KR101152112B1

KR101152112B1 - 조직배양에 의한 억새의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR101152112B1
Application number: KR1020100095798A
Authority: KR
Inventors: 형남인; 권영주; 정지아; 백범선
Original assignee: 상명대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-01
Filing date: 2010-10-01
Publication date: 2012-06-15
Also published as: KR20120034327A

Abstract

본 발명은 억새의 미성숙 화기로부터 기관형성을 통한 억새 식물체 대량 생산 방법, 상기 방법에 의해 생산된 억새 식물체 및 상기 억새 식물체를 가공처리하여 바이오에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

조직배양에 의한 억새의 대량 생산 방법{Method for mass production of Miscanthus sinensis by tissue culture}

본 발명은 조직배양에 의한 억새의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 억새의 미성숙 화기로부터 기관형성을 통한 억새 식물체 대량 생산 방법, 상기 방법에 의해 생산된 억새 식물체 및 상기 억새 식물체를 가공처리하여 바이오에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

억새(Miscanthus sinensis)는 화본과의 다년생 초본으로서 우리나라 전 지역에 걸쳐 대군락을 이루며 널리 분포하고 있다. 이러한 넓은 범위의 군락은 억새가 C4 경로에 의해 광합성을 하는 식물로 광합성 효율이 매우 높고 수분 요구량이 적어 전국 어디서나 자생하기 적합한 특성을 가지고 있기 때문이다. 주로 일조량이 풍부한 산 정상에 자생하는 경우가 많은 억새는 30~35℃의 고온에서 최대 광합성 효율을 나타내고, 생장속도는 7~8월 사이에 가장 빠르다. 종자로도 번식이 가능하지만 주로 근경(rhizome)에 의해 세력이 확장되어 군락을 형성하게 되며, 또한 생활력이 강하여 벌채나 화재로 인한 기존 식생이 파괴된 후 이차천이식생으로 잘 발달하는 대표적인 식물 중의 하나이다. 국내에서는 예로부터 뿌리는 약재로, 줄기와 잎은 가축의 조사료나 지붕을 잇는데 사용하였고, 뿌리가 억세게 옆으로 퍼져나가 산지토양의 유실을 방지하는 피복식물로도 이용되어왔으며, 최근에는 조경수로 많이 사용되고 있다. 보통 초장이 1m 20cm 정도이나, 일조량이 풍부한 지역에서는 2m 이상 자라기도 하여 바이오메스가 매우 큰 작물 중 하나로 알려져 있다.

최근 지구온난화에 의한 기후변화 문제가 급속도로 부각되어, 에너지 문제는 환경문제와 연계되어 새로운 국면으로 접어들게 되면서 이산화탄소 배출규제와 화석연료 고갈에 따른 대체에너지 개발을 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 세계 각국은 기존 화석연료를 대체할 수 있고, 환경오염 배출물질이 적은 바이오연료 생산 기술개발 및 보급을 위해 적극 지원하는 추세이며, 그 시장규모가 매년 30%의 성장세를 보이고 있다는 점에서 "한국형 바이오에너지 공급 시스템"의 조기 확립이 필수적인 상황이다.

재생가능 에너지 중 바이오연료가 차지하는 비중이 높아 바이오에탄올 및 바이오디젤 생산은 연평균 13~28%의 증가율을 보이고 있으며, 미국과 브라질이 옥수수, 사탕수수 등을 이용한 바이오에탄올 세계 생산의 약 80%를 점유하고 있다(해외경제정보 제 2007-11호). 그러나 옥수수, 사탕수수와 같은 당질계 에탄올 생산은 향후 곡물자원의 부족과 곡물가격 상승의 원인이 될 가능성이 높아 바이오연료 산업을 확대하는 동시에 곡물가격의 안정화를 위해 섬유질계 혹은 목질계 바이오메스에 대한 에너지 작물 개발이 활발하게 이루어지고 있는 상황이다. 이러한 경향으로 보아, 향후 50년 이내에 바이오에탄올은 곡물자원과 경합이 없는 비식용, 비사료용 목질계 바이오메스가 주로 활용될 것으로 전망되고 있다. 바이오디젤과 바이오에탄올, 바이오메탄으로 분류되는 대체에너지는 현재까지 주로 식용작물에서 추출되어 곡물가격 상승의 원인으로 작용되고 있으며, 또한 경작지 확보를 위한 삼림의 파괴가 문제점으로 지적되고 있다. 이에 차세대 바이오메스로 비식용, 비사료용 셀룰로오스계 바이오메스에 대한 연구 개발이 매우 활발하게 이루어지고 있으며, 국내에서는 분포지역이 넓고 바이오메스가 큰 억새가 바이오에탄올 원료작물의 하나로 주목받고 있다. 억새는 전국 각지의 다양한 환경에 대한 적응력이 뛰어나고, 광합성 효율이 높아, 한 번 식재된 후 3~4년 뒤부터 10~15년 동안 매년 1ha 당 20~30톤의 수확량을 얻을 수 있다. 게다가 비료나 농약의 요구도가 낮아 친환경 바이오에너지의 원료로 적합하며, 농경지가 아닌 들판이나 간척지 등 유휴지를 이용할 수 있다는 점에서 그 잠재력을 인정받고 있다. 또한, 국내 억새는 세계 각지에 퍼져있는 억새의 원종으로 알려져 있어, 신품종 개발을 위한 유전자원으로도 적합하다.

이러한 억새를 바이오에탄올 원료 작물로 개발하기 위해서 가장 중요한 것은 단위면적당 수확량이 많고, 구성성분인 셀룰로오스의 당화 및 발효 효율이 높은 품종의 개량과 종자나 근경에 의한 증식보다 더 효율적인 대량증식 시스템을 확보하는 것이다. 따라서, 본 발명에서는 국내 자생 억새의 효율적인 대량증식 시스템 확보를 목적으로 억새의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하고 이로부터 기관형성을 통한 식물체 대량 증식 시스템을 확립하고자 한다.

또한, 이러한 억새를 바이오에탄올 원료작물로 개발하기 위해서 가장 중요한 것은 단위면적당 많은 수의 식물체를 확보하는 것과 효율적인 당화 및 발효 공정을 개발하는 것이다. 또한 구성성분인 셀룰로오스의 당화 반응을 저해하는 리그닌의 함량이 감소된 신품종을 개발하는 연구가 선행되어야 한다. 수확량이 증대되고 리그닌 함량을 감소시킨 신품종 억새를 개발하기 위한 방법으로는 여러 가지 한계점을 가지고 있는 전통적인 육종방법보다는 분자육종법의 하나인 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법이 가장 많이 이용되고 있으며, 이를 위해서는 효율적인 식물체 재생 시스템의 확립이 필수적이다. 따라서, 본 발명에서는 바이오에탄올의 원료 작물을 개발하기 위한 국내 자생 억새의 아그로박테리움 매개 유용 유전자 도입 신품종 개발을 목적으로 억새의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하고 이로부터 기관형성을 통한 식물체 대량 증식 시스템을 확립하고자 한다.

한국등록특허 제10-0815439호에는 식물체 조직 유래 체세포배를 이용한 땃두릅나무 묘목의 대량 생산 방법이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 억새의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하고, 계대배양을 통하여 증식한 후, 이로부터 신초를 재생시키는 과정을 통해 억새 식물체의 대량 증식 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 억새의 미성숙 화기로부터 기관형성을 통한 억새 식물체 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 억새 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 억새 식물체를 가공처리하여 바이오에탄올을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 억새의 1개 식물체에서 얻어진 미성숙 화기로부터 캘러스 단계를 거쳐 유도로부터 식물체 재생까지 7개월 만에 약 3만 개 이상의 억새 소식물체를 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 억새 대량 생산 방법은 친환경 바이오에너지 산업의 경쟁력 제고에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 부위에 따른 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 미성숙 화기 길이에 따른 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 2,4-D 및 벤질아데닌 조합처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 배지 고형제의 종류 및 농도에 따른 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 신초의 재생에 미치는 캘러스 유도배지의 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 신초의 재생에 미치는 벤질아데닌 및 나프탈렌 아세트산 조합처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 신초의 재생에 미치는 피타겔 농도의 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 기관형성을 통한 식물체 재생을 나타낸 것이다. 억새의 미성숙 화기(A)를 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하였다(B). 약 2주 후부터 미성숙 화기에서 캘러스가 유도되기 시작하였으며, 4주 까지 유도된 캘러스(C)를 클러스터에서 분리하여 증식시킨 후, 신초 유도배지에 치상하였다. 약 2~4주 후 캘러스가 증식되면서 신초가 발달하였다(D 내지 F). 재생된 신초를 MS 배지에서 신장 및 발근시킨 후, 온실에서 활착하였다(G 내지 I).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(1) MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계;

(2) MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 억새(Miscanthus sinensis)의 상기 유도된 캘러스를 증식하는 단계;

(3) MS 배지, 나프탈렌 아세트산, 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재생하는 단계; 및

(4) MS 배지, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 재생된 신초를 신장 및 발근하는 단계를 포함하는 억새의 미성숙 화기를 이용한 억새 식물체의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 억새 대량 생산 방법은 (1) 단계로서, MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계를 포함한다.

상기 미성숙 화기의 길이는 1~20cm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 캘러스 유도 배지에서, MS 배지는 MS 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, 2,4-D의 농도는 1~15 mg/L, 바람직하게는 5~15 mg/L, 더욱 바람직하게는 10 mg/L이다. 상기 벤질아데닌의 농도는 0.05~0.2 mg/L, 바람직하게는 0.1 mg/L이다. 상기 수크로스의 농도는 20~40 g/L, 바람직하게는 30 g/L이다. 상기 배지 고형제는 피타겔(젤란 검, gellan gum) 또는 한천이며, 바람직하게는 피타겔이다. 또한, 피타겔의 농도는 2~3 g/L, 바람직하게는 2 g/L이며, 한천의 농도는 5~10 g/L, 바람직하게는 6 g/L이다. 2,4-D 10 mg/L 및벤질아데닌 0.1 mg/L가 첨가된 배지에서 캘러스 유도율 및 캘러스 수가 가장 많았다.

본 발명의 억새 대량 생산 방법은 (2) 단계로서, MS 배지, 2,4-D, 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 유도된 캘러스를 증식하는 단계를 포함한다.

상기 캘러스 증식 배지에서, MS 배지는 MS 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, 2,4-D의 농도는 1~15 mg/L, 바람직하게는 5 mg/L이다. 상기 벤질아데닌의 농도는 0.05~0.2 mg/L, 바람직하게는 0.1 mg/L이다. 상기 수크로스의 농도는 20~40 g/L, 바람직하게는 30 g/L이다. 상기 배지 고형제는 피타겔(젤란 검, gellan gum) 또는 한천이며, 바람직하게는 피타겔이다. 또한, 피타겔의 농도는 2~3 g/L, 바람직하게는 2 g/L이며, 한천의 농도는 5~10 g/L, 바람직하게는 6 g/L이다. 2,4-D 5 mg/L 및벤질아데닌 0.1 mg/L가 첨가된 배지에서 캘러스 증식이 가장 양호하였다.

본 발명의 억새 대량 생산 방법은 (3) 단계로서, MS 배지, 나프탈렌 아세트산, 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재생하는 단계를 포함한다.

상기 단계에서, MS 배지는 MS 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, 상기 나프탈렌 아세트산의 농도는 0.1~1.5 mg/L, 바람직하게는 1.0 mg/L이다. 상기 벤질아데닌의 농도는 0.1~10 mg/L, 바람직하게는 0.5~1.5 mg/L, 더욱 바람직하게는 1.0 mg/L이다. 상기 수크로스의 농도는 20~40 g/L, 바람직하게는 30 g/L이다. 상기 배지 고형제는 피타겔(젤란 검, gellan gum) 또는 한천이며, 바람직하게는 피타겔이다. 또한, 피타겔의 농도는 2~3 g/L, 바람직하게는 2 g/L이며, 한천의 농도는 5~10 g/L, 바람직하게는 6 g/L이다. 나프탈렌 아세트산 1.0 mg/L 및 벤질아데닌 1.0 mg/L가 첨가된 배지에서 신초수 및 신초 재생률이 가장 높았다.

본 발명의 억새 대량 생산 방법은 (4) 단계로서, MS 배지, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 재생된 신초를 신장 및 발근하는 단계를 포함한며, 바람직하게는 MS 배지, 수크로스 20~40 g/L 및 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 재생된 신초를 신장 및 발근하는 단계를 포함한다. MS 배지, 수크로스 20~40 g/L 및 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지가 재생된 신초를 신장 및 발근하는데 효과적이었다.

따라서, 본 발명은 더욱 바람직하게는

(1) MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 1~15 mg/L, 벤질아데닌 0.05~0.2 mg/L, 수크로스 20~40 g/L 및 젤란 검 2~3 g/L 또는 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 억새(Miscanthus sinensis)의 1~20cm 길이의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계;

(2) MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 1~15 mg/L, 벤질아데닌 0.05~0.2 mg/L, 수크로스 20~40 g/L 및 젤란 검 2~3 g/L 또는 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 유도된 캘러스를 증식하는 단계;

(3) MS 배지, 나프탈렌 아세트산 0.5~1.5 mg/L, 벤질아데닌 0.1~10 mg/L, 수크로스 20~40 g/L 및 젤란 검 2~3 g/L 또는 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재생하는 단계; 및

(4) MS 배지, 수크로스 20~40 g/L 및 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 재생된 신초를 신장 및 발근시키는 단계를 포함하는 억새의 미성숙 화기를 이용한 억새 식물체의 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 억새 식물체를 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 억새 1개 식물체에서 얻어진 미성숙 화기로부터 캘러스 단계를 거쳐 식물체 재생까지 7개월 만에 약 3만 개 이상의 억새 소식물체를 획득할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 억새 식물체를 가공처리하여 바이오에탄올을 생산하는 방법을 제공한다. 억새 식물체로부터 바이오에탄올을 생산하는 방법은 당업계에 알려진 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 준비

1.1. 식물 재료

본 연구는 충청남도 보령시 청소면 오서산에서 채취한 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기를 포함하고 있는 줄기의 선단부를 30~35cm 길이로 절단하여 지퍼백에 넣은 후 아이스박스에 넣어 실험실로 수송한 후, 실험 전까지 냉장실에 보관한 재료로 사용하여 수행하였다.

1.2. 식물 소독

억새 줄기 선단부의 멸균을 위하여 70% 에탄올에 40초간 침지한 후, 멸균수로 1회 세척하였다. 이어서 Tween-20을 2~3방울/100mL 첨가한 40% NaOCl 용액(유효염소농도 4%의 상업용 표백제)에 20분간 침지한 후, 멸균수로 3회 세척하였다.

소독한 줄기 선단부는 핀셋과 나이프를 이용하여 잎집을 벗겨내고 미성숙 화기를 분리해낸 후, 기부 가까이에 있는 중하부분을 1.0 cm 길이로 절단하고, 실타래처럼 뭉쳐있는 화서를 4~5가닥씩 분리하여 배지에 치상하였다.

2. 미성숙 화기로부터의 캘러스 유도

오서산 억새의 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 여러 요인의 적정 조건을 구명하기 위하여 화기의 길이와 부위, 기본배지, 생장조절제, 배지 고형제, 광조건에 대한 실험을 수행하였다.

캘러스 유도 실험에는 길이 10~15cm의 미성숙 화기를 사용하였으며, 미성숙화기의 중하부분을 7~8mm 길이로 절단한 후 100×20mm 페트리디쉬 당 12개의 클러스터를 치상하였다. 캘러스 유도 배지는 MS 염류와 비타민, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 3 mg/L,벤질아데닌(benzyladenine, BA) 0.1 mg/L, 수크로스 30 g/L, 피타겔(Phytagel) 2 g/L를 첨가한 것을 기본으로 사용하였다. 배지에 피타겔를 넣기 전 pH를 5.5로 조정한 후, 121℃에서 17분간 고압 증기 멸균하였다. 멸균 후 분주된 배지에 미성숙 화기를 치상한 후, 25±2℃의 배양실에서 암상태로 배양하였다.

2.1. 미성숙 화기의 부위 및 길이

2.1.1. 화기의 부위 및 길이

억새 미성숙 화기의 부위 및 길이(발달 단계)가 캘러스 유도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 10~15cm의 미성숙 화기를 상, 중, 하로 나누어 실험을 수행하였고, 발달 단계는 0~5, 5~10, 10~15, 15~20, 20cm 이상으로 미성숙 화기를 구분하여 실험을 수행하였다.

2.2. 배지 성분

2.2.1. 생장조절제 농도의 영향

캘러스 유도에 영향을 미치는 2,4-D와 벤질아데닌 농도의 적정 조건을 규명하기 위하여, 캘러스 유도배지에 2,4-D 0, 1, 3, 5, 7 및 10 mg/L와 벤질아데닌 0, 0.1 및 1.0 mg/L의 18개 조합처리한 배지에 미성숙 화기 클러스터를 치상하여 배양하였다.

2.2.2. 배지 고형제의 영향

캘러스 유도에 적합한 배지 고형제의 농도를 구명하기 위하여 한천(Sigma) 6.0, 8.0 및 10.0 g/L와 피타겔(Sigma) 2.0, 2.5 및 3.0 g/L를 각각 캘러스 유도배지에 첨가하고 미성숙 화기 클러스터를 치상하여 배양하였다.

2.3. 실험군 및 조사

실험에는 용기당 12개의 클러스터를 치상한 것을 1반복으로 하여 처리 당 5반복을 두었으며, 완전 임의배치하여 배양하였다. 절편체로부터의 캘러스 형성에 대한 조사를 위하여 배양 2주와 4주후 두 번에 걸쳐 화기에 형성된 캘러스를 분리하였다. 캘러스의 수는 2주와 4주차에 분리된 캘러스를 합하여 계산하였고, 생존여부와 캘러스 형성률을 조사하였다.

3. 미성숙 화기 유래 캘러스의 유지 및 증식

미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 분리하여 캘러스의 유지 및 증식을 위해 4주마다 2,4-D 1-10 mg/L와 벤질아데닌 0.1 mg/L가 포함된 MS 배지로 계대배양해 주었다. 직경 5mm의 캘러스를 100×20mm 페트리디쉬 당 25개씩 치상하였다. 배양은 25±2℃의 배양실에서 암상태로 실시하였다.

4. 캘러스로부터의 신초 재생

캘러스 유도배지에서 형성된 억새 캘러스로부터 신초 재생에 미치는 여러 요인의 적정 조건을 구명하기 위하여 기본배지, 생장조절제, 배지 고형제에 대한 실험을 수행하였다.

신초 재생 실험에는 2,4-D 7 mg/L와 벤질아데닌 0.1 mg/L가 포함된 캘러스 유도배지에서 형성된 미성숙 화기 유래 캘러스를 유지 및 증식을 위해 4주에 한 번씩 동일한 성분의 신선한 배지로 옮겨주며 20주 동안 배양한 캘러스를 재료로 사용하였으며, 100×40mm 페트리디쉬에 4개씩 치상하였다.

신초 재생 배지는 MS 염류와 비타민, 벤질아데닌 1.0 mg/L, 수크로스 30 g/L, 피타겔 2 g/L를 첨가한 것을 사용하였다. 배지에 피타겔을 넣기 전, pH는 5.5로 조정하여 121℃에서 17분간 고압 증기 멸균하였다.

배양은 25±2℃의 배양실에서 3일 암 배양한 후, 32 μmol/m²/s의백색 형광등하에서 16/8시간 광주기로 조명해 주었다.

4.1. 식물 재료

4.1.1. 캘러스 유도 배지에 따른 차이

캘러스가 유도된 배지의 차이가 신초 재생에 미치는 영향을 구명하기 위하여, 미성숙 화기로부터 캘러스 유도를 위한 생장조절제 실험에서 유도된 캘러스를 동일 조성의 배지에서 증식한 후 이를 재료로 하여 벤질아데닌 1.0 mg/L와나프탈렌 아세트산(naphthalene acetic acid, NAA) 0, 0.1 및 1.0 mg/L의 3개 조합처리 하였다.

4.2. 배지 성분

4.2.1. 생장조절제 농도의 영향

신초 재생에 영향을 미치는 벤질아데닌와 나프탈렌 아세트산 농도의 적정 조건을 구명하기 위하여, 신초 재생배지에 벤질아데닌 0, 1.0, 2.5, 5.0 및 10 mg/L와 나프탈렌 아세트산 0, 0.1 및 1.0 mg/L의 15개 조합처리하여, 2,4-D 7 mg/L +벤질아데닌 0.1 mg/L와 2,4-D 10 mg/L +벤질아데닌 0.1 mg/L에서 유도된 캘러스를 각각 치상하여 배양하였다.

4.2.2. 배지 고형제의 농도의 영향

신초 재생에 적합한 배지 고형제의 농도를 구명하기 위하여 피타겔(Sigma) 2.0, 2.5, 3.0 및 4.0 g/L를 각각 신초 재생배지에 첨가하고 캘러스를 치상하여 배양하였다.

4.3. 실험군 및 조사

실험에는 용기 당 4개의 캘러스를 치상한 것을 1반복으로 하여 처리 당 5반복을 두었다. 배양 2, 4 및 6주 후 생존 여부, 체세포배 형성률, 신초 재생률, 캘러스 당 재생된 신초수 등을 조사하였다.

5. 재생 신초의 신장 및 발근

신초 재생 실험에서 캘러스로부터 재생된 신초는 신장 및 발근을 유도하기 위하여 신초 신장발근배지로 계대배양 하였다. 신초 신장발근배지는 MS염류와 비타민, 수크로스 30 g/L,한천 8g/L를 첨가한 배지를 사용하였다.

6. 소식물체의 활착

신장 및 발근된 소식물체는 배양 용기에서 꺼내어 뿌리에 붙어있는 배지를 흐르는 물에 세척하고 펄라이트(perlite)를 바닥에 1/4 정도 넣고 나머지는 원예범용상토(뚝심이, 농우바이오)를 넣은 육묘판에 이식하였다.

순화를 위하여 이식된 식물체를 투명한 유리 배양용기로 2~3일 정도 덮어두었다가 그 후, 바깥 환경에 적응할 수 있도록 서서히 배양용기를 열어주었다. 성공적으로 활착된 식물체는 큰 분에 옮겨 심어 주었다.

실시예 1: 미성숙 화기로부터의 캘러스 유도

억새의 미성숙 화기를 이용한 캘러스 유도에 있어 영향을 미치는 여러 가지 요인의 최적 조건을 구명하고자 오서산 억새의 미성숙 화기를 절단하여 캘러스 유도를 위한 배지에 치상한 후, 배양하였다(도 8B). 배양 2주 후부터 절단된 미성숙 화기 클러스터에서 캘러스 형성이 관찰되었으며, 절단면과 화기 표면에서부터 다수의 캘러스들이 형성되었다(도 8C). 미성숙 화기로부터 형성된 캘러스는 배양 2주와 4주 후, 2회에 걸쳐 클러스터로부터 분리하여 캘러스 증식용 배지로 옮겨주었다. 이 후, 매 4주마다 신선한 캘러스 증식용 배지로 계대배양 해주었다.

화기의 부위 및 길이에 따른 처리

오서산 억새의 미성숙 화기를 '상', '중', '하' 부위로 구분하여 캘러스 유도율과 클러스터당 캘러스 수를 비교한 결과, '하' 부위가 40.3%의 유도율과 1.9개의 캘러스 수로 가장 높게 나타냈으며 '중', '상' 부위로 올라갈수록 유도율과 캘러스의 수는 감소하는 경향을 보여 주였다(도 1).

미성숙 화기를 길이에 따라 0~5, 5~10, 10~15, 15~20, 20cm 이상의 5가지로 구분하여 캘러스 유도율과 유도된 캘러스의 수를 비교한 결과, 캘러스의 유도율과 수에서 10~15cm가 95.8%와 10.7개로 다른 처리에 비해 현저하게 높았다. 이어서 0~5, 5~10cm의 미성숙 화기는 50% 이상의 유도율과 3개 이상의 캘러스 수를 나타냈고, 15~20cm의 미성숙 화기부터 감소하기 시작하였으며, 20cm 이상의 미성숙 화기로부터는 캘러스가 유도되지 않았다(도 2).

이와 같이 억새의 미성숙 화기로부터 캘러스 유도는 부위와 길이에 따라 차이가 나는 것으로 보여진다. 따라서, 억새의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도할 때에는 10~15cm 길이의 미성숙 화기에서 '중', '하'부분을 사용하는 것이 바람직하다고 판단된다.

생장조절제 농도의 영향

미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 있어서 생장조절제의 농도에 따른 효과를 알아보았다. 생장조절제 2,4-D 10 mg/L + 벤질아데닌 0.1 mg/L를 첨가한 배지에서86.7%로 가장 높은 캘러스 유도율과 5.5개의 캘러스 수를 나타내었고, 2,4-D 5 mg/L + 벤질아데닌 0.1 mg/L에서도 80%의 높은 유도율과 4.8개의 캘러스가 유도되었다(도 3).

2,4-D의 농도가 증가함에 따라 미성숙 화기에서 캘러스 형성이 증가하는 경향을 나타내었으며, 벤질아데닌의 농도는 0.1 mg/L이었을 때 2,4-D의 농도에 관계없이 전반적으로 캘러스의 형성이 증가하였다.

배지 고형제 농도의 영향

배지 고형제가 캘러스 유도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 한천 6, 8 및 10 g/L와 피타겔 2, 2.5 및 3 g/L를 비교하였을 때, 피타겔 2 g/L에서 캘러스 유도율이 77.8%로 가장 높았다. 이것으로 보아, 한천보다는 피타겔을 배지 고형제로 사용하였을 때 캘러스 유도가 효과적인 것으로 나타났다(도 4). 한천와 피타겔 농도가 낮아질수록 캘러스 유도가 용이하였으나 차이는 크지 않은 것으로 나타났다.

실시예 2: 캘러스로부터의 신초 재생

억새의 미성숙 화기 유래 캘러스를 이용한 신초 재생에 있어 영향을 미치는 여러 가지 요인의 최적 조건을 구명하고자 하였다. 미성숙 화기에서 분리하여 4주에 한 번씩 동일 조성의 신선한 배지로 계대배양하면서 20주간 배양된 캘러스를 재료로 사용하였다. 신초 재생을 위한 배지에 치상하여 배양하였을 때, 신초 재생은 배양 2주 후부터 관찰되었다. 배양 2주 후, 캘러스가 증식하였고, 진한 녹색을 띄는 점들이 나타났으며, 일부에서 작은 잎이 분화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 8D). 4주와 6주 후 신초의 수는 점차 늘어났으며, 일부 백색의 비정상적인 신초가 나오거나, 정상적인 신초가 재생되었으나 배양하는 과정에서 갈변되어 죽는 경우가 있었다(도 8E 내지 F).

캘러스 유도배지에 따른 차이

억새 미성숙 화기로부터 2,4-D와 벤질아데닌의 혼용처리에서 유도된 캘러스를 대상으로 신초 재생을 비교하였다. 재생배지는 이 실험에 앞서 실행했던 예비실험의 결과에 따라 벤질아데닌 1.0 mg/L와 나프탈렌 아세트산 0, 0.1 및 1.0 mg/L로 선정하였다. 그 결과, 미성숙 화기로부터 2,4-D 10 mg/L + 벤질아데닌 0.1 mg/L에서 유도된 캘러스가 신초 재생배지 벤질아데닌 1.0 mg/L + 나프탈렌 아세트산 1.0 mg/L에 치상되었을 때, 신초 재생률이58.3%에 신초수 6.3개를 나타내며 가장 높았다(도 5). 신초 재생율에 미치는 벤질아데닌의 효과는 벤질아데닌가 0.1 mg/L 첨가된 배지에서 유도된 캘러스가 벤질아데닌 무첨가 배지에서 유도된 캘러스에 비해 신초 재생에 효과적인 것으로 나타났다.

생장 조절제 농도의 영향

억새의 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 신초 재생에 있어서 생장조절제의 농도에 따른 효율을 알아보았다. 그 결과, 2,4-D 10 mg/L+ 벤질아데닌 0.1mg/L가 첨가된 배지에서 유도된 캘러스가 2,4-D 7 mg/L+ 벤질아데닌 0.1mg/L에서 유도된 캘러스 보다 높은 재생 효과를 나타내었다. 그리고 2,4-D 10 mg/L+ 벤질아데닌 0.1mg/L가 첨가된 배지에서 유도된 캘러스를 벤질아데닌 1.0 mg/L+ 나프탈렌 아세트산 1.0 mg/L가 첨가된 재생배지에 치상하였을 때, 재생률 40%로 가장 높게 나타났다(도 6). 또한, 벤질아데닌의 농도가 증가함에 따라 캘러스의 전체 혹은 일부가 갈변되어 죽는 현상이 나타났다.

배지 고형제 농도의 영향

배지 고형제가 신초 재생에 미치는 영향을 알아보기 위하여 피타겔 2.0, 2.5, 3.0 및 4.0 g/L를 비교하였을 때, 피타겔 3.0 g/L가 첨가된 배지에서 재생률 37.5%, 재생된 신초수 4개로 높게 나타났다(도 7). 이 농도를 제외한 나머지 처리에서는 재생률이 약 18%, 신초수가 2개 이하로 처리 간의 차이가 크지 않은 것으로 나타났다.

실시예 3: 캘러스로부터 재생된 신초의 신장 및 발근

억새의 미성숙화기 유래 캘러스로부터 재생된 신초가 1cm 이상 신장하였을 때, 신장과 발근을 위해 기부를 절단하여 MS 염류와 비타민, 수크로스 30 g/L를 첨가한 배지로 옮겨 준 후, 16/8 광주기로 배양하였다. 재생 신초가 신장하면서 약 2주 후부터 뿌리가 유도되었고, 4주 후에는 줄기가 약 5cm 이상 신장하여 토양으로 이식하기에 적절한 상태로 생장하였다(도 8G).

실시예 4: 소식물체 활착

발근된 소식물체는 펄라이트 1/4과 원예범용상토(뚝심이, 농우바이오) 3/4이 혼합된 배양토가 들어있는 육모판으로 옮겨 2일 정도 습도 100%가 유지될 수 있도록 투명한 유리용기로 덮어두었고, 그 후 바깥 환경에 적응할 수 있도록 용기를 서서히 개방하면서 순화시켰다. 성공적으로 순화되어 뿌리가 튼튼하게 발달하고 지상부의 신장이 이루어진 소식물체는 큰 화분에 옮겨서 증식 및 신장을 유도하였다(도 8H 내지 I).

본 발명에 따르면, 하나의 억새 식물에서 채취한 미성숙 화기에서 24개의 클러스터 형태의 절편체를 얻을 수 있으며, 이로부터 4주 후 유도되는 캘러스의 총 수량은 256개(캘러스 유도율 95.8%, 클러스터당 캘러스 수 10.7개)이다 (1개월 소요). 256개의 캘러스를 매 4주마다 계대배양하여 증식시킬 경우 첫 번째 계대배양에서는 약 2배 증가하여 512개, 두 번째와 세 번째 계대배양에서는 각 4배씩 증식되어 신초 재생에 사용될 수 있는 캘러스는 총 8,192개에 이른다(4개월 소요). 여기에 1.5개월간 소요되는 신초 재생율과 재생된 신초수를 적용하면 하나의 억새 미성숙 화기로부터 재생할 수 있는 신초의 수는 총 30,088개이다(5.5개월). 재생된 신초의 신장과 발근을 위한 1.5개월 경과후에는 7-8cm 의 소식물체 30,088개를 얻을 수 있다(7개월). 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면, 억새 1개 식물체에서 얻어진 미성숙 화기로부터 캘러스 단계를 거쳐 식물체 재생까지 7개월 만에 약 3만 개 이상의 억새 소식물체를 획득할 수 있다.

Claims

(1) MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계;
(2) MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 증식하는 단계;
(3) MS 배지, 나프탈렌 아세트산, 벤질아데닌, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재생하는 단계; 및
(4) MS 배지, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 재생된 신초를 신장 및 발근하는 단계를 포함하는 억새의 미성숙 화기를 이용한 억새 식물체의 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 미성숙 화기의 길이는 1~20cm인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 2,4-D 농도는 1~15 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 나프탈렌 아세트산 농도는 0.5~1.5 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계와 (2) 단계의 벤질아데닌 농도는 0.05~0.2 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 벤질아데닌 농도는 0.1~10 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 수크로스 농도는 20~40 g/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지 고형제는 젤란 검(gellan gum) 또는 한천인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제8항에 있어서, 상기 젤란 검 및 한천 농도는 각각 2~3 g/L 및 5~10 g/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
(1) MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 1~15 mg/L, 벤질아데닌 0.05~0.2 mg/L, 수크로스 20~40 g/L 및 젤란 검 2~3 g/L 또는 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 억새(Miscanthus sinensis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계;
(2) MS 배지, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 1~15 mg/L, 벤질아데닌 0.05~0.2 mg/L, 수크로스 20~40 g/L 및 젤란 검 2~3 g/L 또는 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 증식하는 단계;
(3) MS 배지, 나프탈렌 아세트산 0.5~1.5 mg/L, 벤질아데닌 0.1~10 mg/L, 수크로스 20~40 g/L 및 젤란 검 2~3 g/L 또는 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재생하는 단계; 및
(4) MS 배지, 수크로스 20~40 g/L 및 한천 5~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 재생된 신초를 신장 및 발근하는 단계를 포함하는 억새의 미성숙 화기를 이용한 억새 식물체의 대량 생산 방법.
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