KR101166113B1

KR101166113B1 - 3-히드록시-4-피리디논의 사이클로알킬 유도체

Info

Publication number: KR101166113B1
Application number: KR1020067012201A
Authority: KR
Inventors: 팀 패트 탐; 마이클 스피노; 완렌 리; 잉셍 왕; 얀킹 자오; 비렌쿠마르 하스무크하이 사하
Original assignee: 아포텍스 인크.
Priority date: 2003-11-20
Filing date: 2004-11-18
Publication date: 2012-07-27
Also published as: KR20060096155A; US20090170850A1; CA2546781A1; RU2006121547A; EP1687298A1; EP1687298B1; IL175654A0; ZA200604998B; NZ529657A; MXPA06005594A; US20070082904A1; US7410985B2; WO2005049609A1; UA84178C2; AU2004291184A1; RU2345992C2; CA2546781C; NO20062262L; TNSN06142A1; AU2004291184B2

Abstract

본 발명은 철분과 같은 금속이온의 착화용으로 사용되는 3-히드록시-4-피리디논의 사이클로알킬 유도체를 제공한다. 그의 제도와 용도가 본 발명에 설명되어 있다. 특히 본 발명은 하기 화학식(1)을 가지는 착화제를 포함하는 화학적 및 생물학적 시스템에서 철분 제거에 관련된 것이다.

(화 학 식 1)

상기 식에서 R²가 Y 라는 조건으로 R¹은 X ;

또는 R²가 W라는 조건으로 R¹은 T;

또는 R²R⁵N이 같이 묶어져 있을시 피페리딘, 머포린, 피로리딘, 피페라진 기들로 부터 선택되어진 하나의 헤테로사이클 링을 형성하며, 여기에서 피페리딘 기, 머포린기, 피로리딘기, 피페라진 기는 한 개에서 세 개까지 C₁-C₆ 알킬 그룹으로 치환되거나 치환되지 않는 조건으로 R¹은 X;

X는 C₃-C₆ 사이클로알킬;

Y는 C₃-C₆ 사이클로알킬, C₁-C₆ 알킬 그리고

C₁에서 C₆알킬을 C₃-C₆ 사이클로알킬로 단순 대치하여 구성된 그룹으로부터 선택 되어지며;

T는 C₁에서 C₆ 알킬;

W는 C₃-C₆ 사이클로알킬;

R³는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택되고;

R⁴는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택되고;

R⁵ 는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택됨.

또한 그와 같은 화학물의 약제조성물은 철분과다증을 가진 환자로부터 체내에 있는 과잉철분을 제거하는데 사용된다.

히드록시, 피리디논, 사이클로알킬 유도체

Description

3-히드록시-4-피리디논의 사이클로알킬 유도체{CYCLOALKYL DERIVATIVES OF 3-HYDROXY-4-PYRIDINONES}

본 발명은 신규의 3-히드록시-4-피리디논 유도체 및 그 유도체를 철 이온을 킬레이트하는데 사용되는 용도에 관한 것이다. 더 자세히 설명하면, 본 발명은 3-히드록시-4-피리디논으로부터 유도된 사이클로알킬 유도체에 관한 것이다.

3-히드록시-4-피리디논은 화학구조상 이좌 배위자이며 철 이온과는 3:1의 비율로 킬레이트 시키며 체내에 과다하게 존재하는 철분을 제거하는데 유용하게 사용된다. 체내에 철분이 과다하게 존재하는 것은 일상 섭취하는 음식에서 철분을 과다하게 섭취하거나 또는 유전적으로 이어받은 조건들, 예를 들면, 혈액색소침착증 또는 정규적인 수혈로 인한 것이다. 이러한 수혈은 의학적으로는 지중해성 빈혈증, 적혈구 빈혈증, 특발성 원인 불명의 혈색소증 그리고 재생불능의 무형성 빈혈에 적용된다. 수혈시 철분의 흡수가 증가함에 따라서 철분의 함량이 과도하게 적체된다. 페리틴과 트란스페린이 체내에 포화되면, 철분은 여러 가지 종류의 조직들, 예를 들면, 심근층, 간장 그리고 내분비기관에 독성작용을 가져온다. 철 착화제(킬레이트제)의 연구범위와 착화제(킬레이트제) 적용에 관한 제안서(Current Medical Chemistry, 2003, 10, 983-985, Tim F. Tam, et al)가 보도된 바 있다. 여기서 철 착화제는 히드록시 라디칼 형성을 방지할 수 있는 것으로 추정되어, 암치료, 말라리아, 국소빈혈적 후발성관류 그리고 퇴행성 신경질환에 유용하게 적용될 수 있다.

지중해 빈혈증을 주축으로 앓고 있는 환자는 수혈로 인한 축적된 철을 방출할 수 있는 대책이 없으므로 철 착화제인 데스페랄(desferal), 데스페리옥사민 메실레이트(desferrioxamine mesylate), 페리프록스(feriprox),데페리프론(deferipr온)을 이용하여 환자들의 체내에 과도하게 형성된 철분을 제거하는데 적용하였다. 데스페리옥사민은 환자들에게 일일 투여 간격이 피하 주사에서 8-12시간으로 규정되어져 있다. 현재는 디페리프론(1,2-디메칠-3-히드록시-4-피리디논)은 구강으로만 투여하게 되어 있다. 간장에서는 허용된 복용 양으로는 심한 대사 작용이 동반되며 85%이상이 착염되지 않은 오-글루클로나이트 상태로 소변에 배설되었다고(Drug Metab. Dispo. 1992, 20(2) 256-261 Singh S. et at al.) 발표하였다. 철분이 축적된 체내를 치료하기 위하여서는 상대적으로 높은 량의 구강 투여제는 75 mg/kg, 1일 3.5-4gm이 요구되었다. 그래서 디페리프론 보다 약리 효과가 바람직한 새로운 구강 투여용 히드록시피리디논 활성제를 고려해 볼 필요가 있다.

보스트(Voest)외 여러 연구원들은 철분이 적체되어 있지 않은 상태에서 철의 착화제 킬레이트에 관한 임상실험을 보도하였다(Annals of Internal Medicine 1994, 120, 490-499). 철이 착화제 킬레이트로서 항산화 효과, 항 증식효과, 원생동물의 생육억제 효과, 알루미늄의 착염에 적용될 수 있고, 각종 질병, 예를 들면, 류마티스 관절염, 안트라사이클린 심장독 손상, 한정적 진균 분문에서 허혈관류 손상, 항 종양약제, 말라리아의 치료에 적용될 수 있다.

추가적으로, 벤 아스벡 비. 에쓰와 여러 연구원은에서 철 착화제 킬레이트는 인간 면역 결핍 바이러스인 HIV에 대항하는 활성을 가진다고 하였다(J Clin Virol. 2001 Feb;20(3):141-7). 이러한 사실로 보아서 이온 착화제는 인체에 적체된 철분을 처리하는 방법에만 극한 되어져 있는 것은 아니다.

3-히드록시-4-피리디논의 등급에 속하는 구성원들은 철을 킬레이트 할 수 있는 능력이 있다는 점이 이미 알려져 있다. 이전부터 이러한 기술은 미국특허 RE 35,948, 미국특허 6,448,273, 미국특허 6,335,353, 미국특허 5,480,894에 등재되어져 있었다. 그리고 미국특허 6,335,353에는 기존 약의 치료효과를 향상시키기 위한 에스테르 프로 드러그는 인체의 간에서 철분을 추출하는데 효과적으로 사용되어졌으나, 시판된 이러한 어떤 복합약제도 약제 평가를 받지 못하였다.

한편 다른 시도에서는 선발된 새로운 복합물은 디페리프론의 분자구조에서 C3 산소는 제 2 대사 O-글루쿠론화를 저지하도록 설계하였다. 미국특허 5,688,815에서 1-알킬-3-히드록시-4-피리디논에 C2-메틸그룹이 페닐 또는 헤테로링으로 대치되고 또 히드록시 그룹으로 대치되고 N1치환기는 저급산 알킬로 구성되어져 있다. 미국특허 6,335,353에서는 1-알킬-3-히드록시-4-피리디논이 C2에서 알킬카르밤, 아릴카르밤, 아랄킬카르밤 그룹으로 구성되고 N1-치환기는 지방족 탄화수소 그룹으로 설명되어져 있다. C2-메틸카르밤의 기능적인 응용은 CP502(1,6-디메틸-3-히드록시-4(1H)-피리디논-2-카르복시-(N-메틸)-아마이드 하이드로클로리드: 미국특허 6,335,353)에 있는 C3 산소에서 효과적으로 O-글루쿠론화를 저지시킨다. 또 다른 유사한 약제는 미국특허 6,335,353 에서 CP506(1,6-디메틸-3-히드록시-4(1H)-피리 디논-2-카르복시-(N-이소프로필)-아마이드 하이드로클로리드), C2-이소프로필카르밤 유사체 그리고 CP508(1,6-디메틸-3-히드록시-4(1H)-피리디논-2-카르복시-(N,N-디메틸)-아마이드 하이드로클로리드), 디메틸카르밤 유사체 들을 포함한다.

CP502, CP506 그리고 CP508은 이미 이전부터 존재하였으며 인체에 대한 약제 평가는 하지 않았다.

발명의 개요

본 발명의 첫 번째 태양은 하기 화학식 1의 약제로 받아들일 수 있는 화학식 1의 염을 포함할 수 있는 3-히드록시피리딘-4-온 화합물을 제공하는 데 있다.

(화 학 식 1)

상기 식에서 R²가 Y 라는 조건으로 R¹은 X ;

또는 R²가 W라는 조건으로 R¹은 T;

X는 C₃-C₆ 사이클로알킬;

Y는 C₃-C₆ 사이클로알킬, C₁-C₆ 알킬 그리고

T는 C₁에서 C₆ 알킬;

W는 C₃-C₆ 사이클로알킬;

R³는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택되고;

R⁴는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택되고;

R⁵ 는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택됨.

본 발명의 두 번째 태양은 철분의 과잉으로 인한 질병의 치료에 있어서 화학식 1의 화합물을 사용하는 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 세 번째 태양은 화학식 1의 화합물로 구성된 약제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 화합물 중 한가지 바람직한 등급이라고 할 수 있는 화합물은 화학식 1에서 R²가 Y라는 조건으로 R¹은 X인 화학식 1의 화합물이다. 이때 X는 C₃-C 사이클로알킬; Y는 C₁-C 알킬; R³는 수소; R⁴는 C₁-C 알킬 그리고 R⁵는 수소이 다.

여기에 종속된 더 바람직한 화합물은 R⁴는 메틸, X는 사이클로프로필 그리고 Y는 메틸인 화학식 1의 화합물로서, 이 화합물은 1-사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아마이드이다.

본 발명의 두 번째 바람직한 등급의 화합물은 화학식 1의 화합물이며 여기에서 R²가 Y라는 조건으로 R¹은 X, X는 C₃-C 사이클로알킬,Y는 C₃-C사이클로알킬, R³ 는 수소, R⁴는 C₁-C알킬 그리고 R⁵는 수소이다.

여기에 예속된 바람직한 화합물은 R⁴가 메틸, X=Y=사이클로프로필인 화합물로서, 이 화합물은 1-사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로프로필아마이드이다.

세 번째 바람직한 등급의 화합물은 화학식 1의 화합물로서, 이때 R²가 W라는 조건으로 R¹은 T; T는 C₁에서 C₆알킬; W는 C₃-C_{6사이클로} 알킬, R³는 수소, R⁴는 C₁-C₆알킬 그리고 R⁵는 수소이다.

여기에 예속된 더 바람직한 화합물은 R⁴가 메틸, T는 메틸 그리고 W는 사이클로프로필으로서, 이 화합물은 3-히드록시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로프로필아마이드이다.

본 발명에서 네번째 바람직한 등급의 화합물은 화학식 1 의 화합물로서 이때 R²가 Y라는 조건으로 R¹ = X;, X가 C₃-C_{6사이클로}알킬; Y는 C₁-C₆알킬; R³은 수소; R⁴는 C₁-C₆알킬, R5는 메틸이다.

여기에 예속된 더 바람직한 화합물은 R⁴가 메틸, X는 사이클로프로필 및 Y는 메틸이고, 화합물은 1-사이클로프로필-3히드록시-N, N, 6-트리메틸-4-옥소-1, 4-디하이드로피리딘-2-카르복스아마이드이다.

본 발명에서 가장 바람직하다고 하는 화합물들은 하기 화학식 1A에 따른 화합물 1A 이며, 이때 R¹= X =사이클로 프로필, R²=Y 라고 전제한다면 R³ = H, R⁴=메틸 그리고 Y는 C₃-C₆ 사이클로알킬 그룹에서 선택; C₁에서 C₆ 알킬은 C₃에서 C₆ 까지 사이클로알킬로 단순 치환되며; 또는 R¹= X = 사이클로 프로필, 피페리딘기, 머포린기, 피로리딘기 또는 피페라진 기들이 치환되지 않거나 치환된 하나에서 세 개의 C₁-C₆ 알킬 그룹인 피페리딘기, 머포린기, 피로리딘기 또는 피페라진기들로부터 선택된 헤테로사이클 링으로 함께 묶여진 형태의 R²R⁵N라고 전제한다면 R³ =H, R⁴=메틸이다.

(화학식 1A)

상기한 바에 따라 비추어 본다면, 본 발명은 3-히드록시-4-피리디논의 사이클로알킬 유도체이며 이전의 기술로 보도된 화합물과 비교하여 보면 향상된 성질을 보여주고 있다. 사이클로알킬기는 N1 과/또는 C2 아미도 N 원자에 첨부되어져 있다. 이것을 응용하기 이전에는 N1 사이클로알킬 치환기 또는 C2 아미도 N-사이클로알킬기로 치환된 화합물은 문헌에 잘 알려져 있지 않다. 이 화합물들은 기존약의 치료효과를 상승시키기 위한 프로드러그(prodrug)가 아니고 탁월한 금속 이온 선별력을 가졌다. 이들 화합물들은 칼슘이나 마그네슘 같은 필수 금속과는 복합물을 형성하지 않는 점이 pH 7.4 화학분석에서 보여주었다. D₇ _.4라는 수치는 완성된 제약인 디페리프론의 범위내에 있으며 철분이 과잉된 쥐의 경우 경구 투여에서 활성을 나타내었다. 이 화합물은 유리한 범위 8.3에서 8.8인 페놀 C3 OH pKas, pFe³치수가 20이상에서 부드럽게 1:3의 철 킬레이트 형성이 본 과제의 계획에 의하여 명백히 계획 되어졌다. 그리고 D₇ _. ₄치수는 0.1보다 크다. Fe(III)을 킬레이트한 단순 결정체 구조는 화학식 1 의 화합물에서 이좌배위자 리간드(bidentate ligand) 라는 것을 확인할 수 있다.

도 1 은 Apo6622(1-사이클로 프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1, 4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로프로필 아마이드)에서 발명의 구성을 단계별로 설명한 도해도로서, 화학식 1 의 화합물을 나타냄.

도 2 는 Apo6617(1,6-디메틸-3- 히드록시-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로프로필 아마이드)에서 발명의 구성을 단계별로 설명한 도해도 로서, 화학식 1의 화합물을 나타냄.

도 3 은 Apo6619(1-사이클로 프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카복실 산 메틸 아마이드)에서 발명의 구성을 단계별로 설명한 도해도로서, 화학식 1의 화합물을 나타냄.

도 4 는 Fe³ ⁺- Apo6619의 특정 구성도.

도 5 는 Fe³ ⁺- Apo6617의 특성 구성도.

도 6 은 Apo6619와 Apo6617에서 유래된 철이 과도하게 적재된 쥐에 있어서(n=6) 소변으로 배설된 증진 효과에 관한 설명도.

도 7 은 Fe(Apo6617)₃킬레이트된 단순 결정체 구조.

도 8 은 Fe(Apo6619)₃킬레이트된 단순 결정체 구조.

도 9 는 pH 7.4에서 철 -Apo6619 시스템의 주기식 볼트 그래프.

표 1 : 화학식 1 에서의 화합물의 화학적 성질.

표 2 : Apo6619 의 금속 결합의 선택성.

표 3 : 철 분이 과잉된 쥐에 있어서 Apo6619와 Apo6617에 의한 대변으로 배설된 철분의 증진 효과. 단위 치수는 μg/day/Kg로 표기

표 4 는 철분이 과잉된 쥐에 있어서 Apo6619와 Apo6617에 의한 대변과 소변으로 배설 된 철분의 증진 효과(n=6/그룹). 단위 치수는 μg/day/Kg 표기. 대변으로 배설된 결과 치수는 킬레이트 착화제 사용 3일후가 표기되었고 킬레이트 시행하기 3일전에 기준선과 비교하였음. 숫자는 평균치±1SD.

표 5. Fe(Apo6617)₃의 결정체 데이터 와 세밀한 구조.

표 6. Fe(Apo6617)₃의 결합간격 [Å] 과 결합각도 [°].

표 7: Fe(Apo6619)₃결정체 데이터 와 세밀한 구조.

표 8. Fe(Apo6619)₃의 결합간격[Å] 과 결합각도 [°].

본 발명에서 사용되는 용어 중, "알킬"이란 측쇠가 있든가 또는 측쇠가 없는 포화 탄화수소 사슬이며 다른 표기가 없는 이상, 하나에서 여섯 개의 탄소원자를 일컫는 것으로서, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-프로필, 부틸, 이차 부틸, 이소 부틸, n-펜틸, 헥실이 제한되지 않고 포함되어진다.

"사이클로 알킬”이라는 용어는 단독으로 또는 하나의 링을 함유하고 포화 사이클 탄화수소 그룹을 포함하는 다른 그룹의 일부로 적용되며, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실을 포함하는 세 개에서 여섯 개의 탄소를 형성하는 모노 사이클 알킬을 포함한다.

약제로 허용되고 비독성인 염은 본 발명에서 화합물로서 제약적으로 허용된 염으로 언급되며, 원칙적으로 화합물의 생물학적 활성이 유지되거나 생물학적으로 활성이 없거나 또는 다른 면으로 기대치 않은 방향을 생각할 수 있다(예를 들면, 염은 화학적으로 안정되었다.) 두 가지 형태의 염이 본 발명의 화합물로 구성되어졌다: (1) 무기 염 또는 유기 염 을 기초로 한 화학식 1 화합물은 페놀 기능기를 가짐, (2)산이 첨가된 염은 본 발명 화학식 1 화합물의 기능성 아민기에서 형성된다.

약제로 허용되어진 염은 무기물을 기초로 한 나트륨, 칼륨, 리듐, 암모늄, 칼슘, 그리고 마그네슘 염들이다. 특히 바람직한 염은 나트륨, 칼슘 그리고 마그네슘 염이다. 약제로 허용되고 유기물을 기초로 된 비독성인 염은 일차, 이차, 삼차 아민염을 포함하며, 치환된 아민은 자연에서 볼 수 있는 치환아민, 사이클아민 그리고 염기성 이온수지들을 포함한다. 이러한 염들은 예를 들면 2-아미노-2-히드록시 메틸 프로판 1,3-디올, 이소 프로포피라민, 트로메타민, 글루코자민, 메틸글루카민, 퓨린 ,피페라민, 엔-에틸피페리딘, 폴리아마이드 수지 등이 좋은 예가 된다.

약제로 허용되고 산이 첨가된 염은 유기산 또는 무기산을 형성한다. 예를 들면 할로산, 황산, 질산, 인산, 메탄슬폰산, 에탄슬폰산이 여기에 해당된다.

본 발명의 화합물은 4-옥소-1,4-디하이드로 피리딘-2-카르복아마이드 유도체들로부터 유래된 2-아미도 유도체들이며 일반적 구조를 하고 있다.

대부분의 화합물들은 4-옥소-1,4-디하이드로 피리딘-2-카르복아마이드의 유도체로서 명칭되며, 예를 들면:

1-사이클로프로필-N-헥실-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복아마이드:

N-사이클로헥실-1-사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복아마이드:

N-(사이클로헥실메틸)-1-사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복아마이드:

어떤 경우, 화합물은 기본 구조에서 “피리딘-4(1 H)-온” 라고 사용한 이름을 사용하고 있다. 예를 들면:

1-사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-2-(머포린-4-일카보닐)피리딘-4(1H)-온:

1-사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-2-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]피리딘-4(1 H)-온:

본 명세서에서“동물”이라는 용어는 여러 동물 품종 뿐만 아니라 인간도 함께 언급하며, 특히, 포유동물(예를 들면 개,고양이, 말, 돼지(등), 파충류, 물고기, 곤충, 기생충들을 포함하고 있다.

본 발명에서의 화합물은 잘 알려져 있는 디페리프론 유사체의 효능을 증진 시키는데 주력하였다. 한가지 판단 평가의 기준으로 구강투여 활성 킬레이트 착화제인 3-히드록시-4-피리디논 시리즈가 pFe³ ⁺디페리프론 pFe³ ⁺ =19.7보다 더 높은 수치를 기초적인 원리로 계획하였다. pFe³ ⁺에 관한 정의는 용액에서의 철이온의 농도를 여기에서 나타내고 있으며 총 철의 함량은 10^-6M 과 동등하며 리간드(ligand)의 농도는 10^-5M, pH는 7.4. 실험실에서 측정된 pKa와 금속 복합지수는 하이퍼퀘드 소프트웨어(21.버젼, 피터 간스, 리스대학교). pKa 치수의 하락은 C3페놀 OH에서 8.8 이하로 낮을 경우 선호되는 복합지수 β₃와 결합될 때 pFe³ ⁺가 높아진다.

복합체에 대한 계념은 아래에서 자세히 설명하겠다.

3-히드록시-4-피페리논과 같은 이좌배위자 리간드의 단계별 모든 복합지수는 다음과 같다:

Fe(III) + 리간드 → Fe[리간드]₁ K₁

Fe[리간드]₁ +리간드 → Fe[리간드]₂ K₂

Fe[리간드]₂ +리간드 → Fe[리간드]₃ K₃

복합지수 β₃ = K₁.K₂.K₃

철 킬레이트 착화제 디페리프론(1,2-디메틸-3-히드록시-4-피리디논)은 복합지수(log β₃)36.3과 pFe³ 19.7에서 철은 착화된다. 디페리프론의 pKas는 3.56과 9.64이다. 본 발명에서 대부분의 화합물은 유사한 복합지수(log β₃)범위가 34-36이며 pFe³ ⁺>20이며 페놀의 pKa는 8.3-8.8이다. 본 발명에서 화합물은 Fe(III) 착화염으로 우수하다. 인체의 빈 내장에서의 화합물이 투과하는 능력은 시판되는 상표명, QMRRP Pl미국특허 소프트웨어제품(시뮬레이션 플러스사)에 의하여 이론적으로 계산되었다. 발명에서 대부분의 화합물에서 투과력 eff는 1±0.3(cm/s x 10^-4)범위를 나타내었으며, 인체의 빈 내장에서 화합물은 투과력 효율에 좋은 결과를 가져왔다. 인체의 빈 내장에서 화합물은 투과력에서 좋은 결과를 적용할 수 있다. 화학식 1 의 대표될 만한 화합물의 화학적 성상을 표1에서 보여 준다.

화학식 1 의 화합물에서 사이클로알킬 그룹 R¹및/또는 R²들은 금속 킬레이트 착화염으로 유의성 있게 높은 pFe³ ⁺치수를 보여 준다. 화학식 1의 화합물 D₇ _. ₄의값은 디페리프론과 유사하다. 그리고 지속적인 연구에서 철분이 과잉 적재된 쥐에서 화학식 1 의 화합물이 체내의 철분을 제거하는데 효과적이였음을 보여 준다. 동물에 있어서 구체적인 효과에 관한 연구는 아래에 있는 예에서 보여 준다.

화학식 1의 화합물은 예를 들면 망간, 칼슘, 마그네슘 같은 필수금속은 결합하지 않는다. 화학식 1의 대표적인 화합물의 pM치수와 복합지수는 표2에 도시하였다(그리고 실시예 11에서 더 상세하게 거론된다.). 화합물은 Fe³ ⁺을 결합하는데 화학적으로 2가와 3가 금속들, 예를 들면, 구리, 아연, 알루미늄과 같은 금속보다 더 양호하게 결합된다.

화학식 1의 화합물은 3-히드록시-4-피리디논으로부터 유래된 새로운 사이클로알킬 유도체이다. 이 화합물들은 pFe³ ⁺치수가 20이상이면 D₇ _. ₄치수는 유리한 조건으로 디페리프론과 비교되며, Fe³ ⁺의 킬레이트가 쉽게 발생하며 그리고 C2-알킬카르밤 또는 C2-사이클로알킬카르밤의 몫은 3-OH그룹의 제2대사 작용을 저지시킨다.

위 사항에 추가하여, 화학식1의 화합물은 Fe³ ⁺을 생리환경 pH7.4에서 1:3의 비율로 결합한다. 본 과제의 구상을 분석하여 보면 1:3의 비율로 철 금속을 킬레이트 착화시키는 것이 확인된다(도 1 내지 3 및 실시예 9).

종 분화에 따른 계획이 하이퍼 퀴드 시뮬레이션과 종 분화 소프트 웨어를 이용하여 pKa와 (실시예 10과11) 복합지수 K₁.K₂.K₃(실시예 14)를 적용하여 철 복합체와 여러 pH와의 비율이 산출되었다. 도 4와 5는 서로 다른 pH에서 화학식 1의 화합물 종 분화에 대한 도면을 설명하고 있다. 두 가지의 연구에서 화학식 1의 대표적 화합물이 오로지 pH 7.0이상에서 FeL₃킬레이트 형을 취하고 있다(L은 이좌 배위자 리간드). 그러므로 생리 pH 상태에서 FeL² ⁺ 또는 FeL² ⁺의 존재를 확인할 수 없다. 이러한 종이 존재하지 않음은 철이 생리적 환경인 pH 7.4의 체내에서 발견되지 않음을 확인할 수 있다.

화학식 1의 화합물에서 R²가 Y라는 조건에서 R¹는 X 또는 R²가 W라는 조건에서 R¹는 T이라는 방법을 다음의 도식 1에서 제시하였다.

(도식 1)

산(II)을 1,1,-카보닌디이미다졸과 2-5시간 가능하면 5시간을 비 활성용액에서 온도 30-70℃로 반응시킨다. 연이어 아민 R²R⁵NH를 첨가하고 화합물(III)은 일반 전통적인 방법으로 추출되었다. 용액(III)과 아민 R¹NH₂는 비활성 용액인 알콜에서 아민의 삽입에 영향을 주기 위하여 50-80℃로 가열하고 화합물(IV)을 생성시키기 위하여 3-48시간동안 가열한다. 화합물(IV)을 생성하기 위한 대체적인 방법으로는 산성 화학식(V)을 생산하기 위하여 비활성용액에서 아민 R¹NH₂과 화학식 (II)의 화합물과 반응이 포함된다. 화합물(V)은 화학식의 화합물(IV)를 생산키 위해 이때 티오닐 크로리드와 디메틸 포르마미드가 반응한다. 화합물은 일반 전통적인 방법인 칼럼 크로마토그라피 방법과 크리스탈화 방법을 이용하여 추출하였다. 화합물(IV)의 수소 첨가는 알콜 용액에서 수소 첨가 촉매제를 이용하여 화합물(I)을 제조할 수 있다. 잘 알려진 수소 촉매제는 페러디움 탄소 또는 페러디움 히드록시드 탄소 그리고 레니 니켈이 사용된다. 최초에 적용하는 산(II)에 관하여서는 미국특허6,426,418에 공개되어져 있다. 화학식의 산(V)을 제조하기 위한 일반적인 진행 방법은 캐나다특허2379370에서 찾아 볼 수 있다.

화학식 1의 화합물들은 철분이 과도하게 축적된 쥐에게 시험이 되었다. 대변으로 배설된 철분과 소변으로 배설된 대표적인 화합물 Apo6617과 Apo6619에서 유래된 결과가 표 3과 4 그리고 도 6 에서 각 각 보여 주고 있다. 두 개의 화합물은 구강 투여 113과 450μmol/kg을 비교하여 보면 유의성있게 철이 배설된다 할 수 있다. 아울러, Apo6619와 Apo6617에서 유래된 소변에서 배설된 철의 배설물은 디페리프론 450μmol/kg 보다 유의성 있게 더 많이 배설되었다. 이 두 개의 화합물은 철분으로 적체된 쥐의 철분 유동에서 디페리프론 보다 더 효력이 있다.

화학식 1 에서의 철 킬레이트화합물은 합성되고 분리되어진다(실시예 16). Fe(Apo6617)₃ 과 Fe(Apo6619)₃ 의 단일 크리스탈 구조에서 이좌배위자 화합물은 Fe(II)과 반응하여 1:3의 비율로 트리스 바이덴테이트 킬레이트를 한다는 점이 입증되었다(표 5 내지 8, 도 7-8).

화학식 1의 화합물의 설계에서 또 다른 평가기준은 pH 7.4 철 킬레이트 시스템에서 산화 환원 전위의 치수가 음극 -320mv 이하(NHE와 비교)에서 산소와의 어떤 반응을 방지하기 위한 대책에 관련되어져 있다. 철은 Fe² ⁺와 Fe³ ⁺의 복합상태로 존재한다. 철(II)와/ 철(III)의 쌍은 전자를 하나 감소하는 쌍으로 작용하며 산화제 작용을 한다. 크름브리스(http://www.medicine.uiowe.edu/FRRB/VirtualSchool/Crumbliss-Fe.pdf))와 피에레(Biometals,12,195-199,1999)에 의하면 산화 환원 전위를 조절하여 철을 선택적 킬레이트하는 것은 촉매반응으로 생산되는 독성 히드록시 라디칼 또는 활성 산소류(ROS)의 생성에 철이 관여하는 것을 방지하기 위한 수단이라고 하였다(예를 들면, 펜톤의 반응 또는 하버 바이스 싸이클 을 경유). Fe(III)-산화 환원 전위 -320mv 이하(vs. NHE 또는 -540mv vs Ag/AgCl) pH 7.4의 트리스 킬레이트 시스템에서는 예를 들면 NADPH/NADH와 같은 어떤 생물학적 환원 물질에도 환원되지 못한다. 그러므로 어떤 ROS(활성 산소류)를 발생시키기 위하여 하버 바이스 싸이클에 관려할 수 없다. 포유 동물의 체내에는 철이 여러 가지 단백질과 결합되어져 있다. 예를 들면, 트란스페린은 인체의 혈액에 존재하며 어떤 산소 분자와도 반응하지 않는 형태로 유지시키려 한다. 트란스페린의 E½값은 -500 mv( vs NHE 또는 -720mv vs. Ag/AgCl)이다.

철의 화합물에서 산화 환원 전위는 사이클릭 볼트메타(CV)로서 측정할 수 있다. 철 킬레이트인 디페리프론, 디페리옥사민, Apo6619(본 발명의 대표적 화합물)은 각각 착화염 킬레이트이며 CV는 철의 산화환원 전위의 측정에 사용되며 실시예 17 에서 설명되어진다. 철 킬레이트, 예를 들면, Fe-데스페리옥사민(DFO) 그리고 Fe-(디페리프론)₃은 산화 환원 전위 E½값이 pH 7.4에서 각각 -691mv(Ag/AgCl과 비교) 와 -834mv이다. 화학식 1 의 화합물 Fe(Apo6619)₃는 E½값이 -691mv(Ag/AgCl과 비교)이며 데스페리옥사민과 유사하다. Fe-DFO, Fe(디페리프론)₃, Fe(Apo6619)₃의 사이클 볼트 그래프는 도 9 에서 표시하였다. 본 발명에서 착화염 킬레이트의 한가지 유리한 점은 이온 킬레이트 산화 환원 전위가 생리 pH 7.4에서 극단적으로 낮은 음 범위에 있다는 점이다. 그러므로 이온 킬레이트는 생리pH에서 활성 산소류를 생산하기 위한 산화 환원 반응의 주기에 참여하지 않는다. 본 발명에서 서술된 다른 새로운 성상을 연결시켜 본다면 화학식1의 화합물들은 킬레이트 메카니즘을 통해 철을 제거하는데 효과적인 약제이다.

철분 과잉 질병, 지중해 빈혈증, 적혈구 빈혈, 색소증과 환자의 철의 고 농도 독성치료에서 본 발명의 화합물은 구강으로, 피부로, 주사로 용량과 구성에서 일반 비 독성 약제로서 매개체이며 보조제이며 부형 약으로 허용되어져 있다.

철의 과잉으로 인한 조건이 아닌 치료, 예를 들면, HIV감염, 안트라 사이클린 카디아 중독예방, 발암, 말라리아 치료에서 본 발명의 화합물은 구강으로 투입, 피부로, 주사로 사용단위별로 투여될 수 있으며 조성에서는 일반적인 비독성 약제로서 매개체이며 보조약이며 부형 약으로 허용되어져 있다.

주사투여라는 용어는 여기에서는 피하주사 또는 정맥 주입 기술을 의미하는 것으로, 온혈동물 예를 들면 생쥐, 쥐, 말,가축, 양, 개, 고양이 등의 치료에 추가되며, 본 발명의 화합물은 인간의 치료에 효과적이다.

약재의 조성에 사용하기 위하여 일반적인 비독성 고체 매개체가 포함된다. 예를 들면 약재의 등급에서 만나당, 유당, 전분, 마그네슘 스테아르산 염, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로즈, 포도당, 설탕, 마그네슘 카보네이트와 같은 물질이 사용되어진다. 위에서 언급한 활성화합물은 약제로 구성되어져 있다. 약제로 허용된 조성물질은 용해, 분산 등으로 제조되어진다. 활성 화합물은 위에서 언급하였으며 선택적 보조약은 매개체 예를 들면 수분, 염류, 포도당,글리세롤, 에타놀 등, 그것으로 용해나 분산을 시키기 위하여 필요하다면, 제약의 조성에서 비독성 보조 물질 습윤제 또는 유화제와 같은 예를 들면 소듐 아세테이트, 소비톨, 모노라우레이트,트리에타노라민, 나트륨 아세테이트, 올레이트 등 허가된 소수의 양이 첨가될 수 있다. 실제적으로 이러한 적정량 형태로 제조하는 방법은 잘 알려져 있거나 이러한 기술이 숙달된 것이 확실하다(예를 들면 레밍톤 약제과학, 맥출판사, 이스톤, 1975년 15권). 형성된 조성성분이 허가되었으며, 좌우간, 활성화합물의 분량이 함유되어 있으므로 치료되고 있는 주체의 증상이 양적으로 완화되고 있다.

활성재 구성하고 있는 약재는 구강 투여용으로 적합하다. 예를 들면 알약, 정제, 마름모 꼴, 수용액 또는 지방에 분산시키거나 분산 분말 또는 과립체, 유상액, 부드럽고 또는 단단한 캡슐, 또는 시럽이나 엘릭시르로 사용할 수 있다. 구강 투여용으로 쓰이는 조성물은 약제 구성물의 알려진 제조 기술에 의하여 제조되어지며 이러한 조성물은 약제 조성물의 알려진 제조 기술에 의하여 제조되어지고 구성물은 하나 또는 그 이상의 물질 감미료, 향신료, 착색제, 보존료가 품위 있고, 입에 맞는 조제식품을 만들기 위해 사용된다. 알약은 알약을 만들기 적합하게 비독성 약제로 허용된 첨가물이 포함된 활성요소가 함유되어져 있다. 첨가물은 예를 들면 비활성 용매제 예를 들면 칼슘 포스페이트 또는 나트륨 인산염:과립제 또는 분산제 예를 들면 옥수수 전분 또는 알긴산: 결착제로는 전분, 겔라틴 또는 아카시아 그리고 윤활제 마그네슘, 스테아르산 염, 스테아르산 또는 활 석. 알 약은 알 약이 분해되는 것과 흡수되는 것을 소화기 장내에서 지연하기 위하여 장시간 동안 일관된 활성을 제공시킨다. 유연제, 유화제, 가습제, 모노스테아레이트 또는 글리세린 디스테아레이트가 사용된다.

구강용 알약의 조성은 단단한 겔라틴 캡슐을 사용하고 있다. 활성성분은 비활성 고형 희석제에 혼합하였다. 예를 들면 칼슘 포스페이트 또는 카오린, 부드러운 겔라틴 캡슐 활성요소가 물 또는 오일 매개체와 섞여져 있는, 예를 들면, 땅콩유, 파라핀 용액, 올리브유. 수성 현탁은 활성제로 수성현탁에 적합한 첨가물을 혼합하여야 한다.

수성 현탁은 활성제로 수성 현탁에 적합한 첨가물을 혼합하여야 한다. 이러한 혼합물로서는 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로우즈, 메틸 셀룰로우즈, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로우즈, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐 피로이돈, 껌, 아카시아 껌 등이 있다. 분산시키거나 수분을 함축시키는 재료로는 천연산 포스페이트이며 예를 들면 레시친 또는 지방산 알긴 옥사이드 예를 들면 폴리 옥시 에틸렌 스테아레이트, 장사슬 환상 알콜과의 에틸렌 옥사이드 제품의 중합체 예를 들면 해프타 데카틸, 또는 지방산, 또는 무수헥시톨로 부터 일부 에스테르화 된 예를 들면 폴리에틸렌, 소비탈 모노 올레이트, 수성 부유는 하나 또는 여러개의 보조재료를 포함하고 있다. 예를 들면 에틸, 엔 프로필, 피-히드록시 벤조 에이트, 하나 또는 그 이상의 착색제 예를 들면 설탕 또는 사카린 등이 있다.

유성 부유는 활성재료로는 식물성 유의 부분에 의하여 형성되어 질 수 있다. 예를 들면 식물의 옆 오일, 올리브 오일, 깨소금, 코코낫 유, 파라핀 유 같은 유제의 부유는 농후제를 사용한다, 예를 들면 꿀벌들의 왁스, 경 파라핀 또는 아세틸 알콜, 단미제 위에 언급되었고 향료는 입맛에 맞게 약제에 제공되는 물질이다. 이 물질은 항산화제 예를 들면 아스코르빈산의 첨가에 의하여 보존이 가능하다.

분산 분말과 분산 과립은 수성 부유 약제를 제조하기에 적합하다. 물의 첨가는 활성 재료의 분산 또는 수분 함축제 또는 부유제는 모두 위에서 언급하였다. 감미료, 향료, 착색제는 말할 나위없이 부가적인 처방으로 존재한다.

본 발명의 약제조성은 수분에서의 지방 분산형을 고려할 수 있다. 지방의 형상은 야채 오일, 예를 들면 올리브 오일 또는 아라키 오일, 또는 미네랄 오일, 예를 들면 액상 파라핀 또는 이것들의 혼합물. 가장 적합한 유화제는 자연에서 확보할 수 있는 인산염, 지방산으로부터 유래된 에스테르 그리고 무수 헥시톨, 예를 들면 소비탄 모노 올레이트 등이 있고, 그리고 에틸렌 옥사이드가 있는 부분 에스테르 제품의 중합체는 예를 들면 폴리 옥시 에틸렌 소비탄 모노올레이트 등이 있다. 유화제(에물젼제) 역시 감미제 와 향신제를 함유할 수 있다.

시럽과 엘릭시르는 감미제로 구성되어 질 수 있다. 예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 오비탈 또는 설탕 등이며, 이러한 조성체는 완화제. 보존제, 향신료, 착색료가 함유될 수 있다. 약제의 조성은 적당한 분산제 또는 수분 함유제, 현탁제는 위에서 서술하였다. 멸균 주사 준비물은 멸균된 용액 또는 비 독성 비 경구용 희석제 또는 용매에 현탁된 것인데 예를 들면 1,3 부탄 디올 용액이고, 허용된 부형 제약과 용매는 수분, 링겔 용액, 생리 식염수 등장액이 적용되었다. 비휘발성 유지가 용매 또는 현탁매로서 상용되었다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 어떤 자극성이 없는 비휘발성 유지는 합성 모노 글리세라이드 또는 디 글리세라이드가 사용되었다. 부가적으로 지방산 예를 들면 올레인 산은 조제약이나 주사용으로 사용할 수 있다.

화학식 1 의 화합물 또는 제약에 허용된 염류 그것으로부터 그리고/또는 제약에 허가된 요매화합물 들은 상용화된 피부용 첨가물과 융화되어 피부용 조제 성분으로 함께 사용될 수 있다. 피부용 조성 형태로 오인트먼트, 크림 또는 로션, 충만한 연고, 젤리, 젤 스틱스프레이, 에어로졸을 들 수 있다. 조성 형태에서 합당한 상용화된 첨가물로서 예를 들면 보존재, 침투를 원활히 하는 용매 그리고 오이트먼트와 크림에 있는 연화제들이 함유될 수 있다. 조성분 들은 융화성 있는 매체인 예를 들면 크림 또는 오인트먼트 기반으로 조성되며 역시 에타놀 또는 올레일 알콜이 로션에 사용될 수 있다. 피부용 약제 조성은 주제에 따라 치료하고 증상을 경감 시킬수 있는 활성 함량이 포함되어져야 한다는 점을 관찰하여야 한다. 화학식 1 의 화합물에 적합하게, 또는 약제에 허용된 염에 의하여 조성분 중량의 0.5에서 10% 까지 조정할 수 있다. 적당한 크림, 로션, 젤리, 스틱, 오인트멘트, 스프레이 또는 에어로졸 조성은 화학식1의 화합물로 사용하거나 약제로 허용된 염인 경우 상용되는 조성분은 형태에서 잘 알려져 있다(예를 들면 표준 책자 레밍톤 제약 과학, 맥 출판사, 이스톤 15권 1975, 83p 1436-1460 , 89p 1576-1607).

비 구강용으로는 일반적으로 주사를 특징적으로 언급한다. 주사는 상용적인 방법으로 액체용액으로 또는 주사하기 전에 용액에 현수시키거나 유탁제를 형태를 이용한다. 추가하여 필요성이 있다면 약의 조성은 소수의 분량으로 비독성 보조 물질 예를 들면 수분 함축제 또는 현탁제, 수소이온 완충제 등과 같은 예를 들면 나트륨 아세테이트, 소비탄 모노 라우레이트, 트리 에타노라민 올레이트 등이 사용되어진다.

활성 성분의 분량은 투여되는 일회분의 분량을 만드는 운반 매개체와 관련되며 섭취하는 동물에 따라 다르며 사람인 경우 허용되는 분량은 0.5mg에서 5㎎의 활성제가 적합하고 매개체의 분량은 변동적이며 조성분의 5-95% 까지 변화될 수 있다. 일회분의 투여 단위도 일반적으로 활성 성분이 1mg에서 500mg 까지 변동 될 수 있다.

특정한 환자의 특별 투여 분량은 화합물의 활성 환자의 연령, 체중, 일반적 건강상태, 성별, 다이어트, 섭취할 수 있는 시간, 약재의 결합 그리고 어떠한 심한 질병에 처하여 치료를 받고 있는 상태인지에 따라서 다르게 투여 분량이 정해진다는 것이 이해되어진다.

본 발명의 화합물은 미국특허 6,448,273, 미국특허 6,335,353, RE 35,948 및 미국특허 5,688,815와는 차이가 있다. 처음 세가지 특허는 3-히드록시-4-피리디논은 하나의 N1 탄화수소 그룹을 가지고 있다. 미국특허 5,688,815 역시 3-히드록시-4-피리디논이 하나의 N1이 저급 알킬 그룹으로 치환되거나 치환되지 않거나 하는 것을 설명하고 있다. 표준 화학 교과서에 의하면, 제임스 비 헨드릭선, 도날도 제이 크람, 조지 에스 함몬드 저서인 제 3권 1970년 맥그로 힐 72페이지에서 지방족 탄화수소들의 탄소 원자 사슬의 구성은 링으로 배치되어져 있지 않다고 한다. 이 그룹에 속하는 물질들은 때로는 열려진 사슬 화합물이라고 불리운다. 지방족 탄화 수소 그룹의 예를 보면 직사슬이거나 측쇠 알킬 예를 들면 메칠, 에칠, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, 부틸 그리고 터어셜-부틸을 들 수 있다. 본 발명의 화합물은 3-히드록시-4-피리디논이 (a) N1-사이클로알킬 치환 그리고 C2 사이클로 알킬카르밤 치환 또는(b) N1-사이클로알킬 치환 그리고 C2사이클로알킬카르밤 대치 또는 (c) C2 사이클로 알킬-카르밤 치환과 함께 N1-알킬 치환하고 있다. 그들은 비순환 탄화 수소 치환물로 이루어진 화합물이다. 비순환 탄화 수소에 있어서 탄소 사슬은 링 형태를 취하고 있다. 비 순환 탄화 수소 그룹은 사이클로알킬로부터 유도된 예를 들면 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 그리고 사이클로헥실이 여기에 속한다. 네 개의 미국특허 미국특허 6,448,273, 미국특허 6,335,353, RE 35,948 그리고 미국특허 5,688,815들은 3-히드록시-4-피리디논의 사이클로 알킬 유도체를 포함하지 않는다. 본 발명는 3-히드록시-4-피리디논 이 하나의 N1-사이클로알킬 그룹과 C2에 하나의 알킬 카르밤 그룹 또는 C2에 하나의 사이클로알킬 카르밤을 가각 포함하고 있다. 또 한 3-히드록시-4-피리디논은 N1-알킬 그룹과 함께 C2 에 사이클로알킬 카르밤을 포함하고 있다.

본 발명에 관하여서는 다음의 특정 실시예에서 더 자세히 설명된다.

도 2 는 Apo6617(1,6-디메틸-3- 히드록시-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로프로필 아마이드)에서 발명의 구성을 단계별로 설명한 도해도로서, 화학식 1의 화합물을 나타냄.

도 4 는 Fe³ ⁺- Apo6619의 특정 구성도.

도 5 는 Fe³ ⁺- Apo6617의 특성 구성도.

도 7 은 Fe(Apo6617)₃킬레이트된 단순 결정체 구조.

도 8 은 Fe(Apo6619)₃킬레이트된 단순 결정체 구조.

도 9 는 pH 7.4에서 철 -Apo6619 시스템의 주기식 볼트 그래프.

표 1 : 화학식 1 에서의 화합물의 화학적 성질.

표 2 : Apo6619 의 금속 결합의 선택성.

표 5. Fe(Apo6617)₃의 결정체 데이터 와 세밀한 구조.

표 6. Fe(Apo6617)₃의 결합간격 [Å] 과 결합각도 [°].

표 7: Fe(Apo6619)₃결정체 데이터 와 세밀한 구조.

표 8. Fe(Apo6619)₃의 결합간격[Å] 과 결합각도 [°].

본 발명의 대표적인 실시예에 대한 상세한 설명

실시예 1 : 3-벤질옥시-6-메틸-4-옥소-4 H-피란-2-카르복실 산 사이클로헥실아마이드의 제조.

1-1‘-카보닐 디이미다졸(1.998g, 12.30 mmol)을 디메칠포름아마이드(DMF, 180ml)용액에 들어 있는 3-(벤질옥시)-6-메틸-4-옥소-4 H-피란-2-카르복실산(2.0g, 7.69mmol 용액에 일반상온에서 첨가하였다. 첨가된 용액은 40-50℃에서 3시간 가온 하였다. 약한 노란색이 용액에서 관측되어졌다. 사이클로헥실 아민(1,23ml, 10.76mmol)을 첨가하였다. 첨가된 용액은 상온에서 하루 밤 동안 교반시켰다. DMF는 감소된 압력하에서 제거되고 거칠은 물질인 노란색의 지방을 확보하였다. 그리고 제목에서 언급한 백색의 고체 화합물(1.60g, 61%의 수율)을 생산하기 위하여 플라쉬 칼름 크로마토 그라피(용리작용의 경사도 조건: 에틸 아세테이트 용액에 10% 메탄올에서 1:1비율의 에틸 아세테이트/헥산)에서 정제하였다.

M.P는 멜팅 포인트 즉 융점을 뜻하는 것으로서, 온도 118-120℃, NMR(NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE)은 핵자기 공명이며 그의 결과를 수록하였다.

M.p. 118-120 ^oC; ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 0.91 (m, 2H, cyclohexyl-H), 1.29 (m, 2H, cyclohexyl-H), 1.58 (m, 3H, cyclohexyl-H), 1.79 (m, 2H, cyclohexyl-H), 2.37(s, 3H, CH₃), 3.79 (m, 1H, CH), 5.40(s, 2H, CH₂), 6.28(s, 1H, CH), 7.41(m, 5h, ArH, 7.67 (br, 1H, NH); MS (m/z) 342 (M⁺ +1).

위에서 설명한 것과 동일한 방법으로 사이클로 핵실아민은 다른 아민으로 치환시키고 다음과 같은 화합물을 준비하였다: 3-벤질 옥시-6-메틸-4-옥소-4 H-피란-2-카르복실 산 사이클로프로필아마이드

M.p. 79-80 ^oC; ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 0.21 (m, 2H, cyclopropyl-H), 0.70 (m, 2H, cyclopropyl-H), 2.35 (s, 3H, CH₃), 2.71 (m, 1H, CH), 5.35 (s, 2H, CH₂), 6.27 (s, 1H, CH), 7.39 (m, 5H, ArH, 7.70 (s, 1H, NH); ¹³C(CDCl₃) δ 6.35, 7.21, 19.87, 22.61, 22.70, 75.56, 115.37, 128.94(2C), 129.17(2C), 129.35, 135.49, 146.14, 146.39, 160.22, 165.74, 176.17; MS (m/z) 300 (M⁺ +1).

3-벤질옥시-6-메틸-4-온소-4H-피란-2-카르복실 산 메틸아마이드.

M.p. 137-140℃, ¹H-NMR (CDCI₃, 400 MHz) δ 2.38 (s, 3H, CH₃), 2.78 (d, 3H, NCH₃), 5.39 (s, 2H, CH₂), 6.30 (s,1H, CH), 7.40 (m, 5H, ArH), 7.62 (br, 1H, NH); MS (m/z) 300 (M⁺ +1).

실시예 2: 4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로헥실아마이드의 제조

3-벤질옥시-6-메틸-4-옥소-4H-피란-2-카르복실 산 사이클로헥실아마이드 (1.40 g, 4.1 mmol)을 함유한 메탄올 5 ml 용액에, 메틸아민 용액 (메탄올에 포함된 2M 용액 9 ml, 16 mmol)을 첨가하였다. 결과된 용액을 밀폐 튜브에 넣고 압력하 70 내지 75℃에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하여 조생성물로서 옅은 황색 고형물을 수득하였다. 이 물질을 컬럼 크로마토그래피 (용출 구배: 100% 에틸 아세테이트 에서 25% 메탄올을 함유 에틸 아세테이트)로 정제하여 백색 고형물로서 표제 화합물을 생성하였다 (1.20g, 83.0%). M. p. 258-260℃; ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ1.26-1.45 (m, 6H, 사이클로헥실-H), 1.79 (m, 2H, 사이클로헥 실-H), 1.95 (m, 2H, 2.41 (s, 3H, CH₃), 3.82 (s, 3H, NCH₃), 3.95 (m, CH), 5.13 (s, 2H, CH₂), 7.19 (s, CH), 7.36 (m, 3H, ArH), 7.43 (m, 2H, ArH), 8.50 (br, 1 H, NH); MS (m/z) 355 M⁺ +1).

유사한 방법으로, 3-벤질옥시-6-메틸-4-옥소-4H-피란-2-카르복실 산 사이클로헥실 아마이드를 다른 옥소-4H-피란-2-카르복실 산 아마이드 유도체들로 대체함으로써, 하기 화합물들을 제조한다:

3-벤질옥시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실산 사이클로프로필아마이드.

M.p. 187-189℃; ¹H-NMR (CDCl₃,400 MHz) δ 0.52 (m, 2H, 사이클로프로필-H), 0.74 (m, 2H, 사이클로프로필-H), 2.18(s, 3H, CH₃), 2.78(m, CH), 3.50(s, 3H, NCH₃), 5.08 (s, 2H, CH₂), 6.12 (s, CH), 7.33 (m, 3H, ArH), 7.39 (m, 2H, ArH), 7.91 (br, 1H, NH); MS (m/z) 313(M⁺ +1).

3-벤질옥시-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실산 메틸아마이드.

M.p. 132-135℃; ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1.05 (m, 4H, 사이클로프로필-H), 2.38(s, 3H, CH₃), 2.70 (d, J=1.8Hz, 3H, NCH₃), 3.35(m, 1 H, CH), 5.07(s, 2H, CH₂), 6.14(s, 1H, CH), 7.15(br, 1H), 7.35(m, 5H, ArH); ¹³C(CDCl₃) δ 9.48, 20.30, 25.86, 34.15, 74.01, 118.16, 127.79, 128.06 (2C), 128.22 (2C), 137.35, 142.05, 143.98, 149.91, 162.01, 173.89; MS (m/z) 313 (M⁺ +1).

3-벤질옥시-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실산 사이클로프로필 아마이드.

M.p. 164-167℃; ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ0.54 (m, 2H, 사이클로프로필-H), 0.76 (m, 2H, 사이클로프로필-H), 1.08-1.11(m, 4H, 사이클로프로필-H), 2.35(s, 3H, CH₃), 2.75(m, 1H, CH), 3.37(m, 1H, CH), 5.05(s, 2H, CH2), 6.13 (s,1H, CH), 7.33 (m, 5H, ArH), 7.89 (br, s, 1 H, NH); MS (m/z) 339 (M⁺+1).

실시예 3: 3-하이드록시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로헥실아마이드 [Apo6621]

탄소상 Pd(OH)₂ (0.18 g, 10% w 건조 중량 기준)를 질소하에서 3-벤질옥시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로헥실 아마이드 (1.0g, 2.82 mmol)을 함유한 에탄올 (50 ml)용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 50 psi 압력하에서 4 시간 동안 수소화시켰다. Pd(OH)₂를 셀라이트 (Celite) 층으로 여과하여 제거한 후, 셀라이트 케이크를 에탄올 (3x10 ml)세척하였다. 에탄올 여과물을 증발시켜 회백색의 고형물을 수득하였다 (0.57 g, 77%). 메탄올 (15 ml)로 재결정 여과함으로써 백색 고형물의 표제 화합물을 수득하였다 (0.18 g). M. p. 280-285℃(dec); (CD₃0D 400 MHz) δ1.30-1.43(m, 5H, 사이클로헥실-H), 1.70(m, 사이클로헥실-H), 1.80(m, 2H, 사이클로헥실-H), 2.00(m, 2H, 사이클로헥실-H), 2.41(s, 3H, CH₃), 3.63(s, 3H, CH₃), 3.90 (m, 1 H, CH), 6.38 (s, 1 H, CH); MS (m/z) 265 (M⁺ +1).

유사한 방식으로, 3-벤질옥시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로헥실아마이드를 다른 3- 벤질옥시-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로알킬 아마이드류로 대체함으로써, 하기 화합물을 제조한다:

3-하이드록시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로프로필아마이드 [Apo6617]

M.p. 260-262℃; ¹H-NMR(MeOD-d₄,400 MHz) δ0.66(m, 2H, 사이클로프로필-H), 0.85 (m, 2H, 사이클로프로필-H), 2.41 (s, 3H, CH₃), 2.95 (m, 1 H, CH), 3.63(m, 1H, NCH₃), 6.38(s, 1 H, CH); MS (m/z) 223 (M⁺+1)

1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-필리딘-2-카르복실산 메틸아마이드 [Apo6619]

M.p. 258-260℃(dec); ¹H-NMR(MeOD-d₄,400 MHz) δ1.05(m, 2H, 사이클로프로 필-H), 1.19(m, 2H, 사이클로프로필-H), 2.54(s, 3H, CH₃), 2.97(s, 1H, NCH₃), 3.46(m, 1 H, CH), 6.33(s, 1 H, CH); MS (m/z) 223 (M⁺+1)

실시예 4: 3-(벤질옥시)-N-사이클로부틸-6-메틸-4- 옥소-4H-피란-2-카르복사마이드의 제조

3-(벤질옥시)-6-메틸-4-옥소-4H-피란-2-카르복실산 (2.5 g, 9.6 1.0 당량), 및 1,1'-카르보닐디이미다졸 (2.49 g, 15.37 mmol, 1.6 당량)의 혼합물을 함유한 DMF (20 mL)를 50℃에서 5 시간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 사이클로부틸아민 하이드로클로라이드 (1.24 g, 11.52 1.2 당량) 및 Et₃N (1.74 mL, 12.48 mmol, 1.3 당량)을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 감압하에서 용매를 제거하였다. 크로마토그래피 (1: 1 헥산/EtOAc, 후속적으로 EtOAc)로 정제하여 황색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (2.76 g, 91.56%). M.p. 69.3-71.0℃;¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ1.51-1.72 (m, 4H, 사이클로부틸 H), 2.19-2.28 (m, 2H, 사이클로부틸 H), 2.37 (s, 3H, 4.39-4.41 (m, CH), 5.41 (s, 2H, OCH₂Ph),6.30 (s, 1 H, CH), 7.39-7.49 (m, 5H, ArH), 7.86 (br, 1 H, NH), 및 MS 314(M⁺ +1), 217, 91.

유사한 방식으로 수행하여, 하기 화합물을 제조한다:

3-(벤질옥시)-N-사이클로펜틸-6-메틸-4-옥소-4H-피란-2-카로복사마이드

M.p. 108.0-108.5℃ 400 MHz) δ1.11-1.16 (m, 2H, 사이클로펜틸 H), 1.50-1.55 (m, 4H, 사이클로펜틸 H), 1.87-1.92 (m, 2H, 사이클로펜틸 H), 2.38 (s, 3H, CH₃), 4.17-4.22(m, 1H, CH), 5.41 (s, 2H, CH₂), 6.30 (s, CH), 7.38-7.43 (m, 5H, ArH), 7.72(br, 1H, NH), MS(m/z) 328(M⁺ +1), 217,91.

실시예 5: 3-(벤질옥시)-N-사이클로부틸-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드의 제조

실시예 4의 화합물 (2.616 g, 8.35 1.0 당량)을 함유한 메탄올 (10 ml)용액에 메틸아민(메탄올 내 2M, 20 ml, 40 mmol, 4.79 당량)을 신속하게 첨가하였다. 밀폐 튜브에 넣고 70-75℃에서 밤새 교반하였다. 결과된 갈색 용액을 증발 건조시키고 크로마토그래피 (EtOAc, 후속적으로 1:4 MeOH/EtOAc)로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물(1.70 g, 62.24%)을 생성하였다. M.p. 221.3-222.4℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ1.65-1.69(m, 2H, 사이클로부틸 H), 1.90-1.95(m, 2H, 사이클로부틸 H), 2.14-2.21(m, 2H, 사이클로부틸 H), 2.31(s, 3H, CH₃), 3.42(s, 3H, NCH₃), 4.34-4.30 (m, 1H, CH), 5.05 (s, 2H, OCH₂Ph), 6.22(s, 1H, CH), 7.39-7.30(m, 5H, ArH), 9.08-9.06 (d, 1H, J=7.08Hz, NH); MS (m/z) 327 (M⁺+1), 230, 166, 91.

유사한 방식으로 수행하여, 하기 화합물을 제조한다: 3-(벤질옥시)-N-사이클로펜틸-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드

M.p.233.6-234.4℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ1.43-1.52 (m, 4H, 사이클로펜틸 H), 1.54-1.60(m, 2H, 사이클로펜틸 H), 1.78-1.83 (m, 2H, 사이클로펜틸 H), 2.30(s, 3H, CH₃), 3.43(s, 3H, NCH₃), 4.13-4.18(m, 1H, CH), 5.04(s, 2H, OCH₂Ph), 6.22 (s, 1H, CH), 7.30-7.41 (m, 5H, ArH), 8.80-8.82(d, J=6.95 Hz, 1H, NH); MS (m/z) 341 (M⁺+1), 230, 166, 91.

실시예 6: N-사이클로부틸-3-하이드록시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드 [Apo6622]의 제조

N-사이클로부틸-3-벤질옥시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드 (1.528 g, 4.68 mmol, 1.0 당량), 활성탄 상의 10% Pd (200 mg, 습윤), 및 에탄올 (200 ml)의 혼합물을 H₂의 50 psi하 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 상기 촉매를 셀라이트를 통해 여과하고 여과물을 증발시켜 고체를 수득하고 이를 MeOH에서 재결정화시켜 백색 고체로서 표제 화합물(0.57 g, 51.5%)을 생성하였다. M.p. 277.3℃ (dec); ¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 1.68-1.70 (m, 2H, 사이클로부틸 H), 1.95-2.01 (m, 2H, 사이클로부틸 H), 2.20-2.26 (m, 2H, 사이클로부틸 H), 2.29 (s, 3H, CH₃), 3.41(s, 3H, NCH₃), 4.31-4.35(m, 1H, CH), 6.13(s, 1H, CH), 8.98(br, 1H, NH); MS (m/z) 237 (M⁺+1) 185, 166, 123.

유사한 방식으로 수행하여, 하기 화합물들을 제조한다:

N-사이클로펜틸-3-하이드록시-1,6-디메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복사마이드 [Apo6620]

M.p. 289.3℃ (dec);¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 1.49-1.55 (m, 4H, 사이클로펜틸 H), 1.61-1.68 (m, 2H, 사이클로펜틸 H), 1.83-1.87 (m, 2H, 사이클로펜틸 H), 2.29 (s, 3H, 3.42 (s, 3H, NCH₃), 4.14-4.18 (m, 1H, CH), 6.12(s, 1H), 8.71-8.73 (d, J=7.05 Hz, 1H, NH); MS (m/z) 251 (M⁺+1), 166.

1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로프로필아마이드 [Apo6618].

M.p. 241-143℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ0.53 (m, 2H, 사이클로프로필-H), 0.71(m, 2H, 사이클로프로필-H), 0.94-1.00 (m, 4H, 사이클로프로필-H), 2.42(s, 3H, CH₃), 2.79 (m, 1H, CH), 3.30(m, 1H, CH), 6.08(s, CH), 8.54(br, s, NH); MS (m/z) 249 (M⁺ +1)

실시예 7: 3-벤질옥시-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아마이드의 제조

3-(벤질옥시)-6-메틸-4-옥소-4H-피란-2-카르복실산 (70 g, 0.27 mol)을 함유한 MeOH (350 mL) 현탁액을 담고 있는, 기계적 교반자가 구비된 3구 둥근바닥 플라스크에 사이클로프로필아민 (120 mL, 1.72 mol)을 첨가하였다. 투명한 옅은 황색 용액이 결과되었다. 상기 반응 혼합물을 약 19시간 환류시켰다. 휘발물질을 진공에서 제거하고 잔류물을 교반하면서 물 (700 mL)에 용해하였다. 수성 혼합물을 셀라이트 (Celite^®)의 패드를 통해 여과시켰다. 여과물을 기계적 교반자를 구비한 3구 둥근바닥 플라스크에 넣고 얼음 수조에서 냉각시켰다. 진한 HCI을 첨가하여 pH를 약 1-2로 조정하고, 많은 양의 "오랜지" 고체가 침전되었다. 아세톤 (200 mL)을 상기 현탁액에 첨가하였다. 다음, 고체물을 흡입 여과로 수집하고, 아세톤으로 철저히 세척하고 공기 건조시켰다. 표제화합물을 회백색의 고체물 (71.0 g, 88%) 하였다. Mp: 139.0-139.5℃;¹H-NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ(ppm): 0.98-1.15 (m, 4H, 2 c-CH₂), [2.37(s)+ 2.40(s), 로타머, 3/2 비율, 3H, CH₃)], 3.30-3.50 (m, 1H, c-CH), 5.00-5.05(m, 2H, CH₂Ph), 6.20-6.25 (m, 1H, C=CH), 7.28-7.50 (m, 5H, Ph); MS (m/z): 300.2 (M⁺+1) 256.2, 192.2, 164.4, 91.0 (100%); C₁₇H₁₇NO₄에 대한 분석 이론치: C, 68.21; H, 5.72 ; N, 4.68 %. 실측치: C, 67.76; H, 5.76 ; N, 4.61%

실시예 8: 3-벤질옥시-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아마이드의 합성

3-벤질옥시-1-사이클로프로필-6-메틸-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실산 (30 g, 0.10 mol), CH₂Cl₂ (150 ml) 및 DMF (7.8 mL, 0.10 mol)의 냉각 현탁액 (얼음-염 수조, 내부 온도=-5℃)을 함유한, 기계적 교반자가 구비된 3구 둥근바닥 플라스크에 티오닐 클로라이드(9.5 mL, 0.13 mol)를 5 분에 걸쳐 적가하였다. 티오닐 클로라이드 첨가 후, 반응 혼합믈은 여전히 현탁액이었다. 상기 얼음-염 수조를 제거하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. 분배한 후 2M 메틸아민을 함유한 THF 용액으로 냉각하였다. 결과된 혼합물을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 결과, 반응 혼합물이 실온에서 3 시간 동안 교반후 출발 물질의 약 96%가 소비된 것이 나타났다 (HPLC, 이동상: 0.035 % HClO₄ /CH₃CN, 80/20, 컬럼: 대칭 C18 WAT046980, 유속: 1 ml/min, 검출 파장: 260 nm, 3-벤질옥시-1-사이클로프로필-6-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실산의 RT= 2.46 min, 3-벤질옥시-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아마이드=5.40 min).

기계적 교반자를 구비한 다른 1-L들이 3N-RBF (3구 둥근바닥 플라스크)에 디클로로메탄 (240 mL) 및 트리에틸아민 (36 mL, 0.26 mol) (얼음-염 수조, 내부 온도=-10℃)를 첨가하였다. 2M 메틸아민을 함유한 테트라퓨란 (73 mL, 0.146 mol)을 상기 냉각 용액에 첨가하였다. 상기 그 자리에서 생성된 산 염화물을 첨가 누두로 옮기고, 30 분에 걸쳐 상기 아민 용액에 서서히 첨가하였다. 발열 반응이 인지되었으나, 내부 온도를 -5℃로 유지하였다. 반응을 TLC (CH₂Cl₂/MeOH, 9/1 비율, v/v)로 지시되는 바와 같이 10 후에 완결시켰다. 반응 혼합물을 물 (100 mL)로 냉각시키고, 혼합물을 5 분간 교반하였다. 유기 분획을 수집하고 물로 두번 세척한 후, 희석 NaOH 용액 (0.05 M, 3x100 ml)로 세척하고 황산 나트륨 상에서 건조시키 고, 여과하고 및 진공 농축시켜 갈색 고형물을 생성하였다. 이 고형물을 에탄올 및 에틸 아세테이트 (2/8 비, v/v)의 혼합물의 150 mL에 현탁시키고 슬러리를 2 시간 교반하였다. 고형물을 흡입 여과로 수집하고, 에틸 아세테이트 (50 mL)로 세척한 후, 공기 건조시켰다. 옅은 분홍색을 띤 약한 갈색 고형물 (14g, 45%)로서 표제화합물을 수득하였다. 이 물질을 컬럼 크로마토그래피 (5% MeOH: CH₂Cl₂)로 더 정제하였다. M.p. 132-135℃;¹H-NMR (CDCl₃,400 MHz), δ 1.05 (m, 4H, 사이클로프로필-H), 2.38(s, 3H, 2.70 (d, J=1. 8Hz, 3H, NCH₃), 3.35 (m, 1H, CH), 5.07 (s, 2H, CH₂), 6.14(s, 1H, CH), 7.15(br, 1H), 7.35 (m, 5H, ArH); ¹³C(CDCl₃) δ 9.48, 20.30, 25.86, 34.15, 74.01, 118.16, 127.79, 128.06(2C), 128.22 (2C), 137.35, 142.05, 143.98, 149.91, 162.01, 173.89; MS (m/z): 313 (M⁺ +1).

유사한 방식으로, 하기 화합물들을 제조하였다:

3-(벤질옥시)-N-(사이클로헥실메틸)-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4- 디하이드로피리딘-2-카르복사마이드

¹H-NMR (CD₃OD, 400MHz) δ 0.90-0.96 (m, 3H), 1.13-1.23 (m, 3H), 1.45-1.54 (m, 1H), 1.64 (br. m, 4H), 1.73-1.76 (br. m, 4H), 2.56 (s, 3H, CH₃), 3.12-3.13 (d, J =6.8 Hz, 2H), 3.36-3.40 (m, 1H, CH), 5.09 (s, 2H), 6.43 (s, 7.31-7. 37 (m, 3H), 7.43-7. 45 (m, 2H); MS (m/z): 395 (M⁺+1).

3-(벤질옥시)-1-사이클로프로필-6-메틸-2-(모르폴린-4-일카르보닐)피리딘-4-온:

¹H-NMR (CDCl₃, 400MHz) δ 0.87-0.94 (br. m,1H), 1.09-1.13 (m, 1H), 1.25-1.30 (m, 2H), 2.56(s, 3H, CH3),3.30-3. 42(m, 2H), 3.45-3.69 (m, 6H), 3.84-3.90 (m, 1H, CH), 4.74-4.77 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 5.54-5.56 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 6.80 (br. s, 1H, NH), 7.36-7.41(m, 5H, ArH); MS (m/z): 369 (M⁺+1).

3-(벤질옥시)-1-사이클로프로필-6-메틸-N-(3-메틸부틸)-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드

¹H-NMR (CDCl₃, 400MHz) δ 0.86-0.88 (d, J = 6.4 Hz, 6H, 2CH₃), 1.04-1.09 (m, 4H), 1.27-1.37 (m, 2H), 1.55-1.60 (m, 1H, CH), 2.37 (s, 3H, CH₃), 3.20-3.25 (m, 2H, CH2), 3.34-3.37 (m, 1H, CH), 5.09 (s, 2H, CH2), 6.10 (s,1H), 7.30-7.38 (m, 5H, ArH), 7.23-2.28 (br. t, 1 H, NH).

3-(벤질옥시)-N-사이클로헥실-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드:

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1.15-1.30 (m, 3H), 1.31 (br, m, 1H), 1.34 (br, m, 5H), 1.66-1.70 (m, 1H), 2.78 (s, 3H, CH3), 3.30-3.34 (m, 1H), 3.42-3.51 (m, 2H), 3.67-3.69 (m, 1H), 3.80-3.83 (m, 1H), 4.82-4.85 (d, J=10.3 Hz, 1H), 5.37-5.40 (d, J=10.5 Hz, 1H), 7.34 (br, m, 5H, ArH), 7.86 (s, 1H)

3-(벤질옥실)-1-사이클로프로필--N-헥실-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드:

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 0.89-0. 92 (t, J = 6.6 Hz, 3H, CH₃), 1.25-1.32 (m, 6H), 1.40-1.47 (m, 4H), 1.64-1.70 (m, 2H, CH₂), 2.54 (s, 3H, CH₃), 3.43-3.48 (m, 2H,CH₂), 3.91-3.93 (m, 1H, CH), 5.10 (s, 2H, CH₂), 7.37-7.46 (m, 6H, ArH 및 C=CH), 9.24 (br. t, 1 H, NH); MS (m/z): 383 (M⁺+1).

3-(벤질옥시)-1-사이클로프로필-6-메틸-2-[(4-메틸피페라진-1-일)카르보닐]피리딘-4(1H)-온:

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 0.85-0.88 (m, 1H), 1.06-1.29 (m, 4H), 1.40-1.45 (br. m, 2H), 1.50-1.58 (br. m, 4H), 2.51(s, 3H, CH₃), 3.12-3.17 (m, 1H), 3.35-3.48 (m, 3H), 3.75-3.78 (m, 1H, CH), 4.76-4.78 (d, J=10.6 Hz, 1H), 5.53-5.56 (d, J=10.7 Hz, 1H), 6.68 (br. s, 1H, NH), 7.30-7.43 (m, 5H, ArH); MS (m/z): 382 (M⁺ +1).

3-(벤질옥시)-1-사이클로프로필-N,N,6-트리메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드:

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1.16-1.20 (m, 2H), 1.27-1.33 (m, 1H),1.87-1.95 (m, 1H), 2.78 (s, 3H, CH3), 3.05 (s, 3H, CH₃), 3.08(s, 3H, CH₃), 3.62-3.68 (m, 1H, CH), 4.86-4.90 (d, J=10.8 Hz, 1H), 5.33-5.38 (d, J=10.8 Hz, 1H), 7.29-7.33 (m, 5H, ArH), 7.77 (s, 1 H, NH); MS (m/z): 327 (M⁺+1).

실시예 9: 1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아아마이드

절차 I:

단계 a. 4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산의 합성

얼음 수조 온도로 유지된 3-벤질옥시-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아마이드(10.0 g, 0.032 mol)을 함유한 메탄올 (40 mL) 및 물 (2.6 mL)의 현탁액에 진한 염산 (3.9 mL)을 적가하였다. 결과된 투명한 갈색 용액을 실온에서 약 5 분간 교반한 후, 질소 가스로 용액을 약 5 분간 기포 처리하였다. Pd-C (10% 습윤, 5% w/w, 0.5g)를 첨가하고 반응 용기를 수소로 두 번 세척하였다. 혼합물을 50 psi 수소 압력하 실온에서 Parr 반응기내에서 수소화시키고, 3 시간에 걸쳐 반응 과정을 HPLC로 검사하였다. 반응은 3 시간 후에 종결시켰다.

여분의 수소를 배출시키고 수소가스를 약 5 분간 용액 내로 기포시켰다. 반응 혼합물을 예비 처리된 셀라이트 (1-사이클로프로필-3- 하이드록시-6-메틸-4-옥 소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실산 메틸아아마이드를 함유한 메탄올 표준 용액으로 미리 세척된)로 여과하고, 얻어진 케이크를 메탄올6x 10 mL로 세척하였다. 여과물의 부피를 감압 하에서 약 30 mL로 축소하였다. 잔류물을 얼음에서 냉각시키고, 이때 일부 고형물이 침전되기 시작하였다. 2N NaOH 용액(25 mL)을 첨가하여 pH를 약 5로 조정하고, 혼합물을 약 10분간 교반하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE, 30 mL)를 첨가하고, 결과된 혼합물을 30분간 얼음 수조 온도에서 교반하였다. 고형물을 흡입 여과하여 수집하고, EtOH/MTBE (1/2 비율) 5 ml로 두 번 완전히 세척하였다. 반응 검출을 위한 HPLC 조건은 휴렛 팩커드 시리즈 1100 HPLC: symmetry C18 컬럼 (WAT046980), 구배0.035% min-% CH₃CN: 0-10; 6-10; 7-20 및 15-20, 210,260 및 285nm에서 λ을 사용하였고; 1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아아마이드의 유지시간은 2.099 분이다.

단계 b. 1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아마이드

단계 a에서 설명된 바와 같이 수득한 조 생성물을 함유한 EtOH/증류수 (14 mL 전체) 1/1 혼합물의 현탁액을 얼음-수조 온도에서 1 시간 교반하였다. 흡입 여과로 고형물을 수집하고, 이를 예비 냉각된 EtOH/증류수 1/1 혼합물의 5 mL로 두 번 철저히 세척하였다, 옅은 분홍색 고형물의 표제 화합물을 진공하 40℃에서 16 시간 동안 건조시켜 일정한 무게를 얻었다. 이 생성물은 음성 질산은 시험을 나타내고 5.3g으로 측정되었다 (74% 전체 생성율, 단계 a 및 b).

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-D₆) δ (ppm): 0.94-0.99 (m, 4H, 2c-CH2), 2.39 (s, 3H, CCH3), 2.76 (d, J=4.4 Hz, 3H, NHCH₃), 3.28-3.31 (m, 1H, c-CH), 6.08 (s,1H, C=CH), 8.44 (br, q., 1H, NHCH3); ¹³C-NMR (75MHZ, DMSO-D₆) δ (ppm); 9.1, 19.9, 25.8, 33.7, 112.3, 130.1, 143.3, 148.7, 161.8, 170.6 ; MS/MS (+ve ES): MS (m/z) 223 (M⁺+1)192.1, 164.2 (M⁺-CONHCH₃, 100%), 150.1, 136.3 ; 원소 분석; C₁₁H₁₄N₂O₃에 대한 분석값. 이론치. C, 59.45; H, 6.35; N, 12.60 %. 실측치: C, 59.19; H, 6.07; N, 12.53 %; IR (KBr) cm^-1: 3300 (NH), 1670,1653, 1495 (C=C).

B. N-(사이클로헥실메틸)-1-사이클로프로필-3-하이드록실-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드:

3-(벤질옥시)-N-(사이클로헥실메틸)-1-사이클로프로필-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드 (2.0 g, 4.8 mmol), Pd/C (10% 습윤, 0.45 g)을 함유한 에탄올 (150 mL) 혼합물을 50 psi의 수소 압력하에서 16 시간 동안 Parr 장치에서 수소화시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 상기 셀라이트를 EtOH (25 mL)로 철저히 세척하였다. 용매를 증발시켜 엷은 분홍색 고형물을 수득하였다. 이 고형물을 뜨거운 메탄올에 용해한 후, 실온으로 냉각하여 고형 생성물을 침전시켰다. 흡입 여과하여 상기 고형물을 수집하였다. 모체 액체를 진공에서 농축시키고 잔류 고형물을 다시 뜨거운 메탄올에 용해하고, 실온으로 냉각시켜 생성물을 침전시킨 후 이를 수집하였다. 이러한 과정을 한 번 더 반목하였다. 세 번 합쳐진 백색 고형 분획물은 0.95 g 무게로 측정되었다(수율 63%).

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ0.84-0.88 (m, 2H, c-Pr의 CH₂), 1.03-1.09 (m, 2H, c-Pr의 CH₂), 1.06-1.31 (m, 5H), 1.65-1.87 (m, 6H), 2.50 (s, 3H, CH₃), 3.33-3.36 (m, 2H, CH₂N), 3.51 (s, 1H), 3.58-3.61 (m, c-Pr의 CH), 6.27(s, 1 H, C=CH), 6.80 (br. t, 1H, NH); MS (m/z): 305 (M⁺ +1).

C. 하기 화합물들을 유사한 방식으로 제조하였다:

1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-N-(3-메틸부틸)-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드:

수율: 88%; ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 0.85-0.89 (m, 1H), 0.98-1.00 (d, J=6.4 Hz, 6H, 2CH₃), 1.15-1.19 (m, 2H), 1.54-1.60 (m, 2H), 1.72-1.77 (m, CH), 2.50 (s, 3H, CH₃), 3.49-3.53 (m, 2H, CH₂), 3.57-3.60 (m, CH), 3.72 (br. s, 1 H), 6.27 (s, 1 H), 7.23 (br. t, 1H, NH); MS (m/z): 279 (M⁺ +1)

1-사이클로프로필-N-헥실-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드:

수율: 87% ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 0.90-0.94 (t, J = 6.8 Hz, 3H, CH₃), 1.27-1.47 (m, 10H), 1.68-1.73 (m, 2H), 2.70 (s, 3H, CH₃), 3.47-3. 52 (m, 2H, CH₂), 3.85-3.88 (m, 1H, CH), 7.05 (s, 1H, C=CH), 8.30 (br. t, NH); MS (m/z): 293 (M⁺ +1)

N-사이클로헥실-1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2- 카르복사마이드:

수율: 91%; ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 0.98-1.05 (m, 1H), 1.21-1.38 (m, 3H), 1.60-1.80 (br. m, 7H), 2.71 (s, 3H, CH₃), 3.32-3.37 (m, 1H), 3.46-3.50 (m, 1 H), 3.55-3.64 (m, 2H), 3.92-3.99 (m, 1 H), 6.88 (s, 1 H, C=CH); MS (m/z): 277 (M⁺ +1).

1-사이클로프로필-3-하이드록시-N,N,6-트리메틸-4-옥소-1,4-디하이드로피리딘-2-카르복사마이드

수율: 97% ¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz) δ 0.98-1.10 (m, 1H), 1.15-1.43 (m, 3H), 2.76 (s, 3H, CH₃), 3.07 (s, 3H, CH₃), 3.16 (s, 3H, CH₃), 3.70-3.76 (m, 1H, CH), 7.10 (s, 1H, C=CH);¹³C-NMR (CD₃OD, 75 MHz) δ 9.5, 10.9, 21.3, 35.0, 38.1, 38.8, 114.4, 138.8, 142.9, 154.7, 162.5, 162.8; MS (m/z): 237 (M⁺ +1).

1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-2-[(4-메틸피페라진-1-일)카르보닐]피리딘-4(1H)-온:

수율: 96% ¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz) δ 0.89-1.00 (m, 1H), 1.06-1.29 (m, 3H), 1.52-1.85 (br, m, 8H), 2.56 (s, 3H, CH3), 3.40-3.60 (m, 3H), 3.88-3.98 (m, 1H, CH), 6.48 (s, 1H, C=CH); ¹³C-NMR (CD3OD, 75 MHz) δ 10.0, 11.0, 21.0, 25.4, 26.4, 27.0, 36.5, 43.8, 49.2, 114.7, 132.9, 144.5, 152.8, 162.4, 170.2

N,1-디사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디아이드로피리딘-2-카르복사마이드:

¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz), δ 0.68-0.70 (m, 2H), 0.85-0.95 (m, 4H), 1.15-1.26 (m, 2H), 2.70 (s, 3H, CH₃), 2.91-2.98 (m, 1H), 3.50-3.61 (m, 1H), 6.26 (s, 1H, C=CH), 7.10 (br. s, 1H, NH); MS (m/z): 249 (M⁺ +1).

1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-2-(모르폴린-4-일카로보닐)피리딘-4(1H)-온:

¹H-NMR (CD₃0D, 300 MHz) δ 1.00-1.10 (m, 1.20-1.45 (m, 3H), 2.73 (s, 3H, CH₃), 3.45-3.53 (m, 2H), 3.62-3.86 (m, 6H), 3.90-4.00 (m, 1H), 7.02 (s, 1H, C=CH); ¹³C-NMR (CD₃0D, 75 MHz) δ 10.3, 11.1, 21.3, 38.6, 43.6, 48.3, 67.4, 67.7, 114.5, 137.2, 143.3, 154.7, 161.2, 163.7; MS (m/z): 279 (M⁺ +1).

실시예 10: 전위차 적정에 의한 Apo6619 대한 pKa 결정

물에서 1x10^-2 M보다 큰 리간드 농도가 준비될 수 있을 때, 리간드의 pKa 값을 전위차 적정에 의해 결정하였다. 전형적인 실험에서, 샘플 농도 (2.67x10^-2 M)는 하기 방법으로 만들었다: Apo6619 (92.6 mg) 칭량하여 25-ml 비이커에 넣은 후, 0.1M NaCl (15 ml)을 첨가하였다. 이 혼합물을 10 분간 음파처리하여 투명한 무색 용액을 생성하였다. 질소 가스를 용액에 기포시켰다. 1.000 N 염화수소 산 (624㎕, 1.5 당량)을 용액에 첨가하여 pH 1.88을 조성하였다. 이 용액을 22℃에서 60분간 평형화시켰다.

다음 용액을 1.000 N NaOH에 대하여 22℃에서 적정하여 pH 11.8을 조성하였다. 염기 첨가할 때마다 일정한 pH가 읽혀질 때까지 평형화시켰다. 각 측정마다 첨가된 염기의 양 및 pH 값을 기록하였다. 137번 측정하여 본 실험을 종료하였다.

pH 대 염기 부피의 데이터 세트를 하이퍼쿼드(Hyperquad) 2000 (버전 2.1, 피터 간스(Peter Gans), 리즈 대학(University of Leeds))를 사용하여 분석하였다. 하기 모델이 주어진다면: L- + H+ ↔ LH 및 LH + H+ ↔ LH2+ (pKa2), Apo6619의 pKa 값은 pKa1 = 8.6 및 pKa2 = 2.5로서 최적화 된다.

실시예 11: 전위차 적정에 의한 Apo6617 대한 pKa 결정

결합된 산 및 염기 둘 다 UV-가시광선 지역에서 흡수될 때 리간드의 pKa 값을 결정할 수 있다. 전형적인 실험에서, 샘플 용액을 하기 방법으로 만들었다: Apo6617 (0.792 mg) 칭량하여 80-ml 비이커에 넣은 후, 0.1M NaCl (50 ml)을 첨가하였다. 이 혼합물을 5 분간 음파 처리하여 투명한 무색 용액을 생성하였다. 질소 가스를 용액에 기포시켰다. 1.000 N NaOH (50㎕)을 첨가하여 pH 10.9로 조정하였다. 이 용액을 22℃에서 1 시간 평형화시켰다.비이커와 유동 셀 간의 샘플 용액을 순환시키기 위해 슬리퍼 (slipper) 시스템을 사용하였다.

상기 샘플 용액을 22℃에서 표준 염화수소산 용액에 대하여 적정하여 pH 1.40으로 조정하였다. 매번 산을 첨가한 후, 일정하게 pH가 읽혀질 때까지 용액을 평형화시켰다. 매 측정마다 pH 및 UV-Vis 스펙트럼을 기록하였다. 탈양자화된 종 (L^-), 중성 종 (LH), 및 양자화된 종 (LH2⁺)의 피크 파장은 각각 314 nm, 281 nm 및 249 nm였다. pH>6인 지역에서, 매번 산 첨가 후에, 각 스펙트럼마다 흡광도에 있어서 314 nm에서 약간의 증가 및 281 nm에서 약간의 감소가 있은 반면, pH,5인 지역에서는, 매번 산 첨가 후에, 각 스펙트럼마다 흡광도에 있어281 nm에서 약간의 감소, 및 249 nm에서 약간의 증가가 있었다. 수 회 후속적으로 산을 첨가한 후 스펙트라에서 명백한 변화가 없을 때까지 상기 용액을 적정하였다. 116 번 측정하여 실험을 마쳤다.

pHAB (Peter Gans, University of Leeds)를 사용하여 결과된 데이터를 분석하였다. Apo6617의 pKa 값들은 pKa₁=8.6 및 pKa₂=2.5로서 최적화되었다.

실시예 12: Job의 방법에 의한 Fe-Apo6622 착염의 화학양론

μμ전형적 실험에서, Fe³ ⁺의 스톡 용액 (원자 흡수 표준, 1 wt% HCl 내 1005 μg, 알드리치) 및 Apo6622의 스톡 용액 (0.1 M MOPS내의 6.98x10^-3 M, pH 7.4)을 혼합함으로써 Fe-Apo6622 착염 용액을 제조하였다. 12 개 샘플 용액을 제조하였다. 상기 12 개 샘플 용액 각각에서 총 철 농도 (C_total ^iron) 및 총 리간드 농도(C_total ^L)의 합을 일정하게 유지하면서(8.00x10^-4 M), 12 개 샘플 용액에서 리간 드의 몰 분획 a (a=C_total ^L/(C_total ^L+C_total ^Iron)은 상이하고 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 및 1.0, 각각 준비하였다. 12 개 샘플 용액 각각에 대한 총 부피는 5 ml이고, MOPS (0.1 M, pH 7.4)를 용매로 사용하였다. NaOH를 첨가하여 12 용액의 pH를 7.4로 조정하였다. 상기 샘플 용액을 실온에서 3 시간 볼텍스한 후, 더브노프 메타볼릭 세이킹 인큐베이터 (Dubnoff Metabolic Shaking Incubator)에 넣고 25℃에서 90 RPM으로 밤새 교반하였다. 샘플 용액을 4000 rpm에서 15 분간 원심분리한 후 항온처리기에서 교반없이 처리하였다. 12개 용액 각각에 대하여 25℃에서 UV-Vis 스펙트럼을 기록하였다.

450 nm에서의 흡광도를 y-축으로 하고 a를 x-축으로 하여 Job의 그래프를 만들었다. 최대 흡광도는 a = 0.75에서 발견되었고, 이는 착염에서 철:리간드 비율이 1:3일 때에 해당하는 것이다. 상기 Job 그래프 결과는 도 (1)에 나타나있다.

유사한 방식으로 수행하여, Fe-Apo6617 및 Fe- Apo6619의 Job 그래프를 생성하였고, 이를 도 (2) 및 (3)에 도시한다.

실시예 13: 분배 계수 결정

분배 계수 결정을 위해, MOPS 완충액 (50 mM, pH=7.4) 및 1-옥탄올을 수성상 및 유기상으로서 각각 사용하였다. MOPS 완충액 및 1-옥탄올을 사용전에 서로 예비 포화시켰다.

전형적인 실험에서, Apo6618 (1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 사이클로프로필아마이드)의 유기 스톡 용액을 상기 화합물의 0.50 mg 계량하여 10-mL 계량 플라스크에 넣고 1-옥탄올을 첨가함으로써 제조하였다. 상기 용액을 60분간 음파처리하여 샘플을 완전히 용해하였다. 상기 스톡 용액의 농도는 C⁰ _org=2.0x10^-4 M로 계산되었다. 상기 스톡 용액을 10-mL 계량 플라스크에서 1-옥탄올로 10배 희석 시킴으로써 2.0x10-5 M농도를 가지는 Apo6618의 유기 표준 용액을 제조하였다. 샘플 용액을 10-mL 계량 플라스크에서 제조하였다. 상기 스톡 샘플 용액 (3 ml)을 피펫으로 플라스크로 옮긴 후 MOPS 완충액 (3 ml)을 첨가하였다. 표준 및 샘플 용액들을 2 시간동안 볼텍스시켰다. 볼텍스 후에, 상기 용액을 시험관으로 옮기고 4000 rpm에서 15분간 원심분리시켰다. 표준 용액에 대하여, 및 샘플 용액의 유기 상(상층)에 대하여 22℃에서 UV-Vis 스펙트럼을 측정하였다. 하기 방정식을 이용하여 분배 계수, D₇ _.4,를 계산하였다:

D₇ _.4 = [A_org/(C⁰ _org e_org - A_org)] x (V_aqu / V_org)

상기식에서 e_org = 상기 유기 표준 용액의 UV-Vis 스펙트럼으로부터 얻은 피크 파장의 몰 흡광계수; A_org = 동일한 ?max 에서의 샘플 용액내의 유기상의 흡광도;C⁰ _org = 스톡 용액의 농도; V_aqu = 샘플 용액에서의 MOPS 완충액의 부피; V_org = 샘플 용액에서의 스톡 용액의 부피.

실시예 14: 금속 착염화 상수의 결정

A. 기구 및 화합물:

pH 측정에 pH 미터 (Accumet Research AR15,13-636-AR15, Fisher) 및 복합 전극 (Accumet Standard-size Glass Combination Electrode, 13-620-285, Fisher) 를 사용하였다. 사용전, 상기 전극은 세 개 표준 완충액 용액 (pH 4.00, pH 7.00, 및 pH 10.00, Fisher)과 영점을 맞추었다. 디지털 피펫(Eppendorf)을 사용하여 적정액을 수동으로 첨가하였다. UV-가시광선 분광측정기 (Agilent 8453)를 사용하여 UV-Vis 흡광도를 측정하였다.

pH-의존성 흡광도를 측정시 슬리퍼 시스템(89068D Agilent)을 사용하였다. 볼텍서 (VX-2500 Multi-tube Vortexer, VWR Scientific Products)를 사용하여 분배 계수 및 Job의 그래프 실험에서 샘플 용액을 제조하였다.

금속 스톡 용액들을 알드리치(Aldrich)로부터 구입하였다: 철 원자 흡수 표준 용액 (1000μg/ml Fe를 함유한 1 wt. % HCl); 알루미늄 원자 흡수 표준 용액 (1000 μg/ml Al을 함유한 1 wt.% HCl); 칼슘 원자 흡수 표준 용액 (1000 μg/ml Ca를 함유한 1 wt. % HCl); 구리 원자 흡수 표준 용액 (1000μg/ml Cu를 함유한 1 wt. % HCl); 마그네슘 원자 흡수 표준 용액 (1000 μg/ml Mg를 함유한 1 wt. % HN0₃); 망간 원자 흡수 표준 용액 (1000 μg/ml Mg를 함유한 1 wt.% HN0₃); 아연 원자 흡수 표준 용액 (1000μg/ml Zn를 함유한 1 wt.% HN0₃). 표준 수산화 나트윰 및 염화수소 산 용액을 VWR Scientific Products로부터 구입하였다. MOPS(3-[N-모르폴리노]프로판설폰 산)을 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

B. 분광광도 적정에 의한 Fe-Apo6619 시스템에 대한 단계적 생성 상수의 결정. Apo6619은 1-사이클로프로필-3-하이드록시-6-메틸-4-옥소-1,4-디하이드로-피리딘-2-카르복실 산 메틸아아마이드이다.

Mⁿ ⁺-리간드 시스템에 대한 단계적 생성 상수는 금속 착염이 리간드 대 금속 전하 전이에 의한 가시 영역에서의 강한 흡광도를 가질 때 분광 광도 적정에 의해 결정되었다. 전형적인 실험에서, 상기 샘플 용액을 하기 방법에 따라 제조하였다: Apo6619 (10.7 mg)을 칭량하여 80-ml비이커에 넣은 후, 0.1 M NaCl (50 ml)을 첨가하였다. 이 혼합물을 10분간 음파처리하여 투명한 무색 용액을 생성하였다. 철 스톡 용액 (원자 흡수 표준, Aldrich, 496 μl, 8.93E-06 몰)을 피펫으로 상기 용액에 넣은 후 1.000 N NaOH (137 μl)를 첨가하였다. 전체 철 및 전체 Apo6619간의 몰비는 1:5.4였다. 상기 혼합물을 밤새 실온에서 평형화시켰다. 질소를 용액내로 기포시겼다. 1.000 N 염산 (3 ml)을 상기 용액에 첨가하여 pH 1.5로 조정하였다. 상기 용액을 22℃에서 3 시간 평형화시켰다.

슬리퍼 시스템을 사용하여 상기 비이커 및 유동 셀간의 샘플 용액을 순환시켰다.

상기 샘플 용액을 22℃에서 표준 NaOH 용액들에 대하여 적정하여 pH 6.89로 조정하였다. 매번 염기를 첨가한 후, 상기 용액을 일정한 pH 값이 도달할 때까지 평형화시켰다. 매 측정마다 pH 및 UV-Vis 스펙트럼을 측정하였다. 매 측정마다, 충분한 염기를 첨가하여 스펙트럼의 흡광도에 있어서 약간의 증가가 있게 하였다. 연속적인 수 번의 염기 첨가 후 스펙트럼에서 명백히 증가되지 않을 때 까지 상기 용 액을 적정하였다. 모두 64 번의 측정을 하여 실험을 종결하였다.

pHAB를 사용하여 결과된 데이터 세트를 분석하였다. 다음 보기가 주어질 때: L^- + H⁺ ↔ LH (pKa₁), LH + H⁺ ↔LH² ⁺ (pKa₂), Fe³ ⁺ + L- ↔ FeL² ⁺ (K₁), FeL² ⁺ + L^- ↔ FeL²⁺ (K₂), FeL² ⁺ + L- ↔ FeL3 (K3), 및 β₃ = K₁K₂K₃, Fe-Apo6619 시스템에 대한 단계적 생성 상수는 logK₁=12.5(1); logK₂=11.6(1); logK₃=9.5(1); logβ₃ =33.6(2)로 최적화되었다.

C. 전위차 적정에 의한 Al-Apo6619 시스템에 대한 단계적 생성 상수의 결정.

Mⁿ ⁺-리간드 시스템에 대한 단계적 생성 상수는 금속 착염(=0.002 M)이 적정 동안 침전되지 않을 때, 전위차 적정에 의해 결정되었다. 전형적인 실험에서, 상기 샘플 용액을 하기 방법에 따라 제조하였다: Apo6619 (31.91 mg)을 칭량하여 25-ml비이커에 넣은 후, 0.1 M NaCl (18.9 ml)을 첨가하였다. 이 혼합물을 10분간 음파 처리하여 투명한 무색 용액을 생성하였다. 알루미늄 스톡 용액 (원자 흡수 표준, Aldrich, 971 μl, 3.59x10^-5 몰)을 피펫으로 상기 용액에 넣은 후 1.000 N NaOH (229 μl)를 첨가하여 pH를 8.56으로 조정하였다. 전체 알루미늄 및 전체 Apo6619간의 몰비는 1:4였다. 상기 혼합물을 밤새 22℃에서 평형화시켰다. 질소를 용액 내로 기포시겼다. 이 혼합물을 22℃에서 2 시간 평형화시켰다. 1.000 N 염산 (264 μl)을 상기 용액에 첨가하여 pH 2.20으 조정하였다. 상기 용액을 22℃에서 1 시간 평형화시켰다.

상기 용액을 22℃에서 1,000N NaOH 에 대하여 적정하여 pH 11.0으로 조정하였다. 매번 염기를 첨가한 후, 상기 용액을 일정한 pH 값이 도달할 때까지 평형화시켰다. 매 측정마다 pH 및 UV-Vis 스펙트럼을 측정하였다. 첨가 염기의 부피 및 pH 값을 매 측정마다 기록하였다. 이번 실험에 모두 93 번의 측정을 실시하였다.

Hyperquad 2000을 사용하여 pH 대 염기 부피의 데이터 세트를 분석하였다. 다음 보기가 주어질 때: L^- + H⁺ ↔ LH (pKa₁), LH + H⁺ ↔ LH² ⁺ (pKa₂), Al³ ⁺ + L- ↔ AlL²⁺ (K₁), AlL² ⁺ + L^- ↔ AlL² ⁺ (K₂), AlL² ⁺ + L- ↔ AlL₃ (K₃), 및 β₃ = K₁K₂K₃, Fe-Apo6619 시스템에 대한 단계적 생성 상수는 logK₁=12.6(2); logK₂=9.2(1); logK₃=8.4(1); logβ₃ =30.2(2)로 최적화되었다.

pMⁿ ⁺의 계산

pMⁿ ⁺는 생리적 조건에서-log[M(H₂O)m]ⁿ⁺로 정의된다, 예를 들어, pH 7.4, 10 μM의 리간드 농도, 및 1 μM의 금속 농도.

ML_n 시스템에 대한 pMⁿ ⁺을 계산하기 위해, βn 및 pKa 값들이 필요하다(βn은 Mⁿ⁺ + nL^- ↔ ML_n에 대한 생성 상수이고; pKa는 L^- + nH⁺ ↔ LH_n ^(n-1)+에 대한 평형 상수이다). Hyss 소프트웨어 (Hyperquad Stimulation and Speciation software: HYSS2 2000 Protonic Sofware)를 사용하여, pMn+를 계산할 수 있다.

식 1의 화합물에 대한 상기 결정값으로부터 얻은 데이터는 표 1 및 2에 기재된다.

실시예 15: 철분 과다 섭취 래트에서의 식 1의 화합물을 평가

철분 과다 섭취 래트에서의 소변 및 대변 철분 배출 촉진에서의 Apo6619 및 Apo6617의 효율

본 연구의 목적은 철분 과다 섭취 래트 모델에서 철분 배출을 촉진하는 데 있어서, Apo6619 및 Apo6617의 효능을 결정하는 것이다. 철분 과다 섭취는 철 덱스트란을 투여함으로써 달성되었다. 철 덱스트란을 사용하여 철분을 과다 섭취시키는 것은 킬레이터 효능을 산정하기 위해 마우스 (Kontoghiorghes G. J., Mol Pharmacol, 1986, 30(6), 670-3; Bartfay 등, Cardiovasc Res. 1999, 43(4), 892-900), 게르빌루스 쥐 (Hershko 등, J. Lab Clin med 2002, 139, 50-58), 래트 (Rakba N. biochem Pharmacol. 1998, 55(11):1796-1806) 및 영장류 (Bergeron 등, Blood, 1992, 79(7), 1882-1890)에서 이전에 이미 사용되어 왔다. 본 연구에 사용된 철분 섭취 섭생법은 수컷 래트에서 간 철분 농도를 20배, 삼장철분 농도를 3.8배 증가시키는 결과를 낳는다. 이러한 모델에서의 이전 연구는 이러한 모델이 동물 체중 증가, 음식 소비, 임상 화학 또는 혈핵학적 변수에서의 심각한 이상징후와 연관이 없는 것으로 밝혔다.

실험 방법:

6 마리 웅성 Sprague-Dawley 래트 (200-250 그람 체중)을 캐나다 퀘벡주 몬트리얼 소재의 Charles River Laboratories 로부터 얻었다. 철 덱스트란을 100 mg/kg 용량으로 일주일에 두 번 4 주간 총 8번 복부 주입하여 철분 섭취케 하였다 (철 덱스트란, Sigma). 주입된 철 덱스트란의 총 부피는 1 mL/kg이었다. 8 주 후, 래트를 대사 케이지로 옮겼다 (한 마리/케이지). 일단 상기 동물이 대사 케이지 내에 있게 되면, 배출물 (소변 및 대변 둘 다)을 매일 각 킬레이터를 투여하기 전 적어도 3일간 및 투여한 후 4일간 수집하였다. 상기 두 개 킬레이터 (Apo6619 및 Apo6617) 각각을 연속적으로 투여하였다. 킬레이터는 2-4 mL/kg의 투여 부피로 경구 튜브(gavage)를 통해 단일 투여량 450 μmoles/kg으로서 투여하였다. 킬레이터 투여후 동물들을 매일 점검 (눈, 피부 및 운동)하여 건강 이상의 어떤 명확한 징후를 결정하였다. 소변 및 대변은 총 철 농도에 대한 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

동물 식사, 물 및 거주:

연구하는 동안 래트를 기후 및 빛 조절이 되는 환경 (온도: 19-25℃, 상대 습도 40%, 12시간 명/암 주기)에 거주하게 하였다. 환경 순응, 철 섭취 및 평형 상태 동안, 래트들을 표준 케이지에 두고 (2마리 래트/케이지), 표준 설치류 음식을 공급하고, 및 원하는 대로 주기적으로 물을 공급하였다. 철 섭취 및 평형 완료 후에 래트를 대사 케이지로 옮겼다 (한마리/케이지, Nalgene, Rochester NY). 대사 케이지로 옮기기 3 일전에, 저 분량 철분 식사 (3 ppm 철분, Dyets Bethlehem, PA)를 공급하고 밀리포어(Millipore)로 정수된 물을 원하는 대로 주었다. 연구 기간동 안 계속하여 저 철분 식사를 공급하였다. 저철분 식사를 제공하는 목적은 대변 샘플에서 식사 철분에 의해 생겨나는 배경 혼란을 감소시키기 위한 것이다.

킬레이터의 투여액 제조:

식 1의 킬레이터 (570 mg)의 50 mg/ml 투여 용액을 밀리포어 물 (2 ml) 및 6N HCl (0.4 ml)의 혼합물에 용해하고 밀리포어 물 (9 ml)로 최종 부피 (11.4 ml)로 만들었다. 이런 용액의 최종 pH를 희석된 수산화 나트륨 용액을 사용하여 4로 조정하였다. 용액들은 빛으로부터 차단되었고 매번 투여하기전에 새로이 제조하였다.

철분 결정:

소변 및 대변 샘플을 캐나다 온타리오주 런던시에 소재하는 런던 건강 과학 센터의 미량원소 연구소 (the Trace Elements Laboratory at the London Health Sciences Center)로 보내어 전체 철분 농도를 분석하였다. 간략하게는, 대변 샘플은 물을 첨가하고, 90℃로 가열하고, 볼텍싱하고 후속적으로 동결 건조시켜 제조하였다. 다음 이러한 샘플을 혼합하고, 대표적인 계대 샘플을 취하고 끓는HN0₃ 및 H₂O₂로 분해시켰다. 다음 대변 샘플을 고해상도 섹터 필드 ICP-MS (Finnigan Element 1)을 사용하여 운행하기 전에 초순수로 1:100로 희석시켰다. 소변 샘플은 0.1% HNO₃로 분해하고 ICP-MS 상에서 운행하기 건에 1/10으로 희석시켰다. 철분이 함유된 샘플 및 NIST 추적가능한 표준물을 사용하여 적절한 표준 커브를 사용하였다. 상기 정량 위 또는 아래에 있는 샘플들은 재검하였다. 일정한 시간 동안 생성된 소변 및 대변의 총량 및 래트 체중을 알기 때문에, 소변 및 대변내의 총 철분 수준은 μg/일/kg으로 표시된다. 언페어드 t-테스트를 사용하여 군 내 또는 군 간의 통계적 비교를 실시하였다. <0.05 의 p 값이 유의한 것으로 받아들여진다.

결과

상기 킬레이터 중 임의의 것을 투여한 후에는 상기 래트는 어떠한 건강 이상 징후를 나타내지 않았다. 상기 킬레이터 각각을 투여한 후 모든 동물들은 계속적으로 체중이 늘었다.

소변 배출:

소변 철분 배출 촉진에 대한 Apo6619 및 Apo6617의 효능은 도 6에 도시되어 있다. Apo6619 투여 전 3일간 청정된 바와 같이 기본 소변 배출량은 6±1 μg/일/kg이었다.

이것이 Apo6619 투여 하루 후에 240±131 μg/day/kg으로 증가되었다 (p=0.007). 후속적으로, Apo6619 투여 후 두 째 날에 16±5μg/day/kg으로 배출이 감소하였으나, 이러한 수준도 여전히 기본 수치 보다 상당히 높은 것이다 (p=0.004). 세 째날 까지, 소변 철 배출은 기본 수치 (5+1 μg/day/kg)로 복귀하였다. Apo6617 또한 투여 후 하루 또는 이틀 후에 철분 배출을 증가시키는 결과를 나타낸다(164±55 및 17±13 μg/day/kg, 각각). 비록 Apo6619에 의해 나타나는 소변 배출이 Apo6617로 활성화된 것보다 숫자적으로 더 크지만 (240±131 μg/day/kg 대 164±55μg/day/kg, 킬레이터 투여 하루 후), 이러한 차이는, 여섯 마리 래트 중 하나가 Apo6619보다 Apo6617에 의해 더 높은 소변 배출을 보였다는 사실로 인하여 통계학 적 유의성을 얻지 못하였다.

비교하기 위해, 철분 킬레이터 (디페리프론 deferipr온)를 상기 모델이지만 상이한 세트의 래트 (n=6)에서 450 μmoles/kg의 투여량으로 연구하였다. 기본 소변 철분 농도는 9±3 μg/day/kg으로 측정되었다. 이러한 것은 디페리프론 두여 하루 후에 80±32 μg/day/kg으로 증가하였고 (p=0.06), 두 째 날까지 기본 수치로 복귀하였다.

대변 배출:

대변 철분 배출을 촉진하는 데 있어서, Apo6619 및 Apo6617의 효능이 표 3에 제시되어 있다. 기본 수치는 물론 킬레이터 후에 유도된 값은 킬레이터 투여 전 및 후 삼 일간에 배출된 철분 총합을 각각 나타낸다. Apo6619 및 Apo6617 둘 다 450 μmoles/kg으로 대변 철분 배출을 증가시켰으나, 이것은 Apo6617 군에서만 통계적 유의성이 있다 (Apo6619: 4154±1245 μg/day/kg, p=0.08 대 기본 수치; Apo6617 4411±790 μg/day/kg 대 기본수치, p=0.008). 동일 모델에서의 이전의 연구 결과는, 디페리프론을 여섯 마리 래트에 450 ㎛oles/kg의 투여량으로 투여하면 킬레이터 투여 3일 후에 2157±169 μg/day/kg의 대변 철분 배출 값을 결과하는 것으로 나타났다.

113 μmoles/kg에서의 두번째 래트 연구

두 번째 연구를 수행하여 상기 연구에서 관찰된 Apo6619 및 Apo6617의 효능 결과를 확증하고 450 μmoles/kg보다 적은 투여량에서 이러한 화합물들의 효능을 더욱 구체화하였다. 이러한 연구는 두 개의 분리된, 철분 과다섭취 래트 군에서 실 시하였다. 이러한 래트들에서 철분 과다 섭취, 두여 용액의 제조 및 효능 산정 방법은 전술한 연구에서 설명된 것과 유사하게 수행하였다.

래트의 제 일 군 (n=6)에 Apo6619을 28,113 및 450 μmoles/kg의 양으로 연속적으로 처리하였다. 유사하게, 래트의 제 이 군 (마찬가지로 n=6)을 동일한 세 가지 투여량으로 처리하였다. 배출 데이터를 표 4에 요약하였다. 이전 연구와 비슷하게, Apo6619 및 Apo6617 둘 다 450 μmoles/kg 투여량에서 소변 철분 배출을 증가시켰다 (Apo6619: 11±3 기본 수치에서 335±76로, Apo6619 투여 1일 후, p=0.0001; Apo6617: 14±4 기본 수치에서 183±20로, Apo6617 투여 1 일 후, p=0.0003). Apo6619 및 Apo6617 간의 소변 배출 효능에서 유의할 차이가 450 μmoles/kg에서 관찰되지 않았던 이전 연구와는 달리, 본 연구에서는 이러한 투여량에서 Apo6619 가 Apo6617 보다 더 효과적이라는 것(p=0.004)이 명백하다. 유사하게, 113 μmol/kg (25 mg/kg)에서, Apo6619 및 Apo6617 둘 다 소변 배출을 증가시켰지만 (p<0.005), Apo6619가 Apo6617보다 더 효과적이다 (p=0.01). 28 ㎛oles/kg에서, 오로지 Apo6617만이 기본 수치보다 넘어서 철분 배출 증가를 가져왔다 (p=0.01). 그러나, 증가된 배출 정도는 Apo6619 및 Apo6617 둘 다에 대하여 작다.

대변 배출이 Apo6619을 450 μmoles/kg 투여시 증가되었고(p=0.03) Apo6617을 사용하여 배출 증가가 또한 있다 (p=0.08). 450 μmoles/kg이하의 투여량에서는 어떠한 킬레이터도 대변 배출에 있어서 유의할 만한 증가가 검출되지 않았다.

종합적으로, 상기 두 연구는 Apo6619 및 Apo6617이 소변 및 대변 철분 배출에서 증가시킨다는 결과를 가져온다는 것을 나타내고 있다. 이러한 배출은 동일한 모델에서 디페리프론으로 실험한 이전의 연구에서 관찰된 것보다 더 우수하다. Apo6619가 높은 투여량에서 Apo6617에 비해 상당히 더 높은 소변 철분 배출을 나타내고 있는 반면, 대변 철분 배출을 증가시키는 것에 있어서 Apo6617에 대한 Apo6619의 우수성은 이러한 연구에서는 명백하지 못한 것이었다. 대부분, 이러한 것은 킬레이터에 의해 유도된 철분 배출 증가를 검출하기 어렵게 하는, 높은 그리고 고도로 가변적인 대변에서의 철분의 "배경" 농도에 기인한다.

실시예 16: A. Fe(Apo6617)₃ 킬레이터의 제조

중탄산 나트륨 0.84g, 탄산 나트륨 1.06g을 탈이온수에 용해하고 및 용액을 50 ml로 희석하여 pH 9.7 탄산염 완충액을 제조하였다. Apo6617 (1.028g, 4.62 mmol)을 상기 탄산염 완충액 (25 ml)에 첨가하였다. 이러한 이질성 혼합물을 실욘에서 15분간 교반하여 투명한 용액을 생성하였다. 무수 염화철(ferric chloride) (0.2417g, 1.49 mmol)을 실온에서 5 분에 걸쳐 소 부분으로 첨가하여 진한 붉은 용액을 생성하였다. 다음 플라스크를 격벽 캡으로 밀봉하고 실온에서 42 시간 교반하였다. 아세토니트릴 (30 ml)을 첨가하고 용매를 감압하 증발시켜 건조된 붉은 고형물을 수득하였다. 고형물을 디클로로메탄 (90 ml)에 용해하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 이러한 조 생성물을 용출 구배액 (디클로로메탄/메탄올 혼합물: 95/5,90/10 및 80/20)을 사용하는 플래쉬 크로마토그래피로 여과하였다. 붉은 색 고형물 (900mg)을 수득하였다. 고형물을 에틸 아세테이트/메탄올 (90/10, 60 ml)와 혼합하고 실온에서 1 시간 교반하였다. 불용성 입자 를 여과하고 여과물을 감압 증발시켜 생성물 (800.5 mg)을 수득하였다. MS (m/z): 742.6 (M⁺+ Na), 720.4 (M⁺+1), 634.6, 499.0, 469.6, 360.4, 334.3

상기 물질 0.2 그람을 디클로로메탄에 용해하여 Fe(Apo6617)₃ 의 용액을 제조하였다. 불용성 입자를 여과하였다. 에틸 아세테이트 0.3 ml을 바이얼에 담겨진 상기 포화 용액 1 ml에 첨가하였다. 바이얼의 뚜껑을 닫고 실온에 두었다. 결정학적으로 확정하기 위해 짙은 갈색 결정을 제거하였다. 3-차원 단일 결정 구조가 도 7에 도시되어 있다. 결정학적 데이터는 표 5 내지 6에 제시되어 있다.

B. Fe(Apo6619)₃ 의 제조

Apo6619 (4.4488 g, 20.0 mmole)을 칭량하여 자기 교반자를 구비한 1-구 둥근바닥 플라스크에 두었다. 탈이온수 (30 ml)를 첨가하여 현탁액을 만들었다. 이 혼합물에 실온에서 NaOH 용액 (6.000 N 용액의 3.336 ml, 20.0 mmole)을 첨가하여 투명한 오렌지-레드 용액을 생성하였다. FeCl₃ 6H₂O (1.7735 g, BDH, 97-102%, 6.56 mmole)을 칭량하여 시험관에 두었다. 탈이온수 (4 ml)을 상기 시험관에 첨가하였다. 이 혼합물을 볼텍스하여 투명한 노란 용액을 생성하였다. FeCl₃ 용액을 상기 Apo6619 용액에 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 6 일간 교반하였다. 이때 고형물이 생성되었다. 이 고형물을 흡입 여과하여 수집하였다. 이 고형물을 상기 둥근바닥 플라스크로 다시 옮기고, 아세톤 50 ml 및 탈이온수 3 ml을 첨가하였다. 혼 합물을 수시간 교반하였다. rhgdanf을 흡입 여과로 수집하였다. 고령물을 공기 건조시켜 3.1 g을 얻었다 (수율=66%). MS: 720.6 (M+1). 톨루엔에서 습윤 DMF로 확산시켜 Fe(Apo6619)₃ 의 단결정물을 성장시켰다. Fe(Apo6619)₃ 의 X-선 결정 구조는 도 8에 도시되어 있다.

실시예 17 Fe-Apo6619 시스템의 E₁ _/2의 결정

A. 재료 및 기기

포타슘 페리시아나이드를 알드리치로부터 구입하였다. 디페로사마이드 메실레이트 (DFO)를 시그마로부터 구입하였다. 철 원자 흡수 표준 용액 (1 wt.% HCl내에 Fe 1005㎍/ml 함유)을 알드리치로부터 구입하였다. 사이클릭 전압측정 분석기 (cyclic voltammetric analyzer) (BAS, CV-50W Potentiostat)를 사용하여 전기화학적 측정을 수행하였다. 소프트웨어 BAS CV-50W Version 2.31 를 사용하였다. 하기 전극을 사용하여 철 착염의 산화환원 전위를 결정하였다: 기준 전극 (BAS, MF-2052); 백금 보조 전극 (BAS, MW-1032); 및 유리질 탄소 작동 전극 (BAS, MF-2012). pH 미터 (Accumet Research AR15, 13-636-AR15, Fisher Scientific) 및 pH 전극 (AccupHast 복합 전극, 13-620-297, Fisher Scientific) 을 사용하여 샘플 용액의 pH를 조정하였다.

B. 샘플 용액의 제조

Fe(DFO)를 함유한 0.1M NaCl (pH 7.4)의 2.0 mM 용액

디페록사마이드 메실레이트 148.1 mg (순도=95%)를 정확히 칭량하여 100-mL 계량 플라스크에 넣었다. 이 고체를 0.1 M NaCl 30 mL에 용해하여 투명한 무색 용액을 만들었다. 이 용액에 표준 철분 용액 11.114 mL (1 wt.% HCl에 Fe 1005 μg/ml 포함)을 첨가하였다. 상기 용액을 0.1 M NaCl로 상기 계량 플라스크의 100 ml 눈금에 맞추었다. 결과된 용액을 볼텍스하여 완전하게 혼합하였다. 용액을 200-mL 비이커로 옮겼다. 용액의 pH를, 수산화 나트륨의 표준 용액을 첨가함으로써 약 7.1로 조정하였다. 다음, 비이커를 파라필름으로 덮고 용액을 밤새 교반하면서 방치하였다. 용액의 pH를 다음 시험날 7.40로 조정하였다. 철_total 및 DFO_total 간의 계산된 몰 비는 1:1.07이다.

Fe(Apo6619)₃을 함유한 0.1M NaCl의 2.0 mM 용액 (pH 7.4)

Apo6619 70.0 mg을 정확히 칭량하여 50-mL 계량 플라스크에 두었다. 이 고체를 NaCl의 15 mL에 용해하여 투명한 무색 용액을 생성하였다. 이러한 용액에 표준 철 용액 5557 μL (1 wt.% HCl에 Fe 1005 μg/ml 포함) 을 첨가하였다. 다음, 0.1 M NaCl을 첨가하여 전체 50 ml 부피로 희석시켰다. 결과된 용액을 볼텍스하여 완전하게 혼합하였다. 용액을 80-mL 비이커로 옮겼다. 다음 상기 용액의 pH 를, 수산화 나트륨의 표준 용액을 첨가하여 약 7.1로 조정하였다. 다음 비이커를 파라필름으로 덮고 용액을 밤새 교반하면서 방치하였다. 용액의 pH 를 다음 시험날 7.40로 조정하였다. 철_total 및 DFO_total 간의 계산된 몰 비는 1:3.15. 유사한 방식으로, Fe(디페리프론)₃의 2.0 mM을 함유하는 0.1 M NaCl 용액(pH 7.4)을 제조하였다.

C. 철염의 산화환원 전위 결정

명세서에서 모든 전위는 Ag/AgCl 기준 전극에 대하여 주어진 것이다. The redox potentials of 2.0 mM of K₃Fe(CN)₆ 2.0 mM을 함유한 1.0 M 질산 칼륨의 산화 환원 전위를 각 작동일 시초에 측정하여 사이클릭 전압기의 적절한 기능을 확인하였다. pH 7.4에서 철염들, 즉, Fe(DFO), Fe(L1)₃, 및 Fe(Apo6619)₃의 2.0 mM 용액의 산화환원 피크 전위를 결정하였다. CV 스캔 전에 철 염들의 샘플 용액을 아르곤으로 15분간 정화하고, 상기 용액들을 측정하는 동안 아르곤하에 두었다. 매번 스캔 후에는 유리질 탄소 작동 전극을 알루미나 상에서 닦았다. 사용된 스캔 속도는 포타슘 페리시아나이 (III) 용액에 대해서 300 mV/sec였고, Fe(DFO), Fe(L1)₃, 및 Fe(Apo6619)₃에 대해서는 450 mV/sec였다. 도 9는 pH 7.4 에서 철(III)L 착염의 사이클릭 전압도를 나타내고 있다: a) K₃Fe(CN)₆; b) Fe(DFO); c) Fe(L1)₃; {L1 = 디페리프론} 및 d) Fe(Apo6619)₃. 상기 네 개 철 염의 환원 피크 전위 (E_p ^red), 산화 피크 전위 (E_p ^ox), E_p ^red 및 E_p ^ox 간의 절대 차 (△E_p), 및 산화환원 전위 (E₁ _/2)를 측정하였다 E₁ _/2 값은 (E_p ^red +E_p ^ox)/2로서 계산되며 도 9내의 표에 제시되어 있다.

K₃Fe(CN)₆의 2.0 mM을 함유한 1.0 M 질산 칼륨의 산화환원 전위를 작동일 시초에 측정하여 사이클릭 전압기의 적절한 기능을 확인하였다. 통상적인 측정에서, 유리질 탄소 작동 전극을 사용하여 이번 실험에서 측정된 K₃Fe(CN)₆의 E_p ^red, E_p ^ox, △E_p, 및 E₁ _/2의 값은 각각, 197mV, 282 mV, 85 mV 및 240 mV였다. 백금 작동 전극을 사용하여 얻은 Bioanalytical Systems Inc. (BAS)의 값은 각각, 237 mV, 306 mV, 69 mV, and 272 mV 였다. 이론적 전망치로부터, 단일 전자 전달 과정에서 △E_p는 약 60 mV여야 한다. 상기 실험값은 BAS의 것과 상당히 일치하는 것으로 판단된다.

K₃Fe(CN)₆와는 달리, Fe(DFO), Fe(L1)3, 및 Fe(Apo6619)₃의 산화환원 특성은 작동 전극 표면의 상태에 매우 민감하다. 산화환원 전위는 매번 스캔한 후 유리질 탄소 작동 전극을 알루미나 상에서 조심스럽게 닦아낸 후에야 재현될 수 있다.

Fe(DFO), Fe(L1)₃, 및 Fe(Apo6619)₃의 △E_p 값은 각각 112 mV, 107 mV, 및 85 mV이다. Fe(DFO), Fe(L1)₃, 및 Fe(Apo6619)₃의 사이클릭 전압도는 기본적으로 가역적이라는 것이 명백하게 나타난다 (도 9). 이러한 두 가지 관찰에 기초하여, 합리적으로는, Fe(DFO), Fe(L1)₃, 및 Fe(Apo6619)₃의 사이클릭 전압도는 각 착염:Fe(III)Ln, Fe(II)Ln에 대하여 가역적인 단일 전자 전이 과정을 나타낸다고 가정하는 것이다. 이러한 실험에서 결정된 Fe(DFO)의 E₁ _/2의 값은 Ag/AgCl 기준 전극에 대하여 -698 mV이고 이는 문헌의 수치 (-688 mV)와 훌륭하게 일치한다 (A. L. Crumbliss 등, Inorganic Chemistry, 2003,42, 42-50) Fe(Apo6619)3의 E₁ _/2 값은 -691 mV이고 이는 Fe(DFO)의 것과 비슷하다.

전술한 실시예들은 오직 예증의 방편으로서 제시되었고 여한한 이유로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도된 것이 아니다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명 이 본 발명의 사상 및 원칙으로부터 이탈되지 않고 다양한 방법으로 개조될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 우리는 그러한 개조를 모두 권리 주장한다.

pH 7.4에서의 철(III)Ln 착염의 전기화학적 특성이 하기 기재되어 있다.

시스템	E_p ^red(mV)	E_p ^ox(mV)	△E_p(mV)	E₁ _/2(mV)
K₃Fe(CN)₆	197	282	85	240
Fe(DFO)	-754	-642	112	-698
Fe(디페리프론)₃	-887	-780	107	-834
Fe(Apo6619)₃	-733	-648	85	-691

표 1 : 화학식 1 의 화합물의 화학적성질

표 2 : Apo6619(pKa₁ = 2.5, pKa₂ = 8.6)의 금속이온결합선택성

표 3 : 철분이 과잉된 쥐에 있어서 450μmoles/㎏의 분량으로 처리된 Apo6619와 Apo6617에 의한 대변으로 배출된 철분의 증진효과(n=6). 단위치수는 ㎕/day/㎏ 임. 대변으로 배설된 결과치수는 추정 킬레이트 착화제 사용 3일후의 것이 주어짐. 단위치수는 평균치±SD임.

표 4 : 철분이 과잉된 쥐에 있어서 Apo6619와 Apo6617에 의한 대변과 소변으로 배설된 철분의 증진 효과(n=6/그룹). 단위 치수는 ㎕/day/㎏ 표기. 대변으로 배설된 결과 치수는 킬레이트 착화제 사용 3일후가 표기되었고 킬레이트 시행하기 3일전에 기준선과 비교하였음. 숫자는 평균치±1SD임.

1- 3일배설량의 평가는 위장계를 통과하는 철분의 통과허용 요구치임.

* 동일그룹의 p<0.05에 대한 기준선 값

τ 동일분량에서의 p<0.05에 대한 Apo6617

표 5 : Fe(Apo6617)₃의 결정체 데이타 및 구조세부사항

동정코드 Fe(Apo6617)₃

실험식(방식) C₃₃ H₄₂ Fe N₆ O₁₀ _.50

처방중량, 공식적중량 746.58

온도 150(1) K

파장 0.71073 Å

결정계 삼사정계

공간군 P -1

단일세포의 용적 a = 10.9760(4) Å α=94.283(2)°.

b = 11.3790(4) Å ß=90.351(2)°.

c = 13.9952(5) Å γ=91.731(2)°

부피 1742.18(11)Å³

Z 2

산출된 밀도 1.423Mg/㎥

흡수계수(광) 0.500 ㎜^-1

F(000) 784

결정체 크기 0.30 × 0.14 × 0.04㎣

자료수집을 위한 세타의 범위 2.62 to 25.00°.

지시구역 -13<=h<13, -13<=k<=13, -16<=1<=16

의견의 수렴 16641

독자적 의견 6114 [R(int) = 0.0753]

세타=25.00°에 대한 안전도 99.8%

흡수도의 보정 당량으로부터 추정

최대최소전도도 0.966 and 0.892

정제방법 F² 최소자승법 완전매트릭스

자료억제요인 6114 / 2 / 462

F2에 일치하는 적수 1.034

마지막 R 값[I>2시그마(I)] R1 = 0.0566, wR2 = 0.1410

R 지수들 R1 = 0.0830, wR2 = 0.1594

감광계수 n온

상승점과 하락점사이의 최대차 0.609 and -0.539 e.Å^-3

표 6 : Fe(Apo6617)₃의 결합간격[Å]와 결합각도[°]

등가원자발생에 사용된 대칭적 성분치환 : #1 -x,-y+1,-z

표 7 : Fe(Apo6617)₃의 결정체 데이타 및 구조세부사항

동정코드 Fe(Apo6619)₃

실험식(방식) C37.50 H53.50 Fe N7.50 O12.50

처방중량, 공식적중량 865.23

온도 150(1) K

파장 0.71073 Å

결정계 삼사정계

공간군 P -1

단일세포의 용적 a = 11.9319(8) Å α=116.811(3)°.

b = 14.3968(9) Å ß=108.353(3)°.

c = 15.3024(9) Å γ=95.164(4)°

부피 2141.6(2)Å³

Z 2

산출된 밀도 1.342Mg/㎥

흡수계수(광) 0.421 ㎜^-1

F(000) 914

결정체 크기 0.22 × 0.21 × 0.10㎣

자료수집을 위한 세타의 범위 2.62 to 27.59°.

지시구역 -15<=h<14, -18<=k<=18, -16<=1<=19

의견의 수렴 20782

독자적 의견 9756 [R(int) = 0.0469]

세타=25.00°에 대한 안전도 98.4%

흡수도의 보정 당량으로부터 추정

최대최소전도도 0.949 and 0.805

정제방법 F² 최소자승법 완전매트릭스

자료억제요인 9756 / 0 / 518

F2에 일치하는 적수 1.053

마지막 R 값[I>2시그마(I)] R1 = 0.0582, wR2 = 0.1519

R 지수들 R1 = 0.0928, wR2 = 0.1663

감광계수 0.0061(14)

상승점과 하락점사이의 최대차 0.559 and -0.504 e.Å^-3

표 8 : Fe(Apo6619)₃의 결합간격[Å]와 결합각도[°]

등가원자발생에 사용된 대칭적 성분치환:

Claims

하기 화학식 1에 의해 얻어지는 3-히드록시피리딘-4-온 화합물

(화 학 식 1)

상기 식에서 R²가 Y 라는 조건으로 R¹은 X ;

또는 R²가 W라는 조건으로 R¹은 T;

또는 R²R⁵N이 같이 묶어져 있을시 피페리딘, 머포린, 피로리딘, 피페라진 기들로 부터 선택되어진 하나의 헤테로사이클 링을 형성하며, 여기에서 피페리딘 기, 머포린기, 피로리딘기, 피페라진 기는 한 개에서 세 개까지 C₁-C₆ 알킬 그룹으로 치환되거나 치환되지 않는 조건으로 R¹은 X;

X는 C₃-C₆ 사이클로알킬;

Y는 C₃-C₆ 사이클로알킬, C₁-C₆ 알킬 그리고

C₁에서 C₆알킬을 C₃-C₆ 사이클로알킬로 단순 대치하여 구성된 그룹으로부 터 선택 되어지며;

T는 C₁에서 C₆ 알킬;

W는 C₃-C₆ 사이클로알킬;

R³는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택되고;

R⁴는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택되고;

R⁵ 는 수소와 C₁-C₆알킬로 구성된 그룹에서 선택됨.
제 1 항에 있어서, R²이 Y라는 조건에서 R¹이 X인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 2 항에 있어서, X가 C₃-C₆ 사이클로알킬, Y가 C₁ 내지 C₆ 알킬 그리고 R⁵가 수소 또는 메틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 3 항에 있어서, X가 사이클로프로필, Y가 메틸, R³가 수소, R⁴가 메틸 그리고 R⁵가 수소이고, 상기 화합물은 1-사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1, 4-디하이드로-피리딘-2-카르복실산 메틸아마이드인 것을 특징으로 하는 화합물.
1-사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1, 4-디하이드로-피리딘-2-카르복실산 메틸아마이드 및 약제적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 과잉 철분 제거를 위한 약제조성물.
제 5 항에 있어서, 구강용인 것을 특징으로 하는 과잉 철분 제거를 위한 약제조성물.
제 2 항에 있어서, X가 C₃-C₆ 사이클로알킬, Y가 C₃-C₆ 사이클로알킬 그리고 R⁵가 수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 7 항에 있어서, X가 사이클로프로필, Y가 사이클로프로필, R³가 수소, R⁴가 메틸이고, 상기 화합물은 N, 1-디사이클로프로필-3-히드록시-6-메틸-4-옥소-1, 4-디하이드로피리딘-2-카르복스아마이드인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 3 항에 있어서, X가 사이클로프로필, Y가 메틸, R³가 수소, R⁴가 메틸 그리고 R⁵도 메틸이고, 상기 화합물은 1-사이클로프로필-3-히드록시-N, N, 6-트리메틸-4-옥소-1, 4-디하이드로피리딘-2-카르복스아마드인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서, R²가 W라는 조건에서 R¹이 T인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 10 항에 있어서, T가 메틸, W가 사이클로프로필, R³가 수소, R⁴가 메틸 그리고 R⁵가 수소이고, 상기 화합물은 3-히드록시-1, 6-디메틸-4-옥소-1, 4-하이드로-피리딘-2-카르복실산 사이클로프로필아마이드인 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식 1A에 의해 얻어지는 3-히드록시피리딘-4-온 화합물.

(화학식 1A)

이때, R²는 C₃-C₆ 사이클로알킬, C₁에서 C₆알킬 그리고 C₁에서 C₆알킬을 C₃-C₆ 사이클로알킬로 단순대치하여 구성된 그룹으로부터 선택되며;

R⁵는 수소와 C₁에서 C₆알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되며;

R⁵R²N은 서로 묶여져 있을 때 피페리딘, 머포린,피로리딘, 피페라진으로부터 선택된 헤테로사이클링을 형성하며, 이때 그룹 피페리딘, 머포린, 피로리딘, 피페라진으로 한개에서 세개까지 C₁에서 C₆알킬그룹으로 치환되거나 치환되지 않으며;

R³는 수소와 C₁에서 C₆알킬로 구성되는 그룹으로부터 선택되고;

R⁴는 C₁에서 C₆알킬로 구성되는 그룹으로부터 선택됨.
하기 화학식 1A로부터 얻어진 화합물의 제조방법이, 하기 일반 화학식(가)에 의한 3-벤질옥시피리딘-4-온, 또는 그의 염산염의 수소첨가 반응으로 벤질기를 디프로텍팅(deprotecting)하는 단계를 포함하는 것을 3-히드록시피리딘-4-온 화합물의 제조방법.

(화학식 1A)

이때, R²는 C₃-C₆ 사이클로알킬, C₁에서 C₆알킬 그리고 C₁에서 C₆알킬을 C₃-C₆ 사이클로알킬로 단순대치하여 구성된 그룹으로부터 선택되며;

R⁵는 수소와 C₁에서 C₆알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되며;

R⁵R²N은 서로 묶여져 있을 때 피페리딘, 머포린,피로리딘, 피페라진으로부터 선택된 헤테로사이클링을 형성하며, 이때 그룹 피페리딘, 머포린, 피로리딘, 피페라진으로 한개에서 세개까지 C₁에서 C₆알킬그룹으로 치환되거나 치환되지 않으며;

R³는 수소와 C₁에서 C₆알킬로 구성되는 그룹으로부터 선택되고;

R⁴는 C₁에서 C₆알킬로 구성되는 그룹으로부터 선택됨.

(일반 화학식 (가))

(이때 R², R⁵, R⁵R²N, R³, R⁴는 특허청구범위 제 1 항에서 정의한 바와 같음)
제 13 항에 있어서, 수소첨가반응이 숯에서의 팔라듐 또는 숯에서의 팔라듐히드록사이드 그리고 메탄올, 에타놀 및 이소프로파놀로 구성되는 그룹으로부터 선 택되는 불활성용제에서의 수소와 함게 실행되는 것을 특징으로 하는 화합물 제조방법.
제 1 항에 따른 화합물과 약제적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 과잉 철분 제거를 위한 약제조성물.
제 15 항에 있어서, 구강용인 것을 특징으로 하는 과잉 철분 제거를 위한 약제조성물.
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