KR101205713B1

KR101205713B1 - 1-［2-（4-니트로-페닐）-벤즈옥사졸-5-일］-프로판-1-온을 유효성분으로 함유하는 톡소포자충 및 콕시디움에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101205713B1
Application number: KR1020100040600A
Authority: KR
Inventors: 박현; 김성연; 석 김; 이규양; 김한영; 서지희; 김낙정
Original assignee: 한국화학연구원; 원광대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2012-11-29
Also published as: KR20110121143A

Abstract

본 발명은 톡소포자충, Eimeria tenella 를 포함한 콕시디움 질환의 우수한 항콕시디움(coccidium)효과를 갖는 하기 화학식 1의 1 -[2-(4-니트로-페닐)-벤조오사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물(1124JH0013), 이의 제조방법 및 콕시디움 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

1-［2-（4-니트로-페닐）-벤즈옥사졸-5-일］-프로판-1-온을 유효성분으로 함유하는 톡소포자충 및 콕시디움에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising 1-[2-(4-nitro-phenyl)-benz-oxsazol-5-yl]-propan-1-one(1124JH0013) for preventing and treating the disease caused by Toxoplasmosis and Coccidium}

항콕시디움(coccidium) 효과를 갖는 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물, 이의 제조방법 및 콕시디움 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] C.M. Jin et al., Experimental Parasitology, 121(2), pp132-136, 2009.

[문헌 2] Jiang JH, Jin CM, Kim YC, Kim HS, Park WC, Park H., Biol Pharm Bull. 31(12):pp.2273-6, 2008.

[문헌 3] Jang, S. I., Jun, M. H., Lillehoj, H. S., Dalloul, R. A., Kong, I. K., Kim, S. and Min, W. G. Anticoccidial effect of green tea-based diets against Eimeria maxima. Vet. Parasitol . 144: pp.172-175, 2007.

[문헌 4] Daugschies et al.. Veterinary Parasitology 103, pp. 299-308, 2002.

톡소포자충, 아이메리아 테넬라(Eimeria tenella)를 포함한 콕시디움은 인수공통 질병을 유발함으로써 가축이나 인간에게 큰 피해를 주고 있다. 콕시디움에 대한 치료 및 예방제로서 항생제를 주로 사용하여 왔으나 치료 효율이 비교적 낮고, 항생제 내성원충이 출현하였으며, 잔류독성 문제가 발생하여 새로운 약제 개발이 요구되고 있다(Daugschies et al.. Veterinary Parasitology 103, pp. 299-308, 2002).

산업동물에 있어서 콕시듐 감염증은 가축 폐사, 사료효율 감소, 증체 감소, 약제 사용에 따른 비용증대 및 인건비 증대 등 막대한 경제적 손실을 유발하고 있다. 특히 양계산업과 양돈 산업은 콕시듐 감염증으로 인해 가장 막대한 피해를 입는 대표적 축종이라 할 수 있다. 양계 산업에 있어서 콕시듐 감염증의 원인체는 아이메리아(Eimeria), 류코싸이토준(Leucocytozoon), 헤모프로테우스속(Haemoprote us), 톡소플라즈마(Toxoplasma), 주육포자충(Sarcocystis) 및 크립토스포리디움 (Cryptosporidium) 등이 보고되고 있으나, 이들 중 아이메리아(Eimeria)에 의한 피해가 가장 심각한 것으로 알려져 있다. 양돈 산업에 있어서 주요 콕시듐 감염증 원인체는 아이메리아(Eimeria), 아이소스포러(Isospora), 와포자충증(Crypto sporidia) 및 톡소플라즈마(Toxoplasma) 등으로 보고되고 있다. 이들 콕시듐에 감염된 개체의 임상증상은 대체적으로 식욕부진, 설사 및 체중감소가 주된 증상이며 폐사율은 높지 않은 편이다. 양계산업에 있어서 콕시듐에 의한 경제적 손실은 미국에서만 연간 15억 달러(1조 8천억원)이상 피해를 보는 것으로 보고되었으며(Weber, 1997), 양돈의 경우 덴마크에서 두당 15%의 증체율 감소(Bayer Health Care)를 보이는 것으로 나타나 이로 인한 경제적 피해는 막대할 것으로 예측되고 있다. 산업동물에 있어서 콕시듐 감염증의 예방 대책은 농가 청결관리 및 소독철저, 항콕시듐제의 예방적 투여, 주요 매개물(설치류, 기구 등)의 차단, 농가간 전파 파단 등이며, 현재 실험적 백신이 보고되고 있으나 아직 상용화 단계는 아니다. 또한 본 질병에 의한 치료방법은 ionophores, sulphonamides, diclazuril, amprolium, furozolidone 등의 항콕시듐제가 사용되고 있으나, 항콕시듐제 남용 및 내성원충의 출현 등으로 치료에 상당한 양과 시일이 소요되고 있어 이에 대한 대책 마련이 절실한 실정이다. 특히 현행 유통되고 있는 사료의 대부분에 사료첨가용 항콕시듐제가 일정부분 들어있어, 내성획득을 쉽게 하는 원충의 특성상, 항콕시듐제를 이용한 콕시듐의 근절은 요원한 실정이다(Daugschies et al.. Veterinary Parasitology 103, pp. 299-308, 2002).

따라서, 신약의 개발이 절실하나 신약개발에 드는 비용이 막대하고, 효능 검정에 드는 부대비용, 내성 획득시 또 다른 신약을 재개발해야 하는 어려움으로 인해 유수의 제약회사에서 항콕시듐제제의 개발에 어려움을 겪고 있다. 이런 항콕시듐제제의 문제점으로 인해 최근의 다수의 연구자들이 내성획득 문제점을 해결할 수 있는 제제 개발에 연구역량을 집중하고 있는 상태이지만 뚜렷한 개발 성과가 없는 실정이다.

최근 의약품의 연구동향은 여러 가지 부작용이나 독성 및 내성 등이 심각해지고 있으므로 세계적으로 천연물로부터의 의약품 개발에 관한 연구가 활발히 추진되고 있다. 이것들이 질병치료에 효과적으로 이용되기 위해서는 치료용량이 숙주에 대해서는 독성을 주지 않고 감염원에 대해서는 살충효과가 매우 커야 하나 독성이 적으며 내성기생충에 유효한 새로운 항생물질을 연구개발하고, 병용투여와 같은 방법으로 내성기생충의 출현 및 독성을 감소시키기 위한 연구가 요구되고 있다.

이에 본 발명자는 콕시디움에 대한 뛰어난 항원충 효과를 나타내는 천연물 제재를 개발하였고, 생체 내 실험에서 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물이 항콕시디움 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적에 따라, 톡소포자충, 아이메리아 테넬라(Eimeria tenella)를 포함한 콕시디움에 대하여 우수한 항콕시디움(coccidium)효과를 갖는 하기 구조식 A의 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.

본 발명은 톡소포자충, 아이메리아 테넬라(Eimeria tenella)를 포함한 콕시디움에 대하여 우수한 항콕시디움(coccidium)효과를 갖는 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 콕시디움에 기인한 질환의 예방 또는 수의학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 콕시디움에 기인한 질환의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

본 발명은 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물을 유효성분으로 함유하는 콕시디움에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 “콕시디움에 기인한 질환”의 대상 동물은 사람, 돼지, 소, 염소 등의 포유동물; 잉어, 금붕어 등의 어류; 및 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함한다.

본 발명에 사용되는 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염 뿐 아니라 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 수화물 및 입체이성질체를 모두 포함한다.

본 발명의 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물의 약학적으로 허용가능한 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염을 예시할 수 있다. 상기 유리산으로는 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있는데, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 아세트산, 글리콜산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있고, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄설폰산, 염산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 산 부가염은 통상의 방법, 즉, 상기 화학식 1의 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물을 아세톤, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 등과 같은 수혼화성 유기용매에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나, 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시킨 후, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 다음 건조시키거나 석출된 염을 흡인 여과시킴으로써 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 반응식으로 표시되는 화학식 1의 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물 제조방법을 제공한다.

상기 반응식에 나타낸 바와 같이, 화학식 1의 화합물은

상기 화학식 5의 화합물을 니트로화 반응하여 화학식 4의 니트로 화합물을 제조하고(단계 1);

상기 화학식 4의 화합물을 환원시켜 화학식 3의 아민 화합물을 제조하고(단계 2);

상기 화학식 3의 아민 화합물로부터 화학식 2의 아마이드 화합물을 제조하고(단계 3); 및

상기 화학식 2의 화합물을 고리화 반응을 통해 제조된다(단계 4).

상기 단계 1의 상기 화학식 4 화합물은 출발물질인 4-하이드록시 프로피오페논에 당량 또는 과량의 질산(HNO₃), 질산소다(NaNO₃), 질산암모늄(NH₄NO₃) 등을 사용하여 니트로화 반응으로 제조한다. 이때 출발물질은 상업적으로 시판되는 것을 사용한다.

여기에서 상기 반응의 반응 용매로는 황산, 아세트산, 무수초산, 클로로포름(CHCl₃) 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 반응 온도는 0℃ 내지 -25℃의 온도 내에서 수행한다.

상기 단계 2의 상기 화학식 4 화합물인 니트로 화합물에서 상기 화학식 3의 아민 화합물이 형성되는 환원 반응에서는 팔라듐 촉매(Pd/C)또는 라니 니켈 촉매 존재 하에 수소가스를 사용하여 수소화 반응시키거나 하이드라진 수화물과 라니 니켈, 염화제일주석(SnCl₂)ㆍ염화수소(HCl), 철(Fe)ㆍ염화수소(HCl) 등을 반응시켜 제조한다. 일반적으로 메탄올과 같은 알코올계 용매에서 반응시킨다.

상기 단계 3의 상기 화학식 2 화합물은 아민 화합물과 3-나이트로 벤조일클로라이드와의 아실화 반응으로 제조된다.

이때, 염기로는 피리딘, 트라이에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 1,8-디아자바이사이클로[5,4,0]운데-7-센(DBU)등의 유기염기 또는 수산화나트륨(NaOH), 탄산나트륨(Na₂CO₃), 탄산칼륨(K₂CO₃), 탄산세슘(Cs₂CO₃) 등의 무기 염기를 당량 또는 과량으로 사용할 수 있다.

여기에서 상기 반응의 반응 용매로는 테트라하이드로퓨란, 디옥산, 디클로로메탄, 1,2-디메톡시에탄과 같은 에테르계 용매와, 디메틸폼아미드(DMF), 디메틸설폭사이드 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 반응 온도는 0℃에서 25℃ 까지이다.

상기 단계 4의 상기 화학식 2 화합물인 아마이드 화합물로부터 벤젠 또는 톨루엔 용매에서 촉매량의 p-톨루엔설폰산을 사용하여 상기 화학식 1의 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물을 제조한다. 이때 반응온도는 상온에서 용매의 비등점까지이다.

본원에서 정의되는 “콕시디움에 기인한 질환”은 콕시디움증으로 한다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물은 톡소포자충, Eimeria tenella를 포함한 콕시디움에 대하여 우수한 항콕시디움(coccidium)효과를 갖는 콕시디움으로 기인한 질환의 예방 또는 치료용 수의학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 제조공정으로 얻어진 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물을 유효성분으로 함유하는 콕시디움에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물을 함유하는 수의학 및 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 화합물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물의 수의학적 투여 형태는 이들의 수의학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 수의학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 수의학 조성물 및 약학 조성물은 수의학 조성물 및 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 수의학 조성물 및 약학 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 수의학 조성물 및 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물이 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.

본 발명에 의한 수의학 조성물 및 약학 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 ㎎/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 공정에서 얻어지는 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물을 유효성분으로 함유하는 콕시디움에 기인한 질환의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

상기의 동물사료 첨가제용 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태일 수 있다.

본 발명의 동물사료 첨가제용 화합물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 동물사료 첨가제용 화합물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 화합물을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 바이러스로 인한 질환의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.

또한, 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물이 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물(예를 들어, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물(예를 들어, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축(예를 들어, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온은 톡소포자충의 증식에 뛰어난 억제 효과를 나타내므로 톡소포자충 및 콕시디움 예방 및 치료용 약학조성물 및 항원충보조제로 이용될 수 있다.

도 1은 항톡소포자충 활성에 대한 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온의 생체 내 억제효과를 도시하는 도이고,
도 2는 분변 속 충란 개수를 나타낸 도이고,
도 3은 콕시디움 감염 6일 후 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온의 콕시디움 억제효과를 나타낸 도이며,
도 4는 콕시디움 감염 7일 후 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온의 콕시디움 억제효과를 나타낸 도이며,
도 5는 콕시디움 감염 9일 후 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온의 콕시디움 억제효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 1-[2-(4-니트로- 페닐 )- 벤즈옥사졸 -5-일]-프로판-1-온 화합물의 합성

1-1. 1-(4- 하이드록시 -3-니트로- 페닐 )-프로판-1-온 (화합물 4)

4-하이드록시프로피오페논 1 g (6.7 mmol)을 황산 30 ㎖에 녹인 후 질산 0.5 ㎖ (6.7 mmol, 1 eq)을 -20℃에서 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 얼음에 반응물을 천천히 첨가한 후 에틸아세테이트 50 ㎖에 녹이고 증류수로 유기층을 씻어주었다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조ㆍ여과하고, 여액을 감압농축하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산:에틸아세테이트=1:4)로 정제한 후 에틸에테르로 재결정하여 하기 물성치를 나타내는 노란색 고체상의 1-(4-하이드록시-3-니트로-페닐)-프로판-1-온 화합물 980 ㎎ (76%)을 수득하였다.

1H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ = 1.24(t, 3H, J = 7.2 Hz), 3.00(q, 2H), 7.25(d, 1H, J = 9.3 Hz), 8.22(dd, 1H, J = 9.0 Hz), 8.73(s, 1H), 10.89(s, 1H)

MS(m/e, M+) : 195

1-2. 1-(3-아미노-4- 하이드록시 - 페닐 )-프로판-1-온 (화합물 3)

상기 단계 1-1에서 얻은 1-(4-하이드록시-3-니트로-페닐)-프로판-1-온 화합물 900 ㎎ (4.6 mmol)을 메탄올에 용해시키고, 10% 팔라듐/활성탄 90 ㎎를 적가한 후 수소 기체를 이용하고 압력(15 psi)을 가하여 10분 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 종결 된 후 반응액을 셀라이트로 여과한 후 감압 증류하여 하기 물성치를 갖는 미색의 1-(3-아미노-4-하이드록시-페닐)-프로판-1-온 화합물을 548 ㎎(72 %) 수득하였다.

¹H NMR (300 MHz, DMSO) : δ = 1.02(t, 3H, J = 7.2 Hz), 2.84(q, 2H), 6.69(d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.12(dd, 1H, J = 8.1 Hz), 7.21(s, 1H)

MS(m/e, M+) : 165

1-3. N-(2- 하이드록시 -5- 프로피오닐 - 페닐 )-4-니트로- 벤즈 아미드 (화합물 2)

상기 단계 1-2에서 얻은 1-(3-아미노-4-하이드록시-페닐)-프로판-1-온 화합물 500 ㎎ (3.0 mmol)을 테트라히드로퓨란 15 ㎖에 녹인 후 4-니트로 벤조일클로라이드 562 ㎎ (3.0 mmol, 1 eq), 피리딘 490 ㎕ (6.0 mmol, 2 eq)을 0℃에서 첨가하고 1시간 동안 교반 하였다. 4N 염산을 이용하여 pH4로 산성화 시킨 후. 에틸아세테이트를 이용하여 추출하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조ㆍ여과하고, 여액을 감압농축 하여 얻어진 잔류물을 메탄올에 녹이고 2N 수산화나트륨 4.5 ㎖ (9 mmol, 3 eq)을 가하고 상온에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 감압농축한 후, 에틸에티르에 녹이고, 4N 염산을 가하여 pH4로 산성화 시킨 후 생성되는 고체를 필터 하고 에틸에테르로 세척하여 하기 물성치를 갖는 노란색 N-(2-하이드록시-5-프로피오닐-페닐)-4-니트로-벤즈 아미드 고체 화합물을 915 ㎎ (96%) 수득하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ = 1.06(t, 3H, J = 7.2 Hz), 2.94(q, 2H), 7.04(d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.74(dd, 1H, J = 8.4 Hz), 8.18-8.33(m, 3H), 8.35(d, 2H, J = 6.9 Hz), 9.98(s, 1H), 10.79(br s, 1H)

MS(m/e, M+) : 314

1-4. 1 -[2-(4-니트로- 페닐 )- 벤즈옥사졸 -5-일]-프로판-1-온 (화합물 1)

상기 단계 1-3에서 얻은 N-(2-하이드록시-5-프로피오닐-페닐)-4-니트로-벤즈 아미드 화합물 900 mg (2.8 mmol)을 벤젠 15 ㎖에 녹인 후 파라-톨루엔설폰산 545 ㎎ (2.8 mmol, 1 eq)을 첨가하고 딘스탁 장치를 설치 후, 100℃ 24시간 동안 환류하였다. 반응물을 에틸아세테이트 50 ㎖에 녹이고 2N 소듐하이드록사이드를 가하여 염기화 시킨 후 증류수로 유기층을 씻어주었다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조ㆍ여과하고, 여액을 감압농축 하여 얻어진 잔류물을 에틸에테르를 이용하여 재결정하여 하기 물성치를 나타내는 옅은 노란색 고체상의 1 -[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물 678 ㎎ (80%)을 수득하였다(이하, “1124JH0013”라 명명함).

1H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ = 1.11(t, 3H, J = 7.2 Hz), 3.15(q, 2H), 7.97(d, 1H, J = 8.4 Hz), 8.11(dd, 1H, J = 8.7 Hz), 8.45-8.49(m, 5H)

MS(m/e, M+) : 296

참고예 1. 톡소포자충의 준비

항톡소포자충 실험에 사용된 톡소포자충 (RH strain of Toxoplasma gondii, ATCC, No. 50174)의 영양형(tachyzoite)은 ICR female mouse(KOATECH Co., Korea)에서 얻었다. 1x10⁵개의 톡소포자충의 영양형을 6주령 ICR 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 사망시켰다. 그리고 2%의 FBS(GIBCO, Lot No. 1315128)를 함유한 RPMI 1640 media (GIBCO, Lot No. 1346255) 5 ml씩 2번 복강에 주입하고 1분 30초 동안 가볍게 마사지해준 뒤, 다시 복강액을 뽑아내고 500RPM에서 5분간 원심분리 후, 침전물은 버리고 상층액은 새로운 50 ml tube에 옮겨서 500RPM에서 5분간 원심분리 하였다. 이렇게 얻은 상층액은 비교적 순수한 톡소포자충의 영양형은 10%의 FBS를 함유한 RPMI 1640 배지에 재부유 시키고 즉시 카운팅하였다. 이중 일부는 생체 내(in vivo) 및 실험관 내(in vitro) 실험에 사용하고 일부는 또다시 새로운 ICR 마우스에 주입하여 유지하였다(C.M. Jin et al., Experimental Parasitology, 121 (2), pp132-136, 2009).

참고예 2. HeLa 세포배양

한국세포주은행에서 구입한 HeLa 세포는 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃의 온도의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.

실험예 1. 1-[2-(4-니트로- 페닐 )- 벤즈옥사졸 -5-일]-프로판-1-온(1124 JH0013 )의 항톡소포자충 활성 시험

시험관 내(in vitro)에서 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온(1124NJ0013)의 톡소포자충 억제활성을 조사하기 위해서, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다(C.M. Jin et al., Experimental Parasitology, 121 (2), pp132-136, 2009).

한국세포주은행에서 구입한 HeLa 세포를 96well에 2x10³/well씩 접종하고 6시간 후, 2%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 교환하고 그로부터 18시간 후, 2%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 교환 및 톡소포자충의 영양형을 HeLa 세포수의 5배되게 처리하였다. 24시간 후, 화합물과 대조군 피리메탄아민(pyrimethamine) (SIG MA,P7771-10G)을 농도별로 처리하였다. 24시간 배양한 뒤 세포증식분석(cell titer 96 Aqueous one solution cell proliferation assay(PROMEGAL, Lot No.: 22257902))을 실시하고 2시간 후 흡광광도계(Molecular Devices THERMOmax, Microplate reader UVT 07073)로 490nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 톡소포자충의 증식을 억제하는 농도 (EC₅₀; 50% 세포증식억제농도)는 하기 수학식 1과 같이 산출하여 약효판정계수 선택성(selectivity)을 구하였다.

화합물을 처리한 후 세포증식분석으로 선택성을 조사한 결과, HeLa 세포에서 현재 사용 중인 항톡소포자충 약물인 피리메탄아민(pyrimethamine)보다 더 높은 선택성을 보였다(표 1 참조).

	HeLa 세포에 대한 EC50(uM)	T.gondii에 대한 EC₅₀(uM)	선택성
1124JH0013	241.4	136.2	1.8
피리메타민(pyrimethamine)	760.0	850.0	0.9

실험예 2. 항톡소포자충 활성의 생체 내 ( in vivo ) 실험

생체 내(in vivo)에서 항톡소포자충 활성을 조사하기 위해서, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다(J.H. Jiang et al., Biol. Pharm. Bull. 31:2273-6, 2008).

톡소포자충의 영양형 1x10⁵개를 6주령 ICR암컷 마우스 복강에 주입한다. 주입 2시간 후부터 화합물 100mg/kg/day 연속 4일간 경구 투여하고 마지막날 마우스를 경추탈골 사망시켰다. 복강 내의 톡소포자충의 영양형을 얻어 계량하였다.

상기 실험 결과, 본 발명의 1 -[2-(4-니트로-페닐)- 벤조오사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물은 생체 내에서 20.5%의 억제효과를 보였다(도 1 참조).

실험예 3. 콕시디움( Eimeriatenella, 291-7)충란 준비

콕시디움 oocytes(경상대학교 수의과대학 분리주)는 Potassium Diclomate 보존액에 8.5× 10⁴/㎖의 개수로 보존되어 있고, 보존액은 유독물질이므로 washing 과정을 실시하였다. 보존액을 버리고 보존액 양만큼 멸균 D.W.를 넣어 4,000rpm, 25분 동안 원심분리를 3번 실행한다. 원심분리 할 때마다 상층액을 버리고 동량의 D.W.를 넣고, washing이 끝난 후 충란을 세어 농도를 구하였다. 충란이 든 희석액을 먼저 D.W.로 20배 희석하고 포화 염화나트륨(saturated NaCl(Sigma))로 5배 희석(통상 5~10배)하여 ×100 배율에서 chamber(Difco)를 이용하여 counting한다. 충란의 최종 농도는 4.3×10⁴/ml이다.

실험예 4. 항콕시디움 ( Anticoccidial ) 활성의 생체 내 ( in vivo ) 실험

생체 내(in vivo)에서 콕시디움 억제활성을 조사하기 위하여, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다(Jang, S. I., et al., Vet. Parasitol. 144:172-175, 2007).

육추에 감염 전 3일 동안 사료에 적응을 시킨 후, 한 마리당 10⁴/ml의 농도로 경구 감염을 실시하였다. 감염한 다음날부터 4일간 약물을 경구 투여하였다. 약물은 1124JH0013을 사용하며, DMSO만 투여하는 감염군과 비감염군의 2개 대조군으로 분류하여 실험을 실시 하였다 (그룹당 10수, 총 7그룹). 약물의 적정 경구투여 농도는 100 mg/1kg으로 1일 2회(아침, 저녁) 투여하고, 대조군의 경우 DMSO만 동일농도로 투여하였다.

약물투여기간이 끝난 다음 날 닭장의 분변을 모두 제거하고, 다음날부터 5일 동안 매일 분변을 수거한다. 수거한 분변 sample은 희석과정을 통해 분변 속 충란 개수를 세어준다. 즉, 먼저 DW로 1000배 희석한 후 균질화되면 1차 희석하고, saturated NaCl로 2차 희석하여 ×100 배율에서 chamber를 이용해 counting 한다.

상기 실험 결과, 감염 대조군과 비교해서 감염 후 6일째에 본 발명의 1124JH0013 화합물은 생체 내에서 49.5%의 억제효과를 보였고, 감염 후 7일째에 본 발명의 1124JH0013 화합물은 20.7%의 억제효과를 보였다. 특히 감염 후 9일째에 본 발명의 1124JH0013 화합물은 54.4%의 억제효과를 보였다(도 3 ; 도 4 ; 도 5 참조).

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예1. 사료 조성물

1124JH0013 화합물 240g

부형제(말분) 760g

상기의 혼합물의 조성비는 비교적 사료조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 대한약전 산제제법에 준하여 제조에 사용할 수 있다.

Claims

항콕시디움(coccidium)효과를 갖는 하기 구조식 A의 1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염:
1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 하는 이메리아(Eimeria) 또는 톡소플라즈마(Toxoplasma)로 기인한 콕시듐 감염증의 예방 또는 치료용 수의학 조성물.
1-[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물을 유효성분으로 함유하는 이메리아(Eimeria) 또는 톡소플라즈마(Toxoplasma)로 기인한 콕시듐 감염증의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 이메리아(Eimeria) 또는 톡소플라즈마(Toxoplasma)로 기인한 콕시듐 감염증의 대상 동물은 사람, 돼지, 소, 염소, 잉어, 금붕어; 꿩, 닭, 오리, 또는 칠면조인 조성물.
1 -[2-(4-니트로-페닐)-벤즈옥사졸-5-일]-프로판-1-온 화합물을 유효성분으로 함유하는 이메리아(Eimeria) 또는 톡소플라즈마(Toxoplasma)로 기인한 콕시듐 감염증의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제.
제 5항에 있어서, 상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 동물사료에 첨가하는 것을 특징으로 하는 동물사료 첨가제.
제 5항의 동물사료 첨가제를 포함하는 사료.