KR101248948B1 - 신경 세포사 억제 활성을 갖는 천마 추출물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents
신경 세포사 억제 활성을 갖는 천마 추출물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 천마 추출물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신경 세포사 억제 및 항산화 활성을 갖는 천마 추출물을 유효성분으로 함유하여 신경세포 사멸에 저항성을 나타냄으로써 파킨슨병, 알츠하이머병 등과 같은 뇌질환 증상을 예방하고, 개선 할 수 있는 천마 추출물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 천마 추출물을 함유한 조성물은 신경세포에 대하여 세포사 억제 및 항산화 활성을 가짐으로써 뇌신경 보호효과를 나타내므로 파킨슨병, 알츠하이머 등과 같은 뇌질환 증상의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 천마 추출물을 함유한 조성물은 신경세포에 대하여 세포사 억제 및 항산화 활성을 가짐으로써 뇌신경 보호효과를 나타내므로 파킨슨병, 알츠하이머 등과 같은 뇌질환 증상의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 천마 추출물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신경 세포사 억제 및 항산화 활성을 갖는 천마 추출물을 유효성분으로 함유하여 신경세포 사멸에 저항성을 나타냄으로써 파킨슨병, 알츠하이머병 등과 같은 뇌질환 증상을 예방하고, 개선 할 수 있는 천마 추출물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
파킨슨병(PD)은 흑질(substantia nigra)에서 도파민으로 활성화되는(dopaminergic) 신경세포의 손실 및 뇌 영역의 도파민의 결피이 특징으로 산화적 스트레스의 발생과 미토콘드리아의 기능이상이 병인으로 강력하게 주장되고 있다. 또한, 파킨슨병에서 미토콘드리아의 결손은 미토콘드리아 전기전달 복합체 Ⅰ의 억제로 인하여 나타난다(Pieczenik and Neustadt, 2007; Szeto, 2006; Mattson, 2000).
활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)은 여러 질병을 일으키는 원인이며, ROS의 과잉생산은 산화적 스트레스, 세포기능의 손상시켜 궁극적으로는 세포사나 세포괴사로 이르게 한다(Loh KP, Huang SH, De Silva R, Tan BK, Zhu YZ. Curr Alzheimer Res. 3(4):327-337. 2006). 또한, ROS는 세포내 신호전달체계의 신호전달자로의 역할을 하며(Kamata H, Hirata H. Cell Signal. 11(1):1-14. 1999 Review), 세포 생존 및 죽음에 중요한 역할을 하는 미토콘드리아는 전자전달시스템을 통한 ROS와의 산화환원반응에 의해 ROS의 primary intercellular source이다(Boveris A, Cadenas E. Oxygen, Gene Expression and Cellular Function. p1-25. 1997).
합성마약에서 발견된 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라-하이드로피리딘(1-methly-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine (MPTP)는 인격장애(personality, PD)와 같은 증상을 유발시킨다. MPTP는 모노아민 산화제 B(monoamine oxidase-B, MAO-B)에 의하여 1-메틸-3-페닐-피리듐 요오드화물(1-methly-4-phenyl-pyridium iodide, MPP+)로 분해되어 원형질막의 도파민 전달체를 통해 도파민 뉴런 세포내로 유입되고 미토콘드리아에 축적된다(Burns, R.S., Chiueh, C.C., Markey, S.P., Ebert, M.H., Jacobowitz, D.M. and Kopin, I.J. Proc. NatL Acad. Sci. USA, 80;4546-4550. 1983, Hallman, H., Olsos, L. and Jonsson, G., Eur. J. Pharmacol., 97;133-136. 1984, Langston, W.J., Forno, L.S., Rebort, C.S. and Irwin, I., Brain Res., 292;390-394. 1984, Langston JW and Irwin I. Clin Neuropharmacol 9:485-507. 1986, Snyder SH and D''Amato RJ. Neurology 36:250-258. 1986.).
MPP+는 미토콘드리아의 전자전달계복합체 Ⅰ(complex Ⅰ of the electron transport system(ETC))를 방해하여 미토콘드리아막 삼투압의 붕괴를 유발시키며, 미토콘드리아 침투성 변이 흡수공(mitochondrial permeability transition(MPT) pores)을 개방한다.
이러한 미토콘드리아 기능장애는 세포내 ATP의 감소와 활성산소의 증가를 유발시키며 결국 세포사로 이어지게 된다(T.P. Singer, R.R. Ramsay, FEBS Lett. 274;1-8. 1990, T.A. Seaton, J.M. Cooper, A.H. Schapria, Brain Res. 777;110-118. 1997.).
한편, 천마(Gastrodia elata Blume : GE)는 수세기 동안 동양권에서 중요한 약용식물로 사용되었으며, 두통, 어지러움증, 현기증, 간질 및 파상풍과 같은 경련성인 병(convulsive illnesses)에 사용되어져왔다. 이에 따른 천마의 신경 효과 (neurological effects)에 대한 약리효과에 대해서 보고되어 있으나 파킨슨병과 같은 neurodegenerative diseases에 대한 기능을 가지고 있음은 연구된 바 없다.
이에 본 발명자들은 신경세포사를 조절하여 파킨슨병 또는 알츠하이머병과 같은 뇌질환 증상을 예방 및/또는 개선할 수 있는 유효물질을 꾸준히 연구한 결과, 천마 추출물이 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y에 MPP+로 유독한 세포독성 및 ROS 발생을 억제하고 , 세포사와 관련된 유전자 및 단백질 발현을 효과적으로 억제함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천마(Gastrodia elata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 증상의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
상기에서 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물인 것을 특징으로 하며, 상기 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 피크(Pick)병을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 천마 추출물을 함유한 조성물은 신경세포에 대하여 세포사 억제 및 항산화 활성을 가짐으로써 뇌신경 보호효과를 나타내므로 파킨슨병, 알츠하이머 등과 같은 뇌질환 증상의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 MPP+로 유도된 세포사에서 천마 추출물의 효능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 천마 추출물 및 MPP+ 72시간 처리 후 유세포 측정기를 이용한 분석을 나타낸 그래프이다.
도 3은 MPP+에 의해 발생하는 세포내 ROS의 천마 추출물에 의한 변화를 나타낸 것이다.
도 4a는 각 농도별 천마 추출물의 POBN-alkyl 라디칼 소거능 측정을 나타낸 것이다.
도 4b는 각 농도별 천마 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정을 나타낸 것이다.
도 5는 MPP+에 의하여 세포사에서 천마 추출물의 농도별 Bcl-2 family의 발현양상을 나타낸 것이다.
도 6은 MPP+에 의한 세포사에서 천마 추출물의 cleaved PARP 저해효능을 나타낸 것이다.
도 7은 MPP+에 의한 세포사에서 천마 추출물의 caspase-3 활성 저해 효능분석을 나타낸 것이다.
도 2는 천마 추출물 및 MPP+ 72시간 처리 후 유세포 측정기를 이용한 분석을 나타낸 그래프이다.
도 3은 MPP+에 의해 발생하는 세포내 ROS의 천마 추출물에 의한 변화를 나타낸 것이다.
도 4a는 각 농도별 천마 추출물의 POBN-alkyl 라디칼 소거능 측정을 나타낸 것이다.
도 4b는 각 농도별 천마 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정을 나타낸 것이다.
도 5는 MPP+에 의하여 세포사에서 천마 추출물의 농도별 Bcl-2 family의 발현양상을 나타낸 것이다.
도 6은 MPP+에 의한 세포사에서 천마 추출물의 cleaved PARP 저해효능을 나타낸 것이다.
도 7은 MPP+에 의한 세포사에서 천마 추출물의 caspase-3 활성 저해 효능분석을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 천마 추출물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 천마 추출물은 천마 시료 중량의 약 1 내지 10배 부피의, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 알코올을 첨가하여 냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출등의 추출방법으로, 바람직하게는 초음파추출방법으로 추출한 후 여과하고, 여과한 추출물은 20 내지 100℃, 바람직하게는 30 내지 70℃에서 진공농축하여 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 뇌질환은 신경세포사에 의하여 유발되는 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 피크(Pick)병 등을 포함한다.
또한, 상기 추출물은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.
따라서, 본 발명의 추출물은 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 의약품, 건강보조식품 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 천마 추출물을 0.01~99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1~50% 함유하는 것은 더욱 바람직하다. 그러나, 상기와 같은 조성이 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 추출물이 의약품으로 이용될 경우에는 생약 추출물 그 자체만으로 포함할 수 있지만, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형, 예를 들면, 분말, 정제, 과립, 캅셀 또는 주사제 등의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다. 또한 항산화 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 천마 추출물을 통상적인 방법에 의해 정제로 제형화할 경우, 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 상기 천마 추출물을 1 : 1의 비율로 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 천마 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없으며, 체내 흡수도, 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 변할 수 있으며, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 뇌질환의 예방의 효과를 나타내는 천마 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 천마 추출물 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 그의 사용목적, 예를 들면, 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품에 포함되는 천마 추출물의 유효량은 상기 약학 조성물의 유효량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안정성 면에서는 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
또한, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 건강 기능성 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 환제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 향미제 도는 모노사카라이드, 포도당, 과당과 같은 천연 탄수화물, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 천마추출물의 제조
본 발명에 따른 천마 추출물은 천마시료 40g을 가속화용매추출기(ASE300, DIONEX Corporation, USA)로 에탄올 200ml을 첨가하여 추출한 후 여과하고, 여과한 추출물은 50℃에서 1500psi 압력으로 진공농축 20분간 하여 수득하였다. 또한, 당성분이 많은 천마뿌리는 시료 100g을 초음파분쇄기(Ultrasonic cleaner, BRANSON Ultrasonics corporation, USA)로 파쇄하여 에탄올 1L을 첨가 한 후 50℃에서 3~7일 진공농축하여 수득하였다.
실험예 1. 세포 배양
인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포는 ATCC에서 구입하였으며 열불활성화 된 우태아혈청(fetal bovine serum)10%, 100U/㎖ 페니실린 및 100㎎/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다. 또한, 세포들은 온도 37℃, 습도 5%, CO2 5%, air 95%의 배양조건을 계속 유지하면서 배양하였다.
실험예 2. 천마추출물의 세포 독성 및 세포사 억제능 확인
(1)
MTT
분석
MTT 용액은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라아졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT)를 PBS(Phosphate Buffer Saline)에 5 mg/ml의 농도로 충분히 잘 녹인 후 0.22㎛ 필터를 통해 여과하여 4℃에 보관하면서 사용하였다.
SH-SY5Y 신경모세포종 세포를 96웰 플레이트에 웰당 5×104 이 되도록 하여 48시간 배양하고, 천마 추출물을 4시간 전처리하였다. 그런 다음, 천마 추출물과 MPP+ 1mM을 48시간 반응시킨 후, 배지를 제거하고 MTT 용액 30ul를 첨가하여 빛을 차단한 상태로 37℃에서 4시간 반응시킨다. 이때 살아있는 세포는 MTT와 반응하여 보라색 포마잔을 형성한다.
4시간 후 DMSO를 100㎕ 첨가하여 포마잔을 잘 녹이고 미량 역가판 판독기(microtiter plate reader)를 이용하여 550nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, MPP+와 천마를 농도별(10, 100, 200 ㎕/㎖)로 처리한 군에서는 5347.60 % ± 1.2 %, 60.31 % ± 1.2 % 및 81.0 % ± 1.1% 로 각각 나타났으며,또한 Neuro-2A 세포를 이용한 세포생존율 검사에서도 SH-SY5Y 세포와 유사하게 나타났다(도 1참조).
(2) 유세포 측정기를 이용한 분석
MPP+에 의한 신경세포사에서 천마 추출물의 신경세포 보호능을 확인하기 위하여, 천마 추출물 농도별 처리 시 DNA 절편화(DNA fragmentation)를 유세포 측정기를 이용하여 측정하였다.
MPP+에 의하여 미토콘드리아 전기전달계가 저해되면 여러 경로를 통하여 DNA 손상을 받게 되어 게놈 DNA가 절편화된다. 이 때, 프로피디움 요오드화물(propidiumiodide, PI)로 염색한 세포를 유세포 측정을 통해 세포주기를 측정하게 되면 DNA 절편화를 정량적으로 측정할 수 있다.
SH-SY5Y 세포를 6웰 플레이트에 1×106 개로 씨딩(seeding)한 후 48시간 동안 배양하고, 천마 추출물을 4시간 동안 농도별로 전처리하였다. 그 다음 천마 추출물과 1mM MPP+를 함께 처리하였다. 72시간 배양 후 세포를 차가운(ice-cool) PBS로 한번 세척하고, 차가운(ice-cold) PBS 300㎕를 넣고 고무 폴리스맨(Rubber poilceman)을 이용하여 세포를 떼어내고 새로운 1.5㎖ 마이크로원심분리 튜브에 옮겼다. 300g 5분간 4℃에서 원심분리 후 상등액을 버리고 70% 에탄올(0.5% 트윈20 in PBS)을 첨가하여 재현탁시킨 후 4℃에서 밤새두었다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 차가운(ice-cold) PBS에 두 번 세척한 후 프로피디움 요오드화물(PI, 3㎍/㎖)과 RNase A(100㎍/㎖)을 포함한 차가운(ice-cold) PBS 300㎕에 재현탁하고, 30분간 실온에서 배양한 후 유세포 측정기로 측정하였다.
그 결과, MPP+를 처리하지 않은 대조군에서는 G1기가 가장 높게 나오지만 MPP+(1mM)를 처리하고 72시간 후 측정한 peak는 G1기 왼쪽의 hypodiploid sub-G1 peak가 가장 높게 나왔다. 이는 MPP+의 독성에 의한 DNA fragmentation이 측정되는 것이다. 이를 정량적으로 분석해본 결과 대조군은 hypodiploid DNA content가 2~3%로 나타나며, 1mM MPP+와 농도별 천마(10, 100, 200㎕/㎖)를 처리한 군에서는 31.7 % ± 1.1 %, 25.2 % ±2.5 %, 및 13.5 % ± 3.4 %로 각각 나타나서 농도 의존적으로 DNA fragmentation의 양이 감소함을 확인할 수 있었다(도 2참조).
실험예 3. 천마추출물의 세포내 산화 스트레스 억제능 확인
세포 내 활성산소종(ROS)의 증가는 세포사를 유도한다. 본 발명에서는 DCFA-DA로 염색한 세포를 유세포 측정기(FACS)로 측정하여 MPP+에 의해 유도된 활성산소종을 측정하였다.
구체적으로 1mM MPP+와 각기 다른 함량의 천마를 처리한 세포를 48시간 배양한 후 배지를 제거하고 DCFA-DA (10uM, Molecular Probes)를 무혈청 배지에 희석하여 첨가하였다. 20분간 배양 후 배지를 제거하고, 트립신처리(trypsinization)하여 세포를 모아 10% FBS가 함유된 배지로 재부유시켜 유세포 측정기로 DCFA-DA의 형광도를 측정하였다.
그 결과를 나타낸 도 3에서 볼 수 있듯이, 1mM MPP+를 24시간 처리한 실험군에서 DCF의 염색비율이 98.11%로 나타났으며, 대조군과 천마 단독처리군에서는 3%대의 염색비율을 보였다. 천마와 1mM MPP+를 동시 처리한 실험군에서 98.2 % ± 3.4 %, 83.6 % ±3.1 %, 및 62.5 % ± 6.2 %로 각각 관찰되어 천마의 농도가 높아짐에 따라 DCF의 염색비율이 낮아짐을 확인할 수 있었다(도 3참조).
실험예 4. 천마 추출물의 활성산소 제거능 확인
본 발명에 따른 천마 추출물의 활성산소 제거능을 확인하기 위하여, ESR 스펙트로미터를 이용하여 자유라디칼 소거능(free radical scavenging activity)을 측정하였다.
(1) 퍼옥시 라디칼(peroxy radical) 소거능 측정
APPH는 알킬 라디칼 형으로 분해가 되며, 알킬 라디칼과 산소(O2)의 반응으로 지질 과산화(lipid peroxidation)를 유도한다. APPH를 37℃에서 30분간 배양하면 4-PBON/자유 라디칼의 알킬 라디칼 스핀 생성물이 발생된다.
본 발명에서는 각기 다른 함량의 천마 추출물과 10mM APPH, 10mM 4-POBN을 혼합한 PBS(pH 7.4) 반응물을 37℃ water bath에 30분간 incubation하고 100ul Teflon capillary tube에 옮긴 후 ESR spectrometer(JEOL, Tokyo, Japan)로 측정한다.
그 결과, 도 4a에서 보는 바와 같이 다양한 농도(0.062, 0.125, 0.25, 0.5 and 1 mg/ml) 의 천마 추출물의 alkyl radical 소거능은 각각 13.22 % ± 17.54 %, 42.43 % ± 10.07 %, 58.86 % ± 9.7 %, 75.00 % ± 2.65 % 및 83.86 % ±1.89 %이었으며, IC50은 0.18 ± 0.07 mg/mL 이었다.
(2)
DPPH
라디칼
소거능
측정
본 발명에서 DPPH 라디칼 소거능은 난조 등의 문헌(Nanjo, F., Goto, K., Seto, R., Suzuki, M., Sakai, M., Hara, Y., Free radical biology and medicine 21; 895-902. 1996.)에 기술된 방법을 사용하였다.
구체적으로, 각기 다른 함량을 조제된 천마 추출물 60ul에 DPPH 60ul (60uM, in methanol solution)를 넣어준 후 10초간 혼합하고, 100ul 테플론 모세관에 옮겨 2분 후 ESR 스펙트로미터로 측정하였다.
그 결과, 도 4b에서 보는 바와 같이 다양한 농도(0.031, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5 and 1 mg/mL)의 천마 추출물의 hydroxyl radical 소거능은 각각 9.20 % ± 12.69 %, 37.58 % ± 6.48 %, 40.79 % ± 23.11 %, 72.77 % ± 10.57 %, 83.64 % ± 4.74 %, 89.30 % ± 3.61 % 및 91.74 % ± 2.88%이었으며, IC50은 0.09 ± 0.04 mg/mL.이었다(도 4b참조).
실험예 5. 유전자 단계에서의 천마추출물의 세포사 억제능 확인
세포사와 항세포사 구성원을 포함하고 있는 Bcl-2 family의 발현을 비교분석함은 세포사에 대한 저해정도를 확인 할 수 있다. 세포사 초기 단계에서 세포생존은 Bcl-2 family 중 세포사와 항세포사 단백질의 균형에 의해 결정되므로, 항-세포사 단백질(anti-apoptosis protein)인 Bcl-2의 절대량보다는 Bax/Bcl-2의 비율(ratio)이 더 중요하다.
본 발명에서는 천마 추출물의 세포사 억제 효능을 유전자 단계에서도 확인하기 위하여, Bcl-2와 Bax 유전자의 발현양상과 Bax/Bcl-2의 비율을 분석하였다.
구체적으로, 1mM MPP+와 천마 추출물을 농도별로 처리하고 48시간 배양한 세포를 배양기에서 꺼내어 차가운(ice-cold) PBS로 두 번 세척하였다. 여기에 트리졸(trizol) 1000㎕를 첨가한 후 고무 폴리스맨(rubber policeman)을 이용하여 세포를 떼어내고 새로운 1.5㎖ 마이크로원심분리 튜브에 옮겼다. 26G 실린지를 이용하여 세포를 균질화하고, 트리졸의 1/5 부피의 클로로포름(120㎕)을 첨가하여 볼텍싱(voltexing) 후 5분간 실온에 놔두었다가 원심분리(12000rpm, 15분, 실온)하였다. 상층액을 새로운 1.5㎖ 마이크로원심분리 튜브에 옮겨 상층액과 동일량의 이소프로판올을 첨가하여 약하게 볼텍싱하였다. 다시 원심분리(14000rpm, 15min, 4℃)하고 펠렛을 10분간 건조시킨 후, 여기에 DEPC수(0.05%) 50㎕를 넣어 잘 녹여 전체 RNA를 분리하였다.
전체 RNA는 2.5㎍을 랜덤 프라이머, 10mM dNTP, 올리고 dT 각 1㎕와 잘 섞고, 65℃에서 5분간 변성(denature) 시켰다. 그리고 여기에 10× RT 완충액과 25mM MgCl2, 0.1M DTT, RNase OUT, 역전사효소(Reverse Transcriptase)를 첨가하여 잘 섞은 다음 25℃에서 10분, 50℃에서 50분, 85℃에서 5분 동안 반응시켜 4℃에서 보관하였다. RNaseH 1㎕를 첨가 후 37℃에서 20분 반응시키고 합성된 cDNA가 25ng/㎕가 되도록 TE를 첨가하여 희석하였다.
주형으로 합성된 cDNA 1㎕에 2.5mM dNTP 1.2㎕, 10×완충액 2㎕, taq polymerase 0.1㎕를 첨가한 후 전체 부피를 20㎕로 맞추어 PCR을 수행하였다.
이 때, GAPDH는 유전자 정량 분석의 대조군으로 사용하였고, PCR에 사용한 primer은 표 1과 같다.
| 서열번호 | 프라이머서열 | 유전자 | 예상크기(bp) | |
| 1 | F | cgagatccctccaaaatcaa | GAPDH | 323 |
| 2 | R | gtcttctgggtggcagtgat | ||
| 3 | F | actttgcagagatgtccagt | Bcl-2 | 217 |
| 4 | R | cggttcaggtactcagtcat | ||
| 5 | F | actggacagtaacatggagc | Bax | 459 |
| 6 | R | tcttcttccagatggtgagc | ||
MPP+를 처리하지 않은 대조군에서는 Bax 유전자의 발현량이 거의 없었고, Bcl-2 유전자의 발현은 증가되어있음이 확인되었다. 또한, MPP+를 처리한 실험군에서는 Bax 유전자의 발현량이 확연히 증가하였고, Bcl-2 유전자의 발현량은 감소하였으며, 대조군에 비하여 Bax/Bcl-2 비율은 약 4.6배 증가하였다.
또한, 천마 추출물의 농도 의존적으로 Bax는 감소하였고, Bcl-2는 증가하여 Bax/Bcl-2 비율이 감소하는 것으로 나타났다(도 5참조).
실험예 6. 단백질 단계에서의 천마추출물의 세포사 억제능 확인
본 발명에서는 천마 추출물의 세포사 억제 효능 분석을 위하여 MPP+에 의한 세포사 유도시 발현이 증가하는 caspase-3의 활성 증가 및 PARP의 분해 산물(PARP cleaved form)을 웨스턴 브롯을 통해 단백질의 발현 양상을 정량적으로 확인하였다.
구체적으로, 1mM MPP+ 및 천마 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양한 다음 배양기에서 꺼내어 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척한 후, PBS 1㎖를 배양접시에 넣고 세포를 폴리스맨으로 떼어냈다. 떼어낸 세포를 마이크로원심분리 튜브에 옮겨 원심분리(3000rpm, 3분, 4℃)한 다음, 상등액을 버리고 인산분해효소(phospatase)와 단백질분해효소(proteinase)가 첨가된 1×RIPA 라이시스 완충액(lysis buffer)을 100㎕을 첨가하여 균질화하였다. 5분간 얼음에 놔두어 라이시스하고, 원심분리(10000rpm, 3분, 4℃)한 다음 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다.
분리된 단백질의 농도를 BSA를 표준물질로 하여 BCA 방법으로 측정하고, 20~40㎍의 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에 사용하였다. 관찰할 단백질의 크기에 따라 로딩 시간과 전압을 달리하였다.
로딩된 단백질은 polyvinylidene difluoride(PVDF) 멤브레인에 280mA로 90분간 전이(transfer)하였고, 전이가 잘 되었는지는 ponseuS로 5분간 염색하여 확인하였다.
0.1% TBST(Tween-Tris-buffered saline)으로 세척하고 5% 탈지분유로 1시간 동안 실온에서 블록킹한 후 1차 항체는 2시간 실온에서 반응시키거나 caspase의 경우, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 10분씩 3번 세척한 후 HRP-컨쥬게이트된 2차 항체를 1시간 반응시켰으며, 이 때 1차 항체와 2차 항체의 희석비율은 표 2와 같다.
항체 반응이 끝난 멤브레인을 TBST로 1분씩 4번 세척하고, ECL 발색시약을 이용하여 검출하였다. 표 2에서 β-actin은 정량 확인의 대조 단백질이다.
| 항체 | Cat. No. | 1차 항체 | 2차 항체 |
| PARP | santa cruz, sc-7150 | 1:2000 | 1:10000 |
| β-actin | santa cruz, sc-1616 | 1:1000 | 1:20000 |
그 결과, MPP+ 단독 처리한 실험군은 PARP cleavage가 263.42% ± 25.55% 증가하였으며, 1mM MPP+와 천마를 농도별로 처리한 군에서는 248.99% ± 25.76%, 181.21% ± 17.04% 및 145.89% ± 10.36%로 각각 관찰되어, 천마의 농도가 높아짐에 따라 감소함을 확인하였다(도 6참조).
Caspase-3는 신경 세포사의 바이오 마커로 세포사의 executor로 작용하며, 세포사시 활성이 증가한다. SH-SY5Y 세포에 MPP+(1mM) 및 천마를 농도별로 처리하고 48시간 배양한 후, caspase-3 활성 측정을 한 결과 Caspase-3 활성 측정은 colorimetric caspase-3 assay kit(sigma)를 사용하여 측정하였다. 5㎕ cell lysate와 10㎕ caspase-3 substrate (Ac-DEVD-pNA) (final concentration, 200 ㅅM)를 포함하는 reaction mixture (total volume, 100 μL)를 96-well plate에 옮기고, 90분간 37℃에 배양한 후 405nm의 파장에서 측정하였다.
그 결과 Caspase-3는 신경 세포사의 바이오 마커로 세포사의 executor로 작용하며, 세포사시 활성이 증가한다. SH-SY5Y 세포에 MPP+(1mM) 및 천마를 농도별로 처리하고 48시간 배양한 후, caspase-3 활성 측정을 한 결과 1mM MPP+ 단독 처리군에서 399.66 ± 11.93 %. 로 증가하며, 1mM MPP+와 천마를 농도별로 처리한 군에서는 366.00 ± 8.71 %, 234.66 ± 13.20 %, 173.66± 10.06 %로 각각 관찰되어, 천마의 농도가 높아짐에 따라 감소함을 확인하였다(도 7참조).
실험예 7. 통계분석
실험결과의 재현성 확인을 위하여, 상기 각 실험을 2회 또는 3회 실시하였으며 실험 결과의 분석을 시그마플롯(sigma-plot)을 사용하여 Bonferroni method를 이용한 일원분산분석(one-way ANOVA)을 하였다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp.
<120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACT OF GASTRODIA
ELATA BLUME HAVING ANTI-APOPTOTIC OXIDATIVE ACTIVITY FOR
PREVENTING AND TREATING OF NEURODEGENERATIVE DISEASES
<130> P10-E177
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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cgagatccct ccaaaatcaa 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 6
tcttcttcca gatggtgagc 20
Claims (7)
- Bax 유전자 및 카스파제-3(caspase-3)의 발현을 억제함으로서 도파민 신경세포의 세포사 억제 활성을 갖는 (1) 천마(Gastrodia elata)를 초음파분쇄기로 파쇄하는 단계;와 (2) 에탄올을 첨가하여 추출한 후 여과하는 단계; 및 (3) 50℃에서 3 내지 7일 동안 진공농축하여 천마 에탄올 추출물을 수득하는 단계;를 포함하여 제조되는 천마 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학조성물.
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- Bax 유전자 및 카스파제-3(caspase-3)의 발현을 억제함으로서 도파민 신경 세포의 세포사 억제 활성을 갖는 (1) 천마(Gastrodia elata)를 초음파분쇄기로 파쇄하는 단계;와 (2) 에탄올을 첨가하여 추출한 후 여과하는 단계; 및 (3) 50℃에서 3 내지 7일 동안 진공농축하여 천마 에탄올 추출물을 수득하는 단계;를 포함하여 제조되는 천마 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 증상 개선용 건강기능식품.
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