KR20230075158A

KR20230075158A - 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본의 추출방법

Info

Publication number: KR20230075158A
Application number: KR1020210161481A
Authority: KR
Inventors: 박재남
Original assignee: 학교법인 송원대학교
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2023-05-31

Abstract

본 발명은 칡에 함유되어 있는 다량의 페놀화합물과 이소플라본(isoflavone)을 효과적으로 추출하도록 하는 방법에 관한 것으로, 페놀화합물은 칡을 분말화한 후 칡 분말 1중량부 대비 추출용매로서 메탄올 17~20 중량부를 투입한 후 100 ~ 140분 간 초음파 처리하여 추출하고, 이소플라본은 칡을 분말화한 후 칡 분말 1중량부 대비 추출용매로서 메탄올 17~20중량부를 투입한 후 실온에서 12~18시간 교반하여 추출하는 것을 특징으로 한다.

Description

칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본의 추출방법{Extracting method of phenol compounds and isoflavone from kudzu vine}

본 발명은 칡에 함유되어 있는 다량의 페놀화합물과 이소플라본(isoflavone)을 효과적으로 추출하도록 하는 방법에 관한 것이다.

폴리페놀 화합물(polyphenolic compound)은 식물 내에 가장 많이 존재하는 물질 중의 하나로 일반적으로 식물들의 2차 대사 작용에 의한 산물로 생성되며, 주로 당(glycoside)에 부착된 형태로 존재하나 경우에 따라 아글리콘(aglycone) 형태로도 존재한다.

최근 폴리페놀 화합물이 주목받고 있는 이유는 생체내에서 산화를 방지하는 기능, 즉, 항산화 기능뿐만 아니라 항돌연변이, 항암 및 항염증 활성 등을 가지고 있어 건강 유지와 질병 예방 등에 기여할 것으로 기대되기 때문이다. 또한, 폴리페놀 화합물은 콜레스테롤이 소화관으로 흡수되는 것을 막아주기 때문에 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮게 해주는 기능도 한다.

한편, 퓨라린(puerarin)은 콩과식물에 존재하는 주요 이소플라본(isoflavone)의 일종으로써, 주로 칡 뿌리(pueraria lobata)에서 많이 발견된다 [Guerra MC, Speroni E, Broccoli M, Cangini M, Pasini P, Minghetti A, Crespi-Perellino N, Mirasoli M, Cantelli-Forti G, Paolini M, Life Sci 2000, 67: 2997-3006]. 퓨라린은 암세포 증식 억제, 항산화, 당뇨, 심장질환 완화 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있어, 예로부터 동양권에서는 약재로 사용되어져 왔다 [Xiong FL, Sun XH, Gan L, Yang XL, Xu HB, Eur J Pharmacol 2006, 529: 1-7]. 퓨라린과 같은 이소플라본 계열인 다이드진(daidzin)이나 제니스틴(genistin)은 갱년기모델 동물실험 및 임상실험에서 골다공증, 고지혈증, 유방암 같은 갱년기 증후군에 효능이 있다고 보고되었다 [Mindy SK, Xia X, Annu Rev Nutr 1997, 17: 353-381].

위에서 언급한 다양한 효과를 이용하기 위해 폴리페놀 화합물이나 이소플라본을 천연식물로부터 추출하는 시도가 꾸준히 이루어지고 있는 실정이다.

종래, 천연식물로부터 폴리페놀 화합물과 이소플라본을 추출함에 있어 추출량이 많지 않았으며, 특히 천연식물 중에서도 칡에 함유되어 있는 폴리페놀 화합물과 이소플라본을 최적의 조건으로 추출하는 기술에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없었다.

공개특허공보 제10-2011-0085758호(20110727, 새싹보리 유래 폴리페놀계 화합물을 함유하는 추출물 및 이의 제조방법) 등록특허공보 제10-1177508호(2012.08.21. 폐경기 여성건강 예방 및 치료용 칡 추출물 조성물)

본 발명자는 칡에 함유되어 있는 페놀화합물과 이소플라본(isoflavone)의 함량을 측정하여 추출하는 방법을 예의 연구한 결과, 추출용매로 사용되는 메탄올의 농도를 변화시켜 줌으로써 추출되는 페놀화합물과 이소플라본의 함량이 변화되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 추출용매로 사용되는 메탄올을 최적의 농도로 투입하여 칡에 함유된 페놀화합물와 이소플라본을 다량 추출할 수 있도록 하는 데 그 목적이 있다.

상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 해결수단은, 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본을 추출함에 있어서, 페놀화합물은 칡을 분말화한 후 칡 분말 1중량부 대비 추출용매로서 메탄올 17~20 중량부를 투입한 후 100 ~ 140분 간 초음파 처리하여 추출하고, 이소플라본은 칡을 분말화한 후 칡 분말 1중량부 대비 추출용매로서 메탄올 17~20중량부를 투입한 후 실온에서 12~18시간 교반하여 추출하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 페놀화합물의 다량 추출을 위한 메탄올 농도 결정은, 추출용매로 사용되는 메탄올의 농도를 조절해가면서 복수번 추출과정을 과정을 각기 다른 칡 추출액을 수득하는 단계와, 수득된 각각의 칡 추출액에 함유된 페놀화합물의 함량을 확인하여 서로 비교하는 단계와, 가장 많은 량의 페놀화합물이 함유된 칡 추출액을 선별한 후 해당 칡 추출액에 사용된 메탄올 농도를 확인하는 단계를 거쳐 최적의 메탄올 농도를 결정하게 된다.

상기 페놀화합물의 추출함량 확인은, 원심분리기를 이용하여 칡 추출액을 원심분리하여 상등액을 취한 후, 상등액 0.5 ~ 1.5㎖에 플론시약(Folin-ciocalteau reagent) 0.1㎖를 혼합하여 실온에 방치하고, 탄산나트륨(Na₂CO₃) 포화용액 0.2㎖를 가하여 혼합한 후 증류수 2㎖를 첨가하여 희석한 다음 실온 암조건에서 1시간 더 방치하며, 이 후 원심분리하여 상등액을 취한 후 상등액의 흡광도를 측정하여 페놀화합물의 함량을 확인하게 된다.

또한, 이소플라본의 다량 추출을 위한 메탄올 농도 결정은, 추출용매로 사용되는 메탄올의 농도를 조절해가면서 복수번 추출과정을 과정을 각기 다른 칡 추출액을 수득하는 단계와, 수득된 각각의 칡 추출액에 함유된 이소플라본의 함량을 확인하여 서로 비교하는 단계와, 가장 많은 량의 이소플라본이 함유된 칡 추출액을 선별한 후 해당 칡 추출액에 사용된 메탄올 농도를 확인하는 단계를 거쳐 최적의 메탄올 농도를 결정하게 된다.

상기 이소플라본의 추출함량 확인은, 원심분리기를 이용하여 칡 추출액을 10분동안 3,000 RPM에서 원심분리하여 상등액을 취한 후 이를 여과하고, 여과된 상등액을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분리하여 함량을 확인하게 된다.

본 발명의 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본의 추출방법은, 추출용매로 사용되는 메탄올의 농도를 변화시키면서 추출되는 페놀화합물과 이소플라본의 함량을 비교하여 확인함으로써 최적의 메탄올 농도를 결정하여 추출하도록 함으로써 추출물의 수득율 향상을 도모할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 칡에 함유되어 있는 페놀화합물의 추출 용매별 추출함량을 보인 표.
도 2는 도 1의 추출 용매 및 농도별 페놀화합물의 추출 함량을 보인 그래프,
도 3은 본 발명에 따른 이소플라본의 HPLC 분석조건,
도 4는 본 발명에 따른 칡에 함유되어 있는 이소플라본의 추출 용매별 추출함량을 보인 표.

본 발명에 따른 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본을 추출하는 추출방법에 대해 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 페놀화합물과 이소플라본 추출방법은 칡을 분말화한 후 용매로서 메탄올을 이용하여 페놀화합물과 이소플라본을 추출하게 되는 것이고, 메탄올의 농도변화를 통해 최적의 농도를 갖는 메탄올을 이용하여 페놀화합물과 이소플라본을 최대한 다량 추출할 수 있게 된다.

구체적으로, 칡을 구매하여 분쇄하여 분말화한다.

먼저, 페놀화합물의 추출을 위해, 칡 분말에 추출용매로서 메탄올을 사용하게 되며, 칡 분말 1중량부 대비 추출용매로서 메탄올 17~20 중량부를 혼합하며, 10kHz 내지 50kHz에서 10W 내지 300W의 세기로 100 ~ 140분 간 초음파 처리과정을 거쳐 추출한다.

초음파 처리를 통해, 칡 분말의 세포벽을 효과적으로 파괴하여 본 발명에서 추출하고자 하는 활성물질인 페놀화합물의 용출을 보다 더 증진시켜 줄 수 있다.

메탄올을 이용한 추출방법은 초음파 처리 후 원심분리기(Beckman, USA, CA)를 이용하여 3 ~ 5℃의 온도에서 1000~1200 RPM으로 7 ~ 15분 동안 각각 원심분리한 다음 상등액을 취하고, 이렇게 취한 상등액을 기준 시료용액으로 사용하게 된다.

이때, 추출용매로 사용되는 상기 메탄올은 농도에 따라 추출액에 함유된 페놀화합물의 함량에 차이가 발생하게 된다.

다량의 페놀화합물 추출을 위한 메탄올 농도 결정은, 추출용매로 사용되는 메탄올의 농도를 조절해가면서 복수번 추출과정을 과정을 각기 다른 칡 추출액을 수득하는 단계와, 수득된 각각의 칡 추출액에 함유된 페놀화합물의 함량을 확인하여 서로 비교하는 단계와, 가장 많은 량의 페놀화합물이 함유된 칡 추출액을 선별한 후 해당 칡 추출액에 사용된 메탄올 농도를 확인하는 단계를 거쳐 최적의 효율을 갖는 메탄올 농도를 결정하게 된다.

메탄올의 농도에 따라 칡 분말의 추출액에 함유된 페놀화합물의 함량은 도 1 및 도 2에 도시되어 있다. 도 1 및 도 2의 페놀화합물의 함량 수치는 g중의 GAE mg(gallic acid equivalents)로 나타내었으며, 도면에는 메탄올 외에 용매로서 물을 이용하여 추출한 페놀화합물의 함량도 나타내었다.

도 1 및 도 2를 보면 칡 분말에 함유되어 있는 페놀화합물의 추출량은 물에 비해 메탄올을 이용한 경우 추출량이 많았으며, 메탄올의 농도가 진할수록 추출되는 양이 증가되는 것으로 나타났다. 50농도%의 농도를 갖는 메탄올을 이용한 경우 페놀화합물의 추출량이 많았으며, 그 이상의 농도 예로서 70농도%의 농도를 갖는 메탄올을 사용한 경우에는 50농도%의 메탄올보다는 추출량이 많았으나 그 차이가 미비한 것으로 나타났다.

따라서, 고농도의 메탄올을 이용한 경우 중간농도의 메탄올에 비해 추출량은 높으나 그 차이가 미비하고 오히려 비용증가로 인해 경제적이지 못함에 따라 45~55농도%의 메탄올을 이용하여 추출하도록 하는 것이 효율적임을 확인할 수 있다.

본 발명에서 칡 분말에 함유된 페놀화합물의 추출용매로 사용되는 메탄올은 45 ~ 55농도%의 메탄올을 사용하여 추출하도록 함이 바람직하다.

추출액에 함유된 페놀화합물의 함량을 확인하기 위해, 원심분리하여 취한 상등액 0.5 ~ 1.5㎖에 플론시약(Folin-ciocalteau reagent) 0.1㎖를 혼합하여 실온에 약 2시간 정도 방치하고, 탄산나트륨(Na₂CO₃) 포화용액 0.2㎖를 가하여 혼합하고 그 후 증류수 2㎖를 첨가하여 희석한 다음 실온 암조건에서 1시간 더 방치한다.

이 후, 원심분리하여 상등액을 취하고, 750nm에서 분광광도계(UV spectrophotometer)로 상등액의 흡광도 측정을 통해 정량하여 확인하게 된다.

정량을 위한 검량선은 갈산(Gallic acid (Sigma G7384)) 1mg을 70% 메탄올 1㎖에 용해시켜 2, 4, 6, 8, 10 ug/㎖가 되도록 조제한 후 상기 상등액과 같은 방법으로 처리하여 750 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.

도 2에는 용매의 농도별 페놀화합물의 함량 그래프가 도시되어 있다. 그래프에 도시된 바와 같이, 메탄올의 농도가 진할수록 추출한 페놀화합물의 함량이 많았으며, 70농도%의 메탄올을 사용한 경우에 50농도%의 메탄올과 차이가 미비한 것으로 나타나 효율성 면에서 50농도% 메탄올을 사용함이 바람직하다.

효율성면에서 최적의 메탄올 농도는 45 ~ 55농도%의 메탄올을 사용하여 추출하도록 한다.

그리고 본 발명에서 이소플라본은 칡을 분말화한 후 칡 분말 1중량부 대비 추출용매로서 메탄올 17~20중량부를 투입한 후 실온에서 12~18시간 교반하여 추출하게 된다.

이소플라본의 추출을 위한 메탄올 농도 결정도, 상기 페놀화합물의 메탄올 농도 결정과 같이 추출용매로 사용되는 메탄올의 농도를 조절해가면서 복수번 추출과정을 과정을 각기 다른 칡 추출액을 수득하는 단계와, 수득된 각각의 칡 추출액에 함유된 이소플라본의 함량을 확인하여 서로 비교하는 단계와, 가장 많은 량의 이소플라본이 함유된 칡 추출액을 선별한 후 해당 칡 추출액에 사용된 메탄올 농도를 확인하는 단계를 거쳐 최적의 효율을 갖는 메탄올 농도를 결정하게 된다.

본 발명에서 칡에 함유된 이소플라본은 6종(Diadzin, Glycitin, Genistin, Daidzein, Glycitein, Genistein)을 확인하게 된다.

이소플라본의 추출함량을 확인하기 위해, 원심분리기를 이용하여 칡 추출액을 8~12분동안 2,500 ~3,500 RPM에서 원심분리하여 고형분을 제거하고 상등액을 모아 0.45um syringe filter로 여과하고, 여과된 상등액을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분리하여 함량을 확인하게 된다.

이소플라본의 함량확인을 위해 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)의 분석조건은 도 3에 도시되어 있다.

구체적으로, 칼럼(column)은 YMC ODS-AM-303 C₁₈ reverse-phase column을 사용하였고, 이동상은 A: 0.1% formic acid in Acetonitrile, B: 0.1% formic acid in Water로 A 용매를 0 min ~ 15%, 50 min ~ 35%, 60 min ~ 100%, 75 min ~ 15%로 복귀하여 5분 정도 유지시켜 안정화시켰다.

또한, 이동상의 유속은 1.0 mL/min 이었고, 시료주입량은 10 uL, 칼럼(column)의 온도는 35℃로 사용하였으며, 254nm에서 분석하였다. 표준물질 Daidzin, Glycitin, Genistin, Daidzein, Glycitein, Genistein (sigma)을 정량하였다.

도 4에는 용매의 농도별 이소플라본의 함량 결과표가 도시되어 있다. 표에 도시된 바와 같이, 분석한 이소플라본 6종 중 칡 분말에 함유된 이소플라본은 Diadzin과 Genistin 및 Daidzein이 함유되어 있고 나머지는 거의 함유되어 있지 않은 것으로 확인되었다. 이는 칡의 생물분류로 살펴볼 때 콩목 콩과에 분류된 식물로 일반적으로 콩에 함유된 이소플라본 종류가 추출되는 것으로 판단된다.

추출결과, Genistin과 Daidzein은 메탄올의 농도가 진할수록 추출수율이 증가하는 것으로 나타난 반면에, Diadzin은 메탄올의 농도가 높아질수록 추출 수율이 증가하기는 하나 50%농도와 70농도%의 차이가 미비한 것으로 나타났다.

따라서, 효율성 면에서 45 ~ 55농도% 메탄올을 사용하여 추출하도록 함이 바람직할 것이다.

없음

Claims

칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본을 추출함에 있어서,
페놀화합물은 칡을 분말화한 후 칡 분말 1중량부 대비 추출용매로서 메탄올 17~20 중량부를 투입한 후 100 ~ 140분 간 초음파 처리하여 추출하고,
이소플라본은 칡을 분말화한 후 칡 분말 1중량부 대비 추출용매로서 메탄올 17~20중량부를 투입한 후 실온에서 12~18시간 교반하여 추출하는 것을 특징으로 하는 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본의 추출방법.
제1항에 있어서,
페놀화합물의 다량 추출을 위한 메탄올 농도 결정은,
추출용매로 사용되는 메탄올의 농도를 조절해가면서 복수번 추출과정을 과정을 각기 다른 칡 추출액을 수득하는 단계와,
수득된 각각의 칡 추출액에 함유된 페놀화합물의 함량을 확인하여 서로 비교하는 단계와,
가장 많은 량의 페놀화합물이 함유된 칡 추출액을 선별한 후 해당 칡 추출액에 사용된 메탄올 농도를 확인하는 단계를 거쳐 최적의 효율을 갖는 메탄올 농도를 결정하게 되며,
최적의 메탄올 농도는 45 ~ 55농도%의 메탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본의 추출방법.
제2항에 있어서,
상기 페놀화합물의 추출함량 확인은,
원심분리기를 이용하여 칡 추출액을 원심분리하여 상등액을 취한 후, 상등액 0.5 ~ 1.5㎖에 플론시약(Folin-ciocalteau reagent) 0.1㎖를 혼합하여 실온에 방치하고, 탄산나트륨(Na₂CO₃) 포화용액 0.2㎖를 가하여 혼합한 후 증류수 2㎖를 첨가하여 희석한 다음 실온 암조건에서 1시간 더 방치하며, 이 후 원심분리하여 상등액을 취한 후 상등액의 흡광도를 측정하여 페놀화합물의 함량을 확인하는 것을 특징으로 하는 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본의 추출방법.
제1항에 있어서,
이소플라본의 다량 추출을 위한 메탄올 농도 결정은,
추출용매로 사용되는 메탄올의 농도를 조절해가면서 복수번 추출과정을 과정을 각기 다른 칡 추출액을 수득하는 단계와,
수득된 각각의 칡 추출액에 함유된 이소플라본의 함량을 확인하여 서로 비교하는 단계와,
가장 많은 량의 이소플라본이 함유된 칡 추출액을 선별한 후 해당 칡 추출액에 사용된 메탄올 농도를 확인하는 단계를 거쳐 최적의 효율을 갖는 메탄올 농도를 결정하게 되며,
최적의 메탄올 농도는 45 ~ 55농도%의 메탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본의 추출방법.
제4항에 있어서,
상기 이소플라본의 추출함량 확인은,
원심분리기를 이용하여 칡 추출액을 8~12분동안 2,500 ~3,500 RPM에서 원심분리하여 상등액을 취한 후 이를 여과하고, 여과된 상등액을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분리하여 함량을 확인하는 것을 특징으로 하는 칡에 함유된 페놀화합물과 이소플라본의 추출방법.