KR101201464B1 - 생물학적 활성을 조정하기 위한 이특이성 결합제 - Google Patents

Abstract

이특이성 결합제의 생물학적 및 약제학적 특성을 개선하기 위한 방법을 본원은 기재하고 있으며, 이특이성 결합제는 고친화도 결합 도메인에 의해 세포를 중요한 생물학적 효과를 유발하지 않는 첫 번째 세포 표면 마커로 표적화할 수 있고, 두 번째 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 저친화도 결합 도메인은 요구되는 생물학적 효과를 일으킨다. 이러한 이특이성 결합제의 조성물, 이들을 위한 용도, 및 이들을 포함하는 키드를 또한 제공한다.

Description

생물학적 활성을 조정하기 위한 이특이성 결합제{BISPECIFIC BINDING AGENTS FOR MODULATING BIOLOGICAL ACTIVITY}

관련된 출원에 교차 참조

본 출원은 2004년 5월 5일에 출원된 미국 가 출원 제 60/568,656호의 이익을 청구하고 이의 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

배경 기술

많은 질병 및 장애는 세포 표면 수용체의 활성화에 원인 되는, 예를 들어 수용체-특이적 리간드의 결합에 의해 원인이 되는 신호 전달 경로의 부적절한 또는 과도한 활성화에 의해 생긴다. 암 및 자가면역질환와 같은 질병 및 장애의 개시 또는 진행에 관련된 수용체는 수용체 활성화를 줄이거나 막는 치료제의 개발을 위한 주된 표적으로서 나타났다. 표적 수용체의 예는 예를 들어 표피 성장 인자 수용체("EGFR"), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체("IGFl-R"), 및 혈소판-유래 성장 인자 수용체("PDGFR")를 포함하며, 이는 비 소세포성 폐암 및 유방, 전립선 및 결장 암을 포함하는 가장 공통적인 고형 종양과 같은 많은 질병 상태 및 중증근육무력증, 전신홍반루푸스, 및 류마티스 관절염과 같은 많은 자가면역 질병에서 과발현 또는 이상 활성화되는 경향이 있다. 수용체의 활성화는 질병 진행을 이끄는 신호 전달 경로를 구동하는 자가인산화를 야기한다.

수용체 억제제를 가진 정낭 연구는 질병 상태와 관련된 수용체의 활성화를 막음에 의해 그 질병 상태의 발달을 바꿀수 있음을 분명하게 증명하였다. 일반적으로는 그렇지만 질병 상태에 책임이 있는 수용체 또는 수용체들은 질병 세포 또는 조직 이외에 많은 상이한 세포 및 조직에 발현된다. 수용체 억제제, ErbB2 ("HER-2")를 표적화하는 예를 들어 헤르셉틴®(Herceptin®)는 임상적 용도에 유용하게 되지만, 새로운 도전은 감염되지 않은 세포 및 조직을 표적화함 없이 질병 세포 또는 조직을 효과적으로 표적화할 치료제를 확인하는 것을 포함한다.

작용제를 질병 세포에 특이적으로 표적화하는 하나의 접근은 "bsBA"로 본원에서 때때로 지칭되는 이특이성 결합제의 사용이다. 이특이성 결합제는 두 개의 결합 도메인을 포함하며, 이의 각각은 특이적으로 개개의 분자를 인식하고 분자에 결합한다(편의를 위해, 각 개개의 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 분자는 그 결합 도메인을 위한 "리간드"로 지칭될 수 있다). 이특이성 결합제는 문헌 [Schmidt M, et al., "A bivalent single-chain antibody-toxin specific for ErbB-2 and the EGF 수용체," Int J Cancer, 65(4):538-46 (1996), Lu D, et al., "Simultaneous blockade of both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptor signaling pathways in cancer cells with a fully human recombinant bispecific antibody," J Biol Chem. 279(4):2856-65 (2004), 및 Francois C, et al., "Antibodies directed at mouse IL-2-R alpha and beta chains act in synergy to abolish T-cell proliferaton in vitro and delayed type hypersensitivity reaction in vivo," Transpl Int. 9(l):46-50 (1996)]에 의해 예증되는 바와 같이, 잠시 시도되었다. 왜냐하면 bsBA는 종종 하나 또는 둘의 결합 도메인으로서 항체를 사용하기 때문에, bsBA는 때때로 면역치료제로서 참조되는 작용제의 부류에 포함된다.

불행하게는, bsBA를 위한 표적으로서 사용될 수 있는 분자의 영역은 제한된다. 단지 상대적으로 적은 수의 분자만이 정상 세포가 아닌 질병 세포에 발현되고, 그래서 이는 작용제를 질병 세포에 배타적으로 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 추가적 수의 분자들은 정상 세포에 보다 질병 세포에 더 많은 수로 발현된다. 이 분자들은 정상 세포를 넘어서 질병 세포에 작용제의 약간 우선적 전달을 가능하게 할 수 있으며, 이는 분자가 정상 세포에 비해 질병 세포에 과발현되는 정도에 의존한다.

그러나, 표적 세포상에 표적 분자의 상당한 과발현으로도, 표적화된 치료제의 전달은 표적 분자를 발현하는 정상 세포에 작용제의 결합으로 인하여 해로운 부작용이 종종 동반된다. 예를 들어, FDA 승인된 면역치료제 헤르셉틴®(Herceptin®)를 위한 표적은 HER2(erbB2) 수용체는 비-암세포에서 HER2 수용체의 발현보다 약 10 내지 100배 많은 수준으로 과발현된다. 그럼에도 불구하고, 일부의 환자들은 정상 세포에 헤르셉틴®의 결합 때문에 심부정맥 및 다른 해로운 부작용을 일으킨다.

따라서, 비표적 세포에 결합하는 것 없이 표적 세포에 결합하는 개선된 능력을 가진 bsBA를 개발함으로써 면역치료제의 치료 범위를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 이특이성 결합제의 새로운 조성물뿐만 아니라 이들을 함유하는 키트 및 이들을 위한 방법 및 용도를 제공하는 것이다.

구체예의 첫 번째 군에서, 본 발명은, (i) 표적 세포 표면상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이하의 Kd를 가지는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포 표면상의 제 2 표적 분자에 대해 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 가지고, (ii) 상기 제 2 표적 분자가 상기 제 1 표적 분자와 상이하며, (iii) 상기 제 2 표적 분자에 대한 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 상기 제 1 표적 분자에 대한 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높고, (iv) 추가로 상기 제 1 결합 도메인의 표적 분자가 ErbB2인 경우에, 상기 제 2 결합 도메인을 위한 표적 분자는 ErbB3이 아닌,이특이성 결합제를 사용하는 표적 세포의 생물학적 활성을 조정하기 위한 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 상기 제 1 및 제 2 결합 도메인이 각각 상기 제 1 및 제 2 표적 분자에 결합하도록 하는 조건 하에서 상기 이특이성 결합제를 표적 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서, 상기 제 2 결합 도메인이 상기 제 2 표적 분자에 결합되면 상기 제 2 표적 분자의 생물학적 활성이 조정됨으로써 표적 세포의 생물학적 활성이 조정되고, 추가로 상기 제 1 결합 도메인이 상기 제 1 표적 분자에 결합되면 표적 세포의 생물학적 활성이 조정되지 않는다. 몇몇 구체예에서, 이특이성 결합제는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디(diabody), 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 표적 세포는 암세포이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체 또는 성장 인자 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 종양 관련 항원은 MART-1, gp100, 및 MAGE-1으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 암배아 항원(CEA), ErbB2, EGFR, Lewis^Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 및 TAG72로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자는 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGFl-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 표적 세포는 유방암세포이고, 표적 분자는 표피 성장 인자 수용체(EGFR), ErbB2(HER2/neu), ErbB3(HER3) 및 ErbB4(HER4)로 구성되는 군으로부터 선택되는 수용체 티로신 키나아제이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd는 10^-8 내지 10^-12 M 이다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자에 대한 제 2 결합 도메인의 Kd가 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd보다 20배 이상 높다.

본 발명은 추가로 표적 및 비표적 세포를 가지는 생물체에서 표적 세포상의 표적 분자의 생물학적 활성을 조정하는 방법을 제공하며, 여기서 표적 세포는 이의 외부에 제 1 표적 분자를 가지고 이의 외부 표면에 제 2 표적 분자를 가지며, 여기서 (i) 상기 제 1 및 제 2 표적 분자는 공통 리간드를 공유하지 않고, (ii) 상기 제 1 표적 분자는 제 2 표적 분자를 또한 지니는 비표적 세포상에 존재하는 양 보다 표적 세포의 표면상에 10배 이상 더 풍부하며, (iii) 상기 제 2 표적 분자가 생물학적 활성을 가지고, 상기 제 1 표적 분자는 생물학적 활성을 가지지 않으며, (iv) 상기 제 1 결합 도메인의 표적 분자가 ErbB2(HER2)인 경우에, 상기 제 2 결합 도메인에 대한 표적 분자는 ErbB3(HER3)이 아니며, 이러한 방법은 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이하의 해리 상수 (Kd)를 가지는 제 1 결합 도메인 및 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높은 제 2 표적 분자를 위한 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 가지는 이특이성 결합제를 사용하고; 제 1 및 제 2 결합 도메인이 제 1 및 제 2 표적 분자에 각각 결합하도록 하는 조건 하에서 상기 이특이성 결합제를 표적 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 상기 제 2 결합 도메인이 결합되면 상기 표적 세포상의 상기 제 2 표적 분자의 생물학적 활성이 조정된다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 표적 세포는 암세포이다. 몇몇 구체예에서, 표적 분자는 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 종양 관련 항원은 MART-1, gp100, 및 MAGE-1으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자가 암배아 항원(CEA), ErbB2, EGFR, Lewis^Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 및 TAG72로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자는 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGFl-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd는 10^-8 내지 10^-12 M 이다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자에 대한 제 2 결합 도메인의 Kd는 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd보다 20배 이상 높다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자에 대한 제 2 결합 도메인의 Kd는 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배 이상 높다. 몇몇 구체예에서, 조정은 수용체 티로신 키나아제의 활성을 감소시키는 것이다.

구체예의 또 다른 군에서, 본 발명은 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이하의 해리 상수(Kd)를 가지는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 상기 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제(bsBA)를 제공하며, 여기서 (i) 상기 제 1 및 제 2 표적 분자는 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, (ii) 상기 제 1 표적 분자가 아닌 상기 제 2 표적 분자가 생물학적 활성을 가지며, (iii) 상기 제 1 결합 도메인의 표적 분자가 ErbB2(HER2)인 경우에, 상기 제 2 결합 도메인을 위한 표적 분자는 ErbB3(HER3)이 아니고, 추가로 상기 제 2 결합 도메인은 상기 제 2 표적 분자에 결합되는 경우에 제 2 표적 분자의 생물학적 활성을 조정한다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인의 상기 Kd는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배를 초과하여 높다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인의 상기 Kd는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 높다. 몇몇 구체예에서, bsBA는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인은 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 암배아 항원(CEA), ErbB2, EGFR, Lewis^Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 및 TAG72로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자는 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGFl-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인의 Kd는 10^-8 내지 10^-12 M 이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 정상 세포상에서의 이의 발현에 비해 표적 세포상에서 10배 이상 과발현된다.

구체예의 또 다른 군에서, 본 발명은 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이하의 해리 상수(Kd)를 가지는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제(bsBA) (a) 및 약제학적으로 허용되는 담체 (b)의 조성물로서, 상기 제 1 및 제 2 표적 분자가 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, (i) 상기 제 1 표적 분자가 아닌, 상기 제 2 표적 분자가 생물학적 활성을 가지고, (ii) 상기 제 2 결합 도메인은, 상기 제 2 표적 분자에 결합되는 경우에 제 2 표적 분자의 생물학적 활성을 조정하며, (iii) 상기 제 1 결합 도메인의 표적 분자가 ErbB2(HER2)인 경우에, 상기 제 2 결합 도메인에 대한 표적 분자는 ErbB3(HER3)이 아니다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배를 초과하여 높다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인의 상기 Kd는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 높다. 몇몇 구체예에서, bsBA는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인은 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체에 결합한다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 암배아 항원(CEA), ErbB2, EGFR, Lewis^Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 및 TAG72로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자는 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGF1-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 상기 제 1 표적 분자는 제 2 표적 분자를 또한 지니고 있는 비표적 세포상에서의 발현 보다 표적 세포상에서 10배 이상 과발현된다.

구체예의 또 다른 군에서, 본 발명은 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이하의 해리 상수(Kd)를 가지는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제(bsBA)의 약제 제조용 용도를 제공하며, (i) 상기 제 1 및 제 2 표적 분자가 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, (ii) 상기 제 1 표적 분자가 아닌 상기 제 2 표적 분자가 생물학적 활성을 가지며, (iii) 상기 제 2 결합 도메인은 상기 제 2 표적 분자에 결합되는 경우에 제 2 표적 분자의 생물학적 활성을 조정하고, (iv) 상기 제 1 결합 도메인의 표적 분자가 ErbB2인 경우, 상기 제 2 결합 도메인에 대한 표적 분자는 ErbB3이 아니다. 몇몇 구체예에서, 상기 제 2 결합 도메인의 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배를 초과하여 높다. 몇몇 구체예에서, 상기 제 2 결합 도메인의 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 높다. 몇몇 구체예에서, bsBA는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인에 의해 결합된 표적 분자는 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 및 성장 인자 수용체로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고, 단, 제 1 결합 도메인과 제 2 결합 도메인은 동일한 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체와 결합하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 약제는 암세포의 증식을 억제하기 위한 것이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 제 2 표적 분자를 또한 지니는 비표적 세포상에서의 발현 보다 표적 세포상에서 10배 이상 과발현된다.

추가로, 본 발명은 용기 (a), 및 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7M 이하의 해리 상수(Kd)를 가지는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 상기 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제(bsBA) (b)를 포함하는 키트를 제공하며, (i) 상기 제 1 및 제 2 표적 분자는 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, (ii) 상기 제 1 표적 분자가 아닌 상기 제 2 표적 분자가 생물학적 활성을 가지며, (iii) 상기 제 2 결합 도메인은 상기 제 2 표적 분자에 결합되는 경우에 제 2 표적 분자의 생물학적 활성을 조정하고, (iv) 상기 제 1 결합 도메인의 표적 분자가 ErbB2(HER2)인 경우에, 상기 제 2 결합 도메인에 대한 표적 분자는 ErbB3(HER3)이 아니다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인의 상기 Kd는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배를 초과하여 높다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인의 상기 Kd는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 높다. 몇몇 구체예에서, bsBA는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인은 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체에 결합한다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 암배아 항원(CEA), ErbB2, EGFR, Lewis^Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 및 TAG72로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자는 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGFl-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인의 Kd는 10^-8 내지 10^-12 M 이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 정상 세포상에서의 이의 발현에 비해 표적 세포상에서 10배 이상 과발현된다.

발명의 상세한 설명

서론

현재의 면역치료제가 가진 하나의 문제점은 질병 세포 뿐만 아니라 정상 세포에도 결합하려는 이들의 경향이 유해한 부작용을 유발한다는 것이다. 따라서, 과학계의 하나의 목적은 비표적 세포(즉, 정상 세포)와 또한 결합하는 것 없이 표적 세포(예를 들어, 질병 세포)에 결합하는 개선된 능력을 가지는 면역치료제를 개발하는 것이었다.

본 발명은 표적 세포와 결합하는 것에 대해 한 부류의 면역치료제의 특이성을 개선하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이 방법 및 조성물은 비표적 세포의 상응하는 활성에 영향을 주지 않고 표적 세포의 생물학적 활성을 조정하는 개선된 능력을 제공한다. 놀랍게도, 이특이성 결합제("bsBAs")로 알려진 면역치료제에 의한 질병 세포를 표적으로 하는 특이성은 bsBAs의 두 개의 결합 도메인의 결합 친화도에서의 차이를 조절함에 의해 증가될 수 있다는 것이 발견되었다. 그 후, 본 발명의 bsBAs는 표적 세포상의 표적 분자의 생물학적 활성을 증가시키거나 감소시키기 위해 사용될 수 있고, 이로써 존재하는 경우 비표적 세포의 상응하는 활성에 대해 감소된 효과를 나타내며 표적 세포의 생물학적 활성을 조정하는 개선된 능력을 제공한다.

명칭이 함축하는 바와 같이, bsBA는 상이한 표적 분자(편의상, 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 분자는 결합 도메인에 대한 "리간드"로 지칭될 수 있다)에 대해 각각 특이적인 두 개의 결합 도메인을 가진다. 제 1 결합 도메인은 선택된 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 일반적으로 사용되며, 종종 "표적 세포"로 지칭된다. 따라서, 이러한 결합 도메인은 또한 본원에서 "표적화 도메인"으로 지칭된다. 본 발명의 방법에서, 표적화 도메인이 표적 분자에 결합되면 표적 세포에서 중요한 생물학적 효과가 유발되지 않는다. 제 2 결합 도메인은 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 결합한다. 제 2 결합 도메인이 이의 리간드에 결합되면 특이적 생물학적 효과를 조정(다시 말해, 그러한 생물학적 활성을 증가시키거나 억제)될 것으로 의도된다. 상이한 방법으로 생물학적 활성을 조정하는 능력을 가진 결합 도메인은 당 분야에 알려져 있다.

종종, 생물학적 활성은 결합 도메인의 이의 표적 분자에 결합함으로써 억제된다. 예를 들어, 결합 도메인에 의해 결합된 분자가 사이토카인 수용체의 부분이라면, 결합 도메인이 그 수용체에 결합하면 사이토카인이 수용체에 접근하는 것을 차단할 수 있고, 이로써 그렇지 않은 경우 그 결합에 의해 그렇지 않다면 유발될 수 있는 생물학적 활성을 억제한다. 유사하게는, 결합 도메인이 수용체에 결합하면 수용체가 인터루킨 ("IL")-2 수용체와 같은 몇몇 사이토카인 수용체의 완전한 활성화를 위해 요구되는 이질이합체(heterodimer)를 형성하는 것을 막을 수 있다. 또한, 결합 도메인이 결합되면 수용체의 형태를 변화시킬 수 있어서, 이의 천연 리간드와 결합할 수 없게 되어 활성화될 수 없다. 반대로 말하면, 결합 도메인은 수용체에 결합함에 의해 생물학적 활성을 증가시키는 이의 능력을 위해 선택된 것일 수 있다. 예를 들어, 결합 도메인이 수용체에 결합하면 수용체를 위한 천연 리간드의 효과를 흉내낼 수 있어서, 그러한 결합이 수용체를 활성화시키거나, 이러한 결합 도메인의 결합은 저친화도 수용체가 이의 천연 리간드에 대해 고친화도 수용체로 되도록 하는 형태적 변화를 유발할 수 있다.

살펴본 바와 같이, 본 발명의 bsBA의 제 1 결합 도메인은 bsBAs를 표적 세포에 표적화시키지만, 제 2 결합 도메인은 주로 표적 세포에 대한 효과를 유발하는 기능을 한다. 따라서, 두 도메인을 구별하는 편의성을 위해, 제 1 결합 도메인은 종종 본원에서 "표적화 도메인"으로 지칭되지만, 제 2 결합 도메인은 종종 본원에서 "이펙터 도메인"으로 지칭된다. 유사하게는, 두 결합 도메인에 의해 결합되는 분자를 구별하는 편의성을 위해, 이펙터 도메인에 대한 표적 분자는 종종 본원에서 "이펙터 표적 분자"로 지칭될 것이지만, 용어 "표적 분자" 그 자체로 표적화 도메인의 표적을 지칭할 것이다.

종래의 bsBAs는 각 표적 분자의 각각을 위해 가장 높은 유용한 친화도를 가진 결합 도메인을 사용하여 전형적으로 만들어졌다. 당업자는 한 도메인이 이의 각 표적에 대해 나머지 도메인이 가지는 친화도와 정확하게 같은 친화도를 가지는 것은 있음직하지 않은 것으로 인식할 것이므로, 2개의 결합 도메인은 일반적으로 친화도에 있어서 차이를 갖는다. 그러나, 종래의 bsBAs의 경우, 친화도의 차이는 전형적으로 크지않고, 결합에 대한 실제 효과의 관점에서 중요하거나 중요하지 않을 수 있다.

그러나, 본 발명의 방법 및 조성물의 경우, 표적화 도메인은, 이펙터 도메인이 이의 리간드에 대해 지니는 친화도 보다 10배 이상 높은 결합 친화도를 이의 리간드에 대해 지니도록 선택된다. 다시 말해, 표적화 도메인은 그것이 인식하고 결합하는 분자에 대해, 이펙터 도메인이 인식하고 결합하는 분자에 대해 이펙터 도메인이 지니는 친화도보다 10배 이상 더 큰 친화도를 가진다. 몇몇 구체예에서, 표적화 도메인이 이의 리간드에 대해 지니는 친화도는 이펙터 도메인의 친화도보다 15배 이상 더 높고, 다른 구체예에서는 이의 표적에 대한 이펙터 도메인의 친화도보다 20배 이상 높고, 몇몇 다른 구체예에서는 25배 이상 높고, 몇몇 구체예에서는 30, 40, 50 또는 100배 이상 높은 친화도를 가지며, 친화도가 높을 수록 더욱 바람직하다. 본 발명의 bsBAs의 두 개의 결합 도메인 사이에 결합 친화도에 10배 이상의 차이가 있기 때문에, 이러한 bsBAs는 때때로 본원에서 "hi-lo" bsBAs로 지칭된다.

표적 결합 도메인과 이펙터 결합 도메인 사이의 결합 친화도에서 의도적인 상당한 차이는 종래의 이특이성 분자보다 놀랍고 종전에 인식되지 않은 장점을 제공한다. 상기 내용과 같이, 종래에 공지된 이특이성 작용제는 표적 리간드에 대해 가능한 한 높은 친화도를 가진 결합 부분을 지녔었다. 그러나, 유사한 친화도를 가진 결합 부분을 가진 이특이성 분자는 본 발명의 조성물 및 방법에 비해, 이들이 표적화할 수 있는 분자 및 이들이 사용될 수 있는 환경에 제약을 받는다. 본 발명의 몇몇 장점은 가정적 실시예를 참조하여 인식될 수 있다.

두 개의 수용체, 정상 세포에 비해 암세포에 과발현되는 수용체 A, 및 암세포에 존재하는 것과 거의 같은 수의 카피로 정상 세포상에서 발현되는 수용체 B를 가지는 암세포의 경우를 생각해 보자. 두 수용체에 대해 거의 같은 친화도를 가진 결합 도메인을 가진 이특이성 결합제는 암세포 및 정상인 비-암세포 둘 모두에 대해 거의 동등한 효과를 가지는 경향이 있을 것이다. 이는 bsBAs가 고농도로 사용되는 경우에 특히 그러한데, 이는 bsBAs가 1가 결합에 의해 두 수용체를 포화시키는 경향이 있기 때문이다.

대조적으로, 수용체 A에 표적화된 고친화도 표적화 도메인과 수용체 B에 표적화된 저친화도 이펙터 도메인을 지니며 수용체 B에 대해서 보다 수용체 A에 대해 10배, 20배, 30배 또는 이 보다 더 큰 배수의 친화도를 가지는 본 발명의 bsBA는 암세포에 우선적으로 결합하고, 정상적인 속도론적 상호작용에 의해, 정상 세포에 비해, 암세포에 더 많이 결합할 것이다. 따라서, 상당수의 정상 세포를 포함하는, 수용체 B를 지니는 세포에 불규칙적으로 결합하는 대신에, 이펙터 도메인은 암세포에 선택적으로 전달될 것이다. 따라서, 본 발명은 이펙터 도메인을 표적 세포에 더욱 선택적으로 표적화하는 것을 가능하게 한다.

추가로, 고친화도 결합 도메인이 수용체 A에 결합하면 저친화도 이펙터 도메인을 세포 표면 근처에 고정시키는데, 여기서 저친화도 이펙터 도메인은 시간이 흐르면서 수용체 B와 상호작용하도록 이용될 수 있다. 이펙터 도메인은 수용체 B와 결합하는 것을 가능하게 하는데, 이러한 이펙터 도메인이 "지지대가 없는(free standing)" 1가(또는 "일가") 물질로서 제공되는 경우, 수용체 B에 대한 이의 상대적으로 낮은 친화도가 수용체에 이를 고정시키기에 일반적으로 충분하지 않을 수 있다.

항체 또는 다른 리간드의 해리 상수("Kd")가 리간드의 k_on 및 k_off 둘 모두에 의해 결정된다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 다시 말해, Kd는 항체 또는 다른 리간드가 표적 분자에 결합하는 시간과 결합되지 않는 시간 사이의 균형을 나타낸다. 그래서 저친화도 결합 도메인은 종종 저친화도를 가지는데, 이는 정확하게는 이것이 이의 표적 분자로부터 해리되는 경향이 크기 때문이다. 결합 도메인이 이의 표적 분자로부터 해리되는 기간 동안, 이는 브라운 운동, 유체 흐름 또는 결합 도메인 분자에 작용하는 다른 운동력에 의해 이동할 수 있다. bsBA의 고친화도 도메인에 의해 저친화도 도메인이 고정되면 저친화도 도메인에 의해 표적화된 수용체 근처에 저친화도 결합 도메인을 유지하도록 돕고, 따라서 임의의 시점에서 저친화도 도메인이 이의 표적 분자에 결합할 수 있는 가능성을 증가시키는 경향이 있다. 이 가설에서 본 발명의 bsBAs의 저친화도 도메인의 표적 분자가 수용체 키나아제이기 때문에, 이는 표적 수용체 키나아제와 결합하는 bsBA의 능력을 증가시키는 경향이 있고, 이로써 표적 세포에 대한 이들의 생물학적 효과를 증가시킨다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 bsBAs의 두 결합 도메인은 동일한 리간드에 의해 정상적으로는 결합되지 않는 표적 분자와 결합한다. 당업자는 몇몇 리간드, 예를 들어 인터루킨 IL-2가 두 개의 상이한 수용체 사슬에 의해 결합되고, 그 후 (IL-2에 결합된) 두 개의 사슬이 완전하게 생물학적으로 활성인 단위를 형성하도록 상호작용함을 인식할 것이다. 따라서, 두 개의 수용체 사슬에 대해 유도된 bsBAs가 이러한 수용체의 완전한 활성화를 억제할 수 있는 경우, 이러한 bsBAs의 결합 도메인 둘 모두는 물론 동일한 수용체에 대해 유도된다.

마지막으로는, bsBA와 결합 도메인에 의해 결합되는 두 개의 표적 분자 사이에 삼합체의 형성은 서로에 매우 근접한 위치에서 표적 분자와 결합하고 세포막의 지질 이중층을 통한 이러한 표적 분자의 정상적 확산을 억제하는 추가적인 장점이 있다. bsBAs에 의한 상이한 수용체의 가교는 그 자체로 표적 세포에 대한 bsBAs의 세포독성 또는 세포증식억제성 효과에 기여하는 것으로 믿어진다. 예를 들어, 신호 전달 캐스케이드(cascade)는 전형적으로 이질이합체를 형성하도록 서로 결합하는 두 개의 단백질에 의해 또는 초기 캐스케이드에서 다음 단백질을 (일반적으로 인산화에 의해) 변경시키는 키나아제에 의해 활성화된다. 상이한 수용체의 가교는 이들의 정상적인 이질이합체를 형성하거나 초기 캐스케이드에서 일반적으로 다음 단계일 수 있는 단백질을 변경시키는 수용체의 능력을 방해할 수 있다.

구체예의 한 군에서, bsBA의 표적화 도메인은 질병 또는 장애(예를 들어, 유방암세포)와 연관되어 있는 표적 세포상에서 우선적으로 발현되거나 과발현되는 세포 표면 수용체에 결합하고, 이펙터 도메인은 표적 세포 및 비표적 세포상에서 불규칙하게 또는 도처에서 발현되는 세포 표면 수용체에 결합한다. 본 발명의 bsBA에 의해 표적화될 수 있는 예시적 세포 표면 수용체는 하기 기재되어 있다. 바람직한 구체예에서, 표적화 도메인에 의해 결합되는 분자는 이펙터 도메인에 의해 결합되는 분자의 수준보다 더 높은 수준으로 표적 세포상에서 발현된다. 따라서, 본 발명의 bsBA 및 방법은 바람직하게는 통상적 항체 또는 이특이성 작용제 또는 이 둘 모두에 의해 불규칙적으로 결합되는 표적 분자를 가진 세포로의 이펙터 분자의 특이적 전달을 개선하는데 특히 유용하다. 당업자는 다양한 암의 세포가 다양한 항원을 과발현시키거나 상이한 암 유형의 세포가 발현하는 정도와 다른 정도로 같은 항원을 과발현시킬 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 bsBA의 고안에서, 업에 종사하는 자는 특정 bsBA에 의해 표적화되는 특정 세포상에서 과발현되는 세포 표면 수용체를 표적화하는 표적화 도메인을 선택할 것으로 고려된다.

몇몇 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 질병 또는 장애(예를 들어 암세포)와 연관되어 있는 표적 세포상에서 우선적으로 발현되거나 과발현되는 첫 번째 세포 표면 수용체에 결합되고, 이펙터 도메인은 정상 세포에 비해 질병 세포(예를 들어 암세포)상에서 과발현되는 두 번째 세포 표면 수용체에 결합하지만, 첫 번째 세포 표면 수용체보다 더 낮은 수준으로 발현된다. 이 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 세포 표면 수용체 사이의 발현 수준에서의 차이는 표적 분자를 가진 세포로의 이펙터 분자의 특이적 전달을 개선한다.

배경 기술에서 제시된 바와 같이, HER2는 정상 세포상에서의 이의 발현 수준의 약 10 내지 100배의 수준으로 유방암세포에서 과발현되지만, 몇몇 유해한 부작용이 정상 세포에 면역치료제인 헤르셉틴®의 결합으로부터 환자에게서 관찰된다. 따라서, 표적 분자의 상당한 과발현조차도 고친화도 결합제가 유해한 부작용이 없게 정상 세포에 결합하지 못하도록 하는데 반드시 충분하지는 않다.

대조적으로, 본 발명의 bsBAs는 이펙터 도메인의 친화도보다 10 배 이상 더 높고 종종 훨씬 더 높은 이의 표적 분자에 대한 친화도를 가지도록 선택되는 표적화 도메인을 가진다. 바람직하게는 이의 표적 분자에 대한 표적화 도메인의 해리 상수는 10^-8 내지 10^-12 M 범위이다. 표적 분자는 이것이 정상 세포상에 존재하지 않거나 정상 세포상에서보다 암세포상에서 더 높게, 바람직하게는 정상 세포상에서 발현되는 것보다 20 배 이상 및 더욱 바람직하게는 100 배 이상 고도로 과발현되기 때문에 선택된다. 제시된 바와 같이, 표적 분자에 대한 표적화 도메인의 높은 친화도 때문에, 이는 bsBS가 표적 세포에 우선적으로 bsBS가 결합하게 하는 경향이 있다. 따라서, 이펙터 도메인은 정상 세포상에서 발현되는 표적 분자를 표적화할 수 있어서, 통상적인 bsBAs 보다 더 넓은 치료 범위를 제공하는 선택적인 결합을 달성할 수 있는 것으로 예상된다.

당업자는 암세포가 특히, 정상 세포에서 항상성을 유지하는 역할을 하는 많은 단백질을 포함하는 많은 정상적인 단백질의 발현을 상향조절하는 경향이 있음을 인식할 것이다. 따라서, 암 또는 종양 항원으로 보통 간주되지 않는 단백질 조차도 암세포상에서 상향조절되는 경향이 있다. 예를 들어, 종양 항원으로 간주되지 않는 인슐린 수용체는 종종 정상 세포에 비해 종양 세포상에서 3배 내지 5배 상향조절된다(참조, 예를 들어, 문헌 [Milazzo et al., Cancer Res. 52(14):3924-30 (1992)])

또 다른 구체예로서, ErbB3 수용체는 정상 세포상에서의 이의 발현에 비해 몇몇 암세포상에서 다소 과발현된다. 그러나, 상기 수용체는 표적화 도메인이 더욱 고도로 발현되는 표적 분자에 대해 유도되는 경우, bsBA의 이펙터 표적 분자로서 사용될 수 있다. 실시예는 본 발명의 예시적 bsBA를 나타내는데, 여기서 표적화 도메인은 EGFR에 대해 유도되고, 이펙터 도메인은 ErbB 3에 표적화된다.

표적화 도메인이 표적 세포상에서 과발현되는 표적 분자(예를 들어 암 항원)에 대해 유도되고, 반면에 이펙터 도메인은 표적화 도메인에 대한 표적 분자보다 더 낮은 수준으로 발현되는 분자(예를 들어, 수용체 키나아제)에 대해 유도되는 것이 바람직하다. 표적 분자가 이펙터 도메인에 의해 표적화되는 분자보다 더 높은 수준으로 발현되는 것이 단지 필요하지만, 일반적으로 표적 분자의 발현과 이펙터 분자의 발현 사이에 큰 차이가 있는 것이 유리한데, 이는 이펙터 분자가 표적화 도메인의 Kd 보다 높은 bsBA 농도로 포화될 수 있기 때문이다.

일반적으로, 표적화 도메인에 대한 표적 분자는 비표적 세포상의 그러한 분자의 발현보다 10배, 20배, 50배, 100배, 또는 더 높은 배수의 수준으로 과발현되는 것이 바람직하며, 수준이 높은 수록 더욱 바람직하다. 일반적으로, 이펙터 분자가 비표적 세포상에서 발현되는 수준으로 발현되거나 과발현되는 경우, 비표적 세포의 2 내지 5 배의 수준으로 과발현되는 것이 더 바람직하다. 다시 말해, 표적화 분자가 이펙터 도메인에 의해 결합되는 분자에 비해 높은 수준으로 발현 (또는 과발현)되는 것이 바람직하다.

표적 세포가 질병 세포, 예를 들어 암세포인 경우, 표적 분자의 발현 수준은 암세포가 유래된 조직과 같은 조직 유형의 정상세포상에서의 같은 분자의 발현에 대해 측정된다. 다시 말해, 질병 세포가 유방암세포라면, 발현 수준은 정상 유방 세포에 대해 측정되며, 난소암세포의 분자의 발현 수준은 정상 난소 세포에 발현 수준에 대해 측정된다. 일반적으로, 세포의 집단이 사용되고 발현 수준(예를 들어 세포당 발현되는 분자의 수)의 평균치가 측정된다.

더욱이, 몇몇 바람직한 구체예에서, 이펙터 도메인에 의해 인식되고 결합되는 세포 표면 항원은 도메인의 결합에 의해 조정될 수 있는 생물학적 활성을 가지도록 선택된다. 예를 들어, 이펙터 도메인에 의해 표적화되는 세포 표면 항원은 사이토카인 또는 성장 인자 수용체일 수 있고, 도메인에 의한 이의 차단은 표적 세포의 정상 표현형으로의 회복에 기여할 것이다. 수용체의 차단은 수용체에 의해 활성화되는 경로를 하향조절함으로써, 세포의 증식 속도를 감소시킬 것으로 예측된다.

상기 제시된 바와 같이, 사이토카인 수용체의 효능제 및 이와 유사한 것으로서 작용할 수 있는 항체가 또한 알려져 있는데, 다시 말해, 이들은 표적 분자의 활성을 향상시키는 역할을 한다. 따라서, 종사자에 의해 선택되는 표적 분자와 결합제에 따라, 본 발명의 bsBA의 이펙터 도메인은 표적 분자의 활성을 억제할 수 있거나, 이를 향상시킬 수 있다. 이펙터 도메인의 표적 분자의 활성을 증가시키거나 감소시키는 결합 도메인을 선택하는 능력은 일정 범위의 조건에 대해 효과적인 bsBAs를 고안하는데 상당한 유연성을 종사자에게 제공한다. 종사자의 재량으로 결합제의 현명한 선택에 의해 표적 분자의 활성이 증가될 수 있거나 감소될 수 있음을 나타내기 위해, 표적 분자에 대한 bsBA의 효과는 본원에서 표적 분자의 활성을 "조정하는" 것으로 종종 지칭된다.

예를 들어, 몇몇 암은 티로신 키나아제로서 작용하는 수용체를 암호화하는 유전자의 변이로부터 기인하고, 이는 수용체가 항시적으로 활성인 상태가 되거나 과발현되도록 하여, 세포가 정상 수용체를 가지거나 정상적인 양으로 발현되는 경우보다 더 많이 증식하게 한다. 수용체의 활성을 감소시키기 위해, 종사자는, 이러한 예에서, 결합되는 경우 항시적으로 활성인 수용체의 형태를 변화시켜 이의 활성을 줄이는 것으로 알려져 있는 결합제를 선택할 수 있거나, 과발현되는 수용체의 경우에 이러한 수용체가 이의 천연 리간드에 의해 결합되지 못하게 간단하게 차단함으로써 과발현이 표적 세포 내에서의 신호전달의 부적절한 증가를 야기하지 못하게 하는 것으로 알려져 있는 결합제를 선택할 수 있다. 반대로 말하면, 표적 분자가 이의 활성을 높이는 것이 바람직한 것이라면, 종사자는 결합되는 경우 활성의 효능제로서 작용하는 것으로 알려져 있는 결합제를 선택할 수 있다.

하나의 고친화도 결합 도메인을 가지는 bsBAs를 사용하는 것은 관심있는 세포에 대해 특이적 결합을 제공하기에 충분하다. 연구는 단일 표적 분자에 대해 유도된 두 개의 고친화도 결합 도메인을 가진 결합제가 동일한 결합 도메인을 가진 일가 결합제에 비해 단지 약 3배의 표적 분자에 대한 친화도를 가짐을 밝혀내었다 (참조: Nielsen, U. et al., Cancer Res. 60(22):6434-40 (2000)). 따라서, 일가 결합제는 전형적으로 여전히 나노몰 범위의 Kd를 가질 것이다. 치료제가 전형적으로 결합제의 Kd의 천배인 마이크로몰 농도 이하를 제공하는 양으로 투여되기 때문에, 고친화도 표적화 도메인의 Kd에 비해 결합제의 높은 농도는 결합제가 표적 분자를 지니는 표적 세포에 결합할 수 있게 하는 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 bsBA의 고친화도 표적화 도메인은 이들이 투여될 조건 하에서 bsBA의 특이적 결합을 제공하는 것으로 예상된다.

종사자는 표적화 도메인 및 이펙터 도메인을 위해 표적 분자의 적당한 조합을 선택할 수 있는 것으로 예상된다. 다수의 바람직한 표적 분자 및 이펙터 표적 분자가 하기되어 있지만, 몇몇 바람직한 표적 분자 및 이펙터 표적 분자를 목록으로 만드는 것이 도움이 될 수 있다. 몇몇 바람직한 표적 분자는 EGFR 및 ErbB2이다. 몇몇 바람직한 이펙터 표적 분자는 ErbB3, ErbB4, 임의의 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체 1-4, 간세포 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGFl-R), 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT이다. 이 분자의 각각은 당 분야에 공지되어 있고, 뒤 부분에서 SWISS-PROT 데이터베이스에 있는 이의 참조 번호에 의해 확인된다.

마지막으로, 본 발명의 bsBA는 HER3이 하나의 결합 도메인과 결합되고 HER2/neu이 제 2 결합 도메인과 결합되는 bsBAs를 포함하지 않는다.

정의

단위, 접두사 및 기호는 이들이 표준 국제 단위(SI) 허용 형태로 표시되어 있다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 다르게 표시되지 않는다면, 헥산은 5' 내지 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재되어 있고; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재되어 있다. 본원에서 제공되는 표제는 본 발명의 다양한 측면 또는 구체예의 제한은 아니며, 이는 전체로서 상세한 설명에 참조로서 여겨질 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 상세한 설명에 참조에 의해 그대로 더욱 완전하게 정의된다. 본원에 정의되지 않는 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 보통의 의미를 가진다.

결합제의 "친화도"은 이들의 해리 상수 또는 "Kd"에 의해 전형적으로 기재된다. 전형적으로, 유용한 결합제는 나노몰 농도로 기재되는 Kd를 가진다. 당업자는 10^-8M 의 Kd를 가진 항체는 10^-7의 Kd를 가진 것의 10 배 정도 높은 친화도 및 10^-6의 Kd를 가진 항체의 100배의 친화도를 가짐을 인식할 것이다. 따라서, 친화도가 더 높은 작용제는 더 낮은 수로 기재된 Kd를 가진다(즉, 10^-8은 10^-6보다 더 작은 수이다).

참조의 편의성을 위해, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 달리 요망되지 않는 경우 전체 항체, 전체 항체의 변경에 의해 생산되든지 재조합 DNA 방법을 사용하여 새로이 합성되든지 간에 항원 인식 및 결합 능력을 보유하는 항체 단편, 단클론성 항체, 다중클론성 항체, 및 항체 모사물(mimic)을 포함한다. 항체는 IgM, IgG (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄), IgD, IgA 또는 IgE일 수 있다.

용어 "항체 단편"은 완전한 항체의 부분, 일반적으로는 dhs전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하는 분자이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 나선-안정화된 항체(참조 예를 들어, 문헌[Arndt et al., J MoI Biol 312:221-228 (2001)]; 디아바디(아래 참조); 단일 사슬 Fv("scFv," 참조 미국 특허 제 5,888,773호); 이황화물 안정화된 항체("dsFv", 참조, 미국 특허 제 5,747,654호), 및 도메인 항체("dAbs," 참조, [Holt et al., Trends Biotech 21(11):484-490 (2003), Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521-526 (1997), Lauwereys et al, EMBO J 17:3512-3520 (1998), Reiter et al., J. MoI. Biol. 290:685-698 (1999), Davies and Riechmann, Biotechnology, 13:475-479 (2001)])을 포함한다.

용어 "디아바디"는 두 개의 항원 결합 부위를 가지고 있는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(V_H-V_L)에서 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결되어 있는 중쇄 가변 도메인(V_H)를 포함한다. 너무 짧아서 동일한 사슬상의 두 도메인 사이에 쌍을 형성할 수 없는 링커를 사용하여, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어, 두 개의 항원-결합 부위를 생성시키도록 되어진다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가진다. 각 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역를 포함한다(영역(region)은 또한 도메인(domain)으로 알려져 있다). 경쇄 및 중쇄 가변 부위는 또한 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 불리는 세 개의 과가변 영역이 개재되어 있는 "프레임워크" 영역을 포함한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 크기는 규정되었다. 문헌[Kabat and Wu, infra]을 참조할 수 있다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 비교적 종 내에서 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 3차 공간에서 CDR을 정위시키고 배열하는 기능을 한다.

CDR는 주로 항원의 에피토프와의 결합을 담당한다. 각 사슬의 CDR은 전형적으로 CDRl, CDR2, 및 CDR3로 지칭되며, N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 번호가 매겨지고, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해 확인된다. 따라서, V_H CDR3는 이것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 영역에 위치하며, 반면에 V_L CDRl는 발견되는 항체의 경쇄의 가변 영역으로부터의 CDR1이다.

"V_H" 또는 "V_L"은 Fv, scFv , dAb, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 부위를 지칭한다. "VL" 또는 "VL"은 Fv, scFv , dsFv, dAb, or Fab을 포함하는 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.

"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 통상적인 두 개 사슬 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인이 하나의 사슬을 형성하도록 연결된 항체를 지칭한다. 선택적으로는, 링커(일반적으로 펩티드)는 두 개의 사슬 사이에 주입되어 적당한 폴딩 및 활성 결합 부위의 생성을 가능하게 한다.

"이특이성 결합제", 또는 "bsBA"는 하나 이상의 표적 분자 유형에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자이다.

"결합제"는 특이적으로 표적 분자에 결합을 가능하게 하는 임의의 분자이고, 항체, 항체 단편, 압타머, 펩티드(예를 들어, [Williams et al., J Biol Chem 266:5182-5190 (1991)]) 및 항체 모방체, 예를 들어 10번째 화이브로넥틴 형태 III 영역으로부터 만들어질 수 있는 것(참조, 예를 들어, [Xu, L., et al., Chem Biol. 9(8):933-42 (2002), Koide et al., J MoI Biol 284:1141-1151, Skerra, J MoI Recognit 13:167-187 (2000), Main et al., Cell, 71:671-678 (1992), and Dickinson et al., J MoI Biol, 236:1079-1092 (1994)])을 포함하고, 천연 단백질 및 비 천연 잔기을 포함하도록 변형되거나 조작된 단백질을 포함한다. 몇몇 구체예에서, "결합제"는 또한 수용체에 대한 천연 리간드를 지칭한다. 예를 들어, IL-13은 IL- 13 수용체에 대한 결합제로서 사용될 수 있다.

일반적으로 "압타머"는 단일 한정 서열의 올리고뉴클레오티드이거나 상기 올리고뉴클레오티드들의 혼합물을 지칭하며, 여기서 혼합물은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 특성을 지닌다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "압타머"는 올리고뉴클레오티드의 단일 또는 복수의 서열을 가리킨다. 구조적으로는, 본 발명의 압타머는 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 통상적인 염기, 당 잔기 및 뉴클레오티드간 연결뿐만 아니라, 임의의 또는 전부의 이 세 부분의 변경을 포함하는 것을 포함한다. 본원에서 참조로서 통합된 미국 특허 제 5,756,291호는 압타머의 설명, 압타머를 제조하고 시험하는 방법, 및 이의 용도를 제공한다.

"표적 분자"는 본 발명의 이특이성 결합제의 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 "제 1 표적 분자" 및 "제 2 표적 분자"는 같은 분자 종류의 두 개의 분자보다, 두 개의 별개의 분자 종류의 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 이러한 분자 종류는 예를 들어 두 개의 상이한 수용체 티로신 키나아제(예를 들어, 염기성 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 및 간세포 성장 인자 수용체)일 수 있다. 몇몇 사이토카인 수용체 및 다른 수용체는 "사슬"로 알려진 하부단위로 구성되고, 몇몇 경우에 수용체는 수용체에 대한 리간드가 사슬 중 하나에 결합된 경우 사슬을 보충함으로써 완전히 활성화된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 수용체(예를 들어, IL-2 수용체)의 모든 사슬은 같은 분자종으로 간주되고; 따라서, 주어진 수용체의 사슬이 본 발명의 bsBA의 제 1 결합 도메인에 의해 결합되는 "제 1 표적 분자"라면, "제 2 표적 분자"는 같은 수용체의 두 번째 사슬일 수 없다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "생물학적 활성"은 표적 분자에 의해 수행되는 규정되고 알려진 활성을 지칭한다. 가장 일반적으로는, 본 발명의 bsBA에 의해 표적화된 분자의 생물학적 활성은 신호 전달이다. 예를 들어, 이 상세한 설명의 후반부에 표적 분자일 수 있는 분자로서 다수의 성장 인자 수용체를 나열하였다. 이 수용체는 전형적으로 세포의 세포외 표면상의 리간드 결합 도메인, 막 통과 도메인 및 티로신 키나아제 효소 활성을 가지는 세포질 도메인을 가진다. 전형적으로는, 티로신 키나아제 활성은 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합에 의해 활성화된다. 수용체 키나아제 활성은 그 다음에 신호 캐스케이드를 시작한다. 따라서, 이 표적 분자의 생물학적 활성은 신호 전달이다. 당업자는 표적 분자의 생물학적 활성이 궁극적으로 표적 분자가 위치하는 세포에 영향을 미침을 인식할 것이다. 예를 들어, 수용체를 과발현시키는 암세포에 있는 성장 인자 수용체를 활성화시킴에 의해 시작되는 신호 전달 캐스케이드는 세포의 성장 및 증식을 증가시키는 것으로 여겨지며, 수용체의 활성을 억제하는 것은 증식을 억제하거나 지연시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 용어 "생물학적 활성"은 또한 표적 분자의 활성과 대비하여 세포의 활성과 관련하여 더욱 넓게 본원에서 사용될 수 있다. 무엇을 의미하고자 하는 지는 문맥상 명백할 것이다.

상기 진술된 바와 같이, 본 발명의 bsBA에 대한 표적 분자로서 사용될 수 있는 몇몇 분자는 생물학적 활성을 가지는 것으로 알려져 있지 않다. 세포 표면상의 임의의 주어진 분자가 본 발명의 목적을 위한 생물학적 활성을 가지던지 아니던지를 결정하는 것은 하기 수단에 의해 수행될 수 있다. 세포 표면 분자를 지니는 인간 세포의 배양물은 두 개의 별도의 배양물을 형성하도록 나눠질 수 있다. 첫 번째 배양물은 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하고, 분자를 위한 임의의 천연 리간드의 결합을 차단하는 것으로 기대되는 결합 도메인과 접촉한다. 다른 군은 그렇게 하지 않는다. 두 개의 군은 그 다음에 그렇지 않다면 동일한 조건 하에서 배양된다. 본 발명의 목적을 위해, 표적 분자는 결합제에 의한 분자의 결합이 세포 증식, 세포 생존능, 아폽토시스(apoptosis), 다운스트림 키나아제의 활성화, 전사 활성화, 표면에로의 부착, 또는 연질 아가에서 콜로니를 성장시키는 능력에서 주목할 만한 차이를 일으키지 않는다면, "생물학적 활성"을 가지지 않는 것으로 간주된다. 이러한 특성들에서의 주목할 만한 차이를 관찰하기 위한 검정은 당 분야에 잘 알려져 있고, 여러가지가 더욱 상세하게 아래에서 논의되고 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 활성의 "조정"은 종사자의 요구에 따라 표적 분자의 생물학적 활성을 증가시키거나 억제하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 표적 분자가 암세포의 증식을 증가시키는 것으로 간주되는 수용체(예를 들어, EbrB3 수용체)라면, 종사자는 수용체에 결합하는 결합 도메인을 사용하여 수용체의 천연 리간드에 의한 수용체의 결합을 차단함에 의해 수용체의 활성을 억제하고자 할 수 있다. 종종, 이 표적 분자들은 천연 리간드의 결합시에 티로신 키나아제로서 역할을 하는 수용체이다. 반대로, 표적 분자의 생물학적 활성이 종사자가 증가시키기를 바라는 것이라면, 예를 들어, 종사자는 표적 분자의 효능제로서 작용하는 것으로 당 분야에 알려진 항체를 결합 도메인으로서 사용할 수 있다. 그 결과는 치료되는 질병 또는 질병 상태에 이롭도록 의도되며, 예를 들어, 악성 및 몇몇 자기면역 장애의 치료를 위해, 요망되는 효과는 일반적으로 세포 성장의 억제 또는 아폽토시스의 유도일 수 있거나, 자가면역질환의 치료를 위해서는 특정 세포 유형, 예를 들어 T-조절 T-세포의 증식의 유도일 수 있다.

세포 표면 수용체는 이 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드를 가지는 것으로 이해된다. 따라서, 주어진 수용체에 대하여, 용어 "천연 리간드"는 정상 생리 과정에서 그 수용체에 결합하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 인터루킨("IL")-13은 IL-13 수용체를 위한 천연 리간드이고, IL-2는 IL-2 수용체를 위한 천연 리간드이며, 표피 성장 인자는 EGF 수용체를 위한 천연 리간드이다.

용어 "유효량" 또는 "효과적인 양" 또는 "치료적 유효량"은 세포 단백질 합성을 50% 이상 억제하는 것 또는 세포를 치사시키는 것과 같은 요망되는 결과를 생성하기에 충분한 작용제의 용량에 관한 것을 포함한다.

"이펙터 분자"는 본 발명의 bsBA의 이펙터 도메인과 같은 결합 분자에 의해 접촉되는 경우, 예를 들어 신호전달, 인산화, 증식 유도 또는 세포사 유도에 의해, 세포의 행동을 조정하기 위해 사용될 수 있는 세포 표면 수용체로서 정의된다.

"Kd"는 하기 형태의 반응을 위한 역반응 및 정반응 속도 상수의 비율이다:

A + B = AB.

평형에서, 평형 상수(K)는 생성물의 농도에 의해 나눠진 반응물 농도의 곱과 동일하고, 농도의 차원을 가진다.

Kd = (농도 A x 농도 B) / (농도 AB)

"일가 결합제" 및 "일가 결합 조성물"은 세포 표면 마커와 결합하기 위한 단일 도메인을 가진 결합 분자로 정의되고, 예를 들어 두 개의 결합 도메인을 가진 온전한 면역글로불린 G 분자와 대조된다. 일가 결합제는 전형적으로 scFv, Fab', 단일 영역 항체 등과 같은 이특이성 항체를 형성하는 두 개의 결합 도메인 중 하나의 분리된 단편이다.

"표적 세포"는 본 발명의 이특이성 항체 결합제가 이의 고친화도 표적화 도메인을 통해 우선적으로 결합되도록 의도되는 세포이다.

용어 "접촉"은 직접적인 물리적 회합 상태에 놓여지는 것을 포함한다.

세포는 여러 가지 단백질, 예를 들어 운반자, 이온 채널, 및 사이토카인 수용체가 위치하고 있는 지질 이중층을 포함하는 (공통적으로 "세포 막"으로 지칭되는) 원형질 막에 의해 결합되는 것으로 일반적으로 당 분야에서 이해되고 있다. 일반적으로, [Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (3rd Ed., 1994), Chapter 10]이 참조된다. 세포막은 세포질 또는 세포의 내부를 마주하고 있는 세포 표면, 및 세포의 외부 또는 세포외액 공간을 마주하고 있는 표면을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 막투과 단백질은 종종 양친매성, 즉 이들은 소수성 및 친수성 영역을 가진다. 막을 통과하는 영역은 소수성이고 이중층을 포함하는 지질 분자의 소수성 꼬리와 상호작용한다. 친수성 영역은 막의 세포외 면 또는 세포질 면상의 물에 노출되어 있다. 막투과 단백질의 막투과 도메인은 알파 나선 또는 다수의 베타 가닥으로 존재한다. 예를 들어, [Lodish et al., Molecular Cell Biology, W.E. Freeman and Co., New York (4th Ed., 2000), at chapter 3]가 참조된다.

"사이토카인"은 세포사이 매개체로서 같은 세포 집단(자가분비) 또는 또 다른 세포 집단(주변분비)에 대해 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질을 위한 포괄적인 용어를 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 통상적인 폴리펩타이드 호르몬을 포함한다. 성장 호르몬 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상샘 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 글리코단백질 호르몬 예를 들어 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 황체형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 젖샘 자극 호르몬; 종양 괴사 인자-α 및 β; 뮬러-억제 물질; 마우스 생식샘자극호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자 예를 들어 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자(PDGF); 전환 성장 인자(TGF) 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 예를 들어, IGF-I 및 IGF-II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론 예를 들어 인터페론-α, -β, 및 -γ; 집락 자극 인자(CSF) 예를 들어 마크로파지-CSF(M-CSF); 과립구-마크로파지-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL) 예를 들어 IL-I, IL-lα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8, IL9, IL-11, IL-12; 및 다른 폴리펩타이드 인자 예를 들어 LIF 및 키트 리간드(KL, 스틸(steel) 인자로 또한 알려짐)가 사이토카인에 포함된다.

다르게 가리키지 않는다면, 본원에서 항체 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 위치에 대한 참조는 "카바트 앤 우"("Kabat and Wu") 시스템 하에서 아미노산의 번호 매김을 지칭한다. 본원에서 참조로서 통합되는 [Kabat, E., et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, U.S. Government Printing Office, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]에서 참조된다(Kabat and Wu 데이터베이스 및 번호 매김 시스템은 또한 "카바트(Kabat)"시스템 및 번호매김으로서 본원에서 지칭된다). 카바트 앤 우 데이터베이스는 당분야에서 항체의 아미노산 잔기의 번호 매김을 위해 가장 넓게 사용되는 시스템이고, 지금은 너무 커서 편리하게 인쇄되지 않을 수 있다. 현재는 "http://"에 이어 "immuno.bme.nwu.edu/"을 입력함으로써 찾아질 수 있는 온라인 예약 서비스로서 유지되고 있다. 카바트 앤 우 시스템 하에서 잔기에 따른 번호는 그 사슬의 아미노 말단으로부터 계산함에 의해 주어진 중쇄 또는 경쇄에 있는 잔기에 대해 얻을 수 있는 번호와 반드시 일치하지 않는다.

용어 "잔기" 또는 "아미노산 잔기" 또는 "아미노산"은 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩티드 (집합적으로 "펩티드")에 통합되는 아미노산에 대한 것을 포함한다. 아미노산은 자연적 발생 아미노산일 수 있고, 다르게 제한되지 않는다면, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능할 수 있는 천연 아미노산의 유사체를 포함한다.

단백질을 기재하는 경우에, "보존성 치환"은 단백질의 활성에 실질적으로 변화를 주지 않는 단백질의 아미노산 조성에서 변화를 지칭한다. 따라서, 특정 아미노산 서열의 "보존적으로 변경된 변이"는 결정적인 아미노산의 치환이 활성을 실질적으로 바꾸지 않도록 유사한 특성(예를 들어, 산성, 염기성, 양성 또는 음성 대전, 극성 또는 비극성 등)을 가지는 다른 아미노산으로 아미노산의 치환 또는 아미노산의 단백질 활성에 결정적이지 않은 아미노산들의 아미노산 치환을 지칭한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당 분야에 잘 알려져 있다. 표 A에 있는 하기 6개의 군은 각각 서로를 위한 보존성 치환체인 아미노산을 포함한다.

표 A

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

또한, [Creighton, 단백질s, W.H. Freeman and Company, New York(1984)]가 참조된다.

용어 "선택적으로 반응성" 및 "선택적으로 결합"은 항원에 대해, 전체 또는 부분적으로, 그러한 항원을 지니는 세포 또는 조직과 항체의 우선적 결합을 지칭하고, 항원이 없는 세포 또는 조직에 대해서는 아니다. 물론, 비특이적 상호작용의 특정 정도는 분자와 비표적 세포 또는 조직 사이에서 발생할 수 있는 것으로 인식된다. 그럼에도 불구하고, 선택적 반응성은 항원의 특이적 인식을 통해 중개됨으로써 구별될 수 있다. 비록 선택적 반응성 항체는 항원과 결합하지만, 이들은 낮은 친화도를 가지고 그렇게 할 수 있다. 반면에, 특이적 결합은 결합된 항체와 항원이 없는 세포 사이보다 항체와 항원을 지니는 세포 사이에 훨씬 강한 결합을 일으킨다. 특이적 결합은 전형적으로 항원 또는 마커가 없는 세포 또는 조직에 비해 표적 항원 또는 마커를 가지는 세포 또는 조직에 대해 2배, 바람직하게는 5배, 더욱 바람직하게는 10배 및 가장 바람직하게는 100배보다 더 큰 양의 결합된 항체의 증가를 야기한다. 이러한 조건 하에서 단백질에 특정 결합은 특정 단백질에 대한 특이성을 위해 선택된 항체를 요구한다. 다양한 면역검정 포맷이 특정 단백질에 특이적으로 면역반응성이 있는 항체를 선택하는데 적합하다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정은 단백질에 특이적 면역반응성이 있는 단클론 항체를 선택하기 위해 보통 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역측정 포맷과 조건의 설명을 위해 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)]이 참조된다.

용어 "면역 반응성 조건"은 특정 에피토프에 대해 생성된 항체가 그 에피토프에 실질적으로 모든 다른 에피토프에 결합하는 것보다 감지할 수 있을 만큼 더 큰 정도로 및/또는 그러한 결합을 실질적으로 배제할 정도로 결합하게 하는 조건에 대한 것을 포함한다. 면역 반응성 조건은 항체 결합 반응의 포맷에 의존하고, 전형적으로 생체내에서 만나게 되는 면역검정 프로토콜 또는 이의 조건으로 활용되는 것이다. 면역검정 포맷 또는 조건에 대한 설명을 위해, [Harlow & Lane, supra]가 참조된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 면역 반응 조건은 살아있는 포유류 또는 포유류의 세포 내에 전형적인 조건(예를 들어, 온도, 오스몰농도, pH)에 대한 것을 포함하는 "생리적 조건"이다. 몇몇 기관이 극한 조건을 받는 것으로 인식되어 있지만, 개체 내 및 세포 내 환경은 일반적으로 약 pH 7(즉, pH 6.0 내지 pH 8.0, 더욱 전형적으로는 pH 6.5 내지 7.5)이고, 주된 용매로서 물을 함유하고, 0℃ 위 및 50℃ 아래의 온도로 존재한다. 오스몰농도는 세포 생존능 및 증식을 지원하는 범위 내이다.

치료제 또는 표지에로의 bsBA의 결합

bsBA가 이들의 리간드 그 자체에 결합되면 예를 들어, 사이토카인의 이들의 수용체로의 접근을 차단함에 의해 표적 세포의 생물학적 활성을 조정하도록 의도되지만, 생물학적 활성에 대한 bsBA의 효과는 치료제를 bsBA에 결합시킴에 의해 증가될 수 있다. 따라서, 몇몇 구체예에서, bsBA는 치료제의 부착을 허용하는 작용기를 도입하도록 유도체화된다. bsBA는 예를 들어 하이드라지드, 하이드라진, 일차 아민 또는 이차 아민기에서 종결되는 곁사슬 말단을 도입하도록 유도체화될 수 있다. 치료제는 예를 들어 쉬프 염기 연결(Schiffs base linkage), 하이드라존 또는 아실 하이드라존 결합 또는 하이드라지드 링커를 통해 컨쥬게이션될 수 있다(예를 들어, 특히 본원에서 참조로서 통합된 미국 특허 제 5,474,765 및 5,762,918가 참조된다). 본 발명의 bsAB에 치료제를 컨쥬게이션하는데 적절한 다수의 다른 화학은 당 분야에 잘 알려져 있고, [Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996)]에 의해 예시되고 있다.

치료제는 예를 들어 항신생물제, 항대사제, 방사능제, 세포독성 작용제, 및 화학요법제로부터 선택될 수 있다.

세포독성 작용제는 하기와 같은 항암제: 젬시타빈(gemcitabine); 메토트렉세이트(methotrexate); 5-FU; FUDR; FdUMP; 하이드록시우레아(hydroxyurea); 도세탁셀(docetaxel); 디스코데르몰리드(discodermolide); 에포틸론(epothilones); 빈크리스틴(vincristine); 빈블라스틴(vinblastine); 비노렐빈(vinorelbine); 메타-팩(meta-pac); 이리노테칸(irinotecan); SN-38; 10-OH 캄프토(campto); 토포테칸( topotecan); 에토포시드(etoposide); 아드리아미신(adriamycin); 플라보피리돌(flavopiridol); 시스플라틴(cisplatin); 카르보플라틴(carboplatin); 블레오미신(bleomycin); 미토미신(mitomycin) C; 미트라미신(mithramycin); 카페시타빈(capecitabine); 시타라빈(cytarabine); 2-Cl-2'데옥시아데노신(deoxyadenosine); 미톡산트론(mitoxantrone); 미토졸로미드(mitozolomide); 펜토스타틴(pentostatin); 및 랄티트렉시드(raltitrexed)를 포함한다.

본 발명의 bsBA는 진단 또는 치료적 용도를 촉진하기 위해 추가로 변경되거나 표지될 수 있다. 예를 들어, 방사성, 형광성, 중금속, 또는 다른 표지와 같은 검출가능한 표지가 본 발명의 bsBA에 컨쥬게이션될 수 있다. bsBA의 단일, 이중, 또는 다중 표지화가 이로울 수 있다. 예를 들어 bsBA는 하나 이상의 잔기의 방사성 요오드화 및 킬레이팅 기를 통한 아민-함유 측쇄 또는 반응성 기에 예를 들어 ⁹⁰Y의 결합 둘 모두로 이중으로 표지될 수 있다. 이 조합 표지화는 넓게 퍼진 작은 신생물 세포 덩어리의 확인과 같은 특수한 진단적 필요를 위해 유용할 수 있다.

본 발명의 bsBA의 방사능 표지를 위한 방사성 동위원소는 bsBA의 잔기에 컨쥬게이션되거나 결합될 수 있는 임의의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 동위원소는 베타 또는 감마 방사선을 방출하는 방사성 동위원소로부터 선택될 수 있거나, 대안적으로는, 펩티드 작용제는 예를 들어 유사체의 리신 잔기에 공유결합될 수 있는 킬레이팅 기를 포함하도록 변경될 수 있다. 킬레이팅 기는 그 다음에 변경되어 임의의 다양한 방사성 동위원소, 예를 들어 갈륨, 인듐, 테크네튬, 이테르븀, 레늄, 또는 탈륨 (예를 들어, ¹²⁵I, ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ⁹⁹mTc, ¹⁶⁹Yb, ¹⁸⁶Re)를 포함할 수 있다.

킬레이팅 기는 검출가능한 표지 또는 다른 분자를 본 발명의 bsBA에 간접적으로 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이작용성의 안정한 킬레이터가 에드만 분해를 막는 이소티오시아네이트 베타-알파 또는 적정한 비(非) 알파-아미노산 링커를 통해 하나 이상의 말단 또는 내부 아미노산 반응성 기에 연결될 수 있다. 당 분야에 알려진 킬레이터의 예는 예를 들어, 이니노카르복실 및 폴리아미노폴리카르복실 반응성 기, DTPA(N,N-비스[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]글리신), 및 DOTA (l,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-l,4,7,10-테트라아세트산)를 포함한다.

암 진단 및 치료와 관련하여, 본 발명의 bsBA는 진단 및 영상 조성물, 및 진단 및 영상 방법(예를 들어, 생체 내 및 시험관 내에서의 진단 방법)에서 bsBA을 활용하는 키트를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈관 종양은 생체내 진단 영상 작용제에 부착되어 있는, 종양 세포, 종양 혈관, 또는 종양 기질의 접근가능한 성분에 결합하는 첫 번째 결합 분자를 적어도 포함하는 bsBA의 진단적 유효량을 사용하여 영상화될 수 있다.

질병 또는 장애가 암인 또 다른 바람직한 구체예에서, 암치료 전 사전 영상화는 (a) 종양 세포, 또는 종양 혈관 또는 종양 기질의 특징인 높게 발현된 수용체에 높은 친화도로 결합하는 첫 번째 결합 분자, 및 적어도 10배 낮은 친화도로 편재적으로 발현되는 두 번째 수용체(예를 들어, ErbB3 또는 ErbB4)에 결합하는 두 번째 결합 분자를 가지는 본 발명의 검출가능하게 표지화된 bsBA를 포함하는 약제학적 조성물의 진단적 유효량을 동물 또는 환자에 투여한 후 (b) 종양 세포, 종양 혈관, 또는 종양 기질에 결합되어 있는 검출가능하게 표지화된 bsBA를 검출하여, 이로써 종양, 종양 혈관, 및/또는 종양 기질의 영상을 얻음에 의해 수행될 수 있다.

이론에 의해 구속하고자 하는 것은 아니지만, bsBA는 세포 표면 수용체에 결합하기 위해 천연 리간드와 경쟁함에 의해 세포 신호전달을 줄이거나, 막거나, 억제할 수 있다. 이러한 상황에서, bsBA는 리간드 결합시에 유도되는 세포 신호전달을 차단함에 의해 작용을 한다. bsBA는 또한 세포 표면 수용체의 내재화/하향조절을 유도함에 의해 역할을 할 수 있다. 내재화/하향조절에 의해 야기되는 세포 표면에서의 수용체의 수의 감소는, 수용체를 위한 신호 전달 경로에 따라 일어나는 세포 신호전달을 줄이거나 막는 수용체 활성화의 감소를 일으킨다. 마지막으로, 수용체 이합체화가 신호 전달에 요구되는 경우에, bsBA는 두 개의 세포 표면 수용체의 이합체화를 막음에 의해 역할을 할 수 있다.

표적으로서 용도 및 이펙터를 위한 세포 마커의 선택

bsBA를 표적화하기 위해 사용되는 세포 마커는 전형적으로는 비표적 세포상에서보다 표적 세포상에서 더 높은 수준으로 발현되거나, 비표적 세포상에서는 발현되지 않는다. 예를 들어, 표적 마커는, 특히 암에서, 비표적 세포에서의 이의 발현에 비해 높게 발현될 수 있거나, 암성이지 않은 세포에 의해 발현되지 않을 수 있다.

이펙터로서 사용되는 세포 마커는 전형적으로 주어진 병리학 조건에서 조정하기에 유리한 성장 인자, 사이토카인, 또는 케모카인 수용체와 같은 세포 신호전달에 관여한다. 본 발명의 hi-lo bsBA에 의해 제공되는 선택성 때문에, bsBA 이펙터 도메인에 의해 결합된 마커의 발현은 표적 세포 제한될 필요가 없고 생물체의 다른 세포상에서 발현될 수 있다.

Kd 측정

bsBA의 결합 분자의 결합 친화도는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 본원에 참조로서 통합되는 미국 특허 제 6,703,020호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다. bsBA의 첫 번째 및 두 번째 결합 분자의 이들의 각 표적 수용체로의 결합 친화도, 및 bsBA-수용체 복합체의 해리 속도(off rate)는 경쟁적 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예는 증가하는 양의 표지되지 않은 수용체의 존재 하에서 관심 bsBA와 함께 예를 들어 ³H 또는 ¹²⁵I로 표지된 하나 또는 두 개의 수용체를 배양하고, 표지된 수용체에 결합된 bsBA를 검출하는 것을 포함하는 방사성면역검정법이다. 특정 수용체에 대한 관심 bsBA의 친화도 및 결합 해리 속도는 예를 들어, 스카트차드(Scatchard) 플롯 분석에 의한 데이타로부터 결정될 수 있다. Kd는 또한 예를 들어, 문헌 [Nielsen et al. (Cancer Res. 60(22): 6434-40 (2000))]에 기재된 바와 같이 유세포분석기(flow cytometry)에 의해 결정될 수 있다. Kd를 측정하기 위한 예시적인 검정은 실시예에서 설명된다.

바람직한 방법에서, bsAB의 수용체-결합 친화도는 비아코어 표면 플라스몬 공명 시스템(BIAcore surface plasmon resonance system)(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 측정되는 결합 및 해리 속도 상수로부터 결정된다. 전형적으로는, bsBA의 리간드 분자에 대한 친화도는 바이오센서 칩(BIAcore)에 적당한 양(예를 들어, 500 공명 단위)을 고정시킴에 의해 결정된다. bsBA의 결합 및 해리 속도는 전형적으로 PBS에서 5분 동안 칩 표면 위에 25 μg/ml bsBA를 주입한 후, 결합된 물질이 5분 동안 칩 위에 완충 용액을 흐르게 함에 의해 해리되도록 함으로써 측정된다. 결합 운동은 예를 들어 BIAevaluation 2.1 소프트웨어(BIAcore)를 사용하여 분석될 수 있다. 특정 bsBA가 본 발명의 범위 내에 속하는 지를 결정하기 위해, bsBA가 형성된 후에 bsBA의 결합 도메인의 친화도를 결정하여(bsBA에 배치하기 전에 도메인들의 친화도를 개별적으로 측정하는 것에 반대됨), 결합 도메인의 상대적 친화도를 결정할 수 있다.

요망되는 생물학적 효과의 측정

본 발명의 bsBA는 요망되는 치료적 또는 예방적 활성을 위해 바람직하게는 시험관 내에서 먼저 테스트된다. 예를 들어, bsBA의 치료적 또는 예방적 유용성을 설명하기 위해 사용될 수 있는 시험관 내 검정은 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 bsBA의 효과를 포함한다.

세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 bsBA의 효과는 다른 것들 중에서 예를 들어, 세포 증식 검정, 세포 생존능 검정, 단백질 인산화 검정, 단백질 키나아제 활성, 아폽토시스 검정, 및 단백질 합성 억제 연구를 포함하는 당업자에 알려진 기술을 활용하여 측정될 수 있다. 단백질 경로에서 다중 단백질에 대한 효과를 결정하기 위해 항체 마이크로어레이가 사용될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 문헌[Nielsen et al. (Proc Natl Acad Sci USA., 100(16):9330-5. (2003)) ("Nielsen 2003")]에 기재되어 있다. 그 다음에 bsBA는 인간 임상 실험을 시작하기 전에 비 인간 동물에서 효능에 대해 생체 내에서 테스트된다.

일가 결합 조성물의 제조

bsBA가 화학적 가교에 의해 만들어지는 경우, 가교되지 않은 단편은 그 자체로 일가 결합 단편이다. 유전적으로 연결된 (다시 말해, 재조합 발현된) bsBA의 경우에, 일가 결합 조성물은 개개의 결합 단백질을 1가 결합 단백질의 발현 및 분리를 가능하게 하는 발현 벡터내로 클로닝함에 의해 제조될 수 있다. 개개의 1가 결합 조성물의 친화도는 그 다음에 위에 설명된 바와 같이 결정될 수 있다.

당량 Kd 의 테스트

당량 Kd는 위에서 설명된 방법에 의해 1가 결합 조성물을 사용하여 결정될 수 있다.

bsBA 및 1가 결합 조성물의 결합 비교

1가 결합 조성물 및 bsBA는 예를 들어, 치료제로서의 이의 효율성을 평가하고 bsBA의 효율성을 비교하기 위해 생물학적 활성 검정될 수 있다. 이러한 검정은 당분야에 공지되어 있고 표적 항원에 의존한다. 예는 ELISA 또는 헤레굴린(heregulin) 또는 다른 성장 인자에 의한 활성화에 이은 면역블로팅에 의한 AKT 인산화의 측정, 성장 억제 검정(예를 들어, WO 89/06692에 기재되어 있음); 또는 아폽토시스의 검정을 포함한다.

인산화를 위해, 예를 들어 이펙터 분자 그 자체 또는 다운스트림 키나아제의 활성화에 대한 결합 분자의 효과를 결정하기 위해 표준 면역블로팅이 사용될 수 있거나, 문헌 [Nielsen 2003, supra]에 상세히 기재되어 있는 바와 같이 항체 검정이 사용될 수 있다.

아폽토시스를 위해, 아폽토시스 세포에서 DNA 틈(nick)을 검출하는 표준 전기영동 또는 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 검정을 사용하여 시험관 내에서 DNA 단편화가 검출될 수 있다. 세포가 고정된 경우, DNA 가닥 끊김(break)은 주형-비의존 방식으로 DNA 단편의 3'-하이드록실 말단에 표지된 뉴클레오티드를 공유적으로 첨가하는 포유류 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)를 사용하여 인시튜(in situ) 검출될 수 있다.

세포 생존능 및 증식은 여러가지 화학적 생물학적 시약으로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 세포-주기 관련 마커에 대한 항체 또는 형광-기반 세포 생존능 및 증식 검정, 예를 들어 삼중수소 티미딘 검정, 트립판 블루 배제 검정, ATCC Bioproducts™ MTT 세포 증식 검정 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), 또는 CellTiter-Blue® 세포 생존능 검정 (Promega, Madison, WI)이 있다.

성장 인자 수용체와 결합하는 bsBA의 용도

다수의 분자들은 본 발명의 bsBA의 이펙터 도메인에 의해 결합될 수 있다. 하나의 중요한 일련의 구체예에서, 이펙터 도메인은 티로신 키나아제 수용체와 같은 세포 표면상의 성장 인자 수용체와 결합한다. 다수의 중요한 성장 인자 수용체 및 이들의 리간드, 예를 들어 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 과에 속하는 것의 과발현 또는 부적절한 활성화는 질병 및 장애, 예를 들어 암 및 자기면역 질병의 개시 및 진행에 연관되어 있거나 이를 초래하는 것으로 알려져 있다. 이 성장 인자들은 질병 세포의 생존, 증식, 또는 이주를 자극하도록 자가분비 및/또는 주변분비 방식으로 작용하는 것으로 인식된다. 이러한 수용체들에 성장 인자가 결합하면 예를 들어, 수용체 자가인산화 및 다양한 신호전달 분자의 배열을 통한 후속 신호 전달을 일으키는 수용체 이합체화에 의해, 수용체의 활성화를 야기한다.

이러한 세포에서 티로신 키나아제 수용체의 활성화 또는 성장 인자의 결합 활성을 방해하는 것은 비암성 표현형을 복구하거나 질병 세포의 증식 속도를 줄일 수 있다. 다시 말해, 수용체가 본 발명의 bsBA와 접촉하면 리간드, 예를 들어, 성장 인자가 이들의 세포 표면 수용체에 결합시에 생성되는 신호를 차단한다. bsBA는 수용체에 리간드가 결합하는 것을 막거나 줄임에 의해, 또는 리간드-유도된 수용체 이합체화를 막거나 줄임에 의해 신호 전달의 경로의 활성화를 막거나 줄인다.

본 발명의 방법에서 유용한 결과를 이루기 위해 bsBA의 이펙터 도메인에 의해 결합될 수 있는 (대안적인 이름이 괄호에서 보여지는) 예시적인 티로신 키나아제 수용체는

ALK (역형성 림프종 키나아제), 역형성 거대 세포 림프종(ALCL)에서 키메라 NPM-ALK 단백질의 부분으로서 발현된 티로신 키나아제 수용체;

디스코이딘 영역 수용체 (DDR), 렉틴 디스코이딘 I (디스코이딘 수용체 티로신 키나아제) (티로신-단백질 키나아제 CAK) (세포 유착 키나아제) (TRK E) (단백질-티로신 키나아제 RTK 6) (CD 167a 항원)과 동종인 독특한 세포외 도메인에 의해 구별되는 수용체 티로신 키나아제;

디스코이딘 영역 수용체 2 전구체 (수용체 단백질-티로신 키나아제 TKT) (티로신- 단백질 키나아제 TYRO 10) (향신경성 티로신 키나아제, 수용체-관련 3);

표피 성장 인자 수용체 (수용체 단백질-티로신 키나아제 ErbB-1);

수용체 단백질-티로신 키나아제 erbB-2 (pl85erbB2) (NEU 원종양유전자) (C-erbB-2);

수용체 단백질-티로신 키나아제 erbB-3 전구체 (c-erbB3) (티로신 키나아제-형 세포 표면 수용체);

수용체 단백질-티로신 키나아제 erbB-4 (pl80erbB4) (티로신 키나아제-형 세포 표면 수용체);

염기성 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 (FGFR-I) (bFGF-R) (Fms-유사 티로신 키나아제-2) (c-fgr);

FL 사이토카인 수용체 (티로신-단백질 키나아제 수용체 FLT3) (줄기 세포 티로신 키나아제 1) (STK-I) (CD135 항원);

비만/줄기 세포 성장 인자 수용체 (SCFR) (원종양유전자 티로신-단백질 키나아제 키트) (c-키트) (CD117 항원);

백혈구 티로신 키나아제 수용체 (단백질 티로신 키나아제- 1);

간세포 성장 인자 수용체 (Met 원종양유전자 티로신 키나아제) (c-met) (HGF 수용체) (HGF-SF 수용체);

단백질-티로신 포스파타제 eta (R-PTP-eta) (HPTP eta) (단백질-티로신 포스파타제 수용체 타입 J) (밀도 증강 포스파타제- 1) (DEP-I) (CD148 항원);

원종양유전자 티로신-단백질 키나아제 수용체 ret (C-ret);

티로신-단백질 키나아제 막통과 수용체 RORl (향신경성 티로신 키나아제, 수용체-관련 1);

티로신-단백질 키나아제 막통과 수용체 ROR2 (향신경성 티로신 키나아제, 수용체-관련 2);

티로신-단백질 키나아제 수용체 Tie-1 ;

안지오포이에틴(Angiopoietin) 1 수용체 (티로신-단백질 키나아제 수용체 TIE-2) (티로신-단백질 키나아제 수용체 TEK) (P140 TEK) (튜니카(Tunica) 내막 내피 세포 키나아제) (CD202b 항원);

고친화도 신경 성장 인자 수용체 (TRKl 전환 티로신 키나아제 단백질) (pl40-TrkA) (Trk-A);

BDNF/NT-3 성장 인자 수용체 (TrkB 티로신 키나아제) (GP145-TrkB) (Trk-B);

NT-3 성장 인자 수용체 (TrkC 티로신 키나아제) (GP145-TrkC) (Trk-C);

혈관 내피 성장 인자 수용체 1 (VEGFR-I) (혈과 투과 인자 수용체) (티로신-단백질 키나아제 수용체 FLT) (FIt-I) (티로신-단백질 키나아제 FRT) (Fms-유사 티로신 키나아제 1);

혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2) (키나아제 삽입 도메인 수용체) (단백질-티로신 키나아제 수용체 FIk-I); 및

혈관 내피 성장 인자 수용체 3 전구체 (EC 2.7.1.112) (VEGFR-3) (티로신-단백질 키나아제 수용체 FLT4)을 포함한다.

아래 논의는 이펙터 도메인과 결합하기에 특히 유용한 티로신 키나아제 수용체뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의해 유용하게 조절될 수 있는 다른 수용체 과에 대한 더욱 특이적인 정보를 설명한다.

표피 성장 인자 수용체 ( EGFR )/ ErbB 수용체

단일 스패닝(single-spanning) 티로신 키나아제 수용체의 EGFR/ErbB 패밀리는 4개의 일원: 표피 성장 인자 수용체(EGFR), ErbB2(HER2/neu), ErbB3(HER3) 및 ErbB4(HER4)으로 구성된다.

ErbB 수용체와 결합하여 이를 활성화시키는 전부 상이한 유전자 생성물인 다수의 리간드가 확인되었다. 이러한 수용체 및 리간드는 정상 세포 성장 및 분화에서 중요한 역할을 한다.
ErbB 수용체 단백질의 비정상적 신호전달 및/또는 비조절된 활성화는 많은 암의 발달 및 진행에 연결되어 있다. 기능장애 ErbB 수용체 경로를 통해 매개된 제어되지 않은 세포 증식은 상피 기원의 많은 종류의 고형 암에서 발견될 수 있고, 데이타는 종양 ErbB 수용체 발현, 과발현 및/또는 조절곤란을 진행된 질병, 전이 표현형, 화학요법에 대한 내성 및 및 전반적으로 더 나빠진 예후에 연결시킨다. 더구나, 또한 데이타는 ErbB 수용체를 증가된 종양 침입, 세포성 아폽토시스의 억제, 증가된 세포 부착 및 혈관 생성에 연루시킨다. 특히, EGFR의 증가된 발현은 유방, 방광, 폐 및 위의 더욱 공격적인 암종(carcinomas)에서 관찰된다(Modjtahedi and Dean, Int. J. Oncol. 4:277-296, (1994)). 인간 ErbB2의 과발현은 유방 및 난소 암(Slamon et al., Science 235:177- 182 (1987) and Slamon et al., Science 244:707-712 (1989)), 위, 자궁 내막, 침샘, 폐, 신장, 결장 및 방광의 암종에 연관되어 있다. ErbB3의 현저하게 증가된 수준은 특정 인간 유방 종양 세포주와 연관되어 있는데, 이는 ErbBl 및 ErbB2와 같은 ErbB3가 인간 악성 종양에서 중요한 역할을 하는 것을 가리킨다. 특이적으로, ErbB3는 유방암(Lemoine et al., Br. J. Cancer 66:1116-1121, 1992), 위장암(Poller et al., J. Pathol. 168:275-280, 1992; Rajkumer et al., J. Pathol. 170:271-278, 1993; and Sanidas et al., Int. J. Cancer 54:935-940, 1993), 및 췌장암(Lemoine et al., J. Pathol. 168:269-273, 1992, and Friess et al., Clinical Cancer Research 1:1413-1420, 1995)에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. 마지막으로, 증가된 ErbB4 발현은 또한 유방 샘암종를 포함하는 인간 암종 예를 들어 표피 기원의 암종과 밀접하게 서로 연관되어 있다.

단백질 수용체의 ErbB 과에 의해 매개되는 신호 전달은 많은 경우에 리간드-유도된 수용체 이질이합체화시에 발생된다. 이질이합체화에 이는 "수용체 크로스토킹(cross-talking)"은 ErbB 수용체 키나아제 도메인의 활성화 및 ErbB 수용체의 교차-인산화를 야기하며, 이는 예를 들어 EGFR과 ErbB2, ErbB2와 ErbB3, 및 ErbB2와 ErbB4 사이에서 발생되는 것으로 알려져 있다(예를 들어, [Wada et al., Cell 61 :1339- 1347 (1990); Plowman et al., Nature 336:473-475 (1993); Carraway and Cantley, Cell 78:5-8 (1994); Riese et al., Oncogene 12:345-353 (1996); Kokai et al., Cell 58:287-292 (1989); Stern et al., EMBO J. 7:995-1001 (1988); and King et al., Oncogene 4:13-18 (1989)]에서 참조된다).

본 발명의 bsBA를 제조에서 사용을 위한 바람직한 결합 분자는 예를 들어, 미국 특허 제 5,183,884, 5,480,968, 5,968,511, 5,977,322, and 6,512,097호; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9193-9197 (1989); 유럽 특허 출원 No. 444,961 Al; 및 Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2900-2904 (1993)에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로서 통합된다. 치료 방법의 구체예는 암 이외의 질병 상태 상태들, 예를 들어 면역 장애, 신경섬유종증 및 말초신경병증과 같은 신경 장애, 및 심장 비대와 같은 심장 장애를 포함한다.

인슐린 수용체 (IR) 및 인슐린-유사 성장 인자 수용체 ( IGF -R)

인슐린 수용체 및 IGF-I 수용체는 두 개의 주된 질병, 당뇨 및 암을 위한 새로운 치료학의 발달을 위해 중요한 표적인 밀접하게 관련된 단백질이다. 당뇨병은 중요성이 증가하고 있는 전지구의 건강 문제이다. 당뇨병은 유행병으로서 세계 건강 기구에 의해 분류된 유일한 비-감염성 질병이다. 당뇨병의 세계적 발생율은 2-3%이고, 미국 및 다른 서방 국가에서 6%로 증가하고 있다.

인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFRs)가 특정 암 및 건선에 중요한 역할을 한다는 증가는 계속 보충되고 있다. 이러한 수용체에 의해 조절되지 않는 신호전달은 방사능요법 및 화학요법에 대한 내성을 가진 예를 들어, 윌름스 종양형성(Wilm's tumorigenesis), 간모세포종, 간세포암종, 결장직장암, 유방암, 아데노코르티칼 카르시노마, 다발 골수종, 림프종, 백혈병, 전립샘암, 및 폐암의 발병기전과 관련되어 있다. 인슐린 및 IGF 수용체는 ErbB 수용체 과에 밀접하게 관련되어 있다.

인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFRs)는 신체의 많은 세포의 정상 기능의 유지에 관련되어 있다. IGF-II 수용체는 종양 세포에 의해 공통적으로 발현되고, 자가분비 성장 인자로서 역할을 할 수 있고; 경우에 따라서는 표적 조직에 도달하여, 종양-유도된 저혈당증을 일으킨다. IGF-I 수용체는 공통적으로 많은 암에서 과발현되고, 많은 최근 연구는 암세포 생존 및 전이에 중요한 기능인 암세포 증식, 부착, 이동, 및 세포 사멸에 영향이 있는 IGF-I 수용체로부터 유래되는 새로운 신호전달 경로를 확인하였다(예를 들어, [LeRoith et al., Cancer Lett. 195:127-137 (2003)]가 참조된다.). IGF-I 수용체는 많은 정상 세포가 또한 이 수용체를 발현하기 때문에, 암 치료법을 위한 유망한 표적으로서 보여지지 않았다. 과학적 증거는 IGF-I 수용체가 세포 증식 또는 종양 발달에 관계된 다수의 세포내 신호전달에 영향을 미치고 IGF-I 수용체 억제가 어떻게 종양 세포를 통상적 화학요법 또는 다른 항암제에 더욱 민감하게 만드는지를 설명하기 위한 가능한 메카니즘을 제공함을 제안한다. 아마 가장 중요하게는 IGF-I 수용체의 신호를 억제하는 것은 종양 성장을 억제하고, 환자 생존을 지속시키고, 다발 골수종 및 다른 혈액암의 임상적으로 관련된 마우스 모델에서 화학요법의 항종양 효과를 높인다. 따라서, bsBA의 저친화도 결합 분자가 IGF-I 수용체에 결합되는 bsBA가 우선적으로 IGF-I 수용체를 표적화하는 종래의 치료제의 결점을 극복할 것이다(다시 말해, 비-표적, 비-질병 세포에서 IGF-I 수용체 신호전달의 억제를 피함에 의해). 이 예에서, bsBA의 고친화도 결합 분자가 bsBA를 질병 세포(예를 들어, IGF-I 수용체의 과자극의 억제가 요구되는 세포)에 특이적으로 표적화하는 세포 표면 수용체에 결합하는 것이 바람직하다. 질병 세포에 우선적으로 표적화된 경우, bsBA의 저친화도 결합 분자는 그 다음에 IGF-I에 결합될 수 있고 질병 상태가 관련된 부적당한 세포 신호전달을 억제할 수 있다.

유방의 진행된 단계의 샘암종을 가진 환자를 위한 치료 전략은 세포독성 화학요법의 사용을 종종 포함한다. 세포 주기 조절에서 주요한 인자인 IGF-I 수용체는 종종 높은 등급 유방암에서 과발현되고 이 암들에서 주된 표적을 대표한다. ErbB2-과발현 유방암세포의 성장을 억제하는 항-HER2/neu 수용체 단클론 항체(Trastuzumab, 또한 Herceptin®로 알려짐)를 사용하여 유방암 치료를 받는 환자가 공통적으로 항체에 대한 내성이 발달함은 또한 알려져 있다. 세포 생존 신호를 활성화시키는 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I)가 트라스투주맵(trastuzumab)의 성장 억제 작용을 방해함이 관찰된다. 본 발명의 bsBA를 사용하여 IGF-I 수용체를 통한 세포 신호를 막거나, 줄이거나 억제함에 의해, 트라스투주맵-유발 성장 억제는 회복될 수 있다(예를 들어, [Lu et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1852-1857, 2001]가 참조된다). 따라서, 본 발명의 bsBA의 하나의 가능한 용도는 IGF-I 수용체 신호전달을 표적화하여 트라스투주맵 또는 다른 현재 또는 미래의 항암 치료제에 대한 내성의 발달을 막거나 지연하는 것이다.

중추신경계(CNS) 비정형기형/횡문근양 종양(ATT/RhT)은 가장 나쁜 예후 및 치명적 결과를 가지는 소아 악성 종양 중 하나이다. 세포증식억제 약물 및 방사선치료에 대한 이들의 주목할만한 내성에 대한 설명은 현재까지 없다. IGF-I 수용체는 세포 생존, 증식, 변형 및 아폽토시스의 조절에 중요한 역할을 한다. IGF-I 수용체는 다양한 항암 약물 및 방사선에 의해 유발된 아폽토시스로부터 암세포를 보호하지만, 억제제 예를 들어 안티센스 전략, 우성 음성 변이체, 또는 삼중-나선 형성에 의해 손상을 받는 경우에, 종양 세포는 대량 아폽토시스를 겪음으로써 시험적 동물 모델에서 종양형성 및 전이를 억제한다. IGF-I 수용체를 표적화하는 본 발명의 bsBA는 IGF-I 수용체의 활성화를 통해 신호 전달을 막거나 줄이기 위해 사용될 수 있고, 이로써 암과 같은 질병 상태를 치료한다.

인슐린-유사 성장 인자(IGF)- 및 에스트로겐 수용체(ER)- 신호전달 경로 사이의 크로스-토크는 상승적 성장을 일으킨다. 에스트로겐은 IGF-I 수용체 및 이의 다운스트림 신호전달 분자, 및 인슐린 수용체 기질 (IRS)-I 및 IRS-2의 발현을 유발함에 의해 IGF 신호를 높인다. IGF-I 수용체 및 IRS 발현의 에스트로겐 유발은 IGF-I 자극 후에 IRS-I의 높아진 티로신 인산화를 야기하고, 후속하여 높아진 미토겐-활성 단백질 키나아제 활성화를 야기한다. 이는 IGF-I 수용체의 활성화가 에스트로겐-매개 성장 및 유방암 발병기전에 관련됨을 나타낸다(예를 들어, [Lee et al., MoI. Endocrinol. 13:787-796, 1999]가 참조된다). 따라서, IGF-I 수용체를 표적화하는 본 발명의 bsBA는 IGF-I 수용체의 활성화를 통해 신호 전달을 막거나 줄이기 위해 사용될 수 있고, 이로써 에스트로겐-유발 유방암 질병 상태를 치료할 수 있다.

혈관 내피 성장 인자 수용체 ( VEGFR )

혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 저산소증 및 발암성 변이에 의해 유발되는 다기능성 사이토카인이다. VEGF는 배아발생에서 혈관 망의 발달 및 유지의 주된 자극제이다. 이는 효력있는 투과성-유발 작용제, 내피 세포 화학주성 작용제, 내피 생존 인자, 및 내피 세포 증식 인자로서 기능한다(Thomas, J. Biol. Chem. 271 :603- 606, 1996; and Neufeld et al., FASEB J. 13:9-22, 1999). VEGF는 중요한 인자이며, 상처 치료(Frank et al., 1995; Burke et al., 1995), 당뇨망막병증(Alon et al., 1995; Malecaze et al., 1994), 건선(Detmar et al., 1994), 죽상동맥경화증(Inoue et al., 1998), 류마티스 관절염(Harada et al., 1998; Nagashima et al., 1999), 및 고형 종양 성장(Plate et al., 1994; Claffey et al., 1996)을 포함하는 많은 생물학적 및 병리학적 과정에서 혈관생성 또는 혈관형성을 이끈다.

매우 다양한 세포 및 조직이 VEGF을 생산한다. VEGF 이량체는 높은 친화도로 두 개의 잘 특징된 수용체, VEGFRl(FLT-1) 및 VEGFR2(KDR/Flk-1)에 결합하며, 이들 수용체는 내피 세포에 선택적으로 발현된다(Flt-1 및 Flk-1는 마우스 동족체이다). VEGFR1 및 VEGFR2에 결합하는 VEGF의 Kd는 각각 15-100 pM 및 400-800 pM이다(Terman et al., 1994). 최근에 확인된 제 3 세포 표면 단백질, 뉴로필린-1은 또한 높은 친화도로 VEGF와 결합한다(예를 들어, Soker et al., Cell. 92(6):735-45 (1998)).

VEGFRl 및 VEGFR2은 7 개의 세포외 IgG-유사 반복체, 단일 스패닝 막통과 영역, 및 세포내 스플릿(split) 티로신 키나아제 영역에 의해 특징되는 형태 III 수용체 티로신 키나아제(RTK III) 과의 맴버이다(Mustonen and Alitalo, J Cell Biol 129: 895-898 (1995)). 매우 최근까지, VEGFRl 및 VEGFR2은 내피 세포(id)에 거의 배제적으로 발현되는 것으로 생각되었다. 최근 연구에 의해 각 VEGF, VEGFR1, 및 VEGFR2가 혈관형성, 혈관생성, 및 배아 발달에 본질적인 것으로 밝혀졌다. VEGFRl는 비록 더 낮은 티로신 키나아제 활성을 가지지만, VEGFR2보다 VEGF에 더 높은 친화도를 가진다.

VEGF 수용체에 VEGF 이량체의 결합은 수용체 이합체화를 유발하는 것으로 여겨진다. 그 다음에 수용체의 이합체화가 신호 전달 캐스케이드를 이끄는 특정 티로신 잔기의 자가인산전이를 일으킨다. VEGF-유발 신호전달에서 추가 다운스트림의 세포내 사건은 덜 명확하지만, 다수의 연구집단이 산화질소(NO)가 VEGFR2의 VEGF의 활성화 후에 생성됨을 밝혀내었다 (Kroll and Waltenberger, Biochem Biophys Res Commun. 252(3):743-6 (1998)). VEGF에 의한 VEGFR1이 아닌 VEGFR2의 활성화는 MAP 키나아제, ERK 1 및 2를 포함하여 Src 및 Ras-MAP 키나아제 캐스케이드를 활성화시킴을 또한 보여주고 있다(Kroll and Waltenberger, J Biol Chem. 272(51):32521-7 (1997)).

본 발명의 bsBA를 제조에서 사용을 위한 바람직한 결합 분자는 예를 들어, 미국 특허 제 5,840,301, 5,874,542, 6,703,020호, 및 WO 99/40118에 기재되어 있으며, 이는 각각 본원에 참조로서 통합된다. bsBA를 제조하는데 사용하기 위한 바람직한 결합 분자는 단클론 항체 2C3(ATCC PTA 1595)이다. VEGF 수용체에 대한 RNA 압타머, 안티센스 분자 및 리보자임은 또한 bsBA에서 결합 분자로서 사용될 수 있다. 바람직한 RNA 안티센스 분자, 압타머 및 리보자임은 예를 들어, [Saleh et al., Cancer Res. 56(2):393-401 (1996); Cheng et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 93(16):8502-7 (1996); Ke et al., Int J Oncol. 12(6):1391-6 (1998); 및Parry et al., Nucleic Acids Res. 27(13):2569-77. (1999)]에 기재되어 있으며, 이는 각각 참조로서 본원에 통합된다.

본 발명의 용도의 조성물 및 방법은 VEGF 수용체의 부적절한 또는 과다 활성화와 관련 있는 임의의 형태의 혈관 종양; 황반 변성, 예를 들어 나이-관련 황반 변성; 관절염, 예를 들어 류마티스 관절염; 죽상동맥경화증 및 죽상경화판; 당뇨망막병증 및 다른 망막병증; 갑상샘 과다형성, 예를 들어 그레이브스 병(Grave's disease); 혈관종; 신생혈관녹내장; 및 건선을 가지거나 발달에 대한 위험이 있는 특히 동물 및 환자(예를 들어, 인간 환자)에 사용을 위해 의도된다.

본 발명의 용도의 조성물 및 방법은 VEGF 수용체의 부적절한 또는 과다 활성화와 또한 관련 있는 동정맥기형(AVM), 수막종, 및 혈관 재협착, 예를 들어 혈관성형술에 따른 재협착, 질환을 가지거나 발달 위험이 있는 동물 및 환자의 치료를 위해 추가로 의도된다. 치료적 방법 및 용도의 다른 의도된 표적은 하기 VEGF 수용체-관련 질환: 혈관섬유종, 피부염, 자궁내막증, 혈우병성 관절증, 비대 흉터, 염증성 질병 및 장애, 고름 육아종, 공피증, 윤활막염, 트라코마 및 혈관 유착을 가지거나 발달 위험이 있는 동물 및 환자이다.

상기 목록된 치료 군은 본 발명의 bsBA에 의해 치료될 수 있는 모든 질환은 아니다. 참조로서 본원에 통합되는 미국 특허 제 5,712,291호는 이펙터 도메인이 VEGF 수용체 중 하나에 대해 유도되는 경우에 본 발명의 bsBA를 사용하여 효과적으로 치료될 수 있는 많은 다른 질환을 확인하는 방법에 대해 기재하고 있다. 더구나, VEGFR을 결합하는 이펙터 도메인을 가지는 본 발명의 bsBA를 사용하여 치료될 수 있는 추가적 질환은 본원에 참조로서 통합되는 예를 들어 미국 특허 제 6,703,020호에서 찾을 수 있다.

종양 괴사 인자 수용체 ( TNFR )

종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타는 많은 생물학적 과정, 예를 들어 감염에 대한 보호 및 충격 및 염증성 질병의 유도를 조절하기 위해 TNF 수용체를 통해 작동하는 사이토카인이다. TNF 분자는 "TNF- 리간드" 수퍼패밀리에 속하고, "TNF- 수용체" 수퍼패밀리인 이들의 수용체 또는 역-리간드와 함께 작용한다. 지금까지, TNF 리간드 속과의 9개 일원이 확인되었고 TNF-수용체의 10개 일원이 특징화되었다. 리간드 중에는 TNF-, 림포톡신(lymphotoxin)-(LT-, TNF-β로서 또한 알려짐), LT-β(복합 이형삼합체 LT-2-β에서 발견됨), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, OX40L 및 신경 성장 인자(NGF)가 포함된다. TNF 수용체의 수퍼패밀리는 p55TNF 수용체, p75TNF 수용체, TNF 수용체-관련 단백질, FAS 항원 또는 APO-I, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, 저친화도 p75 및 NGF-수용체를 포함한다(예를 들어, A. Meager, Biologicals 22:291-295, 1994).

TNF-리간드 수퍼패밀리의 많은 일원은 활성화된 T-세포에 의해 발현되며, 이들은 세포 개체 발생 및 기능의 기초를 이루는 다른 세포 형태와 T-세포 상호작용을 위해 필요함을 암시한다(Meager 1994, supra). TNF 수용체 과의 여러 맴버의 본질적 작용의 상당한 관찰은 이 단백질들의 발현을 폐지하는 변종의 확인 및 출연으로부터 얻어진다. 예를 들어, FAS 항원 및 이의 리간드에서 자연 발생 변이는 림프세포증식성 질병을 일으키며(예를 들어, Watanabe-Fukunaga et al., Nature 356:314, 1992), 아마도 세포예정사의 실패를 반영한다. CD40 리간드의 변이는 원형질에서 높은 수준의 면역글로불린 M 및 낮은 수준의 면역글로불린 G에 의해 특징되는 X-연관 면역결핍증 상태를 일으키며, 오류 T-세포-의존 B-세포 활성화를 나타낸다(예를 들어, R. C. Allen et al., Science 259:990, 1993). 저친화도 신경 성장 인자 수용체의 표적된 변이는 말초 구조의 오류 감각 혁신에 의해 특징되는 장애를 일으킨다(예를 들어, Lee et al., Cell 69:737, 1992).

TNFR 리간드, TNF 및 LT-는 두 개의 TNF 수용체(55- 및 75-kd TNF 수용체)에 결합할 수 있다. TNF 및 LT-에 의해 유도된 이들의 수용체를 통해 작용하는 다수의 생물학적 효과는 이식된 종양의 출혈 괴사, 세포독성, 내독소성 속에서의 역할, 염증, 면역조절, 증식 및 항바이러스 반응뿐만 아니라 이온화방사선의 해로운 효과에 대한 보호를 포함한다. TNF 및 LT-는 넓은 범위의 질병, 예를 들어 내독소성 속, 뇌 말라리아, 종양, 자가면역 질병, AIDS 및 이식-숙주 거부에 관련된다(Beutler and Von Huffel, Science 264:667-668, 1994). ρ55 수용체에서 변이가 미생물 감염에 대한 감수성을 증가시킨다.

또 다른 TNFR, TNF-관련 아폽토시스-유발 리간드 또는 "TRAIL"는 많은 인간 조직(예를 들어, 비장, 폐, 전립선, 흉선, 난소, 소장, 대장, 말초 혈관 림프구, 태반, 신장)에서 발현된다. TRAIL이 FAS 리간드로부터 독립적으로 작용하고, Fas/Apo-1L에 의한 사망 신호에 유사한 시간 프레임 내에서, 그러나 TNF-유발 아폽토시스보다 훨씬 더 빠르게 아폽토시스를 활성화시킴을 보여주고 있다.

종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 리간드는 대다수의 세포성 반응을 유도하는 대부분의 다양성발현 사이토카인, 예를 들어 세포독성, 항바이러스 활동, 면역조절 활동, 및 여러 유전자의 전사 조절 중에 속하는 것으로 알려져 있다. TNF-과 리간드에 대한 세포성 반응은 정상 생리적 반응은 물론 증가된 아폽토시스 또는 아폽토시스의 억제에 관련된 질병을 포함한다. 아폽토시스-세포예정사는 면역 시스템의 말초성 T 림프구의 삭제에 관련된 생리적 메카니즘이고, 이의 조절곤란은 다수의 상이한 병원성 과정을 이끌 수 있다. 증가된 세포 생존 또는 아폽토시스의 억제에 관련된 질병은 암, 자가면역질환, 바이러스 감염증, 염증, 이식편대숙주 질병, 급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부를 포함한다. 증가된 아폽토시스에 관련된 질병은 AIDS, 신경변성 장애, 골수형성이상증후군, 허혈손상, 독성-유발 간 질병, 패혈쇼크, 악액질, 및 식용부진을 포함한다.

본 발명의 bsBA는 하나 이상의 두 개의 결합영역이 특이적으로 TNFR에 결합하도록 제조될 수 있다. 이러한 bsBA는 그 다음에 TNFR를 활성화시킴에 의해, 예를 들어, TNFR를 결합하고, 이로써 아폽토시스를 조장하며 부적절한 세포 성장(예를 들어, 암의 경우)을 막거나 줄임에 의해, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염, 염증, 이식 vs. 숙주 질병, 급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부를 치료하기 위한 방법에서 사용된다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 하나 이상의 결합 분자는 TNFR을 결합하고 두 번째 결합 분자는 표적 세포에 발현되는 것으로 알려진 두 번째 수용체에 결합한다(예를 들어, 두 번째, 상이한 TNFR, 또는 질병-특이적 수용체). 암의 경우에, 바람직한 두 번째 수용체는 ErbB2과 같은 ErbB 과의 수용체이다. 바람직하게는 TNFR을 결합하는 bsBA의 결합분자는 두 번째 결합 분자가 이의 수용체에 대해 가지는 친화도보다 더 낮은 친화도를 가진다.

대안적으로는, 본 발명의 bsBA는 하나 이상의 bsBA의 두 개의 결합 분자가 특이적으로 예를 들어, TNFR에 리간드 결합을 차단함에 의해 TNFR에 결합하고 TNFR의 활성화를 막거나 줄이도록 제조될 수 있다. 이러한 bsBA는 그 다음에 TNFR의 활성화를 막거나 줄임에 의해, 예를 들어 TNFR에 리간드 결합을 막거나 줄이고, 이로써 아폽토시스를 막거나 줄임에 의해 AIDS, 신경변성 장애, 골수형성이상증후군, 허혈손상, 독성-유발 간 질병, 패혈성 쇼크, 악액질, 및 식욕부진을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 두 개의 결합 분자가 특이적으로 TNFR에 결합하는 bsBA는 증가된 아폽토시스가 나타나는(예를 들어, 허혈손상) 질병 치료를 위해 사용된다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 표적 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 사용되는 표적 세포(다시 말해, TNFR이 아닌 수용체)에 발현되는 항원 또는 두 번째 수용체에 대해 유도된다.

섬유모세포 성장 인자 수용체 ( FGFR )

섬유모세포 성장 인자(FGF) 신호전달 경로는 정상 발달 및 상처 치유의 중요한 부분이다. FGF는 티로신 키나아제 과의 맴버인 세포 표면 수용체를 통한 이들의 효과를 생산한다. 인간의 경우, 4개의 다른 섬유모세포 성장 인자 수용체(FGFR)가 확인되었다(FGFRl-FGFR4).

FGFR은 이합체화에 이어 자가인산화에 의해 활성화된다. 이합체화는 헤파란황산염의 존재하에서 리간드 결합 후에 발생하고 FGFR의 세포질 영역 내 여러가지 티로신 잔여물의 인산화를 야기한다. FGFR의 인산화는 키나아제 활동을 촉진하고 MAPK, PD 키나아제, 및 Stat1/3 경로의 활성화를 이끈다.

FGFR 유전자에서 변이는 전형적으로 수용체의 부적절한 활성화에 의한 질병 또는 장애를 일으키는 기능 획득(gain-of-function) 변이를 일으킨다. FGFR 변이는 예를 들어, 파이퍼 증후군, 잭슨-바이스 증후군, 크로존 증후군, 에이퍼트 증후군, 비어-스테벤손 쿠티스 기라타(Beare-Stevenson Cutis Gyrata) 증후군, 새트레-코첸(Saethre-Chotzen) 증후군, 연골발육부전, 치사성 형성이상(Thanatophoric Dysplasia), 하이포콘드로플라시아(Hypochondroplasia), 무엔케(Muenke) 증후군, 및 발육 지연과 흑색 극세포증을 수반한 중증 연골발육부전(SADDAN) 이형성증을 포함하는 여러 발달 장애에 연관되어 있다. FGFR은 또한 면역조직화학에 의해 정상 조직에 비교되는 경우에, 많은 종양 샘플에서 과발현되는 것으로 알려진다. 예를 들어, FGFR 과발현은 제 1 결장직장 암, 췌장암, 유방암, 및 결장암에서 확인된다. FGF 분자는 발암에 관련되는 미토겐, 혈관형성, 및 안티아폽토틱 인자로서 작용한다.

본 발명의 bsBA는 하나 이상의 bsBA의 두 개의 결합 분자가 예를 들어, FGFR에 리간드 결합을 차단함에 의하거나 FGFR 이합체화를 막거나 줄임에 의해 특이적으로 FGFR에 결합하고 FGFR의 활성화를 막거나 줄이도록 제조될 수 있다. 이러한 bsBA는 그 다음에 FGFR의 활성화를 막거나 줄입에 의해 파이퍼 증후군, 잭슨-바이스 증후군, 크로존 증후군, 에이퍼트 증후군, 비어-스테벤손 쿠티스 기라타(Beare-Stevenson Cutis Gyrata) 증후군, 새트레-코첸(Saethre-Chotzen) 증후군, 연골발육부전, 치사성 형성이상(Thanatophoric Dysplasia), 하이포콘드로플라시아(Hypochondroplasia), 무엔케(Muenke) 증후군, 발달 지연(Developmental Delay) 및 극세포증(Acanthosis) 흑색의(Nigricans)(SADDAN) 형성이상(dysplasia)을 가진 심한 연골발육부전, 제 1 결장직장 암, 췌장암, 유방암, 및 결장암을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 표적 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 사용되는 표적 세포(다시 말해, FGFR이 아닌 수용체)에 발현되는 두 번째 수용체에 대해 유도된다.

혈소판-유래 성장 인자 수용체 ( PDGFR )

PDGFR 패밀리는 맥관성 평활근세포(VSMCs), 희소돌기아교세포(조직 인케이싱 신경 섬유(tissue encasing nerve fiber)의 세포), 및 연골세포(세포 연골)와 같은 결합 조직 세포의 운동성 및 성장을 자극하는 다운스트림 신호전달 효소를 활성화시킨다. PDGF 베타 수용체는 VSMC의 분화를 유도하는데 필수적이다.

PDGFR 경로의 과발현은 PDGFR의 부적절하거나 증가된 활성화에 연관된 죽상동맥경화증 및 암을 포함하는 다양한 중대한 질병에 연관되어 있다. 대안적으로는, 뼈, 치주, 인대, 및 연골의 손상을 조장하기 위해 PDGFR의 활성화를 촉진하는데 바람직할 수 있다.

본 발명의 bsBA는 하나 이상의 bsBA의 두 개의 분자는 특이적으로 예를 들어 PDGFR에 리간드 결합을 차단함에 의해 PDGFR에 결합하고 PDGFR의 활성화를 막거나 줄이도록 제조될 수 있다. 이러한 bsBA는 그 다음에 PDGFR의 활성화를 막거나 줄임에 의해 예를 들어, 안테로스클레로시스(antherosclerosis) 및 암을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 두 번째 결합 분자는 표적 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 사용되는 표적 세포(즉, PDGFR이 아닌 수용체)에 발현되는 두 번째 수용체에 대해 유도된다. 바람직하게는 PDGFR을 결합하는 bsBA의 결합 분자는 두 번째 결합 분자가 이의 수용체를 위해 가지는 친화도보다 더 낮은 친화도를 가진다.

대안적으로는, 본 발명의 bsBA는 하나 이상의 bsBA의 두 개의 결합 분자가 특이적으로 PDGER을 활성화시키고 이에 결합하도록 제조될 수 있다. 이러한 bsBA는 그 다음에 PDGFR을 활성화시킴에 의해 뼈, 치주, 인대, 및 연골의 손상을 조장하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 이펙터 도메인은 PDGFR을 결합하고, 표적화 도메인은 표적 세포에 발현되는 것으로 알려진 두 번째 수용체 또는 항원에 결합한다(예를 들어, 두 번째, 상이한 PDGFR, 또는 뼈-, 치주-, 인대-, 또는 연골-특이 수용체).

C-KIT 수용체 (또한 스틸 인자(Steel Factor) 수용체로 알려짐)

c-키트 원종양유전자는 멜라닌세포 발달 및 증식에 중요한 막통과 티로신 키나아제 형태 수용체이다. 원종양유전자 c-키트는 혈소판-유래 성장 인자 PDGF/CSF-1 (c-fms) 수용체 아과에 관련된 막통과 티로신 키나아제 수용체를 암호화한다. C-KIT은 배아 멜라닌모세포의 정상 성장 및 분화에 중추적 역할을 하는 것 발견되었다. 멜라닌세포의 악성 변형 및 인간 멜라닌종의 진행은 c-키트 원종양유전자의 발현의 손실에 관련된다. c-키트 원종양유전자에 의해 암호화된 티로신 키나아제 수용체의 발현은 인간 멜라닌종의 침입 및 종양 성장 중에 점차적으로 쇠퇴한다.

본 발명의 bsBA는 하나 이상의 bsBA의 두 개의 결합 분자가 특이적으로 c-키트 수용체를 활성화시키고 이에 결합하도록 제조될 수 있다. 이러한 bsBA는 그 다음에 예를 들어 흑색종을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 표적 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 사용되는 표적 세포(다시 말해, c-키트 수용체가 아닌 수용체)에 발현되는 두 번째 수용체에 또는 항원에 대해 유도된다.

Fc 수용체( FcR )

Fc 수용체는 면역글로불린 분자의 Fc 부분 부위를 결합하고 특정 면역글로불린 부류를 위한 특이성을 나타낼 수 있는 집합한 면역글로불린 또는 항원-항체 복합체를 위한 특이적 세포-표면 수용체이다. FcR는 B 세포, K 세포, 마크로파지, 중성구, 및 호산구에서 발견되고, 몇몇 발달 단계 중에서는 T 세포에서 발견되며; K cell, 마크로파지, 및 중성구에 있는 것들은 항원에 결합된 식균 항체에 결합하고 항원의 포식를 일으킨다.

인간 FcR는 자가면역 질병 (예를 들어, 전신홍반루푸스, 자가면역 혈소판감소자색반, 중증근육무력증, 다발경화증, 포도막염, 및 갑상샘-연관 눈병증) 및 알레르기 항원에 알레르기 반응의 발달 또는 진행에 관련되어 있음이 알려져 있다. FcR의 자연적 억제는 말초의 내성을 유지하고, 이로써 자가면역 및 자가면역 질병의 발달을 막는데 책임이 있다. 대조적으로, 활성화 FcR의 부족은 보호적 표현형을 생성시켜서, 자가면역 질병으로부터 자가면역성을 언커플링(uncoupling)시킨다.

본 발명의 bsBA는 하나 이상의 bsBA의 두 개의 결합 분자가 면역 세포에 Ig 분자에 이의 결합을 차단함에 의해, FcR에 특이적으로 결합하고 FcR의 활성화를 막거나 줄이도록 제조될 수 있다. 이러한 bsBA는 그 다음에 전신홍반루푸스, 자가면역 혈소판감소자색반, 중증근육무력증, 다발경화증, 포도막염, 및 갑상샘-연관 눈병증와 같은 예를 들어, 자가면역 질병을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 전형적으로는, bsBA의 표적화 도메인은 표적 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 사용되는 표적 세포(다시 말해, FcR이 아닌 수용체)에 발현되는 두 번째 수용체에 또는 항원에 대해 유도된다.

사이토카인 수용체를 결합하기 위한 bsBA 의 사용

구체예의 중요한 군에서, 표적화 도메인 또는 이펙터 도메인은 사이토카인 수용체를 세포 표면에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 다소 덜 바람직한 몇몇 구체예에서, 결합제는 사이토카인 수용체를 위한 천연 리간드, 또는 수용체에 결합하는 능력을 보유하는 이러한 리간드의 단편일 수 있다.

본 발명의 방법에서 유용한 결과를 초래하기 위한 bsBA의 표적화 도메인 또는 이펙터 도메인에 의해 요구되는 바와 같이 연결될 수 있는 예시적인 사이토카인 수용체는 다음과 같다:

사이토카인 수용체 공통 감마 사슬 (감마-C) (인터루킨-2 수용체 감마 사슬) (IL-2R 감마 사슬) (P64) (CD 132 항원);

인터루킨-10 수용체 알파 사슬 (IL-IOR-A) (IL-IORl);

인터루킨-10 수용체 베타 사슬 (IL-IOR-B) (IL-10R2) (사이토카인 수용체 등급-II CRF2-4);

인터루킨-12 수용체 베타-1 사슬 (IL-12R-베타l) (인터루킨-12 수용체 베타) (IL- 12 수용체 베타 성분) (IL-12RB1);

인터루킨-12 수용체 베타-2 사슬 (IL-12 수용체 베타-2) (IL-12R-베타2);

인터루킨-13 수용체 알파-1 사슬 (IL-13R-알파-l) (IL-13RA-1) (CD213al 항원);

인터루킨-13 수용체 알파-2 사슬 (인터루킨-13 결합 단백질);

인터루킨-17 수용체 (IL- 17 수용체);

인터루킨-17B 수용체 (IL-17B 수용체) (IL-17 수용체 동종 1) (IL-17RM) (IL17Rhl) (사이토카인 수용체 CRL4) (UNQ2501/PRO19612);

인터루킨 21 수용체 전구체 (IL-21R);

인터루킨-1 수용체, 형태 I (IL-lR-1) (IL-lR-알파) (P80) (항원 CD121a);

인터루킨-1 수용체, 형태 II (IL-1R-2) (IL-lR-베타) (항원 CDwl21b);

인터루킨-1 수용체 길항제 단백질 (IL-lra) (IRAP) (ILl 억제제) (IL-1RN) (ICIL-1RA);

인터루킨-2 수용체 알파 사슬 (IL-2 수용체 알파 소단위) (P55) (TAC 항원) (CD25 항원);

인터루킨-2 수용체 베타 사슬 (IL-2 수용체) (P70-75) (고친화도 IL-2 수용체 베타 소단위) (CD122 항원);

인터루킨-3 수용체 알파 사슬 (IL-3R-알파) (CD123 항원);

인터루킨-4 수용체 알파 사슬 (IL-4R-알파) (CD124 항원);

인터루킨-5 수용체 알파 사슬 (IL-5R-알파) (CD125 항원) 인터루킨-6 수용체 알파 사슬 (IL-6R-알파) (IL-6R 1) (CD 126 항원);

인터루킨-6 수용체 베타 사슬 (IL-6R-베타) (인터루킨 6 신호 전달물질) (막 글리코단백질 130) (gpl30) (온코스타틴(Oncostatin) M 수용체) (CDwl30) (CD130 항원);

인터루킨-7 수용체 알파 사슬 (IL-7R-알파) (CDwl27) (CD127 항원);

고친화도 인터루킨-8 수용체 A (IL-8R A) (IL-8 수용체 형태 1) (CXCR-I) (CDwl28a);

고친화도 인터루킨-8 수용체 B (IL-8R B) (CXCR-2) (GRO/MGSA 수용체) (IL-8 수용체 형태 2) (CDwI 28b);

인터루킨-9 수용체 (IL-9R);

인터루킨-18 수용체 1 (ILl 수용체-관련 단백질) (IL-lRrp);

인터루킨-1 수용체-유사 1 전구체 (ST2 단백질);

인터루킨-1 수용체-유사 2 (IL-lRrp2) (인터루킨-1 수용체 관련 단백질 2) (ILlR-rp2);

톨(Toll)-유사 수용체 1 (톨/인터루킨-1 수용체-유사) (TIL);

톨-유사 수용체 2 (톨/인터루킨 1 수용체-유사 단백질 4);

톨-유사 수용체 5 (톨/인터루킨-1 수용체-유사 단백질 3);

CX3C 케모카인 수용체 1 (C-X3-C CKR-I) (CX3CR1) (프락탈킨(Fractalkine) 수용체) (GPR13) (V28) (베타 케모카인 수용체-유사 1) (CMK-BRL-1) (CMKBLRl);

C-X-C 케모카인 수용체 형태 3 (CXC-R3) (CXCR-3) (CKR-L2) (CD 183 항원);

C-X-C 케모카인 수용체 형태 4 (CXC-R4) (CXCR-4) (스트로말(Stromal) 세포-유래 인자 1 수용체) (SDF-1 수용체) (후신(Fusin)) (백혈구-유래 7 막통과 영역 수용체) (LESTR) (LCRl) (FB22) (NPYRL) (HM89) (CD 184 항원);

C-X-C 케모카인 수용체 형태 5 (CXC-R5) (CXCR-5) (버킷 림프종 수용체 1) (단핵구-유래 수용체 15) (MDRl 5);

C-X-C 케모카인 수용체 형태 6 (CXC-R6) (CXCR-6) (G 단백질-커플링된 수용체 본조(bonzo)) (G 단백질-커플링된 수용체 STRL33);

케모카인 결합 단백질 2 (케모카인-결합 단백질 D6) (C-C 케모카인 수용체 D6) (케모카인 수용체 CCR-9) (CC-케모카인 수용체 CCRlO);

C-C 케모카인 수용체 형태 1 (C-C CKR-1) (CC-CKR-1) (CCR-1) (CCRl) (마크로파지 염증성 단백질-1 알파 수용체) (MIP-l알파-R) (RANTES-R) (HM145) (LD78 수용체);

C-C 케모카인 수용체 형태 2 (C-C CKR-2) (CC-CKR-2) (CCR-2) (CCR2) (단핵구 화학유인물질 단백질 1 수용체) (MCP-1-R);

C-C 케모카인 수용체 형태 3 (C-C CKR-3) (CC-CKR-3) (CCR-3) (CCR3) (CKR3) (호산구 에오탁신 수용체);

C-C 케모카인 수용체 형태 4 (C-C CKR-4) (CC-CKR-4) (CCR-4) (CCR4) (K5-5);

C-C 케모카인 수용체 형태 5 (C-C CKR-5) (CC-CKR-5) (CCR-5) (CCR5) (HIV-1 융합 공동수용체) (CHEMRl 3) (CD 195 항원);

C-C 케모카인 수용체 형태 6 (C-C CKR-6) (CC-CKR-6) (CCR-6) (LARC 수용체) (GPR-CY4) (GPRCY4) (케모카인 수용체-유사 3) (CKR-L3) (DRY6);

C-C 케모카인 수용체 형태 7 전구체 (C-C CKR-7) (CC-CKR-7) (CCR-7) (MIP-3 베타 수용체) (EBV-유발 G 단백질-커플링된 수용체 1) (EBIl) (BLR2);

C-C 케모카인 수용체 형태 8 (C-C CKR-8) (CC-CKR-8) (CCR-8) (GPR-CY6) (GPRCY6) (케모카인 수용체-유사 1) (CKR-Ll) (TERl) (CMKBRL2) (CC-케모카인 수용체 CHEMRl);

C-C 케모카인 수용체 형태 9 (C-C CKR-9) (CC-CKR-9) (CCR-9) (GPR-9-6);

C-C 케모카인 수용체 형태 10 (C-C CKR-1O) (CC-CKR-10) (CCR-1O) (G-단백질 커플링된 수용체 2);

C-C 케모카인 수용체 형태 11 (C-C CKR-11) (CC-CKR-11) (CCR-11) (케모카인 수용체-유사 1) (CCRLl) (CCX CKR);

케모카인 수용체-유사 1 (G-단백질 커플링된 수용체 DEZ) (G 단백질-커플링된 수용체 ChemR23);

케모카인 수용체-유사 2 (IL8-관련 수용체 DRYl2) (흐름-유발 내피 G 단백질-커플링된 수용체) (FEG-I) (G 단백질-커플링된 수용체 GPR30) (GPCR-BR);

케모카인 XC 수용체 1 (XC 케모카인 수용체 1) (림포탁틴(Lymphotactin) 수용체) (G 단백질-커플링된 수용체 5).

종양 관련 항원과 결합하는 bsBA의 용도

구체예의 특별히 중요한 군에서, bsBA의 표적화 도메인은 종양 관련 항원에 결합한다. 이름이 함축하는 바와 같이, 종양 관련 항원(TAA)은 전형적으로 특별한 종양의 세포에 발현되지만, 정상 세포에서 전형적으로 발현되지 않는 항원이다. 종종, TAA는 생물체의 발달에서 특정 지점에서(예를 들어 치명적 발달 중에) 세포에서 정상적으로 발현되고, 발달의 현 지점에서 생물체에서 부적절히 발현되는 항원이거나, 정상 조직에서 또는 항원을 현재 발현시키는 기관의 세포에서 발현되지 않는 항원이다. 다수의 TAA는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, MART-1, 암배아 항원 ("CEA"), gplOO, MAGE-1, HER-2, 및 Lewis^Y 항원, 및 미국 특허 제 5,922,566 및 6,020,478호 및 WO 2004/016643 A2에서 확인되는 항원을 포함한다.

본 발명의 bsBA를 가지는 표적에 적합한 다른 종양 관련 항원은:

- 조혈 분화 항원 -- CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD45, CD52, 및 CD147와 같은 군집 분화 (CD) 군과 일반적으로 연합된 글리코단백질;

-세포 표면 분화 항원, 예를 들어 글리코단백질, 예를 들어 암배아 항원 (CEA, Swiss-Prot ID No. P06731), 종양 관련 글리코단백질 (TAG-72, 또한 CA72-4로 확인된, 예를 들어, [Hombach et al., Gastroenterology. 113(4): 1163-70 (1997)]이 참조되고, 다형 상피 무신(PEM), 상피 세포 유착 분자(Ep-CAM)5 MUC-1, A33, G250, E-cadherin, 전립샘-특이 막 항원 (PSMA, Swiss-Prot ID No. Q04609) 및 전립샘-특이 항원(PSA), 당지질, 예를 들어 강글리오시드, 예를 들어, GD2, GD3, GM2) 및 카르보하이드레이트, 예를 들어 혈액 군-관련 항원, 예를 들어 LEY 및 LEb (LEY는 "Lewis^Y", 또한 "CD174"로 알려짐); 당지질 및 글리코단백질의 형태 2 혈액 군 올리고당류에서 발견되는 이중푸코스된(difucosylated) 테트라당류;

- 성장 인자 수용체, 예를 들어 표피 성장 인자 수용체(EGFR, ErbBl, Swiss- Prot ID P00533) 및 이의 변이 형태 EGFRvIII, ErbB2(HER-2/neu, Swiss-Prot ID No. P04626), ErbB3(HER-3, Swiss-Prot ID No. P21860) 및 IL-2 수용체.

- 혈관생성 및 간질 항원, 예를 들어 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 테나스신 및 인테그린; 및,

- 프리즐(Frizzled) 수용체 패밀리 (예를 들어 Fz-2)를 포함한다.

몇몇 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 이펙터 도메인이 성장 인자 수용체에 결합하는 동안, TAA를 결합하도록 표적된다.

몇몇 바람직한 구체예에서, 표적화 도메인은 CEA (Swiss-Prot ID No. P06731), ErbB2 (Swiss-Prot ID No. P04626 ), EGFR (Swiss-Prot ID No. P00533 ), LewisY, MUC-1 (Swiss-Prot ID No. P15941 ), EpCAM (mAb 17-1A의 표적 (edrecolomab, Panorex®, Glaxo Wellcome GmbH)), CA125 (Swiss-Prot ID No. Q96RK2), PSMA (Swiss-Prot ID No. Q04609), TAG72, CD20 (Swiss-Prot ID No. Pl 1836), CD19 (Swiss-Prot ID No. P15391), CD22 (Swiss-Prot ID No. P20273), 및CD36 (Swiss-Prot ID No. P16671)으로부터 선택되는 분자에 표적된다. CD 항원은 특별하게 종종 정상 세포에 발현되지만, 특정 암을 위한 마커상에서 과발현됨이 인식되어야 한다.

몇몇 바람직한 구체예에서, 이펙터 도메인은 ErbB3 (Swiss-Prot ID No. P21860), ErbB4 (Swiss-Prot ID No. Q15303), FGF 수용체 1-4 (Swiss-Prot ID Nos. P22455, Pl 1362, P21802, P22607), HGF 수용체 (Swiss-Prot ID No. P08581), IGFl-R (Swiss-Prot ID No. P08069), 인슐린 수용체 (Swiss-Prot ID No. P06213), PDGF 수용체s 알파 및 베타 (Swiss-Prot ID Nos. P16234, P09619, respectively) 및 C-KIT (Swiss-Prot ID No. P 10721)로부터 선택된 분자에 결합한다. 몇몇 특별히 바람직한 구체예에서, 표적화 도메인은 이전 단락에 기술된 분자에 결합하고 이펙터 도메인은 본 단락에서 기재된 분자에 결합한다.

압타머

결합 분자의 하나 또는 둘이 압타머인 bsBA는 본원에서 참조로서 통합된 미국 특허 제 5,756,291호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 압타머는 일반적으로 "SELEX"(지수 강화에 의해 리간드의 체계적 진화 "systematic evolution of ligands by exponential enrichment") 방법에 의해 제조된다. 이는 선택된 분자 표적에 압타머를 확인하기 위해 사용되는 반복적 과정이다. 시작을 위해, 헥산 분자의 큰 "라이브러리"가 만들어진다. 선택 단계에서, 중요한 표적을 위한 가장 큰 친화도를 가진 분자는 분리된다. 뉴클레오타이드 서열의 라이브러리는 세포 표면 단백질에 노출되고 일정 시간 동안 배양된다. 표적을 위해 약하거나 친화도이 없는 라이브러리에 있는 분자는 세척되고, 표적-결합 분자 중 가장 높은 친화도 압타머는 표적으로부터 정제되고, SELEX 과정에서 후속하는 단계를 위해 사용된다.

획득되고 정제된 서열은 효소처리로 복제되거나, "증폭"되어 표적에 결합할 수 있는 이들을 위해 실질적으로 강화된 분자의 새로운 라이브러리를 생성한다. 강화된 라이브러리는 선택, 분배 및 증폭의 새로운 순환을 시작하기 위해 사용된다. 완전한 방법의 5-15 순환 후에, 분자의 라이브러리는 독특한 서열의 1015로부터 중요한 세포 표면 단백질에 단단히 결합되는 작은 수로 줄어든다. 혼합물에서 개개 분자는 그 다음에 분리되고, 이들의 뉴클레오티드 서열은 결정되며, 결합 친화도에 대한 이들의 특성은 항체에 대해 실질적으로 측정된다. 종종 압타머는 표적 결합 또는 압타머 구조에 기여하지 않는 임의의 뉴클레오티드를 제거하도록 추가로 정제된다. 이들의 코어 결합영역에 끝이 잘린 압타머는 전형적으로 15 내지 60 뉴클레오티드 길이 범위이다. 두 개의 압타머는 뉴클레오티드 링커에 의해 연결되거나 화학적으로 가교되어 이중특성 압타머를 형성할 수 있거나, 단일 압타머가 항체 또는 항체 단편에 유사하게 연결되어 키메라 항체-DNA 분자를 형성할 수 있다.

화학적 가교에 의한 이특이성 BA의 제조

이특이성 차단제의 두 개의 결합 분자, 예를 들어 이특이성 항체는 헤르만손, 수프라(Hermanson, supra)에서 기재된 것과 같은 당업자에 공지된 통상적인 접합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 몇몇 구체예에서, bsBA의 두 개의 결합 분자는 화학적 결합을 사용하여 연결된다. 화학적 결합을 사용하여 제조된 종래 이특이성 항체의 하나의 예는 문헌[Brennan et al., (Science, 229: 81 (1985))]에 기재되어 있고, 본 발명의 bsBA를 제조하기 위해 또한 사용될 수 있다. 완전한 항체는 단백질 분해효소에 의해 갈라져 F(ab')₂ 단편을 생성한다. 이 단편들은 디티올 복합 작용제 소듐 아비산염의 존재에서 감소되어 인근 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화물 형성을 막는다. 생성된 Fab' 단편은 그 다음에 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 그 다음에 Fab'-티올으로 머갑토에틸아민의 감소에 의해 재전환되고, 다른 Fab'-TNB 유도체의 같은 몰 양으로 혼합되어 이특이성 항체를 형성한다. 생산된 이특이성 항체는 효소의 선택적 고정를 위해 작용제로서 사용될 수 있다.

또 다른 바람직한 화학적 결합은 가교를 위해 비스-말레이미도헥산 또는 비-말레이미도에탄을 사용한다. 가교를 위해 -SH를 함유하는 항체 단편은 또한 재조합(예를 들어 Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))에 의해 제조되어 완전한 길이의 항체의 단백질 분해효소에 의한 절단을 피할 수 있다.

재조합 또는 합성 기술에 의한 bsBA 의 제조

bsBA는 재조합 기술에 의해 또한 제조될 수 있다. bsBA를 암호화하는 헥산 서열은 예를 들어, 적당한 서열의 클로닝 또는 [Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979)]의 포스포트리에스터 방법; [Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979)]의 포스포디에스터 방법; [Beaucage, et al., 테트라. Lett. 22:1859-1862 (1981)]의 디에틸포스포라미디트 방법; 예를 들어, [Needham-VanDevanter, et al. Nucl. Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에서 기재된 자동 합성기를 사용하여, [described by Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859-1862 (1981)]에 의해 기술된 고체 상 포스포라미디트 트리에스터 방법; 및 미국 특허 제 4,458,066호의 고체 지지 방법과 같은 방법에 의한 직접 화학적 합성에 의한 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 화학적 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드을 생산한다. 이는 상보적 서열로 하이브리드 형성에 의해 또는 DNA 중합효소로 중합반응에 의해 주형으로서 단일 가닥을 사용하여 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 기술 중 하나는 DNA의 화학적 합성이 약 100개의 염기 서열로 제한되는 동안, 더 긴 서열은 더 짧은 서열의 연결에 의해 얻어질 수 있다.

바람직한 구체예에서, bsBA를 암호화하는 헥산 서열은 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 적당한 클로닝 및 서열분석 기술의 예, 및 많은 클로닝 실시를 통해 당업자를 가리키기에 충분한 지도는 Sambrook, et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Berger and Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego CA (1987), 또는 Ausubel, et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and John Wiley & Sons, Inc., (1987, 1995 Supplement) (Ausubel))에서 발견된다. 생물학적 시약 및 실험 장치의 제조자로부터의 생성물 정보는 또한 유용한 정보를 제공한다. 이러한 제조자는 시그마 케미칼 컴페니(SIGMA chemical company)(Saint Louis, MO), R&D systems (Minneapolis, MN), 파마시아 아메르샴(Pharmacia Amersham)(Piscataway, NJ), 크론테크 라보라토리스 인크(CLONTECH Laboratories, Inc.)(Palo Alto, CA), 켐 젠 코프(Chem Genes Corp.), 알드리치 케미칼 컴페니(Aldrich Chemical Company)(Milwaukee, WI), 글렌 리서치 인크(Glen Research, Inc.), 지브코 BRL 라이프 테크놀로지 인크(GIBCO BRL Life Technologies, Inc.)(Gaithersburg, MD), 훌루카 케미카-바이오케미타 아날리티카(Fluka Chemica-Biochemika Analytika)(Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), 인비트로젠(Invitrogen)(San Diego, CA), 및 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)(Foster City, CA)뿐만 아니라 당 분야에 알려진 많은 다른 상업적 공급원을 포함한다.

bsBA를 암호화하는 핵산이 클로닝된 경우, 하나는 박테리아, 식물, 이스트, 곤충 및 포유류 세포와 같은 재조합되는 조작된 세포에서 요구되는 단백질을 발현할 수 있다. 당업자 E. coli, 다른 박테리아 숙주, 이스트 및 다양한 고등 진핵세포 예를 들어 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 포함하는 단백질의 발현에 유용한 많은 발현 시스템에서 인식될 수 있음이 기대된다. 원핵생물 또는 진핵생물에서 단백질의 발현을 위해 알려진 다양한 방법을 상세히 설명하는 시도는 없을 것이다.

당업자는 bsBA를 암호화하는 헥산에 변경이 이의 생물학적 활성을 감소시킴 없이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 표적하는 분자의 융합 단백질로의 클로닝, 발현, 또는 합체를 가속화하기 위해 몇몇의 변경은 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 당업자에 잘 알려져 있고, 예를 들어 말단 코돈, 개시 부위를 제공하기 위해 아미노 말단에 첨가된 메티오닌 및 편의적으로 위치된 제한 부위를 만들기 위해 말단에 놓은 추가적 아미노산을 포함한다.

재조합 방법 이외에, bsBA는 또한 표준 펩티드 합성을 사용한 전체 또는 부분으로 만들어질 수 있다. 길이에서 약 50 아미노 산 미만의 본 발명의 폴리펩타이드의 고체 상 합성은 C-말단 아미노산의 서열을 불용성 지지체에 부착하고 그 뒤에 서열에서 남아있는 아미노산의 순차적 첨가에 의해 달성될 수 있다. 고체 상 합성을 위한 기술은 Barany & Merrifield, The Peptidess: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), 및 Stewart, et al., Solid Phase 펩티드 Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984)에 기재되어 있다. 더 큰 길이의 단백질은 아미노과 더 짧은 단편의 카르복실 말단의 축합에 의해 합성될 수 있다. (예를 들어 커플링 시약 N,N'- 디사이사이클로헥실카르보디이미드의 사용에 의해) 카르복실 말단의 활성화에 의한 펩티드 결합의 방법은 당업자에 알려져 있다.

발현되는 경우, 재조합 bsBA는 암모늄 설페이드 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피 등(일반적으로 [R. Scopes, Protein Purification, Springer- Verlag, N. Y. (1982)]에서 참조됨)을 포함하여 당 분야의 표준 과정에 따라 정제될 수 있다. 약제학적 용도를 위해 균질성이 약 90 내지 95% 이상인 실질적으로 순수한 조성물은 바람직하고, 98 내지 99% 또는 그 이상의 균질성은 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 요망되는 경우 균질성으로 정제된 경우, 치료적으로 사용된다면, 폴리펩타이드는 내독소가 실질적으로 없어야 한다.

E.coli와 같은 박테리아로부터 단일 사슬 항체의 발현 및/또는 단일 사슬 항체를 포함하는 적당한 활성 형태로의 리폴딩을 위한 방법은 기재되어 있고 본 발명의 bsBA에, 특히 항체를 사용하는 것들에 적용가능하다. 모두 본원에 참조로서 통합되는 [Buchner, et al., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989) 및 Ward, et al., Nature 341:544 (1989)]가 참조된다.

종종, E.coli 또는 다른 박테리아로부터 기능적 이종 단백질은 봉입체로부터 분리되고 강력한 변성제를 사용한 용해화 및 후속 리폴딩을 요구한다. 용해화 단계 중, 당 분야에 잘 알려진 바와 같이, 환원제는 이황화 결합을 분리하도록 존재해야 한다. 환원제를 가진 예시적인 완충액은 0.1 M Tris pH 8, 6 M 구아니딘, 2 mM EDTA, 0.3 M DTE (디티오에리트리톨)이다. 이황화 결합의 재산화는 낮은 분자량 티올 시약의 존재에서 환원 및 산화된 형태로 발생할 수 있고, 이는 본원에 참조로서 통합된 [Saxena, et al., Biochemistry 9: 5015-5021 (1970)]에 기재된 바와 같고 특히 [Buchner, et al., supra]에 기재된 바와 같다.

재생은 전형적으로 변성되고 환원된 단백질의 리폴딩 완충액으로의 희석(예를 들어 100배)에 의해 달성된다. 예시적인 완충액은 0.1 M Tris, pH 8.0, 0.5 M 1-아르기닌, 8 mM 산화 글루타티온(GSSG), 및 2 mM EDTA이다.

두 개의 사슬 항체 정제 프로토콜의 변경과 같이, 무거운 및 경쇄 영역은 분리되어 용해되고 환원되고 그 다음에 리폴딩 용액에서 결합된다. 바람직한 수율은 이 두 개의 단백질이 다른 것에 대해 하나의 단백질의 5배 몰 초과량을 넘지않는 몰 비로 혼합되는 때 달성된다. 레독스-셔플링이 끝난 후에 초과 산화된 글루타티온 또는 다른 산화 낮은 분자량 화합물을 리폴딩 용액에 첨가하는 것이 바람직하다.

bsBA-기반 치료적 용도

본 발명은 본 발명의 bsBA를 동물, 바람직하게는 포유류, 및 가장 바람직하게는 인간 환자에 하나 이상의 기재된 질병 또는 장애를 치료하기 위해 투여하는 것을 포함하는 bsBA-기재된 치료를 추가로 가리킨다. 본 발명의 치료적 화합물은 제한되지 않지만 본 발명의 bsBA를 포함한다. 본 발명의 bsBA는 세포 표면 수용체의 이상 발현 및/또는 활동에 관련된 것으로 본원에 기재된 질병 및 장애를 치료, 억제, 또는 방지하기 위해 사용될 수 있다. 세포 표면 수용체의 이상 발현 및/또는 활동에 관련된 질병 및 장애의 치료 및/또는 방지는 비제한적으로 이러한 질병 및 장애에 관련된 징후를 줄이는 것을 포함한다. 본 발명의 bsBA는 본원에 기재된 바와 같은 또는 당 분야에 알려진 바와 같은 약제학적으로 허용되는 조성물에서 제공될 수 있다. 본원에서 제공된 내용을 갖춘 당업자는 과도한 실험 없이 진단, 감독, 또는 치료적 목적을 위한 본 발명의 bsBA를 사용하는 방법을 알 것이다.

본 발명의 bsBA는 단독으로 또는 다른 형태의 치료제(예를 들어, 방사선 치료. 화학요법, 호르몬 치료, 면역치료 및 항종양 작용제)와 조합되어 투여될수 있다.

bsBA-기반 치료/예방 조성물 및 이의 투여

본 발명은 본 발명의 bsBA의 유효량의 피검체, 바람직하게는 본 발명의 이특이성 항체에 투여함에 의해 치료, 억제, 및 예방의 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, bsBA는 (예를 들어 이의 효과를 제한하거나 바라지 않는 부작용을 만드는 물질이 없게) 실질적으로 정제된다. 피검체는 바람직하게는 본 발명은 제한되지 않고 소, 돼지, 말, 닭, 고양이 및 개와 같은 동물을 포함하는 동물이며, 바람직하게는 포유류, 및 가장 바람직하게는 인간이다.

여러가지 운반 시스템, 예를 들어, 리포좀 내 피낭, 마이크로입자, 마이크로캡슐, bsBA의 발현이 가능한 재조합 세포, 수용체-매개 엔도시토시스(예를 들어, [Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987] 참조됨), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 부분으로서 헥산의 구조물 등은 공지되어 있고 본 발명의 bsBA를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입의 방법은 제한되지는 않지만 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강내, 경막외, 및 구강 방법을 포함한다. bsBA는 편의적 방법, 예를 들어 융합 또는 덩어리 주입에 의해, 상피 또는 점막 피부 내층을 통한 흡수(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 창자 점막 등)에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 전신 또는 국부에 투여될 수 있다. 추가로, 뇌실내 및 경막내 주입을 포함하는 적합한 경로에 의해 본 발명의 bsBA를 중추 신경계에 도입하는 것이 바람직할 수 있고; 뇌실내 주입은 예를 들어 옴마야(Ommaya) 저장소와 같은 저장소에 붙어있는 뇌실내 카테터(catheter)에 의해 촉진될 수 있다. 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸제의 제형의 이용에 의해 폐의 투여는 또한 이용될 수 있다.

특이적 구체예에서, 국부적으로 치료에 필요한 부위에 본 발명의 bsBA를 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 예를 들어 제한되지 않고, 수술 중 국부 주입, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국부적인 적용에 의해, 주입에 의해, 카테터를 통해, 좌약을 통해 또는 이식물을 통해 달성될 수 있고, 상기 이식물은 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴 물질, 예를 들어 시알라스틱(sialastic) 막과 같은 막, 또는 섬유이다. 바람직하게는 본 발명의 bsBA, 예를 들어 항체가 투여되는 경우에, bsBA가 흡수되지 않는 물질에 주의를 기울여야 한다.

또 다른 구체예에서, bsBA는 소낭(vesicle), 특히 리포좀으로 달성될 수 있다([Langer, Science 249:1527-1533, 1990; 및 Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365, 1989]가 참조됨).

또 다른 구체예에서, bsBA는 조절된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 하나의 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다([Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al, N. Engl. J. Med. 321:574, 1989]가 참조됨). 또 다른 구체예에서, 중합 물질이 사용될 수 있다([Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, N. Y. (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105]가 참조됨). 또 다른 구체예에서, 조절된 방출 시스템은 치료 표적의 인근, 예를 들어, 뇌, 폐, 신장, 간, 난소, 정소, 콜론, 췌장, 유방, 및 피부와 같은 신체의 감염된 기관에 배치될 수 있고, 따라서 전신 투여량의 소량만을 요구한다([Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]가 참조됨)

본 발명은 또한 약제학적 조성물에 제공된 bsBA를 제공한다. 이러한 조성물은 약제학적 유효양의 bsBA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 구체예에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 안에 의해 승인되었거나 동물 및 더욱 특별하게는 인간에 사용을 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 목록되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료적으로 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 운반체를 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 살균한 액체, 예를 들어 물 및 오일, 예를 들어 석유, 동물, 식물 또는 합성 원인의 것들, 예를 들어 피넛유, 소이빈유, 미네날 유, 참깨유 등일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥 내에 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 살린 용액 및 텍스트로즈 수용액 및 글리세롤 용액은 또한 용액 담체, 특별하게는 주입가능한 용액을 위해 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코즈, 락토오즈, 수크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 젤, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탤크, 염화나트륨, 건조된 스킴 우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 전통적인 바인터 및 담체 예를 들어 트리글리세리드를 가진 좌약으로서 조제될 수 있다. 구강 제형은 약제학적 등급의 맨니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 마그네슘 카르보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," A.R. Gennaro, ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (20th Ed., 2003)에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 바람직하게는 정제된 형태로, 적합한 양의 담체와 함께, 환자에게 적당한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 치료적 유효양의 화합물을 포함할 것이다. 제형은 투여의 방법에 적합해야 한다.

바람직한 구체예에서, 조성물은 통상적 절차에 따라 인간의 정맥 내 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 조제된다. 전형적으로는 정맥 내 투여를 위한 조성물은 살균된 등장 수성 완충액 내 용액이다. 필요한 곳에, 조성물은 또한 용해제 및 주입 부위에 고통을 덜기 위해 국부 마취제 예를 들어 리그노카이네를 포함할 수 있다. 일반적으로는, 성분은 분리되거나 단위 용약 형태로 함께, 동결 건조 분말 또는 물이 없는 농축물로서, 완전히 밀동된 용기 예를 들어 활성제의 양을 가리키는 사케트 또는 앰플 내에서 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 곳에서, 살균된 약제학적 등급 물 또는 염수를 포함하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 곳에서, 주입을 위한 살균된 물 또는 염수의 앰플은 제공되어 성분은 주입 전에 혼합될 수 있다.

bsBA가 약제학적 조성물로 제형되는 경우에, 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 얻어진 것을과 같은 음이온으로 형성된 그리고 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 또는 프로카인으로부터 얻어진 것들과 같은 양이온으로 형성된 것들을 포함한다.

세포 표면 수용체의 이상 발현 및/또는 활동과 관련된 질병 또는 장애의 치료, 억제 및 예방에 효과적일 본 발명의 bsBA의 양은 표준 임상적 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관 내 검사는 선택적으로 최적 용량 범위를 확인을 돕기 위해 사용될 수 있다. 제형에 사용될 정밀한 용량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 장애의 심각도에 의존할 것이고, 종사자 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어 한다. 효과적인 양은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 얻어지는 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

bsBA를 위해, 환자에 투여되는 용량은 전형적으로 환자 몸무게의 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 바람직하게는, 환장 투여되는 용량은 환자 몸무게의 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 더욱 바람직하게는 환자 몸무게의 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로는 인간 항체는 이질 폴리펩타이드에 면역 반응 때문에 다른 종으로부터의 항체보다 인간 신체 내 더 긴 반감기를 가진다. 따라서, 인간 항체로부터 얻어지는 bsBA는 더 작은 용양으로 더 적은 빈도수의 투여로 투여될 수 있다. 더구나, 본 발명의 bsBA의 투여 용량 및 빈도수는 예를 들어 지질화(lipidation)와 같은 변경에 의해 흡수 및 항체의 조직 투과를 높임에 의해 줄어들 수 있다.

키트

본 발명은 추가로 생체 내 또는 생물학적 샘플에 표적 분자를 발현하거나 과발현하는 세포를 감지하는데 사용하기 위한 키트를 포함한다. 몇몇 바람직한 구체예에서, 키트는 이특이성 scFv 항체에 의해 표적화된 bsBA를 포함한다. 용도에 따라, 항체는 본원에서 설명된 바화 같이 이펙터(예를 들어, 방사성 부분, 리포좀, 사이토톡신, 또 다른 항체 등)에 커플링되도록 링커 또는 킬레이터 또는 둘 모두에 의해 작용기화될 수 있다. 키트는 선택적으로 bsBA를 검출하기 위해 사용되도록 완충액 및 조성물을 추가로 포함한다.

키트는 또한 예를 들어 암세포를 감지하기 위한 항체의 사용을 교시하고/거나 항체를 작용기화 시약과 조합하는 것을 교시하거나 영상화 및/또는 치료적 적용을 위해 작용기화된 항체를 사용할 것을 교시하는 설명 자료(instructional material)를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, bsBA는 링커 및/또는 킬레이터로 작용기화된 상태로 (하나의 용기에 존재함) 하나 이상의 이펙터, 예를 들어 사이톡신, 방사성 표지 (제 2 용기에 존재함)과 함께 제공되어 두 개의 성분이 개별적으로 (예를 들어 사전표적화(pre-targeting) 방법으로) 투여될 수 있거나 두 개의 성분이 사용 직전에 투여될 수 있다.

특정 설명 자료는 권고된 투여 요법, 카운터 적응증(counter indication) 등을 제공할 것이다. 설명 자료는 전형적으로 기재된 또는 인쇄된 자료를 포함하지만, 이러한 설명을 저장하여 최종 사용자에 이들을 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에 의해 고려된다. 이러한 매체는 비제한적으로 전기 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광 매체 (예를 들어, CD ROM) 등 또는 지시를 제공하는 인터넷 주소를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워져 있는 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지시된 형태의 표시가 이러한 용기에 결합될 수 있고, 이러한 표시는 인간 투여를 위한 제조, 용도 또는 판매가 그러한 기관에 의해 승인되었음을 반영한다.

실시예

실시예 1

디아바디 및 (scFv)₂

디아바디의 생산은 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))]에 기재되어 있다. 디아바디는 항체 단편으로부터, 일반적으로는 두 개의 scFv로부터, 너무 짧아서 같은 사슬상의 두 개의 영역 사이에 쌍을 이룰 수 없는 링커를 사용함에 의해 만들어지며; 도메인들은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 두 개의 항원 결합 부위를 생성시키도록 된다. 대안적으로, 두 개의 scFv는 두 개의 분자를 공유결합시키는 유전적으로 암호화된 링커에 의해 연결되어, 이가 항체인 (ScFv)₂ 를 형성할 수 있다.

실시예 2

다른 형태의 "이합체화 도메인"은 두 개의 항체 단편을 이질이합체화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 유적적으로 이특이성/이가 디아바디를 IgG의 CH(3) 영역의 N-말단에 힌지 영역을 통해 융함함에 의해(Lu et al. J Immunol Methods. 279(l-2):219-32 (2003)), "디-디아바디"로 명명되는 구조물을 만들었다. 그 결과는 힌지 영역과 CH(3) 영역 사이의 이합체화로부터 초래되는 4가 디아바디 이량체 이다.

항체의 천연 CH1 영역은 또한 두 개의 항체 단편을 단일-사슬 Fv(scFV)를 상이한 항원-결합 특이성의 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 유전적으로 융함합에 의해 이질이합체화하기 위해 사용될 수 있다(Lu et al. Immunol Methods. 267(2):213-26 (2002)). IgG 중쇄과 경쇄 사이의 자연 이합체화 메카니즘은 또한 사용될 수 있다. 상이한 특이성의 두 개의 단일-사슬 Fv(scFv)은 인간 카파 사슬(C(L))의 불변 영역 및 인간의 중쇄(C(H1))의 첫 번째 불변 영역에 융합되어, 두 개의 폴리펩타이드, (scFv)(l)-C(L) 및 (scFv)(2)-C(Hl)-C(H2)-C(H3) 각각을 형성할 수 있다. 포유 동물 세포에 있는 두 개의 폴리펩타이드의 공동 발현은 이중 특이성을 가진 공유 결합된 IgG-유사 헤테로-사량체, Bs(scFv)(4)-IgG의 형성을 야기한다([Zuo et al. Protein Eng. 13 (5) :361-7 (2000), Lu et al. J. Biol Chem. 23;279(4):2856-65 (2004)]).

또한 예를 들어 이들이 두 개의 상이한 Fab' 단편에 개별적으로 융합되는 경우에 이특이성 F(ab')2의 형성을 매개할 수 있는 이질이합체-형성 류신 지퍼(zippers)인 포스 앤 준(Fos and Jun)을 사용하여, 이합체화 도메인에서 비공유 상호작용을 통해 두 개의 항체 단편의 이질이합체 형성이 이루어질 수 있다([Tso et al J Hematother. 4(5):389-94 (1995)]).

실시예 3 적합한 표적 및 이펙터 마커의 결정

적합한 표적 마커는 표적 조직에 과발현되는 표적 분자를 확인하기 위해 표적 및 비 표적 조직의 mRNA 프로파일링(profiling)에 의한, 또는 단백질 발현 수준의 비교 및 질량 측정법에 의한 후속적 확인을 위한 표적 및 비표적 세포의 2D 전기영동법과 같은 프로테오믹(proteomic) 방법에 의한 것과 같은 많은 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, mRNA 프로파일링은 전형적으로 아피메트릭스 마이크로어레이(Affymetrix microarray)를 사용하고 표적 및 비 표적 조직(예를 들어 종양 및 인접한 정상 조직)으로부터 제조된 cRNA를 비교함에 의해 [Cao et al (BMC Genomics. 27;5(1):26 (2004))]에서 기재된 바와 같이 수행된다.

프로테오믹 방법에서, 표적 및 비표적 세포는 전형적으로 분해되거나 균질화되고 그 다음에 2 차원 전기영동법을 받게 된다. 단백질은 그 다음에 젤에 고정되고 시각화를 위해 착색된다. 표적 및 비표적 세포로부터 젤의 영상 분석은 차별적으로 발현된 단백질 점을 드러낸다. 이 점들은 그 다음에 단백질 점의 절개, 젤 내 트립신 소화, 및 질량 분광광도계에 의한 분석에 의해 확인될 수 있다. 과정은 예를 들어, [Van Greevenbroek et al. 45, 1148-1154 (2004)]에 기재되어 있다.

적합한 이펙터 마커는 수용체를 잠정 인산화 부위로 확인함에 의한 것과 같은 많은 방법으로 확인될 수 있다. 단백질 또는 DNA 서열은 젠뱅크(GenBank) 또는 다른 공공 데이터베이스로부터 얻어질 수 있고 잠재적 인산화 부위는 공중에 이용가능한 검색 엔진, 예를 들어 스캔사이트(ScanSite)("http://"를 입력하고 후속하여 "scansite.mit.edu/"를 입력함에 의한 온라인) 또는 네트포스(NetPhos)("www"를 입력하고 후속하여 "cbs.dtu.dk/services/NetPhos/"를 입력함에 의한 웹)에 의해 예상될 수 있다. 인산화 부위를 가진 수용체는 이들이 종종 신호전달에 관여하기 때문에 좋은 이펙터 마커일 가능성이 더 많다. 대안적으로는, 적합한 이펙터 마커는 세포에 있는 마커에 대한 항체와 표적 세포를 접촉시킨 후 상기 기재된 바와 같이 요망되는 생물학적 활성을 위해 검정함에 의해 확인될 수 있다.

실시예 4: 1가 및 2가 결합 도메인의 테스트

결합 도메인의 또는 이특이성 결합 분자의 1가 친화도를 테스트하기 위해, bsBA는 상기와 같이 생산된다. 표면 플라스몬 공명에 의한 결합 운동을 측정하기 위해, 바이오센서 칩은 제조자(BIAcore)의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)을 사용하여 수용체의 공유 커플링을 위해 활성화될 수 있다. 마커는 그 다음에 예를 들어 10 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.5)에 주입에 의해 커플링되어 고정된 물질의 이상적으로 400 공명 단위(RU) 미만의 신호를 얻는다. 속도론 측정을 위해, 일가 또는 이특이성 결합 도메인의 2배 연속 희석액은 항원 칩 위에 PBS/Tween 완충액(포스페이트 완충 염수 내 0.05% Tween-20)으로 25℃에서 20μl/분의 흐름 속도를 사용하여 주입하였다. 그 다음에 해리 데이터는 k_off를 얻기에 하나의 부위 모델에 적합하고 위-일차 속도 상수(ks)는 각 연합 곡선으로 계산될 수 있고, k_on +/- s.e를 얻기 위해 단백질 농도의 함수로서 플롯된다. 평형 해리 상수인 Kd는 그 다음에 SPR 측정치로부터 k_off/k_on로 계산될 수 있다. 실험적 인공물의 부재, 예를 들어 해리된 bsBA의 재결합은 다양한 밀도, 예를 들어, 100, 200, 및 400 RU의 여러 표면에 대해 상기 측정을 수행함으로써 결정되어야 한다.

대안적으로는, 이들의 친화도는 또한 예를 들어, [Nielsen et al. (Cancer Res. 60(22):6434-40 (2000)]에 기재된 바와 같이 흐름 세포측정에 의해 결정될 수 있다.

실시예 5: 세포내 이펙터 기능 측정

결합 도메인의 이펙터 기능은 배양물에서 성장된 표적 세포를 예를 들어 30분 동안 다양한 농도의 이펙터 결합 도메인과 접촉시킴에 의해 결정할 수 있다. 이 시점에서, 세포는 몇몇 경우에 외인성 성장 인자로 자극되어 분자가 변경하고자 하는 생물학적 효과를 촉진한다. 6- 또는 12-웰 조직 배양 플레이트에서 성장된, 처리된 세포의 추출물은 세포를 얼음 위 용해(lysis) 완충액(20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA3 1% Triton X-100, 0.5% NP40, 10 mM β-글리세롤포스페이트, 10 mM NaF, 단백질분해효소 억제제 함유 1 mM Na3VO4 (1 mM PMSF, 1 μg/mL Leupeptin, 1 μg/mL Pepstatin)에서 27G 니들을 통해 5번 지나가게 함에 의해 제조된다. 용해 전에, 세포는 차가운 PBS에서 2회 세척된다. 용해물은 그 다음에 예를 들어 인(phospho)-특이적 항체에 의한 면역블롯(immunoblotting)에 의해 분석된다: 총 세포 단백질 추출물(50 μg의 총 단백질/레인(lane))은 7.5% SDS-PAGE 프리캐스트(precast) 젤(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 전기영동에 의해 분석되고, 니트로셀룰로즈(nitrocellulose) 필터로 이동되고, 마커 또는 다운스트림 관련 단백질의 활성화를 검출하는 항체와 인큐베이션된다. 대안적으로는, 용해물은 [Nielsen et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 100(16):9330-5 (2003)]에 기재된 바와 같이 항체 마이크로어레이에 의해 분석될 수 있다.

결합 도메인의 이펙터 기능은 또한 요망되는 생물학적 기능, 예를 들어 세포 증식 검정의 다른 판독치에 의해 결정될 수 있다. 표적 세포는 DMEM 및 5% FCS를 함유하고 결합 도메인의 농도가 변하는 96-웰 접시에서 웰 당 5 x 10³로 시딩될 수 있다. 72시간 후에, 세포가 용해되고 ATP의 양은 제조자의 프로토콜에 따라 셀티터-글로(CellTiter-Glo) 발광성(Luminescent) 세포 생존능 검사(Promega, Madison, WI)에 의해 결정될 수 있다.

인산화 및 증식 검정의 결과는 하기 공식에 맞추어 이펙터 및 표적화 도메인에 대해 결정된 IC₅₀ 및 농도의 로그의 함수로서 억제의 정도와 함께 플롯될 수 있다

bsBA 의 테스트

수용체에 의해 매개되는 세포 신호전달을 막거나, 줄이거나, 억제하는 능력을 위한 bsBA의 효과를 시험하기 위해 A431 (에스트로겐 의존 유방암세포주, 생물 공학 정보를 위한 국제 센터의 어세션 GDS 121(National Center for Biotechnology Information Accession GDS 121))과 같은 암세포 ErbB를 성장 인자(예를 들어, 헤레굴린(heregulin) 또는 EGF)로 세포를 2시간 이하의 시간 동안 자극하기 전 30분 동안 다양한 농도에서 bsBA와 인큐베이션한다. 세포는 그 다음에 트리톤 완충액에서 용해되고 후속하여 초음파처리된다. 용해질은 그 다음에 면역 블롯팅(immunoblotting) 또는 단백질의 인산화에 민감한 항체 마이크로분석을 사용함에 의해 인산화에 변화를 위해 분석된다(예를 들어, [Nielsen et al., 2003, PNAS 100:9330]가 참조됨).

예를 들어, 본 발명자들의 계산 모델은 1 nM의 친화도를 가지며 세포 당 백만개의 카피수로 발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 표적화 도메인 및 1 μM 친화도를 가지는 ErbB3에 결합하는 (그래서 헤레굴린 결합을 위해 경쟁하는) 이펙터 도메인을 가지는 bsBA는 둘 모두가 1 nM 친화도로 결합하는 표적화 도메인 및 이펙터 도메인을 가지는 bsBA 만큼 효과적(IC₅₀에 의해 측정하여)일 것이다.

bsBA는 적절한 항원을 발현하는 암의 성장의 억제를 위해 사용될 수 있다. bsBA의 효과는 작은 분자 약물을 bsBA에 컨쥬게이션시킴에 의해 증진될 수 있다. 약물은 예를 들어 표준 세포독성 작용제, 예를 들어 화학요법, 또는 티로신 키나아제 억제제, 예를 들어 글리벡(Gleevec)® (이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate))일 수 있다.

실시예 7: ErbB BsBA

A431 세포에서 헤레굴린(HRG)-유발 ERK 및 AKT 활성화의 컴퓨터 시뮬레이션은 bsBA의 ErbB 수용체 결합 분자 중 하나가 나머지 ErbB 결합 분자가 이의 수용체에 대해 가지는 것보다 이의 수용체에 대해 더 낮은 친화도를 가진다면 ErbB bsBA가 가장 효율적임을 보여준다.

본 발명의 bsBA의 저친화도 결합 분자가 ErbB3 또는 ErbB4에 대해 유도되고 bsBA의 고친화도 결합 분자가 또 다른 ErbB 수용체(예를 들어, ErbBl 또는 ErbB2)에 대해 유도되는 경우, bsBA는 ErbB 수용체에 의해 매개된 세포 신호전달을, ErbB3 또는 ErbB4를 ErbB3 또는 ErbB4 수용체, bsBA, 및 ErbBl 또는 ErbB2 수용체로 구성되는 삼합체 복합체(다시 말해, ErbB3/4:bsBA:ErbBl/2)로 격리시킴에 의해 (이렇게 믿어짐) 줄이거나 막거나 억제한다.

bsBA의 결합 분자는 또한 ErbB3 및 ErbB4에 대해 유도될 수 있다. 이러한 bsBA는 이러한 ErbB 수용체가 ErbBl 또는 ErbB2와 이합체화하는 것을 억제하는 것으로 여겨진다. 왜냐하면 ErbBl 또는 ErbB2와의 ErbB3 또는 ErbB4의 이합체화가 신호 전달에 필요하기 때문에, bsBA는 이량체의 형성을 차단함에 의해 세포 신호전달을 효율적으로 막거나, 줄이거나 억제한다. 바람직하게는, 이 bsBA의 저친화도 결합 분자는 ErbB3에 결합된다.

bsBA의 결합분자는 이들이 ErbBl 및 ErbB2에 결합되고, 이로써 이 두 개의 수용체를 가교하도록 제조될 수 있다. 이 bsBA는 ErbB3 또는 ErbB4와의 ErbBl 및 ErbB2의 이합체화를 줄이거나 막거나 또는 억제함에 의해 기능하며, 이는 상기 논의된 바와 같이 신호 전달에 필요하다. 바람직하게는, 이 bsBA의 저친화도 결합 분자는 ErbBl에 결합한다.

예시적인 bsBA는 EGFR 또는 ErbB4를 위한 높은 결합 분자와 ErbB3에 결합하는 저친화도 결합 분자를 포함한다. bsBA는 또한 세포독성 또는 화학요법 작용제를 ErbB 수용체를 발현하는 세포에 국한하도록 하기 위해 사용될 수 있다. 이 작용제는 두 개의 결합 분자를 가지며, 이 각각은 상이한 ErbB 수용체에 대해 특이적이고, 세포 독성 또는 화학요법 작용제(예를 들어 사포린(saporin), 안티-인터페론-α, 빈카(vinca) 알카로이드, 린신(ricin) A 사슬, 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 방사능 동위 원소 합텐(hapten))가 bsBA에 컨쥬게이션된다. bsBA는 완전한 길이 항체 또는 항체 단편(예를 들어 F(ab')₂ 또는 (Fv)₂ 이특이성 항체), 디아바디, 또는 두 개의 상이한 결합 분자를 가진 압타머로서 제조될 수 있다.

모델은 수용체의 ErbB 패밀리를 사용하여 테스트된다. EGF 또는 HRG에 의한 ErbB 수용체의 자극은, 신호 캐스케이드 내 여러 수준에서 크로스토크하는, ERK 및 AKT의 인산화를 이끄는 경로의 동시 활성화를 이끈다. 분석의 민감성은 본 발명자들이 모델 입력에서의 불확실성의 상이한 공급원으로 모델 출력의 불확실성을 할당하도록 할 수 있다. 종양 세포가 독특한 수용체 발현 수준에 의해 특징화됨에 따라, 본 발명자들을 HRG가 리간드인 경우에 매우 민감한 표적으로서 ErbB3 및 ErbB4를 확인했다.

일반적으로, bsBA의 결합 분자가 항체 또는 이의 단편인 경우에, 이 결합 분자들은 이들의 해리 상수 또는 결합 및 해리 속도가 쉽게 결정될 수 있기 때문에 생화학적으로 잘 특징화될 수 있다. 마찬가지로, 항체의 활동의 메카니즘은 수학적 모델을 사용하여 쉽게 묘사될 수 있고, 억제제로서 알려진 항체를 사용하는 효과는 인실리코(in silico)에서 테스트될 수 있다. 본 발명자들의 계산 모델을 사용하여, 본 발명자들은 ErbB 세포 신호전달 경로를 차단하기 위해 이특이성 항체(즉, 각 결합 영역이 상이한 ErbB 수용체와 결합하는 두 개의 별개의 결합 분자를 가지는 항체)를 사용하는 개념을 테스트하였다. 인실리코 결과는 하나의 ErbB 수용체에 대한 결합 친화도가 다른 ErbB 수용체에 대한 결합 친화도보다 큰 두개의 상이한 ErbB 수용체에 대한 결합 특이성을 가지는 항체가 ErbB 경로을 통한 세포 신호전달을 차단하거나 막기에 이상적임을 확인한다.

인실리코 방법을 사용하여, 본 발명자들은 단지 하나의 ErbB 수용체를 표적화하는 통상적인 억제제의 능력에 대해 ErbB 수용체(표 1)의 차별적 발현을 나타내는 세 개의 상이한 세포주에서 ErbB 신호전달 경로의 활성화를 차단하거나 막기 위해 두 개의 상이한 ErbB 수용체를 표적화하는 이특이성 항체의 능력을 비교하였다. 각 세포주에서 신호전달 억제는 이특이성 항체 뿐만 아니라 현재의 치료용 단일특이성 항체를 위해 인실리코에서 모델링되었다. 본 발명자들의 모델은 두 개의 상이한 ErbB 수용체에 대한 차별적 친화도를 가지는 이특이성 항체에 의한 세포 신호의 억제가 통상적 단일 수용체 억제제에 의해 매개되는 세포 신호전달의 억제보다 훨씬 높다는 것을 예측하였다. 본 발명자들의 컴퓨터 모델링에 의해 만들어진 데이타는 표 2에서 보여진다. 종양에 존재하는 수용체 비에 따라 고친화도 결합 분자 및 저친화도 결합 분자를 가지는 별개의 bsAB는 두 개의 결합 분자가 같은 결합 친화도를 가지며 이들의 각 항원에 결합하는 이특이성 항체 또는 단일특이적 항체 보다 실질적으로 더 효능있는 억제제임이 예측된다.

표 1: 상이한 세포주상의 ErbB 수용체의 수용체 발현 프로파일

	세포 형태 A	세포 형태 B	세포 형태 C
ErbB 1 ErbB 2 ErbB 3 ErbB 4	XXX XX X -	XX XXX XX XX	X XX X X

표 2: 통상적인 단일특이성 수용체 억제제에 비한 bsBA에 의한 억제

본 발명자들은 모든 자극 조건 하에서 ErbB 경로의 활성화로 인한 세포 신호전달을 차단하기 위한 가장 효과적인 차단제로서 ErbBl (고친화도) 및 ErbB3 또는 ErbB4 (저친화도)에 대한 이특이성 항체를 확인했다. ErbBl-ErbB2 bsAB는 또한 모든 자극 조건 하에서 ErbB 세포 신호전달 차단제로서 꽤 효과적이었다. HRG가 활성제로서 사용되는 경우에, ErbB3-ErbB4 bsAb는 ErbB 경로의 매우 효과적인 차단제이다. 따라서, 바람직한 bsBA는 차단제의 하나 이상의 특징이 (저친화도 결합 분자를 사용하여) ErbB3 또는 ErbB4 수용체를 표적화하는 능력인 차단제이다. 사실, 컴퓨터 모델의 도움으로, 본 발명자들은 ErbB3/4의 강한 신호전달 특성을 확인했다. ErbB3/4를 그들 자신 또는 더욱 전형적인 암 항원 예를 들어 ErbBl 또는 ErbB2에 가교하는 것은 두 개의 수용체의 동시 억제 또는 수용체들의 격리에 의해 ErbB3/4 신호전달을 억제하는 메카니즘을 제공한다.

단일특이성 항체와 같은 통상적인 단일특이성 차단제 보다는 bsBA를 사용하는 것과 관련된 장점 중 하나는 이특이성 차단제가 안정한 삼합체(다시 말해, ErbB 수용체-이특이성 차단제-ErbB 수용체)를 형성한다는 것이다. 따라서, bsBA의 효율은 표 2에서 있는 바와 같이 통상적인 단일 수용체 억제제의 효율 보다 훨씬 높다.

두 개의 상이한 ErbB 수용체에 결합함에 의해, 본 발명의 bsBA는 동일하거나 상이한 ErbB 수용체와의 상호작용으로부터 ErbB 수용체를 격리한다. bsBA는 결합된 ErbB 수용체의 세포 신호전달 활성을 막거나, 줄이거나, 억제하는 매우 안정한 (비가역적) 삼합체 복합체를 형성한다. ErbBl, ErbB2, ErbB3, 또는 ErbB4에 bsBA의 초기 결합 단계는 가역적 단계일 수 있고 남아있는 ErbB 수용체에 대한 두 번째 결합 단계는 매우 안정한 삼합체의 형성을 이끈다. 대안적으로는 ErbBl, ErbB2, ErbB3, 또는 ErbB4에 대한 bsBA의 첫 번째 결합 단계는 비가역적일 수 있고 두 번째 결합 단계가 가역적일 수 있어, 이로써 bsBA가 다수의 상이한 삼합체 복합체를 형성하도록 할 수 있다. ErbB 수용체:bsBA:ErbB 수용체 삼합체의 형성은 세포 신호전달을 유도할 수 없는 복합체를 야기한다. 더욱이, ErbBl, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4를 격리함에 의해, bsBA는 동일하거나 상이한 ErbB 수용체와의 이 ErbB 수용체의 이합체화를 막거나, 줄이거나 억제한다. 바람직하게는, bsBA는 ErbB1 또는 ErbB2에 대해 더 높은 친화도를 가지고 ErbB3 또는 ErbB4에 대한 더 낮은 친화도를 가지는데, 단, bsBA의 하나의 결합 도메인이 ErbB2에 대한 높은 친화도를 가지는 경우, 제 2 결합 도메인은 ErbB3에 결합하지 않는다

bsBA의 두 개의 결합 분자 중 단지 하나가 관계되는 불완전한 bsBA-ErbB 수용체 이량체의 형성은 세포 신호전달을 손상시키는 복합체를 야기하지 않는데; 단지 삼합체 복합체(다시 말해, ErbB 수용체:bsBA:ErbB 수용체)의 형성이 세포 신호를 막는다. 더욱이, 삼합체 형성은 bsBA에 의해 결합되는 두 개의 ErbB 수용체 사이에서는 가능하지 않다.

bsBA의 다른 특성은 HRG와 같은 ErbB 수용체를 위한 천연 리간드와 경쟁함에 의해 세포 신호를 줄이거나 막거나 차단하는 하나의 결합 도메인의 능력을 포함한다.

본 발명자들의 인실리코 데이타는 ErbB3-ErbB4 bsBA가 단일특이성 ErbB3 또는 ErbB4 억제제보다 세포 신호전달을 차단하는데 더욱 효율적임을 증명한다. ErbB3 또는 ErbB4에 대해 단독으로 유도된 단일특이성 억제제는 주로 ErbB3 및 ErbB4의 높은 세포 표면 발현 수준 때문에 ErbB3-ErbB4 bsBA만큼 효과적인 AKT 인산화를 억제하지 않는다. AKT 인산화는 ErbB3 및 ErbB4 단일특이성 억제제 둘 모두가 사용되는 경우에만 억제된다.

bsBA가 결합되지 않은 상태 또는 단지 하나의 ErbB 수용체를 가진 이합체 복합제로서 임의의 억제제 효과를 가지지 않기 때문에, ErbB 수용체가 bsBA로 포화되게 하는 억제제 농도의 증가는 bsBA의 억제 효과를 감소시킨다. 이러한 효과는 ErbB2에 대한 증가된 친화도를 가지는 bsBA를 제공함에 의해 역전될 수 있고, 이로써 bsBA의 결합 친화도는 ErbB4에 대한 것보다 ErbB3에 대해서 더 크다(다시 말해 KdErbB3> ErbB4)).

상기 논의된 bsBA는 HRG 우세 요법에서 특히 효율적이다. 일반적으로 bsBA는 단지 하나의 수용체를 표적화하는 ErbB 수용체 억제제에 비해 훨씬 낮은 용량에서 효율적이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 bsBA의 하나의 결합 분자가 ErbBl (고친화도 결합)를 위한 결합 특이성을 가지고 다른 결합 분자가 ErbB3 또는 ErbB4 (저친화도 결합)를 위한 결합 특이성을 가지는 bsBA이다. 일반적으로, 종양 세포는 높은 양의 ErbB1을 발현하지만(다시 말해, 종종 100,000 수용체/세포보다 높음), ErbB3 및 ErbB4를 위한 수용체 발현은 5,000 내지 20,000 수용체/세포 범위이다. 리간드 결합을 길항하는 bsBA는 수용체 발현 수준이 10배가 넘게 다르지만, 성공적으로 수용체 신호전달을 억제할 것이다.

본 발명자들의 인실리코 분석은 이특이성 ErbBl/ErbB3 및 ErbBl/ErbB4 bsBA의 효과를 확인한다. ErbB3 수용체의 억제는 HRG 우세 요법에서 신호전달을 억제한다.

ErbB 세포 신호전달 경로의 본 발명자들의 인실리코 분석에 기초하여, 본 발명자들은 낮은 해리 상수 KD < 1nM를 지니지만 비가역적이지는 않은 고친화도 결합 부위로서 ErbBl 결합 분자를 확인했다. ErbB3 및 ErbB4 수용체는 ErbBl 수용체보다 훨씬 더 낮은 수준에서 발현된다. 왜냐하면 bsBA는 ErBl 및 ErbB3/ErbB4 수용체 둘 모두에 결합하기 때문에, 그리고 bsBA가 더욱 풍부한 ErbBl 수용체에 대해 더 높은 친화도를 가지기 때문에, bsBA는 통상적인 단일특이성 ErbB 억제제보다 훨씬 낮은 농도에서 ErbB3 또는 ErbB4와의 ErbB의 이합체화에 의해 매개되는 세포 신호전달을 효과적으로 차단할 수 있다. ErbB1에 대한 bsBA의 높은 친화도는 낮은 bsBA 농도에서 높은 효율을 초래한다.

본 발명자들의 방법은 가교를 위한 최적의 수용체 뿐만 아니라 두 개의 결합 분자의 요망되는 친화도를 확인하기 위해 컴퓨터 모델링을 이용한다. bsBA의 두 개의 결합 분자의 차별적 친화도는 효과적으로 암세포에 특이적이지 않은 것으로 여겨지는 ErbB3와 같은 수용체에 bsBA를 표적화한다. ErbBl와 같은 더욱 전형적인 암 항원에 대한 ErbB3의 가교는 암세포를 특이적으로 표적하고 이 세포들 내에서 ErbB3 수용체 활성을 조정하는 수단을 제공한다.

본 발명자들의 컴퓨터 모델을 사용하여, 본 발명자들은 bsBA의 두 개의 결합 분자의 차별적 친화도의 필요성을 확인했다. 차별적 친화도는 bsBA 삼합체 복합체의 안정화를 촉진한다. 일반적으로 말해서, bsBA의 활성 결합 분자는 불활성 또는 더 낮은 활성 결합 분자에 비해 더 낮은 친화도를 가져야 한다. bsBA의 두 결합 분자가 불활성 또는 더 낮은 활성이라면, 더 높게 발현되거나 더 강한 신호전달 수용체를 표적화하는 결합 분자는 더 높은 친화도를 가져야 한다. 표적화된 수용체 중 하나에 대해 차별적 친화도를 가지는 하는 것은 하기 사항을 야기한다: bsBA가 고친화도 상호 작용(예를 들어 ErbB1)의 Kd 보다 높은 농도지만, 저친화도 상호작용(예를 들어 ErbB3)의 Kd 보다 낮은 농도로 투여된다면, bsBA는 고친화도 상호작용을 위한 항원을 발현하는 세포상으로만 축적될 수 있다. bsBA의 다른 말단은 이의 생물학적 기능(예를 들어 다운스트림 신호전달을 막는 ErbB3)를 방해하는 이 세포들상의 저친화도 항원과 상호작용하도록 이용될 수 있다. 어는 수용체가 낮거나 고친화도 상호작용인 지는 수용체의 특이적 신호전달 강도(표적으로서 중요함) 및 bsBA의 작용 모드에 의존한다.

본원에 기재된 실시예 및 구체예는 예시적 목적을 위한 것이고 이의 관점에서 여러 변경 또는 변화는 당업자에게 제안될 것이고 본 출원에 취지 및 범위 내 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되어야함은 이해된다. 본원에 인용된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그대로 참조로서 본원에 통합된다.

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24. 외부 표면에 제 1 및 제 2 표적 항원을 갖는 표적 암 세포의 생물학적 활성을 조정하는 이특이성 결합제(bsBA)로서, 여기서

    (i) 상기 제 1 및 제 2 표적 항원이 공통 리간드를 공유하지 않고,

    (ii) 상기 제 2 표적 항원은 수용체 티로신 키나아제이며,

    (iii) 상기 이특이성 결합제는 제 1 표적 항원에 대해 10^-7M 이하의 해리 상수(Kd)로 제 1 표적 항원에 결합하는 항체인 제 1 결합 도메인 및 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높은 제 2 표적 항원에 대한 Kd로 제 2 표적 항원에 결합하는 항체인 제 2 결합 도메인을 가지고,

    제 1 결합 도메인의 제 1 표적 항원이 ErbB2(HER2)인 경우, 제 2 결합 도메인에 대한 제 2 표적 항원은 ErbB3(HER3)이 아니며,

    여기서 제 1 표적 항원의 제 1 결합 도메인에 대한 결합은 상기 제 1 표적 항원의 생물학적 활성을 조정하지 않지만, 제 2 표적 항원에 대한 제 2 결합 도메인의 결합은 상기 제 2 표적 항원의 생물학적 활성을 조정하고, 상기 생물학적 활성이 표적 세포 증식의 억제 또는 표적 세포의 사멸을 초래하며,

    여기서, 상기 제 1 표적 항원은 암배아 항원(CEA), ErbB2, EGFR, Lewis^Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 및 TAG72로 구성되는 군으로부터 선택되고,

    상기 제 2 표적 항원은 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGFl-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택되는, 이특이성 결합제(bsBA).
25. 제 24 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배를 초과하여 높음을 특징으로 하는 bsBA.
26. 제 24 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 높음을 특징으로 하는 bsBA.
27. 제 24 항에 있어서, 상기 bsBA가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 bsBA.
28. 제 26 항에 있어서, 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 bsBA.
29. 제 24 항에 있어서, 상기 제 1 결합 도메인이 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체에 결합함을 특징으로 하는 bsBA.
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32. 제 24 항에 있어서, 상기 제 1 결합 도메인의 Kd가 10^-8 내지 10^-12 M임을 특징으로 하는 bsBA.
33. 제 24 항에 있어서, 상기 제 1 표적 항원이 정상 세포상에서의 이의 발현에 비해 표적 세포상에서 10배 이상 과발현됨을 특징으로 하는 bsBA.
34. 외부 표면에 제 1 및 제 2 표적 항원을 갖는 표적 암 세포의 생물학적 활성을 조정하는 이특이성 결합제(bsBA)(a) 및 약제학적으로 허용되는 담체(b)의 암 치료용 약제학적 조성물로서, 여기서

    (i) 상기 제 1 및 제 2 표적 항원이 공통 리간드를 공유하지 않고,

    (ii) 상기 제 2 표적 항원은 수용체 티로신 키나아제이며,

    (iii) 상기 이특이성 결합제는 제 1 표적 항원에 대해 10^-7M 이하의 해리 상수(Kd)로 제 1 표적 항원에 결합하는 항체인 제 1 결합 도메인 및 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높은 제 2 표적 항원에 대한 Kd로 제 2 표적 항원에 결합하는 항체인 제 2 결합 도메인을 가지고,

    제 1 결합 도메인의 제 1 표적 항원이 ErbB2(HER2)인 경우, 제 2 결합 도메인에 대한 제 2 표적 항원은 ErbB3(HER3)이 아니며,

    여기서 제 1 표적 항원의 제 1 결합 도메인에 대한 결합은 상기 제 1 표적 항원의 생물학적 활성을 조정하지 않지만, 제 2 표적 항원에 대한 제 2 결합 도메인의 결합은 상기 제 2 표적 항원의 생물학적 활성을 조정하고, 상기 생물학적 활성이 표적 세포 증식의 억제 또는 표적 세포의 사멸을 초래하며,

    여기서, 상기 제 1 표적 항원은 암배아 항원(CEA), ErbB2, EGFR, Lewis^Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 및 TAG72로 구성되는 군으로부터 선택되고,

    상기 제 2 표적 항원은 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGFl-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택되는, 암 치료용 약제학적 조성물.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배를 초과하여 높음을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
36. 제 34 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 높음을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
37. 제 34 항에 있어서, 상기 bsBA가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
38. 제 37 항에 있어서, 상기 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
39. 제 34 항에 있어서, 상기 제 1 결합 도메인이 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체에 결합함을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
40. 삭제
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42. 제 34 항에 있어서, 상기 제 1 표적 항원이 상기 제 2 표적 항원을 또한 지니고 있는 비표적 세포상에서의 발현보다 표적 세포상에서 10배 이상 과발현됨을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
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51. 용기(a), 및 외부 표면에 제 1 및 제 2 표적 항원을 갖는 표적 암 세포의 생물학적 활성을 조정하는 이특이성 결합제(bsBA)(b)를 포함하는 키트로서, 여기서

    (i) 상기 제 1 및 제 2 표적 항원이 공통 리간드를 공유하지 않고,

    (ii) 상기 제 2 표적 항원은 수용체 티로신 키나아제이며,

    (iii) 상기 이특이성 결합제는 제 1 표적 항원에 대해 10^-7M 이하의 해리 상수(Kd)로 제 1 표적 항원에 결합하는 항체인 제 1 결합 도메인 및 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 높은 제 2 표적 항원에 대한 Kd로 제 2 표적 항원에 결합하는 항체인 제 2 결합 도메인을 가지고,

    제 1 결합 도메인의 제 1 표적 항원이 ErbB2(HER2)인 경우, 제 2 결합 도메인에 대한 제 2 표적 항원은 ErbB3(HER3)이 아니며,

    여기서 제 1 표적 항원의 제 1 결합 도메인에 대한 결합은 상기 제 1 표적 항원의 생물학적 활성을 조정하지 않지만, 제 2 표적 항원에 대한 제 2 결합 도메인의 결합은 상기 제 2 표적 항원의 생물학적 활성을 조정하고, 상기 생물학적 활성이 표적 세포 증식의 억제 또는 표적 세포의 사멸을 초래하며,

    여기서, 상기 제 1 표적 항원은 암배아 항원(CEA), ErbB2, EGFR, Lewis^Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 및 TAG72로 구성되는 군으로부터 선택되고,

    상기 제 2 표적 항원은 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGFl-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택되는, 키트.
52. 제 51 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배를 초과하여 높음을 특징으로 하는 키트.
53. 제 51 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 상기 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 높음을 특징으로 하는 키트.
54. 제 51 항에 있어서, 상기 bsBA가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 키트.
55. 제 54 항에 있어서, 상기 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 키트.
56. 제 51 항에 있어서, 상기 제 1 결합 도메인이 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체에 결합함을 특징으로 하는 키트.
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59. 제 51 항에 있어서, 상기 제 1 결합 도메인의 Kd가 10^-8 내지 10^-12 M임을 특징으로 하는 키트.
60. 제 51 항에 있어서, 상기 제 1 표적 항원이 정상 세포상에서의 이의 발현에 비해 표적 세포상에서 10배 이상 과발현됨을 특징으로 하는 키트.