de una pluralidad de plantas (al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, en al menos dos o tres réplicas preferentemente) de ese genotipo es significativamente mayor en comparación con los controles susceptibles (plantas que carecen de un fragmento de introgresión que comprende un alelo de MYaVo un ortólogo de MYaV, como las variedades de melón Galia Amaregal F1 (Nunhems) o Glory (Origene Seeds); o las variedades de melón Piel de Sapo Medellín (Nunhems) o Sancho (Syngenta)), cuando se cultivan en el mismo entorno. Así, por ejemplo, las plantas de melón de una línea que comprende la introgresión del locus que confiere resistencia al MYaV, o una parte de éste que confiere resistencia, en forma heterocigótica u homocigótica, pueden cultivarse junto con plantas de melón de control adecuadas (especialmente plantas de melón susceptibles al MYaV) en un campo abierto en el noreste de Brasil y cuando todas las plantas de control susceptibles muestran claros síntomas de amarilleamiento (véase la figura 2) todas las plantas se fenotipan en una escala de resistencia a la enfermedad de 1 (hojas totalmente amarillas, es decir hojas en el primer 1/3 de la planta son 100 % amarillas) a 9 (hojas totalmente verdes; las hojas del primer 1/3 de la planta son 100 % verdes), por lo que 2 = alrededor del 81 % al 99 % de la superficie foliar del primer 1/3 de la planta es amarilla, 3 = alrededor del 65 % al 80 % de la superficie foliar del primer 1/3 de la planta es amarilla, 4 = alrededor del 49 % al 64 % de la superficie foliar del primer 1/3 de la planta es amarilla, 5 = aproximadamente del 33 % al 48 % de la superficie foliar del primer 1/3 de la planta es amarilla, 6 = aproximadamente del 17 % al 32 % de la superficie foliar del primer 1/3 de la planta es amarilla, 7 = hasta aproximadamente el 17 % de la superficie foliar del primer 1/3 de la planta es amarilla, 8 = algunas hojas del primer 1/3 de la planta empiezan a mostrar sombra amarilla / moteado. El primer 1/3 de la planta se refiere a las hojas más viejas en el primer 1/3 de la zona de la planta, tal y como se determina desde el sistema principal de tallo/raíz de la planta y como se ve en la Figura 2 (rectángulo negro). Las hojas más jóvenes de las vides, más hacia la punta de las vides, no se fenotipan, ya que generalmente son verdes en el momento del fenotipado y se vuelven amarillas sólo en las plantas susceptibles después de varios días más, por ejemplo, 7-10 días después (aunque ya contienen el virus en el momento del fenotipado). Las plantas con una puntuación media de resistencia a la enfermedad que es significativamente más alta que la puntuación media de la enfermedad de los controles susceptibles, por ejemplo, una puntuación media de al menos 3,0, preferentemente de al menos 4,0, más preferentemente de al menos 5,0, de al menos 6,0, de al menos 7,0, de al menos 8,0, más preferentemente de 9,0, son en el presente documento plantas resistentes a MYaV o plantas que tienen una resistencia a MYaV.

El''ensayo de marcadoresde MYaV' es un ensayo de marcadores moleculares que puede utilizarse para comprobar si en el cromosoma 6 de C. melo está presente en el genoma una introgresión desde un melón silvestre, o pariente silvestre del melón, que comprende el alelo de MYaV (o un alelo ortólogo) (o si en el melón silvestre o parientes silvestres del melón comprenden la región que comprende el QTL de MYaV6.1 en su genoma), determinando el genotipo de uno o más marcadores vinculados al QTL, por ejemplo el genotipo de los marcadores SNP mME15090 y/o mME12135 (en un aspecto preferentemente tanto mME15090 como mME12135), y/o cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre los marcadores SNP mME15090 y mME12135 y/o dentro de 7cM o dentro de 5cM de cualquiera de estos marcadores, y/o dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb o 1 Mb o menos de cualquiera de estos marcadores, y/o opcionalmente A) de uno o más marcadores seleccionados del grupo mME40332, mME28908, mME9692, mME50656, o cualquier silvestre-C. melogenoma o marcador específico del genoma relativo del melón silvestre entre mME1509 y mME50656, y/o B) de uno o más marcadores seleccionados del grupo mME21377, mME36533, mME13585, o cualquier marcador específico del melogenoma silvestre C. específico del melogenoma o del genoma relativo del melón silvestre entre mME21377 y mME13585 y/o C) de uno o más marcadores seleccionados del grupo mME21377, mME13585, o cualquier marcador específico del melogenoma o del genoma relativo del melón silvestre entre mME21377 y mME13585, especialmente entre mME21377 y mME12135.

"Melón" o "melón almizcleño" se refiere en el presente documento a las plantas de la especie Cucumis melo. Los melones o "melones almizcleños", Cucumis melo, pueden clasificarse en: C. melocantalupensis, C. melo inodorous y C. melo reticulatus. Los C. melo cantalupensis también se denominan Cantalupos y tienen principalmente una forma redonda con costillas prominentes y casi sin red. La mayoría tienen una carne anaranjada y dulce y suelen ser muy aromáticas. A diferencia del cantalupo europeo, el "Cantalupo" norteamericano no es de este tipo, sino que pertenece a los verdaderos melones almizcleños. C. melo inodorous (o melones de invierno) puede subdividirse en diferentes tipos, como melón Honeydew, Piel de Sapo, melón de azúcar, melón japonés, etc. C. melo reticulatus es el verdadero melón almizcleño, con piel reticulada (en red) y comprende los melones Galia, Sharlyn y el cantalupo norteamericano.

El término "melón cultivado" se refiere a las plantas de Cucumis melo , es decir, a las variedades, líneas de mejora o cultivares de la especie C. melo, cultivadas por el ser humano y que tienen buenas características agronómicas, especialmente la producción de frutos comestibles y comercializables de buen tamaño y calidad y uniformidad; preferentemente, dichas plantas no son "plantas silvestres", es decir, plantas que generalmente tienen un rendimiento y unas características agronómicas mucho más pobres que las plantas cultivadas y que, por ejemplo, crecen de forma natural en poblaciones silvestres. Las "plantas silvestres" incluyen, por ejemplo, los ecotipos, las líneas de introducción de plantas, las razas autóctonas o las accesiones silvestres o los parientes silvestres de una especie.

El melón y los parientes silvestres del melón son diploides y tienen 12 pares de cromosomas homólogos, numerados del 1 al 12. "Cromosoma 6 del melón" se refiere al cromosoma 6 de C. melo , tal y como se conoce en la técnica y según la nomenclatura ICuGI. El "cromosoma 6 ortólogo" se refiere al cromosoma 6 de los parientes silvestres del melón, partes del cual pueden ser introgresadas en el cromosoma 6 del melón cultivado.

El "melón silvestre" incluye las plantas silvestres de la especie Cucumis melo, por ejemplo, C. melo ssp agrestis, C. melo ssp. melo, C. melo var. texanus, C. melo var. acidulous, las semillas depositadas bajo NCIMB 41966, NCIMB 41969, NCIMB41962, NCIMB41968, y otras accesiones silvestres de C. melo , como por ejemplo las variedades locales o las accesiones de PI encontradas en http://www.ars-grin.gov u otras colecciones de semillas. Las semillas depositadas bajo NCIMB 41966 se obtuvieron de la colección ARS-GRIN en los Estados Unidos y tienen como origen designado "India". Las semillas depositadas bajo el NCIMB 41969 se obtuvieron en España y tienen como origen Uzbekistán. Las semillas depositadas con el número de acceso NCIMB 41967 y las semillas depositadas con el número NCIMB 41968 se obtuvieron en los Estados Unidos y tienen un origen desconocido.

Los "parientes silvestres del melón" incluyen las plantas silvestres de otras especies de Cucumis , pero que pueden cruzarse con Cucumis melo para producir descendencia fértil (opcionalmente con la ayuda del rescate de embriones, la mejora dependiente de la temperatura del crecimiento del tubo de polen o técnicas similares para superar las barreras reproductivas) y de las que se pueden obtener fragmentos de cromosomas y transferirlos a Cucumis melo (ya sea mediante cruces interespecíficos con C. melo o mediante cruces con una especie puente). Ejemplos de parientes silvestres del melón son C. anguria, C. metuliferus, Cucumis callosus, Cucumis trigonus, Cucumis ficifolius, C. picocarpus, C. zeyheri, C. africanus, C. meeusei, C. prophetarum, C. hystrix, C. queenslandicus, y otras especies de Cucumis (véase por ejemplo Sebastian et al. 2010, PNAS Vol 107, no. 32, 14269-14273).

"Media" o "promedio" se refiere en el presente documento a la media aritmética y ambos términos se utilizan indistintamente. El término "media" o "promedio" se refiere, pues, a la media aritmética de varias mediciones. El experto entiende que el fenotipo de una línea o variedad vegetal depende en cierta medida de las condiciones de cultivo y que, por lo tanto, se miden las medias aritméticas de al menos 10, 15, 20, 30 o más plantas (o partes de plantas), preferentemente en diseños experimentales aleatorios con varias réplicas y plantas de control adecuadas cultivadas en las mismas condiciones en el mismo experimento. ";Estadísticamente significativa"t; o "estadísticamente significativa"; diferente o "significativamente"; diferente se refiere a un carácter de una línea o variedad vegetal que, cuando se compara con un control adecuado, muestra una diferencia estadísticamente significativa en ese carácter (por ejemplo, p

< 0,05 utilizando ANOVA) con respecto a la (media del) control.

Un "cromosoma recombinante" se refiere a un cromosoma que tiene una nueva composición genética que surge a través del cruce entre cromosomas homólogos, por ejemplo, un "cromosoma 6 recombinante", es decir, un cromosoma 6 que no está presente en ninguna de las plantas progenitoras y que surgió a través de un evento raro de cruce entre cromosomas homólogos de un par de cromosomas 6. En este caso, por ejemplo, se proporciona un cromosoma 6 de melón recombinante que comprende un locus que confiere resistencia a MYaV, o una parte de éste que confiere resistencia (que comprende un alelo de resistencia a MYaV).

El término "técnicas tradicionales de cría" abarca en el presente documento el cruce, el retrocruzamiento, la autofecundación, la selección, la producción de dobles haploides, el rescate de embriones, la fusión de protoplastos, la selección asistida por marcadores, la cría por mutaciones, etc., tal como los conoce el obtentor (es decir, procedimientos distintos de la modificación genética/transformación/procedimientos transgénicos), mediante los cuales, por ejemplo, se puede obtener, identificar y/o transferir un cromosoma 6 recombinante.

El "retrocruzamiento" se refiere a un procedimiento de mejora mediante el cual un rasgo (único), como la resistencia al MYaV, puede transferirse de un fondo genético inferior (por ejemplo, un melón silvestre o un pariente silvestre del melón; también denominado "donante") a un fondo genético superior (también denominado "progenitor recurrente"), por ejemplo, el melón cultivado. La descendencia de un cruce (por ejemplo, una planta F1 obtenida mediante el cruce de un melón silvestre resistente al MYaV con un melón cultivado susceptible al MYaV; o una planta F2 o F3, etc., obtenida de la autofecundación de la F1) se "retrocruzará" con el progenitor con el fondo genético superior, por ejemplo, con el progenitor cultivado susceptible al MYaV. Tras repetidos retrocruzamientos, el rasgo del fondo genético inferior se habrá incorporado al fondo genético superior.

La "selección asistida por marcadores" o "MAS" es un proceso en el que se utiliza la presencia de marcadores moleculares, que están genéticamente ligados aun locus particular o a una región cromosómica concreta (por ejemplo, un fragmento de introgresión), para seleccionar plantas por la presencia del locus o región específicos (fragmento de introgresión). Por ejemplo, un marcador molecular vinculado genéticamente aun locus de resistencia al MYaV, puede utilizarse para detectar y/o seleccionar plantas de melón que comprendan el locus de resistencia al MYaV. Cuanto más cercano sea el enlace genético del marcador molecular al locus (por ejemplo, aproximadamente 7cM, 6cM, 5cM, 4cM, 3cM, 2cM, 1cM, 0,5cM o menos), menos probable será que el marcador se disocie del locus por recombinación meiótica. Del mismo modo, cuanto más cerca estén dos marcadores entre sí (por ejemplo, dentro de 7cM o 5cM, 4cM, 3cM, 2cM, 1cM o menos), menos probable será que los dos marcadores se separen entre sí (y más probable será que co-segreguen como una unidad).

Un marcador "dentro de 7cM o dentro de 5cM" de otro marcador se refiere a un marcador que mapea genéticamente dentro de la región de 7cM o 5cM que flanquea al marcador (es decir, a cualquier lado del marcador). Del mismo modo, un marcador dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb, 1 Mb o menos de otro marcador se refiere a un marcador que se encuentra físicamente dentro de los 5Mb, 3Mb, 2Mb o 1 Mb, o menos, de la región de ADN genómico que flanquea al marcador (es decir, a cualquier lado del marcador).

La "puntuación LOD" (logaritmo (base 10) de las probabilidades) se refiere a una prueba estadística que se utiliza a menudo para el análisis de ligamiento en poblaciones animales y vegetales. La puntuación LOD compara la probabilidad de obtener los datos de la prueba si los dos loci (loci de marcadores moleculares y/o un locus de rasgo fenotípico) están realmente vinculados, con la probabilidad de observar los mismos datos por puro azar. Las puntuaciones LOD positivas favorecen la presencia de enlace y una puntuación LOD superior a 3,0 se considera una prueba de enlace. Una puntuación LOD de 3 indica una probabilidad de 1000 a 1 de que el enlace observado no se haya producido por casualidad.

"Propagación vegetativa", "reproducción vegetativa" o "propagación clonal" se utilizan indistintamente en el presente documento y significan el procedimiento de tomar parte de una planta y permitir que esa parte de la planta forme al menos raíces, donde la parte de la planta es, por ejemplo definida como o derivada de (por ejemplo, por corte de) hoja, polen, embrión, cotiledón, hipocótilo, células, protoplastos, célula meristemática, raíz, punta de raíz, pistilo, antera, flor, punta de brote, brote, tallo, fruto, pecíolo, etc. Cuando una planta entera se regenera por propagación vegetativa, también se denomina propagación vegetativa.

El "cultivo celular" o "cultivo de tejidos" se refiere al cultivo in vitro de células o tejidos de una planta.

"Regeneración" se refiere al desarrollo de una planta a partir de un cultivo celular o de tejidos o de la propagación vegetativa.

"Transgén" o "gen quimérico" se refiere a un locus genético que comprende una secuencia de ADN, como un gen recombinante o un cromosoma recombinante o parte de él, que se ha introducido en el genoma de una planta de melón por transformación, como la transformación mediada por Agrobacterium. Una planta que contiene un transgén integrado de forma estable en su genoma se denomina "planta transgénica". Un transgén o una planta transgénica también puede contener un cromosoma recombinante completo o parte de un cromosoma recombinante, por ejemplo, la parte que comprende el alelo de MYaV, introducido en el genoma por transformación.

Una "secuencia de ácido nucleico aislada" o "ADN aislado" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que ya no se encuentra en el entorno natural del que se aisló, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped bacteriana o en el genoma nuclear o plastidial de una planta.

Una "célula huésped" o una "célula huésped recombinante" o "célula transformada" son términos que se refieren a una nueva célula individual (u organismo) que surge como resultado de la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico en dicha célula. La célula huésped es preferentemente una célula vegetal o una célula bacteriana. La célula huésped puede contener el ácido nucleico como una molécula de replicación extracromosómica (episomal), o comprende el ácido nucleico integrado en el genoma nuclear o plastidial de la célula huésped, o como cromosoma introducido, por ejemplo, minicromosoma.

La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" pueden determinarse mediante la alineación de dos secuencias peptídicas o de dos nucleótidos utilizando algoritmos de alineación global o local. Las secuencias pueden considerarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando se alinean de forma óptima, por ejemplo, con los programas GAP o BESTFIT o con el programa "Needle" de Emboss (utilizando los parámetros por defecto, véase más adelante) y comparten al menos un determinado porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define más adelante). Estos programas utilizan el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de brechas. En general, se utilizan los parámetros por defecto, con una penalización de creación de brechas = 10 y una penalización de extensión de brechas = 0,5 (tanto para los alineamientos de nucleótidos como de proteínas). Para los nucleótidos la matriz de puntuación por defecto utilizada es DNAFULL y para las proteínas la matriz de puntuación por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919). Los alineamientos de secuencias y las puntuaciones de los porcentajes de identidad de secuencias pueden determinarse, por ejemplo, mediante programas informáticos, como EMBOSS, disponible en la red mundial en ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/). Alternativamente, la similitud o identidad de la secuencia puede determinarse mediante la búsqueda en bases de datos como FASTA, BLAST, etc., pero los resultados deben recuperarse y alinearse por pares para comparar la identidad de la secuencia. Dos proteínas o dos dominios proteicos, o dos secuencias de ácidos nucleicos tienen "identidad de secuencia sustancial" si el porcentaje de identidad de secuencia es de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más (por ejemplo, al menos 99,1, 99,299,399,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 o más (según lo determinado por Emboss "needle" utilizando parámetros por defecto, es decir, penalización por creación de brechas = 10, penalización por extensión de brechas = 0,5, utilizando la matriz de puntuación DNAFULL para ácidos nucleicos y Blosum62 para proteínas).

Cuando se hace referencia a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ADN genómico) que tiene una "identidad de secuencia sustancial con" una secuencia de referencia o que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 %, por ejemplo, al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 %, el 99,2 %, el 99,5 %, el 99,9 % de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de referencia, en una realización dicha secuencia de nucleótidos se considera sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos dada y puede identificarse utilizando condiciones de hibridación estrictas. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico comprende una o más mutaciones en comparación con la secuencia de nucleótidos dada, pero aún así puede identificarse utilizando condiciones de hibridación estrictas.

Las "condiciones estrictas de hibridación" pueden utilizarse para identificar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos determinada. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en distintas circunstancias. Por lo general, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia objetivo se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. Típicamente, se elegirán condiciones estrictas en las que la concentración de sal es de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es de al menos 60 °C. La disminución de la concentración de sal y/o el aumento de la temperatura aumentan la rigurosidad. Las condiciones estrictas para las hibridaciones ARN-ADN (transferencias Northern que utilizan una sonda de, por ejemplo, 100 nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado en SSC 0,2X a 63 °C durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Las condiciones estrictas para la hibridación ADN-ADN (transferencias Southern utilizando una sonda de, por ejemplo, 100nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado (normalmente 2) en SSC 0,2X a una temperatura de al menos 50 °C, normalmente aproximadamente 55 °C, durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Véase también Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001).

El "mapeo fino" se refiere a los procedimientos por los que la posición de un QTL puede determinarse con mayor precisión (reducirse) y por los que el tamaño del fragmento de introgresión que comprende el QTL se reduce. Por ejemplo, se pueden hacer Líneas Isogénicas Cercanas para el QTL (QTL-NILs), que contienen diferentes fragmentos superpuestos del fragmento de introgresión dentro de un fondo genético por lo demás uniforme del padre recurrente. Dichas líneas se pueden utilizar para mapear en qué fragmento se encuentra el QTL e identificar una línea que tenga un fragmento de introgresión más corto que comprenda el QTL.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención divulga una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV). En particular, la resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 del melón, donde dicho fragmento de introgresión es de una planta silvestre de la especie Cucumis melo o de un pariente silvestre del melón.

Los presentes inventores cruzaron dos accesiones silvestres diferentes de C. melo , cuyas semillas representativas fueron depositadas bajo NCIMB 41966 y NCIMB 41969, con una línea de mejora de melón susceptible al MYaV y con una variedad de melón susceptible, respectivamente, y llevaron a cabo un mapeo de QTL, basado en datos de fenotipado obtenidos en campos infestados por el MYaV cerca de Mossoro (Rio Grande do Norte, Brasil).

Sorprendentemente, en ambas poblaciones de mapeo, se encontró un QTL altamente significativo para la resistencia a MYaV en el cromosoma 6 del melón, indicando que diferentes accesiones silvestres de Cucumis melo comprenden un locus de resistencia a MYaV en el cromosoma 6, que fue transferido a C. melo cultivado y confirió resistencia a MYaV a la planta de melón cultivada. En las dos poblaciones de mapeo el QTL, que se denominó MYaV6.1, explicó el 32,6 % y el 91,7 % de la variación fenotípica observada para la resistencia a MYaV, y es por tanto altamente significativo.

Se observa que cuando se hace referencia en el presente documento a un (uno) QTL(MYaV6.1) o a un locus que confiere resistencia a MYaV (o a una parte que confiere resistencia) en el cromosoma 6 del genoma de C. melo , puede ser que haya de hecho dos (o más) QTLs vinculados entre sí en el cromosoma 6, ya que la puntuación LOD tiene dos picos en ambas poblaciones de mapeo (véase la Figura 1). Así, la referencia a un q Tl o a un locus abarca la posibilidad de que haya dos (o más) QTL o dos (o más) loci acoplados entre sí en el cromosoma 6. Igualmente, la referencia en el presente documento a un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 que tenga un QTL o un locus que confiera resistencia al MYaV (o una parte del mismo que confiera resistencia) abarca que el fragmento de introgresión comprende todos los loci que confieren resistencia, o, en el caso de fragmentos de introgresión más pequeños, al menos una región de introgresión lo suficientemente grande (con uno, dos o más QTL) como para que el fragmento de introgresión confiera resistencia al MYaV cuando el fragmento de introgresión esté en forma heterocigota u homocigota en el genoma de C. melo . Así, en el caso de fragmentos de introgresión más pequeños, el fragmento de introgresión comprende preferentemente al menos el QTL principal (es decir, el mayor de los dos picos LOD de la figura 1). En un aspecto, el fragmento de introgresión comprende el genotipo de resistencia de al menos uno o ambos marcadores seleccionados entre los marcadores comunes mME15090 y mME12135. Especialmente la presencia del genotipo de resistencia del marcador mME12135 es indicativa de la presencia del QTL. En un aspecto, el fragmento de introgresión comprende el genotipo de resistencia de al menos uno o ambos marcadores seleccionados entre los marcadores comunes mME15090y mME12135 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón salvaje o pariente salvaje del melón entre los marcadores SNP mME15090 y mME12135, y/o dentro de 7 cM o dentro de 5 cM de cualquiera de estos marcadores, y/o dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb o 1 Mb o menos de cualquiera de estos marcadores.

Los dos marcadores mME15090 y mME12135 también se encontraron en otras dos accesiones silvestres, NCIMB 41967 y NCIMB 41968 y se confirmó que estas dos accesiones silvestres de C. melo contienen el QTL en el cromosoma 6. Ambas accesiones fueron resistentes al MYaV (con una puntuación media de amarilleamiento de 9) y ambas accesiones se cruzaron con el cultivar de melón susceptible Amaregal (un melón Galia) para producir, mediante retrocruzamiento, un melón cultivado con un fragmento de introgresión de NCIMB41967 o NCIMB41968 en el cromosoma 6. El QTL para la resistencia al MYaV se hereda como un gen dominante monogénico. También los melones cultivados que comprenden la introgresión en el cromosoma 6, como indica la presencia del genotipo de resistencia del marcador mME12135 y/o mME15090, fueron resistentes contra el MYaV. Véanse también los Ejemplos.

Así, en un aspecto descrito en el presente documento, se descubrió que un loci de rasgo cuantitativo (QTL MYaV6.1) que confiere resistencia al MYaV está presente en el cromosoma 6 de los melones silvestres y que este QTL, cuando se transfiere (introgresa) a una variedad de melón cultivado, susceptible al MYaV, o a una línea de mejora, y cuando está presente en forma heterocigótica u homocigótica, confiere resistencia al MYaV a la planta de melón cultivada. El QTL, o el fragmento de introgresión que comprende el QTL (que comprende el alelo de resistencia al MYaV), es por tanto dominante, es decir, basta con tener el fragmento de introgresión en uno de los cromosomas 6 (un cromosoma 6 recombinante), mientras que el cromosoma 6 homólogo del par puede ser un cromosoma 6 (no recombinante) de C. melo cultivado que carece del fragmento de introgresión.

Aunque las fuentes actuales de introgresiones de alelos de resistencia a MYaVson dos fuentes silvestres (NCIMB 41966 y NCIMB 41969, de la India y Uzbekistán, respectivamente), es probable que haya otras accesiones silvestres de Cucumis que comprendan alelos de MYaVo alelos ortólogos de MYaV en el mismo locus del cromosoma 6. Dichos alelos de MYaVo alelos ortólogos de MYaVtambién pueden identificarse e introgresarse en C. melo cultivado como se describe en el presente documento, para generar una planta de C. melo cultivada que comprenda un genoma de C. melo y un cromosoma 6 recombinante, en el que el cromosoma 6 recombinante comprende un fragmento de introgresión de la especie Cucumis silvestre, que confiere un fenotipo de resistencia a MYaV a la planta de C. melo cultivada cuando está presente en forma homocigota o heterocigota.

En un aspecto, los inventores han encontrado dos accesiones silvestres adicionales, NCIMB41967 y NCIMB41968, que comprenden el QTL en el cromosoma 6 y que comprenden el genotipo de resistencia del marcador mME12135 y/o mME15090, es decir, el genoma de la planta comprende al menos una A (genotipo AA o AG) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 3 y/o al menos una C (genotipo CC o AC) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 1, respectivamente. Estas dos accesiones silvestres también se han utilizado para hacer un melón cultivado (por retrocruzamiento) que comprende un fenotipo de resistencia a MYaV conferido por un fragmento de intregresión en el cromosoma 6 que comprende el QTL de NCIMB41967 o NCIMB41968, como indica la presencia del genotipo de resistencia del marcador mME12135 y/o mME15090.

Otras accesiones de melones silvestres y parientes silvestres del melón, como las accesiones obtenidas de la colección del Sistema Nacional de Germoplasma Vegetal del USDA o de otras colecciones de semillas, pueden examinarse para detectar la resistencia al MYaV mediante ensayos fenotípicos y/o de marcadores del MYaV, y las accesiones resistentes pueden cruzarse con una planta de Cucumis melo que carezca de resistencia al MYaV. La generación F2 (o una generación posterior, como la F3 o una generación de retrocruzamiento) puede entonces examinarse para detectar plantas recombinantes que tengan el fenotipo de resistencia al MYaV y/o el fragmento de introgresión o una parte del mismo, utilizando los ensayos de marcadores moleculares descritos en el presente documento.

Plantas, semillas y partes de plantas divulgadas en la invención

Así, en una primera divulgación se describe una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV).

La presencia de un fenotipo de resistencia a MYaV puede determinarse utilizando el ensayo de resistencia a MYaV, mediante el cual se examinan las plantas en busca de resistencia en condiciones naturales de campo en una o más áreas donde la incidencia de MYaV es alta, como el noreste de Brasil. Las plantas revelan tener resistencia al MYaV si su puntuación media de la enfermedad, en una escala de 9 = hojas totalmente verdes (en el primer 1/3 de la planta) a 1 = hojas totalmente amarillas (en el primer 1/3 de la planta), es significativamente mayor que la puntuación media de la enfermedad de las variedades susceptibles al MYaV, cuando se cultivan en las mismas condiciones ambientales. La puntuación media de la enfermedad de las plantas de melón cultivadas resistentes al MYaV es, en una realización, de al menos 3, preferentemente de al menos 4, en una escala de 1 = hojas totalmente amarillas a 9 = hojas totalmente verdes, cuando se cultivan en el campo en el noreste de Brasil, o en cualquier otro campo donde la incidencia del MYaV es alta. En otra realización, la puntuación media de la enfermedad es al menos 5, 6, 7, 8 o 9. Si la incidencia del MYaV es alta, puede verse debido a los graves síntomas de amarilleamiento (puntuación media de la enfermedad = 1) que se desarrollan en las plantas de control susceptibles, como los cultivares Sancho, Amaregal u otros. Alternativa o adicionalmente se pueden determinar los niveles del virus MYaV en el tejido del melón, por ejemplo, utilizando anticuerpos policlonales desarrollados para la detección del MYaV.

Las puntuaciones medias de la enfermedad se calculan preferentemente sobre la base de al menos cuatro plantas de una línea o variedad, preferentemente al menos 5, 10, 15, 20 o más plantas cultivadas en las mismas condiciones ambientales.

La resistencia contra el MYaV se confiere mediante un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, en el que el fragmento de introgresión se deriva de un genoma de melón silvestre o de un pariente silvestre del melón. El fragmento de introgresión comprende el locus de rasgo cuantitativo (QTL) denominado en el presente documento MYaV6.1, que a su vez comprende un alelo de resistencia a MYaV, o un alelo de resistencia ortóloga a MYaV, del gen de resistencia a MYaV.

Las plantas de melón cultivadas divulgadas, por tanto, tienen un cromosoma 6 recombinante, que comprende un fragmento de introgresión de un cromosoma 6 de melón silvestre o de un cromosoma 6 ortólogo de un pariente silvestre de melón.

Como la resistencia es dominante, el fenotipo de resistencia se observa cuando el alelo de resistencia (y el SNP vinculado al alelo) está en forma heterocigota u homocigota, las plantas de melón cultivadas divulgadas tienen el fragmento de introgresión, o la parte de éste que confiere resistencia, en el cromosoma 6 en forma heterocigota u homocigota.

En un aspecto, el fragmento de introgresión es identificable por al menos un marcador seleccionado entre:

a) el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 9), o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 (o a la SEQ ID NO: 9);

b) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 (o SEQ ID NO: 10) o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 (o con la SEQ ID NO: 10).

En otro aspecto, el fragmento de introgresión comprende el genotipo de resistencia de al menos uno o ambos marcadores seleccionados de entre los marcadores comunes mME15090 y mME12135 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o salvaje entre los marcadores SNP mME15090 y mME12135, y/o dentro de 7cM o dentro de 5cM de cualquiera de estos marcadores, y/o dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb o 1 Mb o menos de cualquiera de estos marcadores.

El fragmento de introgresión es derivable de (o derivado de) u obtenible de (u obtenido de; o como presente en) una planta silvestre de la especie Cucumis melo, que comprende el QTL MYaV(MYaV6.1) en el cromosoma 6. Alternativamente, el fragmento de introgresión es derivable de (o derivado de) u obtenible de (obtenido de; o como presente en) un pariente silvestre de Cucumis melo, que puede ser cruzado con Cucumis melo (opcionalmente usando rescate de embriones u otras técnicas para ayudar a la producción de una descendencia viable), de modo que el fragmento del cromosoma 6 ortólogo puede ser introgresado en el cromosoma 6 de C. melo, especialmente de C. melo cultivado.

En un aspecto específico descrito, el fragmento de introgresión que comprende el locus de resistencia a MYaV es derivado de (o derivado de) u obtenible de (u obtenido de; o como presente en) plantas silvestres de C. melo , una muestra representativa de semillas de las cuales ha sido depositada bajo el número de acceso NCIMB 41966 o NCIMB41969 o NCIMB41967 o NCIMB 41968, o de otras accesiones silvestres de melón o parientes silvestres de melón. En una realización, el fragmento de introgresión es identificable por uno o más de los marcadores descritos en este documento, especialmente la presencia del genotipo de resistencia de los marcadores mME12135 y/o mME15090. En un aspecto, el fragmento de introgresión es identificable por el genotipo de resistencia de al menos uno o ambos marcadores seleccionados entre los marcadores comunes mME15090 y mME12135 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón salvaje o pariente salvaje del melón entre los marcadores SNP mME15090 y mME12135, y/o dentro de 7cM o dentro de 5cM de cualquiera de estos marcadores, y/o dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb o 1 Mb o menos de cualquiera de estos marcadores.

En un aspecto, la invención describe una planta cultivada de C. melo que comprende resistencia contra el MYaV, en la que la resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 del melón, en el que dicho fragmento de introgresión (que confiere dicha resistencia al MYaV) se obtiene (o se puede obtener) cruzando una planta silvestre de C. melo silvestre que comprende uno o más de los marcadores divulgados en el presente documento (vinculados al QTL; especialmente el marcador mME15090 y/o mME12135) y que comprende un fenotipo de resistencia a MYaV con una planta de melón cultivada.

En un aspecto se describe una planta cultivada de C. melo que comprende resistencia contra el MYaV, en la que la resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 del melón, en el que dicho fragmento de introgresión (que confiere dicha resistencia al MYaV) se obtiene (o puede obtenerse) cruzando una planta cuyas semillas fueron depositadas bajo el número de acceso NCIMB 41966 o NCIMB41969 o NCIMB 41967 o NCIMB 41968 con una planta cultivada de melón. Estas accesiones silvestres de C. melo tienen un fenotipo de resistencia al MYaV, con una puntuación media de la enfermedad de 9,0 (las hojas permanecen verdes), en comparación con una puntuación media de la enfermedad inferior a 2,0, o inferior a 1,5, para las variedades de melón susceptibles, como Amaregal F1. El fragmento de introgresión también puede derivarse de (u obtenerse de) otras plantas silvestres de C. melo u otros parientes silvestres del melón, que tengan una puntuación media de la enfermedad del MYaV de al menos 7, preferentemente de al menos 8, más preferentemente de 9, como se determina, por ejemplo, en el ensayo de resistencia al MYaV.

En otro aspecto, la invención divulga una planta, es decir una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV), en la que dicha resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 en forma homocigota o heterocigota y en la que dicho fragmento de introgresión procede de una planta silvestre de la especie Cucumis melo en la que el fragmento de introgresión es, en un aspecto, "como en" / es "idéntico a" / es "igual que en" el fragmento que confiere resistencia al MYaV en el cromosoma 6, tal como está presente en las semillas depositadas con el número NCIMB 41967, NCIMB 41968, NCIMB 41966, NCIMB 41969, NCIMB 42113 o NCIMB 42198. Como las accesiones silvestres serán genéticamente divergentes, la secuencia genómica del fragmento de introgresión probablemente no será idéntica, e incluso el gen que confiere la resistencia (que comprende un promotor, intrones y exones) puede ser divergente en la secuencia de nucleótidos, pero la función será la misma, es decir, conferir resistencia al MYaV. La divergencia también puede verse en el presente documento, en el sentido de que ciertos marcadores vinculados al QTL MYaV6. 1 no son "marcadores comunes" (como los marcadores comunes mME12135 y mME15090 que se encuentran en las 4 accesiones), sino que son específicos para el QTL MYaV6. 1 tal como se encuentra en una accesión específica. Así, por ejemplo (además de los marcadores comunes) los marcadores mME21377, mME36533 y/o mME13585 se encontraron vinculados al QTL en NCIMB41969; los marcadores mME40332, mME28908, mME9692 y/o mME50656 se encontraron vinculados al QTL en la accesión NCIMB41966; los marcadores mME21377 y/o mME13585 se encontraron vinculados al QTL en NCIMB41968 y NCIMB41967.

La persona experta es capaz de identificar e introgresar la región que comprende el QTL MYaV6. 1 encontrada en otras accesiones de melón silvestre u otros parientes silvestres del melón en C. melo cultivado como se explicará más adelante. El experto también es capaz de identificar otros marcadores moleculares vinculados a (asociados con) el QTL, que pueden utilizarse para identificar la presencia de un fragmento de introgresión de esos otros melones silvestres o parientes silvestres del melón en el cromosoma 6 de C. melo. Dos de los marcadores moleculares proporcionados en el presente documento se encontraron asociados con el QTL de resistencia al MYaV, donde el fragmento de introgresión se obtuvo de cuatro fuentes silvestres diferentes. Estos dos marcadores también pueden estar ligados (asociados) a la resistencia a MYaV en el cromosoma 6, o en cromosomas ortólogos 6, y por lo tanto pueden ser útiles para derivar el QTL de diferentes fuentes. Alternativamente, el experto puede identificar otros marcadores moleculares utilizando procedimientos conocidos.

En una realización, la presencia del fragmento de introgresión, o la región del cromosoma 6 (o la región ortóloga del cromosoma 6), que comprende el locus de resistencia a MYaV, es detectable mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno, preferentemente al menos los dos siguientes marcadores de polimorfismo de nucleótido único (SNP):

a) el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 9) o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 (o con la SEQ ID NO: 9);

b) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 (o SEQ ID NO: 10) o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 (o con la SEQ ID NO: 10).

En otro aspecto, la presencia del fragmento de introgresión, o la región del cromosoma 6 (o la región del cromosoma 6 ortóloga), que comprende el locus de resistencia a MYaV, es detectable mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno, preferentemente al menos dos o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en el marcador mME15090, el marcador mME12135, cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o silvestre entre los marcadores SNP mME15090 y mME12135 cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón dentro de 7cM o dentro de 5cM de mME15090 o mME12135, cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón dentro de 5Mb, 3Mb, 2Mb o 1 Mb o menos de mME15090 o mME12135.

Como se ha mencionado, los dos marcadores SNP mME15090 y mME12135 se encontraron genéticamente vinculados (o asociados) al fragmento de introgresión en el cromosoma 6 que comprende el QTL MYaV6.1 en ambas poblaciones de mapeo, es decir, en plantas que comprenden el QTL de resistencia de dos accesiones de melón silvestre diferentes y también en otras dos accesiones de melón silvestre, a saber, NCIMB41967 y NCIMB41968 que eran resistentes al MYaV. Estos dos marcadores se denominan marcadores comunes, ya que se encontraron vinculados al QTL en cuatro accesiones silvestres.

Así, en un aspecto, las plantas resistentes a MYaV divulgada en el presente documentos comprenden al menos una citosina (C) (es decir, el genotipo CC o AC) en lugar de dos adeninas (AA) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO:1 (o SEQ ID NO:9) o de una secuencia esencialmente similar que comprende al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 (o a la SEQ ID NO: 9) (denominado marcador SNP mME15090) y/o comprenden al menos una adenina (A) (es decir, el genotipo AA o AG) en lugar de dos guaninas (GG) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 3 (o SEQ ID NO: 10) o de una secuencia esencialmente similar que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 (o con la SEQ ID NO: 10) (denominado marcador SNP mME12135). El genotipo SNP se refiere a dos nucleótidos, y las secuencias genómicas que comprenden uno de estos dos nucleótidos, uno en cada cromosoma 6. Así, una planta con genotipo CC para mME15090 tiene un nucleótido idéntico (C) en ambos cromosomas, mientras que una planta con genotipo AC para mME15090 tiene un cromosoma con una A en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 1 y un cromosoma con una C en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 1. El "genotipo SNP resistente" se refiere al genotipo de la planta o parte de la planta para el marcador SNP, por lo que el genotipo SNP es indicativo de la presencia de la resistencia (y del fragmento de introgresión que comprende el alelo de resistencia), por lo que, por ejemplo, el genotipo SNP resistente para el marcador SNP mME15090 es CC (homocigoto) o AC (heterocigoto).

En otro aspecto, el fragmento de introgresión, o la región del cromosoma 6 (o la región del cromosoma 6 ortólogo) que comprende el locus de resistencia al MYaV, es detectable mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta además al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o los ocho marcadores de polimorfismo de nucleótido único (SNP) seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2, o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2;

b) el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4;

c) el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6;

d) el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:7;

e) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME21377 en la SEQ ID NO: 8 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:8;

f) el genotipo TT o GT para el marcador SNP mME36533 en la SEQ ID NO: 11 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11;

g) el genotipo TT o CT para el marcador SNP mME13585 en la SEQ ID NO: 12 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:12.

Así, en un aspecto, la planta de melón resistente al MYaV descrita en el presente documento comprende además al menos una guanina (G) (es decir, el genotipo GG o AG) en lugar de dos adeninas (AA) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 (denominada marcador SNP mME40332), y/o al menos una timina (T) (es decir, el genotipo TT o AT) en lugar de dos adeninas (AA) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 4 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4 (denominado marcador SNP mME28908), y/o al menos una Adenina (A), es decir, el genotipo AA o AT) en lugar de dos Timinas (TT) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 6 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 (denominada marcador SNP mME9692), y/o al menos una citosina (C) (es decir, el genotipo CC o CT) en lugar de dos timinas (TT) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 7 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:7 (denominado marcador SNP mME50656), y/o al menos una Adenina (A), es decir, el genotipo AA o AG) en lugar de dos Guaninas (GG) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 8 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:8 (denominada marcador SNP mME21377), y/o al menos una Timina (T) (es decir, el genotipo TT o GT) en lugar de dos Guaninas (GG) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 11 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11 (denominada marcador SNP mME36533), y/o al menos una timina (T) (es decir, el genotipo TT o CT) en lugar de dos citosinas (CC) en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 12 o en una secuencia que comprende al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:12 (denominada marcador SNP mME13585).

En un aspecto, el fragmento de introgresión, o la región del cromosoma 6 (o la región del cromosoma 6 ortóloga) que comprende el locus de resistencia al MYaV, que es detectable por el o los marcadores mencionados, procede de una planta silvestre de la especie Cucumis melo, y en un aspecto es de una planta de la que se ha depositado una muestra representativa de semillas con el número de acceso n C iMB 41966, NCIMB 41969, NCIMB41967 o NCIMB 41968, por lo que el QTL, y la región cromosómica 6 que comprende el QTL, es en un aspecto el QTL tal como se encuentra en NCIMB 41966 o en NCIMB 41969 o en NCIMB41967 o en NCIMB41968. En un aspecto, el fragmento de introgresión, o el cromosoma 6 recombinante, se obtiene del cruce de una planta cultivada a partir de semillas depositadas con el número de acceso NCIMB 41966 o NCIMB 41969 o NCIMB 41967 o NCIMB41968 con otra planta de melón, especialmente una planta de melón cultivada de la especie C. melo.

Así, en un aspecto se describe la planta de melón resistente al MYaV que comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, que se puede obtener a partir de semillas de las que se ha depositado una muestra representativa bajo el NCIMB 41966 y en el que dicho fragmento de introgresión comprende al menos uno, preferentemente al menos dos, opcionalmente al menos 3, 4, 5, 6 o 7, marcadores SNP seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1;

b) el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2;

c) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME 12135 en la SEQ ID NO: 3.

d) el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4;

e) el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6;

f) el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7.

Preferentemente, dicho al menos un marcador se selecciona entre mME21377 y/o mME15090.

En otro aspecto, se describe la planta de melón resistente al MYaV que comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, que se obtiene a partir de semillas de las que se ha depositado una muestra representativa en el NCIMB 41969 y en el que dicho fragmento de introgresión comprende al menos uno, preferentemente al menos dos, opcionalmente al menos 3, 4 o 5 marcadores SNP seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME21377 en la SEQ ID NO: 8;

b) el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 9;

c) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 10;

d) el genotipo TT o GT para el marcador SNP mME36533 en la SEQ ID NO: 11;

e) el genotipo TT o CT para el marcador SNP mME13585 en la SEQ ID NO: 12.

Preferentemente, dicho al menos un marcador se selecciona entre mME21377 y/o mME15090.

En un aspecto se proporciona un procedimiento para identificar una planta de melón resistente al MYaV según la invención, cuya planta comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, que se puede obtener a partir de semillas de las que se ha depositado una muestra representativa bajo NCIMB 41968 y/o NCIMB 41967, donde dicho procedimiento comprende detectar dicho fragmento de introgresión mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta la presencia de al menos uno, preferentemente al menos dos, opcionalmente al menos 3 o 4 marcadores SNP seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME21377 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 8;

b) el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en el nucleótido 71 de la SEQ ID NO: 1;

c) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 3;

d) el genotipo TT o CT para el marcador SNP mME13585 en el nucleótido 71 de la SEQ ID NO: 12 y

la ausencia del genotipo TT o GT para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mM36533 en la SEQ ID NO: 11; y la ausencia de al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en:

el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2;

el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4;

el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6; y

el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7.

Preferentemente, dicho al menos un marcador se selecciona entre mME21377 y/o mME15090.

Así, en un aspecto, el fragmento de introgresión en el cromosoma 6, que se puede obtener a partir de semillas de las que se ha depositado una muestra representativa bajo NCIMB 41968 o NCIMB41967, no comprende el genotipo TT o GT para el marcador SNP mME36533 en la SEQ ID NO: 11. En otro aspecto, el fragmento de introgresión tampoco comprende al menos un marcador SNP seleccionado del grupo que consiste en:

el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2;

el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4;

el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6; y

el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7.

Para obtener el fragmento de introgresión a partir de las semillas depositadas, se cultiva una planta a partir de la semilla y la planta se cruza con una planta susceptible de C. melo para obtener semillas F1. La semilla híbrida F1 y las plantas cultivadas a partir de ella, contienen un cromosoma 6 del progenitor susceptible (sin QTL MYaV6.1) y un cromosoma 6 del progenitor silvestre resistente a MYaV. Para generar eventos de recombinación entre estos dos cromosomas homólogos 6, es necesario que se produzca la meiosis y que se identifiquen las plantas que comprenden los cromosomas recombinantes 6. Por ejemplo, la F1 puede autofecundarse para producir plantas F2, y/o las plantas F2 o F3 resistentes, etc., pueden retrocruzarse con el progenitor susceptible. Las plantas resistentes al MYaV pueden ser examinadas y seleccionadas por la presencia de uno o más de los marcadores SNP mencionados anteriormente, con el fin de identificar las plantas que comprenden un cromosoma 6 recombinante, que comprende un fragmento de introgresión que confiere resistencia al MYaV a partir de las semillas depositadas.

Del mismo modo, las plantas de melón cultivadas que comprenden la resistencia contra el MYaV, donde la resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, pueden ser generadas y/o identificadas utilizando diferentes procedimientos. Por ejemplo, para obtener una planta de melón cultivada que comprenda un fragmento de introgresión que confiera resistencia al MYaV a partir de un melón silvestre o de un pariente silvestre del melón, primero se identifica un melón silvestre o un pariente silvestre del melón que tenga un fenotipo de resistencia al MYaV y/o que comprenda uno o más de los marcadores SNP asociados con la resistencia al MYaV divulgados en el presente documento, por ejemplo, uno, o más, o todos los marcadores anteriores. Especialmente se pueden utilizar los marcadores mME12135 y mME15090, o cualquier marcador entre estos dos, o dentro de 7 cM o dentro de 5cM de cualquiera de estos marcadores (pero también se pueden utilizar otros marcadores vinculados al QTL). La planta identificada se cruza con una planta susceptible de C. melo para obtener semillas F1. La semilla híbrida F1 y las plantas cultivadas a partir de ella, contienen un cromosoma 6 del progenitor susceptible (sin QTL MYaV6.1) y un cromosoma 6 del progenitor silvestre resistente a MYaV. Para generar eventos de recombinación entre estos dos cromosomas homólogos 6, es necesario que se produzca la meiosis y que se identifiquen las plantas que comprenden los cromosomas recombinantes 6. Por ejemplo, la F1 puede autofecundarse para producir plantas F2, y/o las plantas F2 o F3 resistentes, etc., pueden retrocruzarse con el progenitor susceptible. Las plantas que son resistentes al MYaV pueden ser cribadas para, y/o seleccionadas para, la presencia de uno o más de los marcadores SNP anteriores y/o cribadas para, y/o seleccionadas para, la presencia del fenotipo de resistencia al MYaV, con el fin de identificar las plantas que comprenden un cromosoma 6 recombinante, que comprende un fragmento de introgresión que confiere resistencia al MYaV desde el melón silvestre o pariente silvestre del melón. Alternativa o adicionalmente, se puede llevar a cabo el mapeo de QTL para identificar otros marcadores moleculares vinculados al QTL MYaV6.1 y/o para generar plantas cultivadas de C. melo que comprendan un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 que confiera resistencia a MYaV.

En un aspecto descrito en el presente documento, la presencia del fragmento de introgresión en una planta de melón cultivada, o la región del cromosoma 6 (o región cromosómica 6 ortóloga), que comprende el locus de resistencia a MYaV, es detectable mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 9) o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1;

b) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 (o SEQ ID NO: 10) o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3;

c) cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre los marcadores de a) y b);

d) cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón que esté vinculado genéticamente dentro de los 7 cM del marcador mME15090 o mME12135; y

e) cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón que esté físicamente vinculado dentro de los 5Mb, 3Mb, 2Mb o 1Mb del marcador mME15090 o mME12135;

En un aspecto descrito en el presente documento, se detectan al menos uno, dos, al menos tres, al menos cuatro o más marcadores de los marcadores de a), b) o c) anteriores. En otro aspecto, se detectan al menos uno, dos, al menos tres, al menos cuatro o más marcadores de los marcadores de a), b), c), d) o e) anteriores. En una realización se detecta al menos el marcador de a) y/o b) y opcionalmente se detectan al menos uno, dos, tres o más marcadores de c), d) y/o e).

Cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador de a) y b) se refiere a cualquier marcador molecular que mapea genéticamente a la región del cromosoma 6 entre el marcador mME15090 y mME12135 (véase la Figura 1) y/o que se encuentra físicamente entre el marcador mME15090 y mME12135, y que es indicativo de la región del cromosoma 6 del melón silvestre o de la región del cromosoma 6 del melón pariente silvestre. Esto significa que el marcador es polimórfico entre el genoma del melón cultivado y el genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón. En un aspecto, el marcador es un polimorfismo de un solo nucleótido, pero también pueden utilizarse otros marcadores moleculares como RFLP, AFLP, RAPD, secuenciación de ADN, etc.

En otro aspecto descrito en el presente documento, la presencia del fragmento de introgresión, o la región del cromosoma 6 (o la región ortóloga del cromosoma 6), que comprende el locus de resistencia a MYaV, es detectable mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 9) o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1;

b) el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:7; y

c) cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador de a) y b).

En un aspecto, se detectan al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más marcadores de los marcadores de a), b) o c) anteriores. En una realización se detecta al menos el marcador de a) y b) y opcionalmente se detectan al menos uno, dos, tres o más marcadores de c).

Cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador de a) y b) se refiere a cualquier marcador molecular que mapea genéticamente a la región del cromosoma 6 entre el marcador mME15090 y el mME50656 (véase la Figura 1) y/o que se encuentra físicamente entre el marcador mME15090 y el mME50656, y que es indicativo de la región del cromosoma 6 del melón silvestre o de la región del cromosoma 6 del melón pariente silvestre. Esto significa que el marcador es polimórfico entre el genoma del melón cultivado y el genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón. En un aspecto, el marcador es un polimorfismo de un solo nucleótido, pero también pueden utilizarse otros marcadores moleculares como RFLP, AFLP, RAPD, secuenciación de ADN, etc. En un aspecto divulgado en el presente documento, los marcadores entre el marcador mME5090 y el mME50656 son uno o más marcadores seleccionados del grupo: el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3; el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4; y el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6.

En otro aspecto divulgado en el presente documento, la presencia del fragmento de introgresión, o la región del cromosoma 6 (o región cromosómica 6 ortóloga), que comprende el locus de resistencia a MYaV, es detectable mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME21377 en la SEQ ID NO: 8 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:8;

b) el genotipo TT o CT para el marcador SNP mME13585 en la SEQ ID NO: 12 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12; y

c) cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador de a) y b).

En un aspecto, se detectan al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más marcadores de los marcadores de a), b) o c) anteriores. En una realización se detecta al menos el marcador de a) y b) y opcionalmente se detectan al menos uno, dos, tres o más marcadores de c).

Cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador de a) y b) se refiere a cualquier marcador molecular que mapea genéticamente a la región del cromosoma 6 entre el marcador mME21377 y mME13585 (véase la Figura 1) y/o que se encuentra físicamente entre el marcador mME21377 y mME13585, y que es indicativo de la región del cromosoma 6 del melón silvestre o de la región del cromosoma 6 del melón pariente silvestre. Esto significa que el marcador es polimórfico entre el genoma del melón cultivado y el genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón. En un aspecto, el marcador es un polimorfismo de un solo nucleótido, pero también pueden utilizarse otros marcadores moleculares como RFLP, AFLP, RAPD, marcadores CASP, secuenciación de ADN, etc.

En un aspecto, los marcadores entre el marcador mME21377 y el mME13585 son uno o más marcadores seleccionados del grupo: el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 9 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:9; el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 10 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:10; y el genotipo TT o GT para el marcador SNP mME36533 en la SEQ ID NO: 11 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11.

En otro aspecto divulgado en el presente documento, la presencia del fragmento de introgresión, o la región del cromosoma 6 (o región cromosómica 6 ortóloga), que comprende el locus de resistencia a MYaV, es detectable mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME21377 en la SEQ ID NO: 8 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:8;

b) el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3; y

c) cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador de a) y b).

En un aspecto, se detectan al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más marcadores de los marcadores de a), b) o c) anteriores. En una realización se detecta al menos el marcador de a) y b) y opcionalmente se detectan al menos uno, dos, tres o más marcadores de c).

Cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador de a) y b) se refiere a cualquier marcador molecular que mapea genéticamente a la región del cromosoma 6 entre el marcador mME21377 y mME12135 (véase la Figura 1) y/o que se encuentra físicamente entre el marcador mME21377 y mME12135, y que es indicativo de la región del cromosoma 6 del melón silvestre o de la región del cromosoma 6 del melón pariente silvestre. Esto significa que el marcador es polimórfico entre el genoma del melón cultivado y el genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón. En un aspecto, el marcador es un polimorfismo de un solo nucleótido, pero también pueden utilizarse otros marcadores moleculares como RFLP, AFLP, RAPD, marcadores CASP, secuenciación de ADN, etc.

Por lo tanto, se divulga en el presente documento una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV), donde dicha resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 en forma homocigota o heterocigota y donde dicho fragmento de introgresión es de una accesión silvestre de la especie Cucumis melo, habiendo sido depositada una muestra representativa de semillas de dicha accesión silvestre bajo el número de accesión NCIMB 41967 y NCIMB41968.

La planta anterior tiene una puntuación media de la enfermedad de MYaV de al menos 3 en una escala de 1 hojas totalmente amarillas a 9 = hojas totalmente verdes cuando se cultiva en una zona infestada de MYaV, como en el campo en el noreste de Brasil.

En una realización, en la planta dicho fragmento de introgresión es detectable mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo CC o AC para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME15090 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 1;

b) el genotipo AA o AG para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME12135 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 3;

c) el genotipo AA o AG para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME21377 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 8; y

d) el genotipo TT o CT para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME13585 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 12

y la ausencia del genotipo TT o GT para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mM36533 en la SEQ ID NO: 11; y la ausencia de al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en:

el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2;

el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4;

el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6; y

el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7.

En un aspecto específico de la invención, dicho fragmento de introgresión es detectable en la planta mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno de los marcadores de polimorfismo de nucleótido único (SNP) seleccionado del grupo que consiste en:

a) el genotipo CC o AC para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME15090 en la SEQ ID NO: 1; y

b) el genotipo AA o AG para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME12135 en la SEQ ID NO: 3;

Así, en un aspecto, la planta según la invención no comprende los siguientes marcadores de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP):

a) el genotipo TT o GT para el marcador SNP mME36533 en la SEQ ID NO: 11; y

b) al menos un marcador seleccionado del grupo formado por:

el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2;

el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4;

el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6; y

el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7.

El fragmento de introgresión en las plantas de la invención es en un aspecto un fragmento del cromosoma 6 que está presente en las semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB41967 o NCIMB41968.

La planta puede ser un híbrido F1.

El fragmento de introgresión tiene, en un aspecto, un tamaño igual o inferior a 10 Mb, preferentemente igual o inferior a 8 Mb.

También se divulgan las semillas a partir de las cuales se puede cultivar una planta de la invención, así como los frutos de melón cosechados de una planta de la invención y que comprenden el cromosoma 6 recombinante en su genoma. Asimismo, se describe una célula vegetal, un tejido o una parte vegetal de una planta o de una semilla que comprende al menos un cromosoma 6 recombinante, en el que dicho cromosoma 6 recombinante comprende un fragmento de introgresión de una planta silvestre de C. melo y en el que dicho fragmento de introgresión comprende un alelo que confiere resistencia al MYaV.

Los marcadores moleculares descritos en el presente documento pueden detectarse de acuerdo con un procedimiento estándar. Por ejemplo, los marcadores SNP pueden detectarse fácilmente mediante un ensayo KASP (véase www.kpbioscience.co.uk) u otros ensayos. En el ejemplo 3 se ha desarrollado un ensayo KASP para una serie de SNP. Para desarrollar el ensayo KASP se seleccionaron 70 pares de bases aguas arriba y 70 pares de bases aguas abajo del SNP y se diseñaron dos cebadores delanteros específicos del alelo y un cebador inverso específico del alelo. Véase, por ejemplo Allen et al. 2011, Plant Biotechnology J. 9, 1086-1099, especialmente p097-1098 para el procedimiento de ensayo KASP.

Así, en un aspecto, los marcadores SNP y la presencia/ausencia del marcador asociado con el alelo de resistencia a MYaVse determina utilizando un ensayo KASP, pero igualmente se pueden utilizar otros ensayos. Por ejemplo, opcionalmente también se puede utilizar la secuenciación del ADN.

El mapeo físico utilizando BACs (Cromosomas Artificiales Bacterianos) y el desarrollo de marcadores para los BACs puede llevarse a cabo para mapear la ubicación física de MYaV6.1 en el cromosoma 6 y para desarrollar marcadores que se encuentren físicamente entre cualquiera de los marcadores mencionados y para determinar las distancias físicas entre los marcadores y/o determinar el tamaño de la introgresión.

El tamaño de un fragmento de introgresión puede, por ejemplo, determinarse también mediante la visualización de la introgresión utilizando imágenes de hibridación fluorescente in situ (FISH) (Verlaan et al. 2011, Plant Journal 68: 1093­ 1103).

En un aspecto divulgado en el presente documento, el fragmento de introgresión que confiere resistencia al MYaV tiene un tamaño igual o inferior a 10 Mb, preferentemente igual o inferior a 8 Mb, igual o inferior a 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 Mb, más preferentemente incluso menos, como por ejemplo igual o menos de 500kb, 400kb, 300kb, 200kb, 100kb, 50kb, 25kb, 20kb, 15kb, o menos, pero que aún comprende el alelo de resistencia a MYaV (u ortólogo) y aún confiere resistencia a MYaV a una planta C. melo susceptible. La resistencia es conferida por el cromosoma 6 recombinante, y el fragmento de introgresión que comprende el alelo MYaV cuando el fragmento de introgresión está en forma heterocigota u homocigota. Las plantas con fragmentos de introgresión más pequeños en el cromosoma 6 pueden generarse generando nuevas plantas recombinantes a partir de una población de plantas derivadas de un cruce entre una planta cultivada susceptible al MYaV y un melón silvestre resistente al MYaV o un pariente del melón.

Alternativamente, cuando se identifica una planta cultivada de C. melo que tiene un fragmento de introgresión que confiere resistencia al MYaV, el tamaño de la introgresión puede reducirse, por ejemplo, autofecundando esa planta y seleccionando una progenie recombinante que tenga tamaños de introgresión más pequeños.

En el tomate, por ejemplo, el gran fragmento de introgresión de S. chilense en el cromosoma 6 (aproximadamente 27cM) que comprende el alelo Ty-3 se ha reducido seleccionando una línea de progenie recombinante (LA1931-AL-F2), que comprende un fragmento de introgresión de S. chilense mucho más pequeño (aproximadamente 6 cM) que comprende Ty-3 (véase Ji et al. 2007, Mol. Crianza 20: 271-284).

La planta de melón cultivada que se divulga en el presente documento puede ser una línea endogámica, una OP (variedad de polinización abierta) o un híbrido F1. En un aspecto, el híbrido F1 comprende el fragmento de introgresión en forma heterocigota, es decir, producido por el cruce de dos líneas parentales endogámicas, una de las cuales posee el fragmento de introgresión (preferentemente en forma homocigota, aunque no necesariamente) y la recogida de las semillas del híbrido F1 de dicho cruce. El híbrido F1 también puede comprender el fragmento de introgresión en forma homocigota, es decir, producido por el cruce de dos líneas parentales endogámicas, cada una de las cuales comprende el fragmento de introgresión en forma homocigota o heterocigota.

La planta de melón cultivada puede ser de cualquier tipo. Preferentemente, tiene buenas características agronómicas y de calidad de los frutos, como un tamaño medio grande de los frutos (al menos 500g, 600g, 700g, 800g, 900g, 1000g o más), un brix medio alto de los frutos (por ejemplo, un % medio de sólidos solubles totales en el refractómetro de al menos 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 % o más), la producción de muchos frutos por planta, una pulpa firme, etc. El melón cultivado puede ser C. melo cantalupensis, C. melo inodorous y C. melo reticulatus. Los C. melo cantalupensis también se denominan Cantalupos y tienen principalmente una forma redonda con costillas prominentes y casi sin red. La mayoría tienen una carne anaranjada y dulce y suelen ser muy aromáticas. A diferencia del cantalupo europeo, el "Cantalupo" norteamericano no es de este tipo, sino que pertenece a los verdaderos melones almizcleños. "C. melo inodorous (o melones de invierno) puede subdividirse en diferentes tipos, como melón Honeydew, Piel de Sapo, melón de azúcar, melón japonés, etc. C. melo reticulatus es el verdadero melón almizcleño, con piel reticulada (en red) y comprende los melones Galia, Sharlyn y el cantalupo norteamericano. Los melones tienen muchos tamaños y formas: redondos, ovalados y cilíndricos. La pulpa es generalmente anaranjada y bastante dulce, pero algunas variedades de melón y, en concreto, los melones persas, pueden tener la pulpa verde o blanca. Algunos melones de pulpa verde son bastante dulces, pero la mayoría de los melones de pulpa verde y blanca tienen un sabor menos dulce, pero muy refrescante.

También se pueden introducir otras resistencias en las plantas de melón de la invención, como la resistencia a una o más de las siguientes enfermedades: Marchitez bacteriana, pudrición de la raíz, tizón de la corona, roya del melón, mildiú polvoriento, marchitez del Verticillum , quemadura del azufre, sarna, mosaico de la sandía, mildiú velloso, Fusarium oxysporum f.sp. melonis (Fom) raza 0, Fusarium oxysporum f .sp . melonis (Fom) raza 1, Fusarium oxysporum f.sp. melonis (Fom) raza 2, Fusarium oxysporum f .sp. melonis (Fom) raza 1.2, Fusarium Wilt R2, Root Knot (Nematode), Anthracnose , Cucumber Mosiac, y Squash Mosaic, y/o resistencia a una o más de las siguientes plagas: Resistencia al pulgón, al gusano del pepino, al escarabajo de la tierra, al escarabajo del pepino en banda, al ácaro, a la chicharrita del melón, al gusano del melón, al escarabajo rayado del pepino o al minador del melón. También pueden introducirse otros genes de resistencia, contra virus patógenos, hongos, bacterias o plagas.

En un aspecto se describen las semillas a partir de las cuales se pueden cultivar las plantas divulgada en el presente documentos. En un aspecto, las semillas son semillas híbridas F1, que comprenden el cromosoma 6 recombinante en forma homocigota o heterocigota y que tienen un fenotipo de resistencia al MYaV cuando se cultivan en el campo.

También se describen en el presente documento los envases y paquetes que contienen o comprenden semillas a partir de las cuales se pueden cultivar las plantas divulgadas. Estos pueden ser etiquetados como que contienen semillas de melón cultivadas con resistencia al MYaV.

También se proporcionan semillas progenitoras y plantas progenitoras de las plantas divulgada en el presente documentos, que conservan la introgresión que confiere resistencia al MYaV en el cromosoma 6, o una introgresión más pequeña, es decir, una parte del fragmento de introgresión que confiere resistencia. La progenie puede ser cualquier generación obtenida mediante la autofecundación de una planta de melón divulgada en este documento y/o el cruce de una planta de melón divulgada en este documento con otra planta de melón una o más veces. La progenie es, por tanto, la generación (semillas) producida a partir del primer cruce (F1) o de la autofecundación (S1), o cualquier otra generación producida mediante el cruce y/o la autofecundación (F2, F3, etc.) y/o el retrocruzamiento (BC1, BC2, etc.) de una o más plantas seleccionadas de la generación F1 y/o S1 y/o BC1 (o de plantas de cualquier otra generación, por ejemplo la F2) con otra planta de melón (y/o con un pariente silvestre del melón). La progenie se selecciona preferentemente para retener el cromosoma 6 recombinante que comprende el fragmento de introgresión del melón silvestre o de un pariente silvestre del melón. Así, la progenie también tiene el fenotipo de resistencia al MYaV, preferentemente el mismo nivel de resistencia al MYaV que la planta utilizada en el cruce inicial o en la autofecundación. La presencia (o la retención) del fragmento de introgresión que comprende el QTL MYaV6. 1 puede determinarse en el ensayo de resistencia a MYaV, fenotípicamente, y/o en el/los ensayo/s de marcadores moleculares descritos en el presente documento. En cuanto a la evaluación fenotípica, por supuesto hay que tener en cuenta la naturaleza dominante del alelo de MYaV.

En otro aspecto, se divulgan en el presente documento partes de las plantas de melón según la invención. Las partes incluyen, por ejemplo, células y cultivos celulares, cultivos de tejidos, tejidos vegetales (hojas, raíces, etc.), flores, polen, embriones, frutos, partes de frutos, etc. Las partes de la planta comprenden el fragmento de introgresión en el cromosoma 6, como se ha descrito, y como puede detectarse utilizando uno o más de los ensayos de marcadores de MYaVdescritos. Además, cuando se regeneran plantas enteras a partir de dichas partes del melón, como células, cultivos de células o tejidos, las plantas regeneradas comprenden el cromosoma 6 recombinante y el fenotipo de resistencia al MYaV.

Así, también se divulga una célula vegetal, tejido o parte de una planta o de una semilla que comprende al menos un cromosoma 6 recombinante, en el que dicho cromosoma 6 recombinante comprende un fragmento de introgresión de una planta silvestre de C. melo y en el que dicho fragmento de introgresión comprende un alelo que confiere resistencia al MYaV.

También se divulgan en el presente documento cultivos celulares in vitro y cultivos de tejidos in vitro, de células o tejidos que comprenden un cromosoma 6 recombinante descrito. Preferentemente, las células o los tejidos pueden regenerarse en una planta de melón completa, es decir, las células son regenerables y los tejidos comprenden células regenerables. Por lo tanto, también se divulgan en el presente documento las propagaciones vegetativas de las plantas. Así, se divulga una planta de melón cultivada de propagación vegetativa que comprende el fenotipo de resistencia al MYaV y un cromosoma 6 recombinante como se describe en el presente documento.

En un aspecto específico se divulga un fruto de melón cosechado de una planta según la invención. Los frutos de melón comercializables se clasifican generalmente por tamaño y calidad después de la cosecha. También se dan a conocer en el presente documento envases o embalajes que comprenden o consisten en frutos de melón cosechados. De nuevo, las células de los frutos se distinguen de otros melones por la presencia del cromosoma 6 recombinante (como se puede determinar en uno o más de los ensayos de marcadores moleculares y/o en un ensayo de resistencia al MYaV, por ejemplo, cultivando las semillas presentes en los frutos, o la progenie obtenida por autofecundación de las plantas cultivadas a partir de las semillas).

La invención también divulga un producto alimenticio o de alimentación animal que comprende o consiste en una parte de la planta descrita en el presente documento, preferentemente un fruto de melón o una parte del mismo, y/o un extracto de una parte de la planta descrita en el presente documento. El producto alimenticio o el pienso puede ser fresco o procesado, por ejemplo, enlatado, cocido al vapor, hervido, frito, escaldado y/o congelado, etc. Por ejemplo, también se describen en el presente documento envases como latas, cajas, cajones, bolsas, cartones, envases de atmósfera modificada, películas (por ejemplo, películas biodegradables), etc. que comprenden partes de plantas como frutas o partes de frutas (frescas y/o procesadas).

procedimientos y usos según la invención

La invención divulga un procedimiento para producir una nueva planta de melón cultivada que comprende un fragmento de introgresión que confiere resistencia al MYaV cuando está en forma homocigota o heterocigota, como se describe. El procedimiento comprende cruzar una planta de la invención, o una planta progenitora de la misma, ya sea como progenitor masculino o femenino, con una segunda planta de melón (o un pariente silvestre del melón) una o más veces, y/o autofecundar una planta de melón según la invención, o una planta progenitora de la misma, una o más veces, y seleccionar la progenie de dicho cruce y/o autofecundación. La primera y/o la segunda planta de melón pueden ser, por ejemplo, una línea o variedad de la especie C. melo cantalupensis, C. melo inodorous o C. melo reticulatus.

Por lo tanto, se divulga un procedimiento para transferir el cromosoma 6 recombinante, que comprende el locus que confiere resistencia a MYaV(MYaV6.1), de una planta de melón (cultivada) a otra planta de melón (cultivada), especialmente a variedades o líneas de cultivo susceptibles a MYaV.

El procedimiento comprende las etapas de:

a) proporcionar una primera planta de melón que comprenda al menos un cromosoma 6 recombinante que tenga un fragmento de introgresión que comprenda un alelo que confiera resistencia al MYaV en forma homocigota,

b) proporcionar una segunda planta de melón, especialmente una planta de melón susceptible al MYaV,

c) cruzar dicha planta de melón de a) con dicha planta de melón de b),

d) Recoger las semillas híbridas F1 de dicho cruce y, opcionalmente,

e) autofecundar la planta cultivada a partir de dichas semillas híbridas F1 para producir semillas F2, y opcionalmente seleccionar las semillas F2 que tengan el cromosoma 6 recombinante, y opcionalmente f) seguir reproduciendo con plantas cultivadas a partir de dichas semillas F2 para producir una planta de melón que tenga buenas características agronómicas y que comprenda el fragmento de introgresión en forma homocigótica o heterocigótica.

La presencia o ausencia del cromosoma 6 recombinante, y del fragmento de introgresión, puede determinarse mediante uno o más de los ensayos de marcadores moleculares descritos en el presente documento y/o mediante ensayos de resistencia a MYaV. La reproducción posterior en el paso f) puede comprender la autofecundación, el cruce, la producción de dobles haploides, el retrocruzamiento, etc. Las plantas y las semillas obtenidas por el procedimiento anterior están incluidas en el presente documento.

También se divulga un procedimiento para producir plantas híbridas C. melo F1 que comprenden un fenotipo de resistencia a MYaV, dicho procedimiento comprende:

a) proporcionar una primera planta endogámica de melón que comprenda al menos un cromosoma 6 recombinante que tenga un fragmento de introgresión que comprenda un alelo que confiera resistencia al MYaV,

b) proporcionar una segunda planta endogámica de melón con o sin el cromosoma 6 recombinante que tenga un fragmento de introgresión que comprenda un alelo que confiera resistencia al MYaV,

c) cruzar dicha planta de melón de a) con dicha planta de melón de b),

d) recoger las semillas híbridas F1 de dicho cruce.

La planta de melón endogámica de a) y b) puede ser homocigota y/o heterocigota para el fragmento de introgresión, y pueden contener fragmentos de introgresión de diferentes tamaños y/o de diferente origen, es decir, de diferentes melones silvestres o parientes silvestres del melón. Así, por ejemplo, el fragmento de introgresión en a) puede ser el mismo o un fragmento de introgresión diferente al de b). Por ejemplo, en a) puede provenir de cualquiera de las cuatro accesiones silvestres divulgadas en el presente documento (NC iMb 41966, NCIMB41969, NCIMB41967, NCIMB41968) y en b) puede provenir de cualquiera de las otras tres accesiones divulgadas en el presente documento o de cualquier otra fuente silvestre.

Las semillas híbridas F1 comprenden preferentemente al menos un cromosoma 6 recombinante y las plantas F1 cultivadas a partir de las semillas son por tanto resistentes al MYaV en su fenotipo.

La presencia o ausencia del cromosoma 6 recombinante, y del fragmento de introgresión, puede determinarse mediante uno o más de los ensayos de marcadores moleculares descritos en el presente documento y/o mediante ensayos de resistencia a MYaV. Las plantas y las semillas que se obtienen por el procedimiento anterior están incluidas en el presente documento.

En otro aspecto, se divulga un procedimiento para producir una planta cultivada de C. melo que comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un alelo de resistencia al MYaV, y que comprende los pasos siguientes

a) proporcionar una primera planta de melón cultivada que sea susceptible al MYaV,

b) proporcionar una segunda planta de melón silvestre que sea resistente al MYaV,

c) cruzar dicha planta de melón de a) con dicha planta de melón de b),

d) recoger las semillas F1 de dicho cruce y retrocruzar una planta F1 con la planta de melón de a) para producir una población de retrocruzamiento (BC1), o autofecundar dichas plantas F1 una o más veces para producir una población de autofecundación F2 o F3 o de generación superior,

e) opcionalmente, retrocruzar una planta de d) una o más veces con la planta de melón de a) para producir una población de retrocruzamiento de generación superior, y

f) la identificación de una planta de autofecundación de generación F2, F3 o superior, o de retrocruzamiento de generación BC1 o superior, que comprenda una introgresión en el cromosoma 6, en la que dicho fragmento de introgresión comprenda un alelo de resistencia al MYaV.

Al referirse a las poblaciones de retrocruzamiento en el procedimiento, las poblaciones de retrocruzamiento también pueden ser autofecundadas, es decir, BC1S1, BC1S2, BC2S1, BC2S2, u otras.

En uno o más de los pasos b) a f), la presencia del alelo de resistencia al M YaV (o el fragmento de introgresión o la región silvestre del cromosoma 6 que comprende el alelo) puede comprobarse (y las plantas pueden seleccionarse) realizando un ensayo de marcadores moleculares como se describe en otra parte del presente documento, por ejemplo, determinando si la planta comprende el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 (o a o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1) y/o el genotipo Aa o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador mME15090 y mME12135.

Utilizando este procedimiento, se pueden generar y/o seleccionar nuevas plantas de melón cultivadas que comprendan una introgresión con el QTL MYaV6.1 a partir de una fuente silvestre, como un melón silvestre o un pariente silvestre del melón (como de NCIMB 41966 o NCIMB 41969 o NCIMB41967 o NCIMB41968, u otros melones silvestres o parientes silvestres del melón).

En un aspecto, el procedimiento en el presente documento descrito para producir una planta cultivada de C. melo que comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un alelo de resistencia al MYaV, comprende los pasos:

a) proporcionar una primera planta de melón cultivada que sea susceptible al MYaV,

b) proporcionar una segunda planta de melón silvestre que sea resistente al MYaV,

c) cruzar dicha planta de melón de a) con dicha planta de melón de b),

d) recoger las semillas F1 de dicho cruce y retrocruzar una planta F1 con la planta de melón de a) para producir una población retrocruzada (BC1), o autocriar dichas plantas F1 una o más veces para producir una población F2 o F3,

e) opcionalmente, autofecundar la población retrocruzada para producir, por ejemplo, una población BC1S1 o BC1S2,

f) identificar una planta F2, F3, BC1 BC1S1, o BC1S2 que comprenda el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y/o el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador mME15090 y mME12135.

También se divulga un procedimiento para identificar una planta de melón silvestre que comprende la resistencia a MYaV en el cromosoma 6, dicho procedimiento comprende:

a) proporcionar una accesión de melón silvestre o varias accesiones de melón silvestre;

b) el cribado de dicha(s) accesión(es) de melón silvestre mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecte al menos un marcador SNP seleccionado del grupo formado por:

Marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 y/o el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3; y

c) identificar y/o seleccionar una planta de melón silvestre que comprenda al menos el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 de la SEQ ID NO: 1 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y/o el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador mME15090 y mME12135; y opcionalmente

d) confirmar la resistencia al MYaV en un ensayo de resistencia al MYaV; y opcionalmente

e) Introducir dicha resistencia al MYaV desde dicha accesión silvestre en el melón cultivado.

En el paso c) también se pueden utilizar otras pruebas de marcadores moleculares descritas en el presente documento. Con este procedimiento se puede, por lo tanto, examinar las accesiones de melón silvestre o los parientes silvestres del melón para detectar la presencia de uno o más de los marcadores y, por lo tanto, la presencia del QTL MYaV6.1 e introgresar la parte que confiere resistencia de estas nuevas fuentes de resistencia en las plantas de melón cultivadas, susceptibles al MYaV. Las plantas y semillas obtenidas por este procedimiento son también un aspecto de la invención descrita.

En otro aspecto más, se divulga un procedimiento para identificar una planta cultivada de C. melo que comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un alelo de resistencia al MYaV, dicho procedimiento comprende:

a) proporcionar una población de plantas recombinantes cultivadas de C. melo (como una población de autofecundación F2, F3 o de generación superior, BC1, BC2, BC1S1 o de retrocruzamiento de generación superior),

b) cribado de dicha población mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecte al menos un marcador SNP seleccionado del grupo formado por:

Marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 y/o el marcador SNP mME12135 de la SEQ ID NO: 3 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o salvaje entre el marcador mME15090 y el mME12135; y

c) identificar y/o seleccionar una planta que comprenda al menos el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 de la SEQ ID NO: 1 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 y/o el genotipo AA o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador mME15090 y mME12135.

En este procedimiento también se pueden utilizar otras pruebas de marcadores moleculares descritas en otras partes del presente documento. Así, utilizando este procedimiento se puede detectar la presencia de un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 que comprende el QTL MYaV6.1 en plantas de melón cultivadas o en partes de la planta.

En otro aspecto más, se divulga un procedimiento para detectar si una planta cultivada de C. melo comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un alelo de resistencia al MYaV, dicho procedimiento comprende:

a) proporcionar una planta de C. melo cultivada,

b) cribado de dicha planta mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecte al menos un marcador SNP seleccionado del grupo formado por:

Marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 o en una secuencia que comprenda al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 y/o el marcador SNP mME12135 de la SEQ ID NO: 3 o en una secuencia que comprenda al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 y/o cualquier marcador específico del genoma del melón silvestre o pariente silvestre del melón entre el marcador mME15090 y mME12135.

El cribado de marcadores moleculares implica obviamente la obtención de material vegetal y el análisis del ADN genómico del material para el genotipo del marcador.

En este procedimiento también se pueden utilizar otras pruebas de marcadores moleculares descritas en otras partes del presente documento. Así, utilizando este procedimiento se puede detectar la presencia de un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 que comprende el QTL MYaV6.1 en plantas de melón cultivadas o en partes de la planta. Si uno o más de los marcadores que están vinculados al QTL están presentes, se puede concluir que la planta comprende un fragmento de introgresión que confiere resistencia al MYaV en el cromosoma 6.

También se divulga en el presente documento un procedimiento para producir una planta cultivada de C. melo que comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un alelo de resistencia al MYaV, que comprende:

a) proporcionar una primera planta de melón cultivada que sea susceptible al MYaV,

b) proporcionar una segunda planta de melón silvestre resistente al MYaV, seleccionada entre las plantas cultivadas a partir de semillas depositadas con el número de acceso NCIMB41967, NCIMB41968 o la progenie resistente al MYaV de cualquiera de ellas;

c) cruzar dicha planta de melón de a) con dicha planta de melón de b),

d) recoger las semillas F1 de dicho cruce y, opcionalmente, autofecundar dichas plantas F1 una o más veces para producir una población F2 o F3 u otra población autofecundada,

e) opcionalmente, retrocruzar la planta F1 o una planta F2 o F3 o una planta de autofecundación adicional con la planta de melón de a) para producir una población retrocruzada,

f) opcionalmente, autofecundar la población retrocruzada una o más veces,

g) la identificación de una planta F2, F3, de autofecundación o de retrocruzamiento que comprenda el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 de la SEQ ID NO: 1 y/o el genotipo AA o AG para el marcador s Np mME12135 en la SEQ ID NO: 3.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para identificar una planta cultivada de C. melo que comprende un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un alelo de resistencia a MYaVy en el que dicho fragmento de introgresión es un fragmento del cromosoma 6 tal como se encuentra en NCIMB41967 o NCIMB41968, que comprende:

a) proporcionar una población de plantas recombinantes cultivadas de C. melo (como una población F2, F3, BC1, BC2, BC1S1),

b) cribado de dicha población mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecte al menos un marcador SNP seleccionado del grupo formado por:

Marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 y el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3; y c) identificar y/o seleccionar una planta que comprenda al menos el genotipo CC o AC para el marcador SNP mME15090 de la SEQ ID NO: 1 y/o el genotipo a A o AG para el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3. En otro aspecto, se divulga un procedimiento de producción de plantas híbridas C. melo F1 que comprenden un fenotipo de resistencia a MYaV que comprende:

a) proporcionar una primera planta de melón endogámica que comprenda al menos un cromosoma 6 recombinante que tenga un fragmento de introgresión que comprenda un alelo que confiera resistencia al MYaV, en el que dicho fragmento de introgresión proceda de NCIMB41967, NCIMB41968 o de la progenie resistente al MYaV de cualquiera de ellos,

b) proporcionar una segunda planta endogámica de melón con o sin el cromosoma 6 recombinante que tenga un fragmento de introgresión que comprenda un alelo que confiera resistencia al MYaV,

c) cruzar dicha planta de melón de a) con dicha planta de melón de b),

d) recoger las semillas híbridas F1 de dicho cruce.

En otro aspecto, se divulga un procedimiento para generar progenie resistente a MYaV de NCIMB41967 o NCIMB41968, dicho procedimiento comprende:

a) cultivar una planta a partir de semillas depositadas con el número de acceso NCIMB41967 o NCIMB41968; b) autofecundación de dicha planta una o más veces o cruce de dicha planta una o más veces con otra planta de melón para generar semillas de progenie;

c) cribado de dichas semillas o plantas progenitoras cultivadas a partir de dichas semillas o partes de las semillas o plantas utilizando un ensayo de marcadores moleculares que detecte al menos un marcador SNP seleccionado del grupo que consiste en:

Marcador SNP mME15090 en la SEQ ID NO: 1 y el marcador SNP mME12135 en la SEQ ID NO: 3; y

d) identificar y/o seleccionar una planta progenitora que comprenda al menos el genotipo CC o AC para el marcador Sn P mME15090 de la s Eq ID No : 1 y/o el genotipo AA o AG para el marcador Sn P mME12135 en la SEQ ID NO: 3; y opcionalmente

e) confirmar la resistencia al MYaV de la planta progenitora en un ensayo de resistencia al MYaV.

También se pueden utilizar los procedimientos y los marcadores descritos en el presente documento para reducir el tamaño del fragmento de introgresión silvestre que comprende el QTL MYaV6.1, es decir, para generar y seleccionar recombinantes que tengan un fragmento de introgresión más pequeño en el cromosoma 6, pero que conserven la parte del fragmento de introgresión que confiere la resistencia a MYaV. También se pueden desarrollar marcadores moleculares alternativos vinculados a MYaV6. 1 para su uso en cualquiera de los procedimientos mencionados.

En un aspecto, la invención divulga el uso de un cromosoma 6 recombinante que comprende un fragmento de introgresión de una planta silvestre de C. melo , dicho fragmento de introgresión comprende un alelo que confiere resistencia al MYaV, para obtener variedades de melón que tengan resistencia al MYaV.

En un aspecto, la invención divulga el uso de un cromosoma 6 recombinante que comprende un fragmento de introgresión de una planta silvestre de C. melo , dicho fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al MYaV, para la obtención de variedades de melón que tengan resistencia al MYaV, donde dicho cromosoma 6 recombinante es el cromosoma 6 recombinante tal como se encuentra en las semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 42113 o NCIMB 42198, o se deriva de dicho cromosoma 6 recombinante. Así, en un aspecto, una planta de melón cultivada divulgada en el presente documento comprende un cromosoma 6 recombinante obtenido por (obtenible mediante) el cruce de una planta cultivada a partir de semillas depositadas con el número de acceso NCIMB 42113 o NCIMB 42198, o de su progenie que conserva el cromosoma 6 recombinante, con otra planta de melón.

Así, la mejora tradicional puede utilizarse para generar una planta de melón cultivada que comprenda el QTL MYaV6.

1 a partir de un melón silvestre o pariente silvestre del melón, que comprenda el QTL, como indica la presencia de los marcadores SNP, especialmente al menos el SNP mME12135 y/o mME15090 en la accesión silvestre y el fenotipo de resistencia a MYaV.

Se observa que al menos uno de los marcadores (o dos o más) vinculados al QTL en las accesiones silvestres se transfiere también, en un aspecto, junto con el fragmento de introgresión que comprende el QTL al melón cultivado, de modo que el ensayo de marcadores en las líneas de reproducción (por ejemplo, poblaciones de retrocruzamiento) y la planta de melón cultivada resultante puede utilizarse para seleccionar plantas que comprendan el QTL mediante la selección de plantas que tengan el genotipo resistente de los marcadores vinculados, especialmente el SNP mME12135 y/o mME15090.

En un aspecto, las plantas, células, tejidos y partes de plantas divulgadas no comprenden el fragmento de introgresión de PI313970, cuyo fragmento de introgresión comprende un QTL de resistencia al CYSDV ligado a al menos un marcador situado en el cromosoma equivalente al grupo de enlace (LG) 6 de la accesión de melón PI313970, tal como se describe y reivindica en EP1962578B1. Como se ha mencionado, en EP1962578B1 denominado arbitrariamente LG6 , pero corresponde al Grupo de Enlace V de la ICuGI (LG V). En un aspecto, las plantas de melón cultivadas divulgadas comprenden un cromosoma 5 (ICuGI LG V) y dicho cromosoma 5 no comprende la introgresión de PI313970, que comprende un QTL de resistencia a CYSDV ligado a al menos un marcador situado en el cromosoma equivalente al grupo de enlace (LG) 6 de la accesión de melón PI313970, tal como se describe y reivindica en EP1962578B1.

En otro aspecto, una planta de melón cultivada que comprende un cromosoma 6 recombinante según la invención y que comprende además un cromosoma recombinante 5 que comprende una introgresión de PI313970, cuya introgresión comprende un QTL de resistencia al CYSDV ligado a al menos un marcador situado en el cromosoma equivalente al grupo de ligamiento (LG) 6 de la accesión de melón PI313970 como se describe y reivindica en EP1962578B1 se divulga en el presente documento, es decir, una planta de melón cultivada, partes y células de la misma, que comprende al menos dos fragmentos de introgresión de melón silvestre, uno que confiere resistencia al MYaV en el cromosoma 6 (como se describe en toda la memoria descriptiva) y otro que confiere resistencia al CYSDV en el cromosoma 5 (ICuGI LG V).

En el presente documento se describen usos, como el uso de un cromosoma 6 recombinante que comprende un fragmento de introgresión de una planta silvestre de C. melo , dicho fragmento de introgresión comprende un alelo que confiere resistencia al MYaV, para la obtención de variedades de melón que tengan resistencia al MYaV.

En un aspecto, en el uso anterior dicho cromosoma 6 recombinante es el cromosoma 6 recombinante tal como se encuentra en las semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 41967 o NCIMB 41968, o se deriva de dicho cromosoma 6 recombinante.

También se divulga el uso de un cromosoma 6 como el que se encuentra en las semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 41967 o NCIMB 41968 o en la progenie resistente a MYaV de cualquiera de ellas para generar una planta de melón cultivada resistente a MYaV que comprende un fragmento de introgresión de dicho cromosoma 6, en el que dicho fragmento de introgresión confiere resistencia a MYaV.

También se divulga el uso de plantas cultivadas a partir de semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 41967 o NCIMB 41968 o la progenie resistente al MYaV de cualquiera de ellas, para generar una planta de melón cultivada que comprenda la resistencia al MYaV, en la que dicha resistencia al MYaV es conferida por un fragmento de introgresión obtenido del cromosoma 6 de dichas plantas o progenie.

El ADN y los cromosomas divulgados

En un aspecto, se divulga en el presente documento un cromosoma 6 de C. melo cultivado y modificado (recombinante), que comprende un fragmento de introgresión de un melón silvestre o pariente silvestre del melón, como se describe a lo largo de la memoria descriptiva. En un aspecto, el cromosoma 6 recombinante se aísla de su entorno natural. En otro aspecto, se encuentra en una célula vegetal, especialmente en una célula de melón, sobre todo en una célula cultivada de C. melo . También se divulga en el presente documento una parte aislada del cromosoma 6 recombinante que comprende el alelo MYaV.

En otro aspecto, se describe una molécula de ácido nucleico recombinante, especialmente una molécula de ADN recombinante, que comprende un alelo MFaF según la invención. En un aspecto, el alelo de MYaV es detectable mediante uno o más de los ensayos de marcadores moleculares descritos en el presente documento. También se describe un vector de ADN que comprende el ADN recombinante. La molécula de ADN recombinante o el vector de ADN puede ser una molécula de ácido nucleico aislada. El ADN que comprende el alelo MFaV puede estar en un microorganismo, como una bacteria (por ejemplo, Agrobacterium).

En el presente documento se describe el uso de dicha molécula de ácido nucleico (aislada o extraída) y/o de dicho cromosoma 6 recombinante o parte del mismo para generar células vegetales y plantas (especialmente células vegetales de melón y plantas de melón) que comprenden un alelo de MYaV. En un aspecto descrito en el presente documento, puede utilizarse para generar células transgénicas de melón, plantas de melón y partes de melón (por ejemplo, frutos) que comprenden el alelo MYaV y la planta comprende un fenotipo de resistencia a MYaV.

Por lo tanto, también se describen en el presente documento células vegetales transgénicas, por ejemplo, células transgénicas de melón, que comprenden en su genoma un cromosoma 6 recombinante como el descrito y/o una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un alelo de MYaV. En un aspecto, la molécula de ADN que comprende el alelo de MYaV se integra de forma estable en el genoma del melón.

El alelo de MYaV también puede ser clonado y se puede hacer un gen quimérico, por ejemplo, vinculando operativamente un promotor expresable en la planta con el alelo de M YaV . Dicho gen quimérico puede introducirse en una célula vegetal y la célula vegetal puede regenerarse en una planta completa para producir una planta transgénica. En un aspecto, la planta transgénica es una planta de melón.

Por lo tanto, las plantas transgénicas, especialmente las plantas de melón cultivadas transgénicas, que comprenden un alelo de resistencia a MYaV y que tienen un fenotipo de resistencia a MYaV se divulgan en el presente documento.

En el presente documento se describen especialmente células o cultivos celulares que comprenden un cromosoma 6 recombinante, independientemente de que el cromosoma 6 recombinante se introduzca por procedimientos transgénicos o por procedimientos de cría. Las células son, por ejemplo, in vitro y son regenerables en plantas de melón que comprenden el cromosoma 6 recombinante de la invención.

También las secuencias de marcadores moleculares (y las moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden la secuencia) descritas en el presente documento y los marcadores moleculares entre cualquiera de los marcadores moleculares mencionados descritos en el presente documento y representados en la Figura 1, vinculados al QTL que confiere la resistencia a MYaV , y su uso en la detección y/o generación de plantas de melón resistentes a MYaV están comprendidos en el presente documento.

LEYENDAS DE LA FIGURA

Figura 1: El perfil LOD de MYaV6.1, un QTL en el grupo de ligamiento VI del melón (LGVI) que confiere resistencia a MYaV. Los mapas de ligamiento de LGVI para los dos cruces [(990631-2)-Q-1-K * NCIMB41966 y Amaregal * NCIMB41969] están representados por barras sólidas, y los marcadores SNP y las distancias en cM (centiMorgan) están a los lados derecho e izquierdo de las barras, respectivamente. Los marcadores SNP comunes entre los dos mapas se indican con líneas de conexión. El perfil LOD del mapa (990631-2)-Q-1-K * NCIMB41966 muestra los resultados de las evaluaciones de campo de las familias F3 replicadas en 2010, mientras que el de Amaregal * NCIMB41969 muestra los resultados de 2011 de las evaluaciones de campo de las plantas F2. El LOD máximo para el cruce (990631-2)-Q-1-K * NCIMB41966 fue de 6,3, explicando el 32,6 % de la variación observada en 2010. El LOD máximo del cruce Amaregal * NCIMB41969 fue de 50,3, explicando el 91,7 % de la variación observada en 2011.

Figura 2: Fotografía tomada en Brasil de la variedad de melón susceptible Hibrix (fila central) que muestra los síntomas del MYaV. El rectángulo muestra la parte de la planta de melón que se fenotipa para los síntomas.

Depósitos de semillas

Una muestra representativa de semillas de accesiones de melón silvestre que comprenden el QTL (designado MYaV6.1) para la resistencia a MYaV en el cromosoma 6 fue depositada por Nunhems B.V. el 2 de mayo de 2012 en el NCIMB Ltd. (Ferguson Building Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Escocia AB21 9YA), de acuerdo con el Tratado de Budapest. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Escocia AB21 9YA, Reino Unido) de acuerdo con el Tratado de Budapest, bajo la Solución de Expertos (EPC 2000, Regla 32(1)). Las semillas recibieron los siguientes números de depósito: NCIMB 41966 y NCIMB 41969 y NCIMB41967 y NClMB41968.

Una muestra representativa (2600) de semillas (BC1S2) de una planta de melón cultivada que comprende el QTL para la resistencia al MYaV en el cromosoma 6 en forma homocigota (designado MYaV6.1) fue depositada por Nunhems B.V. el 15 de febrero de 2013 en el NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Bucksburn Aberdeen, Escocia AB21 9YA) de acuerdo con el Tratado de Budapest, en virtud de la Solución Pericial (EPC 2000, Regla 32(1)). (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Escocia AB21 9YA, Reino Unido) de acuerdo con el Tratado de Budapest, bajo la Solución de Expertos (EPC 2000, Regla 32(1)). Las semillas recibieron el siguiente número de depósito: NClMB 42113.

Una muestra representativa de semillas (BC4F2) de una planta de melón cultivada que comprende el QTL para la resistencia a MYaV en el cromosoma 6 en forma homocigota (designado MYaV6.1) fue depositada por Nunhems B.V. el 12 de diciembre de 2013 en el NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Bucksburn Aberdeen, Escocia AB21 9YA) de acuerdo con el Tratado de Budapest. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Escocia AB21 9YA, Reino Unido) de acuerdo con el Tratado de Budapest, bajo la Solución de Expertos (EPC 2000, Regla 32(1)). Las semillas recibieron el siguiente número de depósito: NCIMB 42198.

El Solicitante pide que las muestras del material biológico y cualquier material derivado del mismo sólo se entreguen a un Experto designado de acuerdo con la Regla 32(1) del CPE o la legislación relacionada de los países o tratados que tengan normas y regulaciones similares, hasta la mención de la concesión de la patente, o durante 20 años a partir de la fecha de presentación si la solicitud es rechazada, retirada o se considera retirada.

El acceso al depósito estará disponible durante la pendencia de esta solicitud para las personas que el Director de la Oficina de Patentes de los Estados Unidos determine que tienen derecho a ello, previa solicitud. Sin perjuicio de lo dispuesto en el 37 C.F.R. § 1.808(b), todas las restricciones impuestas por el depositante sobre la disponibilidad al público del material depositado serán eliminadas irrevocablemente tras la concesión de la patente. El depósito se mantendrá durante un periodo de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vida ejecutiva de la patente, lo que sea más largo, y se sustituirá si alguna vez se vuelve inviable durante ese periodo. El solicitante no renuncia a ningún derecho concedido en virtud de esta patente en esta solicitud o en virtud de la Ley de Protección de las Obtenciones Vegetales (7 USC 2321 et seq.).

Los siguientes Ejemplos no limitantes describen cómo se pueden obtener plantas según la invención, que comprenden un cromosoma 6 recombinante. A menos que se indique lo contrario en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo según los protocolos estándar descritos en Sambrook et al. (1989) Clonación molecular: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressy Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NYy en Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Los materiales y procedimientos estándar para el trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Los procedimientos de mejora estándar se describen en Principles of Plant breeding', segunda edición, Robert W. Allard (ISBN 0-471-02309-4).

EJEMPLO DE REFERENCIA 1 - Resistencia en el cromosoma 6 de NCIMB 41966

1.1 Material y procedimientos

1.1.1 Desarrollo de la población F2 y F3

Se realizó un cruce entre la línea de cría (990631-2)-Q-1-K, que es susceptible al MYaV, y una accesión de melón silvestre, Cucmis melo ssp. agrestis, obtenida en los Estados Unidos pero originaria de la India, cuyas semillas fueron depositadas por Nunhems B.V. con el número de acceso NCIMB 41966.

La progenie F1 obtenida del cruce se autofecundó para obtener una población F2, que se utilizó para el genotipado (se genotiparon 96 plantas F2). Las plantas F2 se autofecundaron para obtener familias F3, que fueron fenotipadas en un ensayo de resistencia al MYaV en el campo, cerca de Mossoro, Brasil, en 2010, como se describe a continuación.

1.1.2 Ensayo de resistencia al MYaV de las familias F3

Los ensayos de resistencia al MYaV se realizaron en 2010 en el campo abierto cerca de Mossoro, bajo una alta incidencia natural del MYaV. Cada familia F3 se plantó en tres repeticiones de 20 plantas por repetición en 2010, junto con controles susceptibles (4 plantas, 3 repeticiones) y el control resistente NCIMB41966 (20 plantas). Se utilizó un diseño aleatorio completo, ya que la presión de la enfermedad era uniforme en todo el campo.

Los controles susceptibles fueron Glory F1 (Origene Seeds), Ruidera F1, Amaregal F1, Guapore, Goldex, DRY9150 y Sancho (Syngenta).

El fenotipado de los síntomas del MYaV se realizó visualmente, cuando los controles susceptibles mostraron claros síntomas de amarilleamiento.

A cada planta se le asignó una puntuación de enfermedad según la siguiente escala, en la que sólo se utilizan las hojas más viejas, es decir, el primer tercio (1/3) de la planta alrededor del tallo principal y el sistema radicular. Por lo tanto, al referirse en el presente documento a "todas las hojas" o "pocas hojas" o a un determinado porcentaje de la superficie total de las hojas, sólo se hace referencia a las hojas del 1/3 más antiguo de la planta; véase también la figura 2, en la que el rectángulo negro indica el 1/3 de la planta que se puntúa de acuerdo con la siguiente escala:

Se calculó la puntuación media de la enfermedad por familia F3 y por control.

1.1.3 Genotipado de las familias F2

El genotipado de las familias F2 se realizó utilizando el SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Illumina Infinium Array, que contiene 4600 SNPs. También se analizaron algunos marcadores ICuGI s Sr (Single Sequence Repeat) que sirvieron de marcadores de anclaje junto con otros pocos marcadores SNP de anclaje para determinar el número y la orientación del grupo de enlace.

1.1.4 Análisis de los datos de genotipo F2 y fenotipo F3

El mapeo de ligamiento se realizó con JoinMap v4 y el análisis QTL se realizó con el software MapQTL v5.

1.2.1 Resultados del ensayo de resistencia del MYaV en 2010

A continuación se muestran los resultados de los controles de susceptibilidad y resistencia:

1.2.2 Resultados del mapeo de QTL de las familias F2 y F3

Los marcadores SNP se asignaron a 12 grupos de enlace, correspondientes al número de cromosomas haploides del melón.

Para los datos del fenotipo de 2010 se encontró un QTL significativo para la resistencia a MYaV en el grupo de enlace VI (basado en la nomenclatura ICuGI), con una puntuación LOD máxima de 6,3 y que explica el 32,6 % de la variación fenotípica observada para la resistencia a MYaV.

Los resultados se muestran en la Figura 1.

Los siguientes marcadores SNP se asociaron con el fenotipo de resistencia al MYaV. El genotipo SNP del progenitor resistente y susceptible en el locus marcador también se indica en la Tabla.

Tabla 1

EJEMPLO DE REFERENCIA 2 - Resistencia en el cromosoma 6 de NCIMB 41969

2. 1 Material y procedimientos

2.1.1 Desarrollo de la población F2

Se realizó un cruce entre la variedad híbrida de melón Galia Amaregal F1, que es susceptible al MYaV, y una accesión de melón silvestre, obtenida en España pero originaria de Uzbekistán, cuyas semillas fueron depositadas por Nunhems B.V. con el número de acceso NCIMB 41969.

La progenie F1 obtenida del cruce se autofecundó para obtener una población F2, que se utilizó para el genotipado (181 plantas F2). Las plantas F2 fueron fenotipadas en un ensayo de resistencia al MYaV en el campo, cerca de Mossoro, Brasil en 2011, como se describe a continuación.

2.1.2 Ensayo de resistencia al MYaV de las plantas F2

Los ensayos de resistencia al MYaV se realizaron en 2011 en el campo abierto cerca de Mossoro, bajo una alta incidencia natural del MYaV.

Los controles susceptibles (10 plantas por parcela) fueron Amaregal (Nunhems), Sancho (Syngenta) y Caribbean Gold. También se incluyó NCIMB 41969 como control resistente (20 plantas por parcela).

El fenotipado de los síntomas del MYaV se realizó visualmente, cuando los controles susceptibles mostraron claros síntomas de amarilleamiento.

A cada planta se le asignó una puntuación de enfermedad según la escala descrita en el apartado 1.1.2.

La puntuación media de la enfermedad se calculó por línea o variedad de planta.

2.1.3 Genotipado de las familias F2

El genotipado de las plantas F2 se realizó utilizando un conjunto de 96 marcadores de todo el genoma en una plataforma KASP para el mapa de andamiaje inicial. También se analizaron algunos marcadores ICuGI SSR (Single Sequence Repeat) que sirvieron de marcadores de anclaje junto con otros pocos marcadores SNP de anclaje para determinar el número y la orientación del grupo de enlace.

2.1.4 Análisis de los datos de genotipo y fenotipo de F2

El mapeo de ligamiento se realizó con JoinMap v4 y el análisis QTL se realizó con el software MapQTL v5.

2.2 Resultados

2.2.1 Resultados del ensayo de resistencia del MYaV en 2011

A continuación se muestran los resultados de los controles de susceptibilidad y resistencia:

2.2.2 Resultados del mapeo de QTL de las plantas F2

Los marcadores SNP se asignaron a 12 grupos de enlace, correspondientes al número de cromosomas haploides del melón.

Se encontró un QTL significativo para la resistencia a MYaV en el grupo de ligamiento VI (basado en la nomenclatura ICuGI), con una puntuación LOD máxima de 50,3 y explicando el 91,7 % de la variación fenotípica observada para la resistencia a MYaV.

Los resultados se muestran en la Figura 1.

Los siguientes marcadores SNP fueron asociados con el QTL. El genotipo SNP del progenitor resistente y susceptible en el locus marcador también se indica en la Tabla.

Tabla 2

Los ejemplos 1 y 2, arriba, muestran que un fragmento de introgresión de melones silvestres, que comprende un locus que confiere resistencia a MYaV, confiere resistencia a MYaV cuando se transfiere al melón cultivado. Dado que el QTL se mapeó en el grupo de enlace 6, el QTL se denominó MYaV6.1. Las semillas de estas plantas de melón cultivadas que comprenden el QTL denominado MYaV6.1, se han depositado bajo el número de depósito NCIMB 42113 (que comprende el fragmento de introgresión de NCIMB 41969) y NCIMB 42198 (que comprende el fragmento de introgresión de NCIMB 41966).

El QTL MYaV6.1 se encontró en dos accesiones de melón silvestre, de diferentes orígenes (India y Uzbekistán), y se encontró que dos marcadores SNP (mME12135 y ME15090) estaban comúnmente ligados al QTL en ambas poblaciones, mientras que cuatro marcadores SNP (mME40332, mME28908, mME9692 y mME50656) y tres marcadores SNP (mME21377, mME36533 y mME13585) se asociaron con (vinculados a) el QTL derivado de NCIMB41966y NCIMB41969, respectivamente.

Uno o más (al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más) o todos los marcadores SNP asociados a MYaV6.1 proporcionados en el presente documento, pueden utilizarse para diversos fines, tales como

a) detectar la presencia de un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 que comprende el QTL MYaV6.1 en plantas de melón cultivadas o en partes de plantas;

b) transferir el cromosoma 6 recombinante, que comprende el locus que confiere la resistencia al MYaV(MYaV6.1), de un melón cultivado a otras plantas de melón cultivadas, especialmente variedades o líneas de mejora susceptibles al MYaV;

c) generar y/o seleccionar nuevas plantas de melón cultivadas que comprendan una introgresión con el QTL MYaV6. 1 a partir de una fuente silvestre, como un melón silvestre o un pariente silvestre del melón (como el NCIMB 41966 o el NCIMB 41969, u otros melones silvestres o parientes silvestres del melón),

d) reducir el tamaño del fragmento de introgresión salvaje que comprende el QTL MYaV6.1, es decir, generar y seleccionar recombinantes que tengan un fragmento de introgresión más pequeño en el cromosoma 6, pero que conserven la parte del fragmento de introgresión que confiere la resistencia al MYaV;

e) desarrollar marcadores moleculares alternativos para cualquiera de los fines mencionados, vinculados a MYaV6.1;

f) examinar las accesiones de melón silvestre o los parientes silvestres del melón para detectar la presencia de uno o más de los marcadores y, por lo tanto, la presencia del QTL MYaV6.1 , e introgresar la parte que confiere resistencia de estas nuevas fuentes de resistencia en las plantas de melón cultivadas, susceptibles al MYaV.

EJEMPLO DE REFERENCIA 3 - Ensayos SNP (ensayo KASP) o "Ensayo de marcador MYaV"

Con el fin de examinar las plantas para detectar la presencia de uno o más de los marcadores moleculares mencionados, vinculados al fragmento de introgresión que confiere la resistencia a MYaV, se desarrolló un ensayo KASP (un ensayo de genotipado SNP o ensayo de genotipado PCR específico de alelos de KBioscience) para los marcadores SNP mME21377, mME1590, mME12135, mME36533 y mME13585.

Sobre la base de las secuencias genómicas que comprenden el SNP (véase la Tabla 3 a continuación y el listado de secuencias), para cada marcador SNP se desarrollaron dos cebadores delanteros específicos para cada alelo (es decir, que detectan el nucleótido del progenitor susceptible o resistente en el locus SNP) y un cebador inverso común (en cursiva), indicados en las Tablas 3 y 4 (todas las secuencias se dan en dirección 5'a 3').

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para identificar una planta cultivada de Cucumis melo que comprende resistencia contra el virus asociado al amarilleamiento del melón (MYaV), en el que dicha resistencia es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 en forma homocigota o heterocigota y en el que dicho fragmento de introgresión procede de una accesión silvestre de la especie Cucumis melo, una muestra representativa de semillas de dicha accesión silvestre que ha sido depositada con el número de acceso NCIMB 41967 y NCIMB 41968, en el que dicho procedimiento comprende la detección de dicho fragmento de introgresión mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta la presencia de al menos uno de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo CC o AC para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME15090 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 1;

b) el genotipo AA o AG para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME12135 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 3;

c) el genotipo AA o AG para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME21377 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 8; y

d) el genotipo TT o CT para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME13585 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 12, y la ausencia del genotipo TT o GT para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mM36533 en la SEQ ID NO: 11; y la ausencia de al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en:

- el genotipo GG o AG para el marcador SNP mME40332 en la SEQ ID NO: 2;

- el genotipo TT o AT para el marcador SNP mME28908 en la SEQ ID NO: 4;

- el genotipo AA o AT para el marcador SNP mME9692 en la SEQ ID NO: 6; y

- el genotipo CC o CT para el marcador SNP mME50656 en la SEQ ID NO: 7.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende la detección de dicho fragmento de introgresión mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos uno de los marcadores de polimorfismo de nucleótido único (SNP) seleccionados del grupo que consiste en:

a) el genotipo CC o AC para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME15090 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 1; y

b) el genotipo Aa o AG para el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido mME12135 en el nucleótido 71 de SEQ ID NO: 3.