KR20030071035A

KR20030071035A - 신경보호활성을 가지는 천마 추출물 및 이를 포함하는치매 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20030071035A
Application number: KR1020020010554A
Authority: KR
Inventors: 김현주; 이상한
Original assignee: 씨.에프. 주식회사
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2002-02-27
Publication date: 2003-09-03

Abstract

본 발명은 신경보호활성을 가지는 천마 추출물 및 이를 포함하는 치매 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 천마 추출물은 신경보호작용을 하여 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사를 억제하는 효과가 있으므로 알츠하이머 질병, 치매 등을 예방 및 치료할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

신경보호활성을 가지는 천마 추출물 및 이를 포함하는 치매 예방 및 치료용 조성물{Gastrodia elata Blume extracts having neuroprotection activity and preventive and therapeutic composition for dementia containing the same}

본 발명은 신경보호활성을 가지는 천마 추출물 및 이를 포함하는 치매 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사를 억제하는 효과가 있어 알츠하이머 질병, 치매 등을 예방 및 치료할 수 있는 천마 메탄올 추출물 및 이의 세분획에 관한 것이다.

알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)은 퇴행성 뇌질환의 일종으로 나이든 사람에게서 알츠하이머 치매의 형태로 나타난다. 신경 병리학적으로는 노인반(senile plaques)과 대뇌혈관의 아밀로이드 침착, 신경섬유의 엉킴과 선택적인 신경손실을 유발하는 것을 특징으로 한다.

최근 연구에 의하며, 아밀로이드 β-펩타이드가 치매의 점진적인 신경손실에 관여한다고 보고되고 있다. 아밀로이드 β-펩타이드는 길이가 대략 40-42 아미노산 잔기를 가지는 하나의 불용성 펩타이드로, Human 아밀로이드 β 서열 (sequence)로부터 유도된 펩타이드는 in vivo에서 신경세포 계통(line) 뿐만 아니라 신경세포 기원의 일차 배양에 독성효과를 일으키는 것으로 나타났다(Pike et al.,J. Neurosci., 13, 16761687 (1993).,Zhang et al.,Neurosci. Lett.,177, 162164 (1994)). 더욱이 아밀로이드 β (1-40) 이나 아밀로이드 β (1-42)를 랫트 뇌의 중격막이나 확대세포성 핵에 주사하면 신경 퇴행성을 일으키고 콜린작동성 표식인자 (cholinergic marker)의 수준을 감소시킨다(Pedersen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 80688071 (1996)., Giovannelli et al.,Neuroscience, 66, 781792 (1995)., Harkany et al.,Brain Res., 695, 7175 (1995)). 또한 아밀로이드 β (1-40)를 주사(injection)하면 안정된 아밀로이드 β-peptide 침착이 초래되고, 국소적인 신경퇴화가 수반된다(Kowall et al.,Proc Natl Acad Sci USA, 88, 72477251 (1991)). 이러한 결과는 알츠하이머 질병을 앓고 있는 환자의 뇌 속에 불용성 아밀로이드 β-peptide가 많이 존재한다는 사실과 일치한다(Wisniewski et al., J.,Neurobiol Aging,10, 409412 (1989).

한편, 천마(天麻,Gastrodia elataBlume)는 수세기 동안 동양권에서 전통적인 초본약재로써, 항간질제로 사용되었으며 진통제와 현기증에 대한 안정제, 고혈압, 일반적인 마비와 파상풍에 사용되어져 왔다. 천마의 성분 중 바닐 알코올(vanilul alcoho)과 가스트로딘(gastrodin)이 항간질 효과를 가지는 것으로 알려져 있으며(Wu et al.,Yao-Hsueh-Hsueh-Yao, 24, 482486 (1989)) 최근에 천마의 구성 성분이 신경세포에서 글루타메이트 유도성 아포토시스 (apoptosis)를 저해한다고 보고되었고(Lee et al.,Arch. Pharm. Res., 22, 404409 (1999)). 또한 천마의 에테르 분획이 GABA(γ-aminobytylic acid)의 감소를 줄이고 글루타메이트 함량의 증가를 감소시키며 펜틸렌 테트라졸 유도성 간질에서 항간질 효과를 나타낸다고 보고된 바 있다(Ha et al.,J. Ethnopharmacol., 73, 329333 (2000)., Huh et al.,J. Appl. Pharmacol., 3, 199204 (1995). )

상기한 바와 같이, 종래에 천마의 항간질효과는 많이 보고되어 있으나, 천마추출물이 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사 억제능을 가지고 있음은 연구된 바 없다.

본 발명자들은 전통 천연생약제인 천마의 추출물 및 이의 활성을 연구하여 오던 중, 천마의 메탄올 추출물 및 이의 세분획이 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사 억제활성을 가지고 있어 치매를 예방 및 치료하는 효과를 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 신경보호활성을 가지는 천마 추출물 및 이를 포함하는 치매 예방 및 치료용 조성물을 제공함에 있다.

이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 천마로부터 메탄올 추출물 및 에틸에테르 분획, 클로로포름 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획을 얻는 추출과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 천마로부터 추출한 메탄올 추출물 및 각 분획물의 하이드록시 라디칼(OH) 포착활성(A)과 항산화 활성을 측정하기 위하여 전자공여 능력을 측정한 결과(B)이다.

도 3은 신경 아세포종 세포(neuroblasttoma cell)에서 천마로부터 추출한 추출물 및 각 분획물의 세포사멸방지능을 측정한 결과이다.

본 발명은 천마추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 을 부탄올로 추출한예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

천마(Gastrodia elataBlume) 추출물은 잘게 분쇄한 천마를 메탄올로 용매 추출 추출물(이하 '천마 메탄올 추출물'이라 함), 상기 천마 메탄올 추출물을 에틸 에테르로 추출하고 남은 물층에 클로로포름으로 추출한 추출물(이하 '클로로포름 분획'이라 함) 상기 클로로포름으로 추출 후 남은 물층을 에틸아세테이트로 추출한 추출물(이하 '에틸아세테이트 분획'이라 함)상기 에틸아세테이트 추출후 남은 물층 추출물(이하 '부탄올 분획'이라 함)을 의미한다.

상기의 방법으로 제조된 본 발명의 천마 추출물은 신경보호작용을 하여 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사를 억제하여 최종적으로는 알츠하이머 질병, 치매를 예방하고 치료한다.

본 발명 천마 추출물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 통상적인 방법에 의하여 정제, 캅셀제, 과립제, 현탁제, 유제와 같은 단위 투여형 또는수회투여형 제제로 제형화하여 신경보호용 또는 치매치료용 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명 천마 추출물은 목적하는 바에 따라 1회 투여량 체중 1kg 당 100 mg 내지 1000 mg으로 일일 수회 나누어 투여할 수 있다. 단, 특정환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 : 천마의 메탄올 추출물 및 세분획의 제조

천마의 메탄올 추출물 및 상기 추출물의 세분획 즉 에테르분획, 클로로포름 분획, 부탄올 분획, 에틸 아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획은 도 1에 나타난 바와 같은 과정으로 추출하였다.

먼저, 한국의 경북지역의 천마 농장에서 구입한 3년근 천마를 세절한 후 70℃의 초급속 냉동기에서 얼려 동결건조한 후 믹서기로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 천마 1kg에 3배의 메탄올(3L)을 첨가한 후 60℃에서 3회 반복 추출하여 천마 메탄올 추출물(M)을 제조하였다. 상기 메탄올 추출물을 10% 메탄올에 재현탁시킨 후 동량의 에테르(1L)를 가하여 분별 깔대기에서 3회 분리하여 에테르 층을 얻은후 40℃이하에서 감압농축하여 에틸 에테르 분획(EE)을 얻고, 물층(water layer)에는 동량의 클로로포름(150mL)을 가하여, 클로로포름 분획(C)과 물층으로 재분획하였다. 상기 물층은 다시 동량의 에틸 아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 분획(EA)과 물층을 얻었으며, 마직막으로 물층에 동량의 부탄올을 가하여 부탄올 분획(B)와 물 분획(W)을 얻었다.

상기 5개의 분획은 모두 진공농축기로 농축하였으며 DMSO에 현탁시켰다. 각 분획의 색깔은 옅은 갈색에서 짙은 갈색이었다.

실험예 1: 항산화 활성에 대한 전자 공여능 측정

활성산소종(reactive oxygen species)은 신경세포사의 시발점이 될 수 있다고 보고되어 있다. 본 실험예에서는 항산화제가 신경세포사를 저해 할 수도 있을 것으로 추정하고, 천마의 메탄올 추출물 및 각 세분획의 항산화 활성을 측정하고자 하였다.

항산화 활성을 측정하기 위해서 DPPH (2-diphenyl 1-picryl-hydrazyl)를 이용하여 전자공여 능력 (electron donating ability; EDA)을 측정하였다.(Choi et al.,Kor. J. Food Nutr., 12, 323335 (1983)).

상기 실시예에서 제조한 천마 메탄올 추출물 및 5개의 분획 각각에 0.1ml에 5×10^-5M의 DPPH 용액 0.8 ml, 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.5)의 1.4 ml, 99.5% 에탄올 1.0 ml을 첨가한 다음 상기 혼합물 (전체부피 3.3ml, 최종농도 100㎍/ml )을 10초 동안 voltex mixer로 혼합하였다. 반응물을 10분 동안 상온에 두었으며 525nm에서 흡광도를 spectrophotometer로 측정하였다. EDA 값은 대조구에 대한 흡광도의 차이에 의해서 계산하였다.

천마의 메탄올 추출물 및 각 분획의 전자공여능력 (EDA)은 도2(A)에 나타난 바와 같이, 에틸 아세테이트 분획 72.2%, 클로로포름 분획 62.7%, 메탄올 추출물 44.2%, 부탄올 39%, 에틸에테르 38.4%, 물층 13.6%으로 측정되었고, BHA(butylated bydroxyanisole)와 BHT(butylated hydroxytoluene)의 전자공여 능력은 각각 94.5%와 94.2%이었다(TP).

실험예 2 : 하이드록시 라디칼 포착 활성 조사(Hydroxyl radical scavenging assay)

천마 분획의 라디칼을 포착활성을 조사하기 위해서 OH· radical 포착 assay를 실시하였다.

천마의 하이드록시 라디칼 포착 활성은 2-deoxy ribose 산화 방법으로 분석하였다(Chung et al.,Biotechnol. Biochem., 61, 118123 (1997).). 2-deoxyribose는 하이드록시 라디칼에 의해서 산화되며 이라디칼은 펜톤 반응에 의해서 생성되어지고 말론 다이알데하이드로 분해되어진다(Gutteridge J. M. C.,Biochem. J., 243, 709714 (1987)).

FeSO₄.7H₂0 (10 mM) 과 에틸렌 다이아민 테트라 아세틱 에시드 (EDTA) (10mM) 0.2ml를 시험관에 넣고 10 mM의 2-deoxyribose 용액 0.2 ml 과 샘플 0.2 ml, 인산 완충액 1.2 ml (pH 7.4, 0.1M)를 부가하여 전체 부피를 1.8 ml로 하였다. 마지막으로 10 mM 과산화 수소(H202) 용액 200㎕ 와 샘플 용액 그리고 인산 완충액 (pH 7.4, 0.1M)을 이 반응 혼합물에 첨가하였으며 4시간 동안 37℃ 에서 정치하였다. 정치(Incubation)후에 트리 클로르 아세틱 에시드 용액 (2.8%)의 각 1 ml 와 2-thiobarbituric acid (TBA) 용액 1%를 반응물에 첨가하였다. 샘플은 100℃에서 10분 동안 끓였으며 얼음에 냉각시키고 그 흡광도를 uv-visible spectrophotometer (UV-1601, Shimazu. Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 520nm에서 측정하였다.

천마의 OH· 포착 활성은 도2(B)에 나타난 바와 같이, 에틸에테르 분획은 100 ㎍/ml 에서 강한 80% OH· 라디칼 활성을 나타내었다. 그리고 강력한 항산화제로 알려진 BHA와 BHT는 각각 80% 와 89% 활성을 나타내었다.

실험예 3: MTT assay

천마의 신경 보호 작용을 조사하기 위하여 human IMR-32 신경 아세포종 세포(neuroblastoma cell)에서 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도된 세포사 회복을 조사하였다. 대조 실험에 있어서 아밀로이드 β-펩타이드(42-1) 가 negative control로서 사용하였다.

IMR 32 세포주는 미국 국립암연구소(NCI), USA로부터 얻었으며, 10% 송아지 혈청을 함유한 RPMI배지에서 배양하고 1×10⁵cell/ml 농도가 되게 한 다음 96 wellplate에 180 ㎕씩 분주하였다. 24 시간 후에 cell이 well plate에 잘 부착 되었는지를 확인한 후 아밀로이드 β-펩타이드(1-42)(Bachem, Bubendorf, Switzerland)가 10 μM 의 최종 농도로 직접 처리하였다. 각 샘플은 최종 농도를 ml 당 10 ㎍으로 하였으며 MTT assay를 하기 전에 24시간 배양시켰다. 최종 DMSO의 농도는 0.1%이였으며 이 농도는 세포의 성장과 소멸에 영향을 주지 않았다. 보존용액(stock solution)은 배양 배지를 이용하여 1: 1000의 비율로 희석하였다.

MTT 용액은 인산완충 식염수 (PBS)에 ml 당 5㎍으로 준비하였고 여과를 하여 사용하였으며 4℃의 암소에 저장하였다. ml 당 5㎍에 MTT 20 ㎕ 를 100㎕의 배양액에 첨가하였다. 37℃ 에서 부가적으로 7-8 시간 인큐베이션 (incubtion) 후에 포말잔 (formazan) 결정을 0.01N HCl에서 10% sodium dodecyl sulfate(SDS)의 100 ㎕로 용해시켰다. 플래이트는 하룻밤 동안 배양하였으며 well의 광학밀도(OD)가 570nm 의 시험 파장에서 그리고 표준 파장이 690nm 에서 ELISA reader를 사용하여 측정하였다.

실험결과 도 3에 나타난 바와 같이, 대조구로 사용한 아밀로이드 β-펩타이드(42-1)는 20 μM 로 처리한 범위내에서 IMR 32세포에 있어서 세포손상을 주지 않았다. 그러나 아밀로이드 β-peptide (1-42)는 세포손상을 유도하였으며 MTT assay에 의해서 O.D 값이 감소하였다. 에틸 아세테이트 분획 단독, 그리고 물 분획 단독으로는 비록 우리가 β 아밀로이드를 첨가하지 않더라도 대조구에 비해서 세포성장을 약간 증가 시켰다. 이것은 이러한 분획이 알려지지 않은 메커니즘에 의해 세포(cell line)의 증식에 영향을 미친 것으로 판단된다.

천마의 에틸에테르 분획이 아밀로이드 β 유도성 세포사에서 92%의 뛰어난 보호 효과를 가짐을 발견하였다(도3). 상기의 결과는 천마의 에틸에테르 분획이 아미로이드 β 펩타이드에서 유도된 IMR-32 세포에 있어서 세포사를 회복한 것을 나타낸다.

이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 명백한 바와 같이, 천마 추출물은 신경보호작용을 하여 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사를 억제하는 효과가 있으므로 알츠하이머 질병, 치매 등을 예방 및 치료할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 기능성 식품 및 의약품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

천마를 세절한 후 분쇄하고 메탄올을 첨가하여 추출하여 얻어지며, 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사 억제활성을 가지는 천마 추출물.
제1항의 천마 메탄올 추출물을 에틸 에테르로 분획한 후 얻어지는 물층을 클로로포름으로 재분획하여 얻어지며, 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사 억제활성을 가지는 천마 추출물.
제 1항의 천마 메탄올 추출물을 에틸에테르로 분획한 후 얻어지는 물층을 클로로포름으로 추출한 후 남은 물층을 에틸아세테이트로 추출하여 얻어지며, 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사 억제활성을 가지는 천마 추출물.
제 1항의 천마 메탄올 추출물을 에틸에테르로 분획한 후 얻어지는 물층을 클로로포름으로 추출한 후 남은 물층을 에틸아세테이트로 추출하고 남은 물층을 부탄올로 추출하여 제조되며, 아밀로이드 β-펩타이드에 의해서 유도되는 신경 세포사 억제활성을 가지는 천마 추출물.
제1항의 천마 메탄올 추출물 또는 제2항 내지 제4항의 천마 추출분획물 중에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 및 치료용 조성물.