KR101177508B1 - 폐경기 여성건강 예방 및 치료용 칡 추출물 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐경기 여성건강 예방 및 치료용 칡 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 칡 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐경기 여성건강 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 칡 추출물을 난소를 절제하여 폐경기를 유도한 마우스에 투여하는 경우, 칡 추출물을 투여하지 않은 대조군에 비해 혈중 에스트로겐의 농도가 증가하고, 혈중 중성지방 수치 및 복부 지방의 무게가 감소하였으며, 간세포의 파괴를 억제하고, 골밀도의 손실을 억제하며, 유방암의 위험성을 감소하는 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 칡 추출물을 함유하는 폐경기 여성건강 개선용 조성물을 이용한 약학적 조성물 및 건강기능식품의 활용이 기대된다.

Description

폐경기 여성건강 예방 및 치료용 칡 추출물 조성물 {Composition of Pueraris lobata extracts for menopausal symptoms}

본 발명은 폐경기 여성건강 예방 및 치료용 칡 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 칡 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐경기 여성건강 개선용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 여성들은 45세 전?후가 되면 난소 기능의 급격한 저하로 폐경기에 접어들게 되고 인생의 3분의 1 가량을 이러한 폐경 상태로 살아가게 된다. 폐경기가 지속되면 여성호르몬인 에스트로겐의 분비도 감소하게 되고, 이로 인해 골다공증, 고지혈증, 안면홍조, 유방암과 같은 갱년기 증후군들의 발병위험 또한 높아진다 [Setchell KS, Am J Clin Nutr 1998, 68: 1333S-1346S]. 따라서 이러한 갱년기 증후군의 치료와 예방에 중요한 혈중 에스트로겐 농도 및 폐경기 여성 질환 관련 바이오 마커들을 효과적으로 조절할 수 있는 건강기능식품과 의약품에 관한 연구가 많이 수행되고 있다. 천연 식의약 소재 개발은 경제 산업적으로 큰 의의를 가지고 있으며, 특히 인체에 부작용이 없으면서 뼈건강, 고지혈증과 같은 갱년기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 천연 식의약 소재의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 퓨라린(puerarin)은 콩과식물에 존재하는 주요 이소플라본(isoflavone)의 일종으로써, 주로 칡 뿌리(pueraria lobata)에서 많이 발견된다 [Guerra MC, Speroni E, Broccoli M, Cangini M, Pasini P, Minghetti A, Crespi-Perellino N, Mirasoli M, Cantelli-Forti G, Paolini M, Life Sci 2000, 67: 2997-3006]. 퓨라린은 암세포 증식 억제, 항산화, 당뇨, 심장질환 완화 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있어, 예로부터 동양권에서는 약재로 사용되어져 왔다 [Xiong FL, Sun XH, Gan L, Yang XL, Xu HB, Eur J Pharmacol 2006, 529: 1-7]. 퓨라린과 같은 이소플라본 계열인 다이드진(daidzin)이나 제니스틴(genistin)은 갱년기모델 동물실험 및 임상실험에서 골다공증, 고지혈증, 유방암 같은 갱년기 증후군에 효능이 있다고 보고되었다 [Mindy SK, Xia X, Annu Rev Nutr 1997, 17: 353-381].

그러나 지금까지 개발된 호르몬 대체요법(Hormone Replacement Therapy; HRT)은 여러 가지 부작용이 나타날 수 있다. 예컨대, 호르몬 대체요법으로 에스트로겐을 투여하였을 경우, 자궁내막염, 유방암, 담낭질환, 유방압통, 정서변화와 기타 고혈압 또는 혈전 정맥염, 체중증가 등의 위험성을 가지고 있는 것으로 알려지고 있어, 모든 폐경기 여성들에게 호르몬 대체요법을 시행하는 것이 바람직하지 않으며, 일부 폐경기 여성들은 호르몬 대체요법을 꺼리거나 중도포기하기도 한다 [Cornwell T, Cohick W, Raskin I, Phytochem 2004, 65: 995-1016]. 따라서 천연물을 이용한 건강기능식품 및 천연물 신약 형태의 새로운 제품개발에 대한 수요가 크며 항산화활성, 고지혈증 및 골다공증 예방과 같은 각종 생리활성이 있는 이소플라본이 다량 함유된 칡에서 유래한 물질을 대상으로 갱년기 증후군 관련 효능물질을 연구할 필요가 있으나, 이 부분에 대한 연구가 많이 진행되지 않았다. 특히, 현재까지 퓨라린을 주성분으로 하는 조성물의 여성 호르몬 개선 및 갱년기 증후군에 관한 효능은 연구된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 퓨라린 및 다이드진을 함유하는 칡 추출물 조성물을 제조할 수 있으며, 상기 칡 추출물을 폐경기가 유도된 마우스에 투여하는 경우, 혈중 에스트로겐의 농도를 증가, 혈중 중성지방 수치 및 복부 지방의 무게를 감소, 간세포의 파괴 억제, 골밀도의 손실 억제 및 유방암의 위험을 억제할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 갱년기 증후군을 예방하고, 비만 및 고지혈증을 예방하며, 골다공증, 유방암을 예방하는 효과를 갖는 칡 추출물 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 칡 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐경기 여성건강 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 칡 추출물은 상기 추출물은 종래 알려진 어떠한 추출방법으로 추출될 수도 있으며, 예컨대 열수추출법, 메탄올 추출법, 에틸아세테이트 추출법을 이용하여 추출할 수 있으나, 바람직하게는 에탄올 용매로 추출되는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 50 ~ 70 %의 주정을 이용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 칡 분말로부터 얻은 분획을 농축 및 건조하여 추출물을 얻어내었다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 칡 추출물은 5 ~ 10 %의 퓨라린(puerarin) 및 1 ~ 3 %의 다이드진(daidzin)을 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 퓨라린은 암세포 증식억제, 항산화, 당뇨, 심장질환 완화 등에 효과가 있다.

본 발명의 상기 조성물은 혈중 에스트로겐의 농도를 증가시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 난소를 절제하여 폐경기를 유도한 마우스에 본 발명의 칡 추출물을 투여하는 경우, 혈중 에스트로겐(estrogen)의 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 칡 추출물이 체내에서 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)으로 작용하여 에스트로겐 수용체와 결합하여 혈중 에스트로겐의 농도를 조절하는 것으로 사료되며, 각종 갱년기 증후군의 예방 및 완화에 대한 효과를 갖는 물질이라고 판단할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 혈중 중성지방 수치 및 체지방을 감소시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 칡 추출물을 투여한 군에서 상기 추출물을 투여하지 않은 대조군에 비해 혈중 중성지방의 수치가 유의적으로 감소하였으며, 복부 지방 무게 또한 대조군에 비해 감소하는 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 칡 추출물은 고지혈증 및 비만의 예방 및 완화에 효과가 있음을 확인할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 간세포의 파괴를 억제시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 혈중 ALT(Alanine aminotransferase) 및 AST(Aspartate aminotransferase)의 수치를 측정하여 세포 파괴 정도를 알아보았으며, 그 결과 상기 칡 추출물을 투여한 군의 경우 추출물을 투여하지 않은 대조군에 비해 상기 효소들의 수치가 감소함을 확인하였다. 상기 효소들은 간을 구성하는 세포에 들어있는 효소로써, 간세포가 손상되거나 파괴되면 상기 효소들은 세포 내에서 혈액으로 흘러들어간다. 즉 혈중 ALT 및 AST의 수치가 높으면 손상된 세포의 수가 많다는 것을 의미한다. 그러나 본 발명의 칡 추출물의 섭취로 인해 상기 효소들의 수치가 감소하였으므로 본 발명의 칡 추출물은 체내에서 간 기능을 보호할 뿐만 아니라, 세포 파괴를 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 골밀도의 손실을 억제시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서 본 발명의 칡 추출물을 투여한 후, 해면골의 골밀도를 분석하는 경우, 난소를 절제하고 칡 추출물을 투여하지 않은 군은 정상 군에 비해 골밀도가 25 % 감소하였으나, 칡 추출물을 투여한 군들에서는 각각 9 %, 7 %씩 감소하였다. 상기의 분석 결과로 볼 때, 본 발명의 칡 추출물이 갱년기 여성의 골밀도를 억제시킬 수 있으며, 갱년기로 인해 쉽게 유도될 수 있는 골다공증을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.

또한 본 발명의 상기 조성물은 유방암의 위험을 억제시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서 유방암 세포의 증식을 촉진시키는 Aromatase의 발현 및 유방암 치료에 표적이 되는 SULT1E1의 혈중 수치를 측정하여 알아보았다. 그 결과, 본 발명의 칡 추출물의 투여로 인해 Aromatase의 발현이 투여하지 않은 대조군에 비해 감소하였으며, SULT1E1의 혈중 수치는 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 칡 추출물은 에스트로겐의 농도를 향상시키면서 동시에 Aromatase의 발현을 감소시킴으로 유방암을 예방할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 SULT1E1은 sulfotransferase의 일종으로서 체내 에스트로겐의 수치를 조절하는 기능을 한다. 따라서 본 발명의 칡 추출물은 에스트로겐의 농도를 향상시키면서 동시에 SULT1E1의 발현을 증가시킴으로써 혈중 에스트로겐이 고농도로 지속되는 것을 방지함으로 유방암에 대한 위험성이 없는 것으로 사료된다.

본 발명의 상기 조성물이 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 치료용 약제의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 질병의 증상, 투여시간, 투여방법에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.

도 1은 칡 추출물의 성분을 HPLC로 정량한 결과이다.
도 2는 칡 추출물 투여에 따른 혈중 에스트로겐을 측정한 결과이다.
도 3은 칡 추출물 투여에 따른 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방, HDL 및 LDL 수치를 측정한 결과이다.
도 4는 칡 추출물 투여에 따른 간, 자궁, 복부 지방조직의 무게를 측정한 결과이다.
도 5는 칡 추출물 투여에 따른 ALT 및 AST 수치를 측정한 결과이다.
도 6은 칡 추출물 투여에 따른 대퇴부의 미세단층 촬영 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 칡 추출물 투여에 따른 대퇴부의 해면골 골밀도 수치를 측정한 결과이다.
도 8은 칡 추출물 투여에 따른 마우스 간조직의 Aromatase 효소의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 칡 추출물 투여에 따른 마우스 간조직의 SULT1E1 효소의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 칡 추출물의 추출 및 정량 분석

칡(Pueraria lobata) 분말에 4 배 부피의 60 % 에탄올(주정)을 첨가하여 상온에서 24 시간 동안 방치한 후, 이를 25 ℃에서 6,000×g으로 30 분간 원심분리시켜 상등액을 얻어내었다. 상기 상등액을 filter paper(Whatman, Maidstone, UK)를 사용하여 여과한 후, rotary vacuum evaporator(Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 용액의 점도가 20 Brix가 될 때까지 농축하였다. 이후, 농축액을 냉동건조하여 분말형태의 칡 추출물을 수거하였다.

상기 얻어낸 칡 추출물을 정량 분석하였다. 먼저, 건조시킨 칡 추출물 시료에 60 % 주정을 첨가하여 기능성분을 녹인 후, 0.45 μm 필터(Alltech associate Inc. Deerfield, IL, USA)로 여과하여 HPLC(Waters Associated, Milford, MA, USA)를 이용하여 기능성분을 분석하였다. HPLC 측정시, 여과시킨 최종 시료 20 μm을 HPLC injector에 주사하였으며, 컬럼으로 Phebomenex Security Guard C₁₈(4×3.0mm I.D) guard column과 4mm Novakpak C₁₈(150×3.99mm I.D) column을 사용하였으며, 이동상(mobile phase)는 0.1 %(v/v) formic acid(A)와 100 % acetonitrile(B)를 1.0 ml/min의 유속으로 적용하였다. 컬럼의 gradient는 이동상에 사용된 용매 A를 0 ~ 10 분까지 90 %로, 10 ~ 15 분까지 75 %, 15 ~ 20 분까지 50 %로 감소시켰고, 20 ~ 28 분까지는 90 %로 증가시킨 후 정치시켜 컬럼을 재평형 시켰다. 컬럼으로부터 용출된 물질은 254 nm에서 검출하여 기능성분을 동정 및 정량하였다. 정량 분석 결과는 도 1 및 하기 표 1에 나타내었다.

도 1 및 표 1에 나타낸 것과 같이, 칡 추출물의 기능성분은 전체 함량 중 퓨라린 7.5 %, 다이드진 2.5 %가 함유되어 있는 것으로 나타났다. 그 밖에 1 %의 포도당, 2 %의 맥아당을 함유하고 있는 것으로 분석되었으며, 나머지 87 %는 전분, 올리고당, 섬유질이 포함되어 있었다.

[표 1. 칡 추출물의 기능성분]

실시예 2. 실험동물의 사육

본 발명에서 사용된 실험동물은 샘타고 바이오(O-san, Korea)로부터 10 주령의 ICR 마우스 20 마리를 구입하여 사용하였다. 마우스는 도착 후, 2주 동안의 수화과정을 거쳤으며, 2 개월간 일반식이와 물을 이용해 사육하였다. 생육환경은 무균시스템 이었으며, 12시간 마다 점등과 소등이 자동으로 조절되는 시스템을 사용하였다. 모든 동물실험 방법은 고려대학교 동물실험규정과 동물실험윤리위원회의 허가를 받은 실험법을 준수하였다.

실시예 3. 실험동물의 난소절제술(Ovariectomy)

실험동물들의 폐경기를 유도하기 위해, 마우스들의 난소절제술을 수행하였다. 먼저, 실시예 2에서 사육한 마우스들의 난소절제술을 실시하기 전, 마우스들에 아버틴(avertin, Sigma)을 복강 주사하여 마취시켰다. 이후, 마우스의 하복부 부분을 양쪽으로 약 1 cm 씩 절개하여 내, 외피와 근육을 절제하고, 자궁을 찾은 후 자궁과 연결된 나팔관 끝 부분에 있는 난소를 제거하였다. 절개한 부위는 마우스 수술용 실과 바늘을 이용하여 봉합하였으며, 약 일주일 간의 회복시간을 거쳤다.

실시예 4. 칡 추출물의 경구투여

상기 실시예 1에서 추출한 칡 추출물의 효과를 측정하기 위해, 마우스들을 네 개의 군으로 나누었다. 난소를 절제하지 않고 복부 절개 후 다시 봉합한 sham 군(정상군)과 난소를 절제한 OVXc, OVX200 및 OVX500 군으로 나누었다. sham 군과 OVXc 군에는 매일 물을 경구 투여하고 OVX200 군에는 매일 200 mg/kg의 칡 추출물을, OVX500 군에는 매일 500 mg/kg의 칡 추출물을 경구 투여하였다. 상기 OVXc 군은 대조군, 칡 추출물을 투여한 군은 실험군으로 설정하였다. 실험이 진행되는 4주 동안 매일 1회씩 같은 시간에 경구투여를 실시하였으며, 외관상의 건강상태와 행동의 이상 징후들을 관찰하였다.

실시예 5. 혈중 에스트로겐 농도 측정

본 발명의 칡 추출물이 혈중 에스트로겐 농도에 미치는 영향을 측정하기 위해, 마우스 에스트라디올(E2) ELISA kit(Cayman, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하였으며, 제조사에서 제공하는 실험법에 따라 측정을 수행하였다. 측정 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 것과 같이, 칡 추출물을 투여하기 전인 0주(baseline)에는 난소를 절제한 OVX 군들의 에스트로겐 농도가 난소를 절제하지 않은 sham 군에 비해 유의적으로 감소하였다(OVXc, OVX200, OVX500 군 각각 sham 군에 비해 24 %, 25 %, 23 % 감소함. p<0.05, p<0.001). 그러나 4주 동안 칡 추출물을 투여한 후에는 대조군인 OVXc 군에 비해 OVX200, OVX500 두 군의 혈중 에스트로겐 농도가 각각 6 %, 17 % 증가하였으며, 특히 OVX500 군의 경우는 정상 마우스(sham 군)와 비슷한 수준까지 증가하였다.

상기의 결과는 폐경이 여성에서 나타나는 골다공증, 고지혈증과 같은 증후군들은 난소 기능의 소실로 인한 혈중 에스트로겐 농도의 감소에서 기인한 것으로 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 칡 추출물을 섭취시, 혈중 에스트로겐 농도가 상승하는 것으로 확인되므로, 칡 추출물이 체내에서 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)으로 작용하여, 각종 갱년기 증후군의 예방 및 완화에 대한 효과를 가지고 있는 물질이라고 판단할 수 있다.

실시예 6. 혈중 지질 분석

본 발명의 칡 추출물이 지질대사에 미치는 영향을 측정하기 위해, 물 또는 칡 추출물을 경구투여한지 0주차(baseline)와 4주차에 각각의 마우스에서 채혈하여 Cobas C111(Roche Diagnostics, Basel, Swiss) 혈액 자동분석기를 이용하여 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방, HLD 및 LDL 콜레스테롤 수치를 측정하였다. 측정 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 것과 같이, 0주차(baseline)에는 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방, HLD 및 LDL 콜레스테롤 수치 모두 대조군과 실험군 간의 유의적인 차이가 없었다. 그러나 4주 동안 칡 추출물을 투여한 후에는 OVX200과 OVX500 두 군의 혈중 중성지방 수치가 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다(각각 30 %, 26 % 감소, p<0.05).

중성지방은 체내에서 에너지원으로 사용되지만, 잉여의 중성지방은 내장과 복부 등에 축적되어 비만을 유도하거나 콜레스테롤과 함께 고지혈증을 유발한다. 따라서 본 발명의 칡 이소플라본은 갱년기 여성 동물 모델에서 혈중 중성지방의 수치를 감소시킴으로써, 고지혈증을 예방하고 완화시키는데 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

실시예 7. 실험동물의 채혈 및 적출 장기의 무게 측정

각 군의 마우스들로부터 혈액을 채혈하기 위해, 칡 추출물을 경구투여하기 전에 안와정맥총 채혈을 수행하였다. 이후, 칡 추출물을 경구투여하고 4주 후에 심장채혈을 수행하였다. 상기의 과정들은 마취하에 진행되었다. 이후, 마우스의 간, 자궁 및 복부 지방조직을 적출하여 각각의 무게를 측정하였으며, 측정 후 즉시 액체질소에서 급속냉동한 후 다음 실험에 사용할 때까지 -80 ℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 혈액은 원심분리하여 혈장만 얻어낸 후, 상기와 같이 -80 ℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 상기 적출한 장기의 무게를 측정한 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 것과 같이, 간의 무게를 측정한 경우, 본 발명의 칡 추출물을 투여한 OVX200, OVX500 군에서 대조군인 OVXc 군에 비해 각각 12 %, 13 %(p<0.05) 증가하여 유의적으로 높았다. 또한 자궁의 무게를 측정한 경우, 칡 추출물을 투여한 OVX200, OVX500 군의 무게가 대조군에 비해 각각 13 %, 24 % 증가하였다. 반면, 복부 지방조직을 측정한 결과 칡 추출물을 투여한 OVX200, OVX500 군의 무게가 대조군에 비해 각각 8 %, 11 % 감소하였다.

간은 영양소를 사용하여 생명유지에 필요한 물질을 생산, 저장, 전환시키는 기능을 담당하고 있으며, 해독작용, 배설 및 방어작용 등 수없이 많은 기능들을 담당하고 있는 인체의 화학공장 집단이라고 할 수 있다. 특히, 콜레스테롤과 지질대사를 조절하는 기관으로서의 역할 또한 매우 중요하다. 따라서 상기의 결과와 같이 본 발명의 칡 추출물 섭취시킨 마우스의 간의 무게가 증가한다는 것은 상기 칡 추출물이 간 기능의 활성화로 폐경기 여성에게서 여러 유익한 효과를 나타낼 수 있으며, 중성지방이 감소하는 결과(도 3)와 일치하므로 지질대사에 영향을 미칠 수 있다고 사료된다. 또한 폐경기가 되면 난소기능의 저하로 인해 자궁의 기능이 퇴화하게 되므로 정상 마우스인 sham 군의 자궁무게에 비해 OVXc 군의 자궁무게가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 그러나 자궁을 적출한 후, 칡 추출물을 투여한 OVX200, OVX500 두 군의 경우 자궁의 무게가 대조군에 비해 증가하였으므로, 칡 추출물의 섭취가 폐경 여성의 자궁기능의 소실을 억제한다고 판단할 수 있다. 또한 폐경기 여성에서 쉽게 나타날 수 있는 증후군 중 하나가 비만으로, 정상 마우스인 sham 군의 복부 지방조직 무게에 비해 OVXc 군의 복부 지방조직 무게가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 그러나 자궁을 적출한 후, 칡 추출물을 투여한 OVX200, OVX500 두 군의 경우 복부 지방 무게가 OVXc 군에 비해 감소하는 효과를 나타내었다. 따라서 칡 추출물의 섭취가 혈중 중성지방의 수치를 감소(도 3)시키며, 이로 인해 복부지방의 무게도 감소시키므로 비만 예방에 효과가 있다고 볼 수 있다.

실시예 8. 혈중 ALT 및 AST 수치 측정

본 발명의 칡 추출물이 간 기능과 세포파괴 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해, 실시예 6에서와 동일한 방법으로 혈중 ALT(Alanine aminotransferase)와 AST(Aspartate aminotransferase)의 수치를 측정하였다. 측정 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 것과 같이, 자궁을 적출시킨 OVXc 군의 ALT 및 AST 수치가 정상 마우스인 sham 군 보다 증가하였으며, 칡 추출물을 투여한 OVX200, OVX500 군의 경우 ALT 및 AST 수치가 대조군인 OVXc 군에 비해 감소하였으며, ALT는 대조군에 비해 각각 21 %, 31 % 감소하였으며, AST는 각각 27 %, 42 % 감소하였다.

상기 실시예 7에서 설명한 것과 같이, 간은 체내에서 수많은 기능을 담당하고 있는 가장 거대한 기관으로서, 간 기능을 유지하는 것은 지질대사뿐만 아니라 갱년기 여성의 총체적인 건강에 있어서도 매우 중요하다. ALT 및 AST는 간을 구성하는 세포 하나하나에 들어있는 효소로서, 간세포가 손상되거나 파괴되면 세포 내에서 혈액으로 흘러들어간다. 즉, 혈중 ALT 및 AST의 수치가 높다는 것은 그 만큼 손상된 세포의 수가 많다는 것을 의미한다. ALT는 전적으로 간세포 내에만 존재하는 반면, AST는 간세포 외에 적혈구나 뇌, 신장, 근육세포 등 체내 다른 조직에도 존재하기 때문에 이러한 조직들의 세포파괴 정도 또한 측정이 가능하다. 따라서 상기의 결과는 칡 추출물의 섭취가 체내에서 간 기능을 보호하고 다른 조직들의 세포파괴 또한 억제하는 것으로 볼 수 있다.

실시예 9. 미세단층 촬영기(micro-CT)를 이용한 골밀도(BMD) 분석

각각의 마우스 군들로부터 골밀도(bone mineral density; BMD)를 측정하기 위해, 대퇴부를 미세단층 촬영기(micro-CT)로 촬영한 후, 해면골(trabecular bone)의 골밀도를 분석하였다. 미세단층 촬영기 영상은 표본을 중심으로 X선 공급원(focal spot size, 5 μm, energy range, 20-100 keV)과 검출기(CCD camera, 2.3 X 4K)가 회전하는 방식인 in vivo x-ray micro-CT 장치(Skyscan 1076, Skyscan, Aartselaar, Begium)로 촬영하였다. 이미지 픽셀 사이즈는 18.1 μm로 촬영하였고, 사용된 분석프로그램으로는 reconstruction에는 NRecon(Skyscan) ver. 1.6.1.2, 골밀도 분석에는 CTAn(Skyscan) ver. 1.9.2.5, 3차원 이미지 분석에는 CTVol(Skyscan) ver. 1.11.1.2가 사용되었다. 분석 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6에 나타낸 이미지를 통해 확인할 수 있듯이 정상 마우스인 sham 군에 비해 자궁을 적출한 OVXc 군의 대퇴부 해면골의 골밀도가 감소함을 볼 수 있다. 그러나 자궁을 적출한 후 칡 추출물을 투여한 OVX200, OVX500 군의 골밀도는 sham 군에 비해서는 낮지만 OVXc 군에 비해서는 골밀도의 감소가 억제되는 것을 확인할 수 있다. 도 7은 도 6의 3차원 이미지를 바탕으로 해면골의 골밀도를 정량하여 수치화한 결과로, OVXc 군의 골밀도는 sham 군에 비해 25 % 감소하는 반면, 칡 추출물을 투여한 OVX200, OVX500 군의 골밀도는 sham 군에 비해 각각 9 %, 7 % 감소하였다.

해면골의 구조는 뼈의 강도를 구하는데 있어서도 밀접한 관련이 있으며, 골다공증 환자의 골절 위험도를 결정하는 중요한 요인이다. 따라서 칡 추출물의 섭취로 골밀도의 손실을 억제할 수 있으므로, 갱년기 여성에서 쉽게 유도될 수 있는 골다공증을 예방하는데 효과가 있다고 판단할 수 있다.

실시예 10. 간 조직의 RNA 추출 및 cDNA 합성

먼저 상기 실시예 7에서 적출하여 냉동고에 보관해놓은 마우스들의 간 조직을 각각의 튜브에 넣고 트리졸 시약(TRIzol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 1 ml 넣은 후, 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 간 조직을 분쇄하여 마우스들 각각의 RNA 추출 시료를 얻었다. 상기 RNA 추출 시료를 5 분간 실온에 방치한 후 1 ml의 트리졸 용액 당 0.2 ml의 클로로포름을 넣고 15 초간 잘 흔들어 준 후, 실온에서 2 ~ 3 분간 더 반응시켰다. 이후, 4 ℃에서 15 분간 12,000×g로 원심분리 하였으며, 원심분리 결과 가장 위층인 RNA, 중간층인 DNA 및 가장 아래층인 단백질 층으로 분리되었다. DNA가 오염되지 않도록 조심스럽게 RNA 층을 잘 분리하여 다른 튜브로 옮긴 후, 이소프로필알코올을 0.5 ml 넣고 10 분간 반응시켜 RNA를 침전시켰다. 그 후, 4 ℃에서 5 분간 12,000×g로 원심분리 한 후, 상층액을 버리고 침전물을 75 % DEPC(diethylpyrocarbonate)-에탄올을 1 ml 넣고 몇 번 흔들어 준 후, 다시 4 ℃에서 5 분간 12,000×g로 원심분리 하였다. 또 다시 상층액을 버리고 실온에서 침전물을 5 ~ 10 분간 건조시킨 후, 0.1 % DEPC-증류수로 침전물을 녹여 RNA 용액을 만들었다. 0.1 % DEPC-증류수 995 ml에 상기 RNA 용액 5 ml을 넣어 200 배로 희석한 후, 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. RNA 농도는 {260 nm에서의 흡광도 값 × 40 μg/ml × (희석배수)}로 계산하였으며, 260 nm와 280 nm의 비가 1.6 이상일 때를 순수한 RNA로 보았다.

이후, first-strand cDNA를 생산하기 위해 먼저 올리고(dT)₁₅ 프라이머(Promega, USA)와 랜덤 헥사머(Random hexamers, Promega, USA)를 동일량으로 섞어 1 μl PCR 튜브에 넣고 상기에서 추출한 RNA 2 μg을 넣은 후, RNnase-free 증류수로 최종 부피가 11 μl가 되도록 맞추었다. 이후, 70 ℃에서 10 분 동안 끓인 후, 즉시 얼음에서 냉각시켰다. 그 후, 5× first-strand 완충액 4 μl, dNTP mix(10 mM each) 2 μl, DTT(100 mM) 2 μl 및 역전사효소(Powerscript Reverse Transcriptase, Clontech) 1 μl를 첨가한 후, 피펫으로 골고루 섞은 후, 42 ℃에서 90 분, 70 ℃에서 15 분간 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다.

실시예 11. 유전자 발현 측정

대조군 및 실험군 각각의 마우스들에서의 유전자 발현을 알아보기 위하여 정량적(quantitative) real-time PCR을 실시하였다. 이때 사용된 Aromatase, SULT1E1(estrogen preferring sulfotransferase family 1E, member 1)의 뉴클레오타이드 서열은 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2. 프라이머]

먼저, real-time PCR용 플레이트에 9 μl SYBR Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 8 μl의 증류수, 1 μl의 cDNA(실시예 10) 및 1 μl의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머(표 2)를 각각 넣은 후, real-time PCR 기기에 넣어 유전자를 증폭시켰으며, 발현정도를 실시간으로 확인하였다. 모든 프라이머의 신장(primer extension) 반응은 혼합물을 95 ℃에서 3 분간 전처리(pre-denature)시킨 후, 95 ℃에서 20 초간, 56 ℃에서 20 초간, 72 ℃에서 1 분간 40 ~ 60 사이클을 수행하였으며, 최종적으로 95 ℃에서 1 분간, 55 ℃에서 1 분간 신장반응을 하였다. DNA 변형곡선(melting curve)은 60 ℃부터 95 ℃까지 0.5 ℃씩 상승시키면서 분석하였다. 모든 PCR 반응은 iCycler iQ5(Bio-Rad)에서 수행되었으며, 데이터는 iCycler iQ5 optical software(Bio-rad) ver. 2.0으로 분석하였다. 분석결과는 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8에 나타낸 것과 같이, 칡 추출물을 4주 동안 투여한 OVX200, OVX500 군의 간에서의 Aromatase 발현이 대조군인 OVXc에 비해 각각 16 %, 36 %(p<0.05) 감소하였다.

갱년기 여성에서 혈중 에스트로겐 농도의 증가는 각종 유익한 효과를 나타내지만 반면에 유방암 세포의 발현을 촉진할 수도 있다. Aromatase의 발현이 증가하면 유방암 세포의 증식이 촉진되므로 유방암 치료분야에서는 상기 효소를 억제하는 것이 약으로 사용된다. 본 발명의 칡 추출물을 투여시 혈중 에스트로겐 농도가 증가하였으므로 유방암을 촉진할 수도 있다는 논란을 불러일으킬 수 있으나, 상기의 결과와 같이 본 발명의 칡 추출물은 에스트로겐 농도를 향상시키면서 동시에 Aromatase의 발현을 감소시킴으로 유방암 세포의 증식에 대한 위험성은 없으며 혈중 에스트로겐 농도의 증가는 Aromatase의 합성에 의한 것이 아닌, 다른 기작(mechanism)에 의한 것으로 사료된다.

또한 도 9에 나타낸 것과 같이, 칡 추출물을 4주 동안 투여한 OVX200, OVX500 군의 간에서 SULT1E1의 발현이 대조군인 OVXc에 비해 각각 111 %, 208 %(p<0.05) 증가하였다.

SULT1E1은 sulfotransferase의 일종으로 상기 sulfotransferase들은 유방암 치료의 표적이 된다. 체내 에스트로겐 수치는 sulfatase와 sulfotransferase의 상호작용에 의해 조절된다. 일반적으로 에스트로겐은 혈중에서 에스트로겐-sulfate의 형태(비활성 형태)로 존재하게 되는데, 혈중 에스트로겐의 농도가 낮을 경우 sulfatase가 활성화되어 에스트로겐-sulfate의 형태로 전환시킨다. 본 발명의 칡 추출물은 혈중 에스트로겐의 농도를 향상시키는 동시에 sulfotransferase의 일종인 SULT1E1의 발현도 증가시킨다. 따라서 본 발명의 칡 추출물은 SULT1E1을 매개로 하여 혈중 에스트로겐이 고농도로 지속되는 것을 방지함으로써 유방암에 대한 위험성이 없는 것으로 사료된다.

본 발명의 실시예들에서 데이터의 통계처리는 두 군 간에는 Students t-test를 이용하였으며, 여러 군 간에는 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후, P<0.05일 때 Tukey test에 의하여 각 실험군의 유의성을 검정하였다. 실험결과는 평균±SD로 나타내었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 퓨라린 및 다이드진을 주 성분으로 함유하는 칡 추출물을 제조할 수 있으며, 상기 칡 추출물을 섭취시 여성호르몬의 개선, 혈중 중성지질 강하 및 체지방 감소 및 골다공증 예방효과를 갖는 장점을 갖는다.

본 발명의 상기 실시예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 칡 추출물을 난소를 절제하여 폐경기를 유도한 마우스에 투여한 경우, 칡 추출물을 투여하지 않은 대조군에 비해 혈중 에스트로겐의 농도가 증가하고, 혈중 중성지방 수치 및 복부 지방의 무게가 감소하였으며, 간세포의 파괴를 억제하고, 골밀도의 손실을 억제하며, 유방암의 위험성을 감소하는 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 칡 추출물을 함유하는 폐경기 여성건강 개선용 조성물을 이용한 약학적 조성물 및 건강기능식품의 활용이 기대된다.

Claims (8)

1. 칡 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐경기 여성의 간세포 파괴 억제 및 간기능 개선용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 칡 추출물은 알코올 용매추출을 이용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 폐경기 여성의 간세포 파괴 억제 및 간기능 개선용 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 칡 추출물은 5 ~ 10 %의 퓨라린(puerarin) 및 1 ~ 3 %의 다이드진(daidzin)을 함유하는 것을 특징으로 하는 폐경기 여성의 간세포 파괴 억제 및 간기능 개선용 조성물.
   
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