KR101152111B1

KR101152111B1 - 조직배양에 의한 갈대의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR101152111B1
Application number: KR1020100095797A
Authority: KR
Inventors: 형남인; 권영주; 정지아; 백범선
Original assignee: 상명대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-01
Filing date: 2010-10-01
Publication date: 2012-06-15
Also published as: KR20120034326A

Abstract

본 발명은 갈대의 미성숙 화기로부터 체세포배 형성을 통한 갈대 식물체 대량 증식 방법, 상기 방법에 의해 생산된 갈대 식물체 및 상기 갈대 식물체를 가공처리하여 바이오에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

조직배양에 의한 갈대의 대량 생산 방법{Method for mass production of Phragmites communis by tissue culture}

본 발명은 조직배양에 의한 갈대의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 갈대의 미성숙 화기로부터 체세포배 형성을 통한 갈대 식물체 대량 증식 방법, 상기 방법에 의해 생산된 갈대 식물체 및 상기 갈대 식물체를 가공처리하여 바이오에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

갈대(Phragmites communis)는 화본과의 다년생 초본으로서 온대와 한대 지역에 분포하며, 우리나라에서는 습지나 호수, 강 하구에 대군락을 이루며 널리 분포하고 있는 정수식물이다. 주로 수변이나 해안염습지 등에 널리 분포하는 경우가 많은 갈대는 강 하구지역에서 오염물질을 정화하는 중요한 역할을 담당하고 있으며, 침식과 퇴적이 많이 일어나는 지역에 있어서 생태계의 보전 기능 또한 수행하고 있다. 종자로도 번식이 가능하지만 주로 근경(rhizome)에 의해 세력이 확장되어 군락을 형성하게 되며, 보통 초장이 2~3m, 엽폭 2~4cm 정도로 넓어 바이오매스가 매우 큰 작물 중 하나로 알려져 있다.

최근 지구온난화에 의한 기후변화 문제가 급속도로 부각되어, 에너지 문제는 환경문제와 연계되어 새로운 국면으로 접어들게 되면서 이산화탄소 배출규제와 화석연료 고갈에 따른 대체에너지 개발을 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 세계 각국은 기존 화석연료를 대체할 수 있고, 환경오염 배출물질이 적은 바이오연료 생산 기술개발 및 보급을 위해 적극 지원하는 추세이며, 그 시장규모가 매년 30%의 성장세를 보이고 있다는 점에서 "한국형 바이오에너지 공급 시스템"의 조기 확립이 필수적인 상황이다.

재생가능 에너지 중 바이오연료가 차지하는 비중이 높아 바이오에탄올 및 바이오디젤 생산은 연평균 13~28%의 증가율을 보이고 있으며, 미국과 브라질이 옥수수, 사탕수수 등을 이용한 바이오에탄올 세계 생산의 약 80%를 점유하고 있다(해외경제정보 제 2007-11호). 그러나 옥수수, 사탕수수와 같은 당질계 에탄올 생산은 향후 곡물자원의 부족과 곡물가격 상승의 원인이 될 가능성이 높아 바이오연료 산업을 확대하는 동시에 곡물가격의 안정화를 위해 섬유질계 혹은 목질계 바이오메스에 대한 에너지 작물 개발이 활발하게 이루어지고 있는 상황이다. 이러한 경향으로 보아, 향후 50년 이내에 바이오에탄올은 곡물자원과 경합이 없는 비식용, 비사료용 목질계 바이오메스가 주로 활용될 것으로 전망되고 있다.

바이오디젤과 바이오에탄올, 바이오메탄으로 분류되는 대체에너지는 현재까지 주로 식용작물에서 추출되어 곡물가격 상승의 원인으로 작용되고 있으며, 또한 경작지 확보를 위한 삼림의 파괴가 문제점으로 지적되고 있다. 이에 차세대 바이오메스로 비식용, 비사료용 셀룰로오스계 바이오메스에 대한 연구 개발이 매우 활발하게 이루어지고 있으며, 국내에서는 분포지역이 넓고 바이오메스가 큰 갈대가 바이오에탄올 원료작물의 하나로 주목받고 있다. 특히, 갈대는 미사함량이 높아 투수성과 통기성이 불량하고 염분의 함량이 높아 식물생육에 부적합한 간척지의 토양환경 개선에도 적합하며, 질소와 인을 흡수하는 수질정화작물로도 알려져 있다. 또한, 비료나 농약의 요구도가 낮아 친환경 바이오에너지의 원료로 적합하며, 간척지 개간을 동시에 이룰 수 있다는 점에서 그 잠재력을 인정받고 있다.

이러한 갈대를 바이오에탄올 원료 작물로 개발하기 위해서 가장 중요한 것은 단위면적당 수확량이 높고, 구성성분인 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 당화 및 발효 효율이 높은 품종의 개량과 종자나 근경에 의한 증식보다 더 효율적인 대량증식 시스템을 확보하는 것이다. 따라서, 본 발명에서는 국내 자생 갈대 우량계통 또는 품종의 효율적인 대량증식 시스템 확보를 목적으로 갈대의 미성숙 화기로부터 배발생 캘러스를 유도하고, 이로부터 체세포배형성을 통한 식물체 대량 증식 시스템을 확립하고자 한다.

또한, 이러한 갈대를 바이오에탄올 원료작물로 개발하기 위해서 가장 중요한 것은 단위면적당 많은 수의 식물체를 확보하는 것과 효율적인 당화 및 발효 공정을 개발하는 것이다. 또한 구성성분인 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 당화 반응을 저해하는 리그닌의 함량이 감소된 신품종을 개발하는 연구가 선행되어야 한다. 수확량이 증대되고 리그닌 함량을 감소시킨 신품종 갈대를 개발하기 위한 방법으로는 여러 가지 한계점이 있는 전통적인 육종방법보다는 분자육종법의 하나인 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법이 가장 많이 이용되고 있으며, 이를 위해서는 효율적인 식물체 재생 시스템의 확립이 필수적이다. 따라서, 본 발명에서는 바이오에탄올의 원료 작물을 개발하기 위한 국내 자생 갈대의 아그로박테리움 매개 유용 유전자 도입 신품종 개발을 목적으로 갈대의 미성숙 화기로부터 배발생 캘러스를 유도하고, 이로부터 체세포배형성을 통한 식물체 대량 증식 시스템을 확립하고자 한다.

한국등록특허 제10-0815439호에는 식물체 조직 유래 체세포배를 이용한 땃두릅나무 묘목의 대량 생산 방법이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 갈대의 미성숙 화기로부터 배발생 캘러스를 유도하고, 계대배양을 통하여 증식한 후, 이로부터 배발생 과정을 거쳐 식물체를 재생시키는 과정을 통해 갈대 식물체의 대량 증식 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 갈대의 미성숙 화기로부터 체세포배 형성을 통한 갈대 식물체 대량 증식 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 갈대 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 갈대 식물체를 가공처리하여 바이오에탄올을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 갈대 1개 식물체에서 얻어진 1개의 미성숙 화기로부터 캘러스 단계를 거쳐 식물체 재생까지 약 6개월 만에 약 4만 개 이상의 갈대 소식물체를 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 갈대 대량 생산 방법은 친환경 바이오에너지 산업의 경쟁력 제고에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 기본 배지의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 2,4-D 농도의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 벤질아데닌(BA) 농도의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 배지 고형제의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 미오-이노시톨 농도의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 미치는 광량의 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 신초 재생에 미치는 기본 배지의 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 신초 재생에 미치는 벤질아데닌 및 인돌 아세트산 조합처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 갈대(Phragmites communis) 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 신초 재생에 미치는 벤질아데닌 및 나프탈렌 아세트산 조합처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 갈대(Phragmites communis)의 미성숙 화기로부터 배발생 캘러스를 통한 식물체 재생을 나타낸 것이다. 갈대의 미성숙 화기(A)를 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하였다(B). 약 2주 후부터 미성숙 화기에서 배발생 캘러스가 유도되기 시작하였으며, 4주까지 유도된 캘러스(C)를 클러스터에서 분리하여 증식시킨 후, 신초 유도배지에 치상하였다. 약 2~4주 후 캘러스가 증식되면서 신초가 발달하였다(D 내지 F). 재생된 신초는 MS 배지에서 신장 및 발근을 유도하였고, 온실에서 활착하였다(G 내지 I).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(1) MS 배지, 수크로스, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 벤질아데닌 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 갈대(Phragmites communis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계;

(2) MS 배지, 수크로스, 2,4-D, 벤질아데닌 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 증식하는 단계;

(3) N6 배지 또는 MS 배지, 수크로스, 벤질아데닌, 인돌 아세트산 또는 나프탈렌 아세트산 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 식물체를 재생하는 단계; 및

(4) MS 배지, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 재생된 식물체를 신장 및 발달시키는 단계를 포함하는 갈대의 미성숙 화기를 이용한 갈대 식물체의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 갈대 대량 생산 방법은 (1) 단계로서, MS 배지, 수크로스, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 벤질아데닌 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 갈대(Phragmites communis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계를 포함한다.

상기 미성숙 화기의 길이는 1~20cm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 캘러스 유도 배지에서, MS 배지는 MS 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, 수크로스의 농도는 20~40 g/L, 바람직하게는 30 g/L이다. 상기 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 농도는 0.1~10 mg/L, 바람직하게는 0.5~2 mg/L, 더욱 바람직하게는 1 mg/L 이다. 상기 벤질아데닌 농도는 0.01~1.0 mg/L, 바람직하게는 0.05~0.2 mg/L, 더욱 바람직하게는 0.1 mg/L 이다. 상기 배지 고형제는 피타겔(젤란 검, gellan gum) 또는 한천이며, 바람직하게는 피타겔이다. 또한, 피타겔의 농도는 2~4 g/L, 바람직하게는 4 g/L이며, 한천의 농도는 6~10 g/L이다. 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 1 mg/L 및 벤질아데닌 0.1 mg/L가 첨가된 배지에서 캘러스 유도율 및 캘러스 수가 가장 많았다.

본 발명의 갈대 대량 생산 방법은 (2) 단계로서, MS 배지, 수크로스, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 증식하는 단계를 포함한다.

상기 캘러스 증식 배지에서, MS 배지는 MS 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, 수크로스의 농도는 20~40 g/L, 바람직하게는 30 g/L이다. 상기 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 농도는 0.1~10 mg/L, 바람직하게는 0.5~2 mg/L, 더욱 바람직하게는 1 mg/L 이다. 상기 배지 고형제는 피타겔 또는 한천이며, 바람직하게는 피타겔이다. 또한, 피타겔의 농도는 2~4 g/L, 바람직하게는 4 g/L이며, 한천의 농도는 6~10 g/L이다. 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 1 mg/L가 첨가된 배지에서 캘러스 유도율 및 캘러스 수가 가장 양호하였다.

본 발명의 갈대 대량 생산 방법은 (3) 단계로서, N6 배지 또는 MS 배지, 수크로스, 벤질아데닌, 인돌 아세트산 또는 나프탈렌 아세트산 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 식물체를 재생하는 단계를 포함한다.

상기 단계에서, 기본 배지는 N6 배지 또는 MS 배지를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 N6 배지를 이용할 수 있다. MS 배지는 MS 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, N6 배지는 N6 염류와 비타민을 포함할 수 있다. 상기 수크로스의 농도는 20~40 g/L, 바람직하게는 30 g/L이다. 생장조절제로서, 벤질아데닌과 나프탈렌 아세트산의 조합 또는 벤질아데닌과 인돌 아세트산의 조합을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 벤질아데닌과 나프탈렌 아세트산의 조합이다. 벤질아데닌과 인돌 아세트산 조합의 농도는 각각 0.1~1.0 mg/L 및 0.01~0.2 mg/L이며, 바람직하게는 각각 0.5 mg/L 및 0.1 mg/L이다. 벤질아데닌과 나프탈렌 아세트산 조합의 농도는 각각 0.1~1.0 mg/L 및 0.01~0.2 mg/L이며, 바람직하게는 각각 0.25 mg/L 및 0.1 mg/L이다. 벤질아데닌 0.25 mg/L 및 나프탈렌 아세트산 0.1mg/L가 첨가된 배지에서 식물체 재생률 및 재생 식물체 수가 가장 많았다.

본 발명의 갈대 대량 생산 방법은 (4) 단계로서, MS 배지, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 재생된 식물체의 신장 및 발달 단계를 포함하며, 바람직하게는 MS 배지, 수크로스 20~40 g/L 및 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 재생된 식물체를 신장 및 발달하는 단계를 포함한다. MS 배지, 수크로스 30 g/L 및 한천 8 g/L를 함유하는 배지가 재생된 식물체를 신장 및 발달시키는데 효과적이었다.

따라서, 본 발명은 더욱 바람직하게는

(1) MS 배지, 수크로스 20~40 g/L, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 0.1~10 mg/L, 벤질아데닌 0.01~1.0 mg/L 및 젤란 검 2~4 g/L 또는 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 갈대(Phragmites communis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계;

(2) MS 배지, 수크로스 20~40 g/L, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 0.1~10 mg/L 및 젤란 검 2~4 g/L 또는 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 증식하는 단계;

(3) N6 배지, 수크로스 20~40 g/L, 벤질아데닌 0.1~1.0 mg/L, 나프탈렌 아세트산 0.01~0.2 mg/L 및 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 식물체를 재생하는 단계; 및

(4) MS 배지, 수크로스 20~40 g/L 및 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 재생된 식물체를 신장 및 발달시키는 단계를 포함하는 갈대의 미성숙 화기를 이용한 갈대 식물체의 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 갈대 식물체를 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 갈대 1개 식물체에서 얻어진 1개의 미성숙 화기로부터 캘러스 단계를 거쳐 식물체 재생까지 약 6개월 만에 약 4만 개 이상의 갈대 소식물체를 획득할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 갈대 식물체를 가공처리하여 바이오에탄올을 생산하는 방법을 제공한다. 갈대 식물체로부터 바이오에탄올을 생산하는 방법은 당업계에 알려진 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 준비

1.1. 식물 재료

본 연구는 충청남도 서천군 한산면 신성리에서 갈대(Phragmites communis)의 미성숙 화기를 포함하고 있는 줄기의 선단부를 30cm 길이로 절단하여 지퍼백에 넣은 다음 아이스박스에 넣어 실험실로 수송한 후, 실험 전까지 4℃ 냉장 보관한 재료를 사용하여 수행하였다.

1.2. 식물 소독

갈대의 줄기 선단부를 멸균하기 위하여 70% 에탄올에 40초간 침지 후 멸균수로 1회 세척하였다. 이어서 Tween-20을 2~3방울/100mL 첨가한 40% NaOCl 용액(유효염소농도 4%의 상업용 표백제)에 20분간 침지한 후, 멸균수로 3회 세척하였다.

소독한 줄기 선단부는 핀셋과 나이프를 이용하여 잎집을 벗겨내고 미성숙화기를 분리해낸 후, 기부 가까이에 있는 화기 아래 부분을 1cm 길이로 절단하고, 화서를 4~5개씩 분리하여 배지에 치상하였다.

2. 미성숙 화기로부터의 배발생 캘러스 유도

신성리 갈대의 미성숙화기로부터의 배발생 캘러스 유도에 미치는 여러 요인의 적정 조건을 구명하기 위하여 기본배지, 생장조절제, 배지 고형제, 기타첨가물 및 광조건에 대한 실험을 수행하였다.

캘러스 유도 실험에는 미성숙 화기를 기부로부터 1.0 cm 길이로 절단한 후 4~5개씩 분리하여 100×20 mm 페트리디쉬 당 12개의 클러스터(cluster)를 치상하였다. 캘러스 유도 배지는 MS 염류와 비타민, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 1 mg/L, 수크로스 30 g/L, 한천 7 g/L를 첨가한 배지를 기본으로 사용하였다. 배지에 한천를 넣기 전 pH를 5.8로 조정한 후, 121℃에서 17분간 고압 증기 멸균하였다. 멸균 후 분주된 배지에 미성숙 화기를 치상한 후, 25±2℃의 배양실에서 암상태로 배양하였다.

2.1. 배지 성분

2.1.1. 기본배지의 영향

기본배지가 캘러스 유도에 미치는 영향을 알아보기 위해 MS 염류와 비타민, N6 염류와 비타민 두 가지를 각각 배지에 첨가하고, 미성숙 화기 클러스터를 치상하여 배양하였다.

2.1.2. 생장조절제 농도의 영향

캘러스 유도에 영향을 미치는 2,4-D와 벤질아데닌(benzyladenine, BA) 농도의 적정 조건을 구명하기 위하여 2,4-D 0, 1, 2, 3, 4 및 5 mg/L 단독처리와 2,4-D 1 mg/L에 벤질아데닌 0, 0.01, 0.1 및 1.0 mg/L를 조합처리한 배지에 각각 미성숙 화기 클러스터를 치상하여 배양하였다.

2.1.3. 배지 고형제의 영향

캘러스 유도에 적합한 배지 고형제의 농도를 구명하기 위하여 한천(Sigma) 6.0, 8.0 및 10.0 g/L와 피타겔(Phytagel, Sigma) 2.0, 2.5, 3.0 및 4.0 g/L를 각각 캘러스 유도배지에 첨가하고 미성숙 화기의 클러스터를 치상하여 배양하였다.

2.1.4. 미오-이노시톨 (myo-inositol)의 영향

미성숙 화기로부터의 캘러스 유도에 미오-이노시톨이 끼치는 영향을 알아보기 위하여 미오-이노시톨 100, 250 및500 mg/L를 각각 첨가한 캘러스 유도배지에서 미성숙 화기 클러스터를 치상하여 배양하였다.

2.2. 배양환경

2.2.1. 광도의 영향

캘러스 유도에 있어서 광도가 미치는 영향을 알아보기 위하여 0, 13 및 32 μmol/m²/s의 서로 다른 광도에서 미성숙 화기 클러스터를 배양하였다.

2.3. 실험군 및 조사

실험에는 용기당 12개의 클러스터를 치상한 것을 1반복으로 하여 처리 당 5반복을 두었으며, 완전 임의배치하여 배양하였다. 절편체로부터의 캘러스 형성에 대한 조사를 위하여 배양 2주와 4주 후 두 번에 걸쳐 화기에 형성된 캘러스를 분리하였다. 캘러스의 수는 2주와 4주차에 분리된 캘러스를 합하여 계산하였고, 생존여부와 캘러스 형성률을 조사하였다.

3. 미성숙 화기 유래 캘러스의 유지 및 증식

미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 분리하여 캘러스의 유지 및 증식을 위해 4주마다 2,4-D 1 mg/L가 포함된 MS 배지로 계대배양해 주었다. 직경 5mm의 캘러스를 100×20mm 페트리디쉬 당 25개씩 치상하였다. 배양은 25±2℃의 배양실에서 암상태로 실시하였다.

4. 배발생 캘러스로부터의 체세포배 형성을 통한 식물체 재생

갈대 캘러스 유도배지에 형성된 캘러스로부터 식물체 재생에 미치는 여러 요인의 적정 조건을 구명하기 위하여 기본배지, 생장조절제 및 배지 고형제에 대한 실험을 수행하였다.

식물체 재생실험에는 2,4-D 1 mg/L가 포함된 캘러스 유도배지에서 형성된 미성숙 화기 유래 캘러스를 매 4주마다 계대배양을 통해 신선한 배지로 옮겨주면서 20주 동안 배양한 캘러스를 재료로 사용하였으며, 배지 50 mL가 포함된 100×40 mm 페트리디쉬에 4개씩 치상하였다.

식물체 재생배지는 MS 염류와 비타민, 수크로스 30 g/L, 한천 7 g/L를 첨가한 것을 기본으로 사용하였으며, 배지에 한천를 넣기 전 pH를 5.8로 조정하여 121℃에서 17분간 고압 증기 살균하였다.

배양은 25±2℃ 배양실에서 32 μmol/m²/s의백색 형광등 하에서 16/8시간 광주기로 조명해 주었다.

4.1. 배지 성분

4.1.1. 기본배지의 영향

기본배지가 식물체 재생에 끼치는 영향을 알아보기 위해 MS 염류와 비타민, N6 염류와 비타민 두 가지를 배지에 첨가하여 실험을 수행하였다.

4.1.2. 생장조절제 농도의 영향

식물체 재생에 영향을 미치는 벤질아데닌 및 나프탈렌 아세트산(naphthalene acetic acid, NAA) 농도별 조합처리와 벤질아데닌 및 인돌 아세트산 (indole-3-acetic acid, IAA) 농도별 조합처리의 적정 조건을 구명하기 위하여, 식물체 재생배지에 벤질아데닌 0, 0.1, 0.25, 0.5 및 1.0 mg/L와 나프탈렌 아세트산 또는 인돌 아세트산 0, 0.01 및 0.1 mg/L를 조합처리하여 총 30개 처리군에 각각 캘러스를 치상하여 배양하였다.

4.1.3. 배지 고형제의 농도의 영향

식물체 재생에 적합한 배지 고형제의 농도를 규명하기 위하여 한천(Sigma) 6, 7, 8, 9 및 10 g/L를 각각 식물체 재생배지에 첨가하고 캘러스를 치상하여 배양하였다.

4.2. 실험군 및 조사

실험에는 용기 당 4개의 캘러스를 치상한 것을 1반복으로 하여 처리 당 5반복을 두었다. 배양 2, 4 및 6주 후 생존 여부, 식물체 재생률, 캘러스 당 재생된 식물체 수 등을 조사하였다.

5. 갈대 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 재생된 식물체의 신장 및 활착

갈대 미성숙 화기 유래 캘러스를 이용한 식물체 재생 실험에서 재생된 식물체는 신장 및 발달을 시키기 위하여 식물체 신장배지로 계대배양하였다. 식물체 신장배지는 MS 염류와 비타민, 수크로스 30 g/L,한천 8 g/L를 첨가한 배지를 사용하였다.

신장된 소식물체는 배양 용기에서 꺼내어 뿌리에 붙어있는 배지를 흐르는 물에 세척하고, 펄라이트(perlite)를 바닥에 1/4 정도 넣고 나머지는 원예범용상토(뚝심이, 농우바이오)를 넣은 육묘판에 이식하였다.

순화를 위하여 이식된 식물체를 투명한 유리 배양용기로 2~3일 정도 덮어두었다가 그 후, 바깥 환경에 적응할 수 있도록 서서히 배양용기를 열어주었다. 성공적으로 활착된 식물체는 큰 분에 옮겨 심어 주었다.

실시예 1: 미성숙 화기로부터의 배발생 캘러스 유도

신성리 갈대의 미성숙 화기를 이용한 캘러스 유도에 있어 영향을 미치는 여러 가지 요인의 최적 조건을 구명하고자 신성리 갈대의 미성숙 화기를 절단하여 캘러스 유도를 위한 배지에 치상하여 배양하였다(도 10B). 배양 2주 후부터 화기 클러스터에서의 캘러스 형성이 관찰되었으며(도 10C), 배양 4주에는 미성숙 화기의 절단면과 표면을 중심으로 많은 점액질의 캘러스들이 형성되었다. 미성숙 화기로부터 형성된 캘러스는 배양 2주 및 4주 후 2회에 걸쳐 절편체로부터 분리하여 캘러스 증식용 배지로 옮겨주었다. 그리고 4주마다 신선한 캘러스 증식용 배지로 계대배양 해주었다.

기본배지의 영향

신성리 갈대의 미성숙 화기로부터 캘러스 유도에 있어서 기본배지의 영향을 알아보았다. 2,4-D 1 mg/L에 각각 MS 염류 및 비타민, 그리고 N6 염류 및 비타민 두 가지를 첨가한 유도배지를 사용하였으며, 그 결과 MS 염류와 비타민을 첨가한 배지가88.9%의 유도율과 8.7개의 캘러스 수를 나타내며 N6 염류와 비타민을 첨가한 배지보다 훨씬 높게 나타났다(도 1).

생장조절제 농도의 영향

2,4-D 및 벤질아데닌 농도에 따른 캘러스 유도율 및 캘러스 수를 비교하였다. 2,4-D 1 mg/L를 첨가한 배지에서 캘러스를 유도하였을 때, 가장 높은 66.7%의 유도율과 2.9개의 캘러스 수를 나타냈다. 2,4-D 2 mg/L를 첨가하였을 때까지 높은 유도율을 보이다가 3 mg/L부터 점점 감소하는 결과를 나타내었다(도 2). 벤질아데닌 농도는 2,4-D 1 mg/L를 첨가한 배지에 벤질아데닌 0.1 mg/L를 첨가하였을 때 58.3%로 가장 높은 유도율을 나타내었다(도 3).

배지 고형제의 영향

배지 고형제가 캘러스 유도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 한천 6, 8 및 10 g/L와 피타겔 2, 2.5, 3 및 4g/L를 비교하였을 때, 피타겔 4 g/L에서91.7%의 높은 유도율을 나타내었으며, 가장 낮은 농도인 한천 6 g/L에서 61.6%로 가장 낮은 유도율을 보였다(도 4).

기타 첨가물의 영향

갈대의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는데 미오-이노시톨 농도에 따른 효과를 알아보았다. 그 결과 모든 처리에서 50% 정도의 유도율을 나타내어, 갈대의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는데 미오-이노시톨은 처리 농도간에 차이를 나타내지 않는 것으로 나타났다(도 5).

광도의 영향

캘러스 유도에 있어서 광도가 미치는 영향을 알아보기 위하여 0, 13 및 32 μmol/m²/s의 서로 다른 광도에서 실험하였다.32 μmol/m²/s에서 83.3%로 가장 높은 유도율을 나타냈으나, 처리간 차이가 크지 않았다(도 6).

실시예 2: 배발생 캘러스로부터 식물체 재생

갈대 미성숙 화기 유래 캘러스를 이용한 식물체 재생에 있어 영향을 미치는 여러 가지 요인의 최적조건을 알아보고자 하였다. 미성숙 화기에서 분리하여 4주에 한 번씩 동일한 조성의 신선한 배지로 계대배양 하면서 20주간 배양된 캘러스를 재료로하여 식물체 재생을 위한 배지에서 배양하였을 때 식물체 재생은 배양 2주 후부터 관찰되었다. 배양 2주 후, 캘러스는 진한 녹색을 띄고 있었으며, 일부에서 녹색의 작은 식물체가 보이기 시작하였다.

배양 4주후에는 지상부의 신장과 함께 뿌리가 관찰되었고, 배양 6주 후 3~4cm 크기의 소식물체로 발달하였다.

기본배지의 영향

신성리 갈대의 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 식물체 재생에 있어서 기본배지의 영향을 알아보았다. 각각 MS 염류 및 비타민, 그리고 N6 염류 및 비타민 두 가지를 첨가한 재생배지를 사용하였으며, 그 결과 MS 염류와 비타민을 첨가한 배지가95%, N6 염류와 비타민을 첨가한 배지가 100%로 둘 다 높은 재생률을 나타내었지만, 신초수에서 MS 염류 및 비타민보다 N6 염류 및 비타민을 첨가한 재생배지가 13.8개로 약 3배정도 높았다(도 7).

생장조절제 농도의 영향

신성리 갈대의 미성숙 화기 유래 캘러스로부터 식물체 재생에 있어서 생장조절제의 농도에 따른 효율을 알아보았다. 벤질아데닌 및 인돌 아세트산, 그리고 벤질아데닌 및 나프탈렌 아세트산의 혼용처리를 하였을 때, 벤질아데닌 및 인돌 아세트산의 혼용처리는 벤질아데닌 0.5 mg/L+ 인돌 아세트산 0.1 mg/L를 첨가한 처리군에서 재생률 100%에 신초수 13.2개를 나타내어 가장 높았고, 배지에 생장조절제를 첨가하지 않은 처리군에서는 재생률 90%에 신초수 4.1개로 가장 낮았다(도 8).

벤질아데닌 및 나프탈렌 아세트산 혼용처리에서는 벤질아데닌 0.25 mg/L+ 나프탈렌 아세트산 0.1mg/L를 첨가한 재생배지에서 재생률 100%와 신초수 17.4개로 가장 높았다. 벤질아데닌의 농도가 높아질수록 신초수가 많아졌으며, 나프탈렌 아세트산의 농도가 높아질수록 재생률이 높아졌다(도 9).

혼용처리된 모든 배지에서 70~100%의 높은 재생률을 나타내었다. 그리고 벤질아데닌및 인돌 아세트산을 혼용하는 것보다 나프탈렌 아세트산을 혼용하여 배지에 첨가하는 것이 더 높은 재생율을 나타냈다.

실시예 3: 배발생 캘러스로부터 재생된 소식물체의 신장 및 활착

신성리 갈대의 미성숙 화기로부터 재생된 식물체의 신장과 발달을 위해 주변부의 캘러스를 제거하고 발근된 소식물체를 분리하여 MS 염류와 비타민, 수크로스 30 g/L를 첨가한 배지에 옮겨 준 후, 16/8시간 광주기에서 배양하였다.

약 4주 후에 소식물체가 8~10 cm로 신장하여, 자라 토양으로 이식하기에 적절한 상태가 되었다. 신장된 소식물체는 1/4은 펄라이트 및 3/4은 원예범용상토(뚝심이, 농우바이오)로 채운 분에 옮겨 2일 정도 습도 100%가 될 수 있게 배양용기로 덮어 두었고, 그 후 바깥 환경에 적응할 수 있도록 용기를 서서히 개봉하면서 순화시켰다.

본 발명에 따르면, 하나의 식물체에서 얻어진 미성숙 화기에서 20개의 클러스터 형태의 절편체를 만들 수 있으며, 이로부터 4주 후 유도되는 캘러스의 총 수량은 174개(캘러스 유도율 88.9%, 클러스터당 캘러스 수 8.7개)이다(1개월 소요). 174개의 점액질 표면을 가진 캘러스와 밝은 노란색(옅은 금색) 캘러스 (1:1)를 매 4주마다 계대배양하여 증식시킬 경우 첫 번째 계대배양에서는 1.5배(2개월 소요), 두 번째와 세 번째 계대배양에서는 각 3배가량 증식되어 캘러스가 총 2,349개에 이른다(4개월 소요). 여기에 2개월간의 캘러스로부터의 식물체 재생 과정을 거쳐 식물체 재생율과 재생 식물체수를 적용하면 하나의 갈대 미성숙 화기로부터 얻을 수 있는 약 8-10cm 길이의 소식물체의 수는 약 40,872개이다(6개월 소요). 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면, 갈대 1개 식물체에서 얻어진 1개의 미성숙 화기로부터 캘러스 단계를 거쳐 식물체 재생까지 약 6개월 만에 약 4만 개 이상의 갈대 소식물체를 획득할 수 있다.

Claims

(1) MS 배지, 수크로스, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 벤질아데닌 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 갈대(Phragmites communis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계;
(2) MS 배지, 수크로스, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 증식하는 단계;
(3) N6 배지 또는 MS 배지, 수크로스, 벤질아데닌, 인돌 아세트산 또는 나프탈렌 아세트산 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 식물체를 재생하는 단계; 및
(4) MS 배지, 수크로스 및 배지 고형제를 함유하는 배지에서 상기 재생된 식물체를 신장 및 발달시키는 단계를 포함하는 갈대의 미성숙 화기를 이용한 갈대 식물체의 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 미성숙 화기의 길이는 1~20cm인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 농도는 0.1~10 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 수크로스 농도는 20~40 g/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지 고형제는 젤란 검(gellan gum) 또는 한천인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 젤란 검과 한천 농도는 각각 2~4 g/L 및 6~10 g/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 벤질아데닌 농도는 0.01~1.0 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 벤질아데닌과 인돌 아세트산 조합의 농도는 각각 0.1~1.0 mg/L 및 0.01~0.2 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 벤질아데닌과 나프탈렌 아세트산 조합의 농도는 각각 0.1~1.0 mg/L 및 0.01~0.2 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
(1) MS 배지, 수크로스 20~40 g/L, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 0.1~10 mg/L, 벤질아데닌 0.01~1.0 mg/L 및 젤란 검 2~4 g/L 또는 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 갈대(Phragmites communis)의 미성숙 화기로부터 캘러스를 유도하는 단계;
(2) MS 배지, 수크로스 20~40 g/L, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 0.1~10 mg/L 및 젤란 검 2~4 g/L 또는 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 미성숙 화기로부터 유도된 캘러스를 증식하는 단계;
(3) N6 배지, 수크로스 20~40 g/L, 벤질아데닌 0.1~1.0 mg/L, 나프탈렌 아세트산 0.01~0.2 mg/L 및 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 식물체를 재생하는 단계; 및
(4) MS 배지, 수크로스 20~40 g/L 및 한천 6~10 g/L를 함유하는 배지에서 상기 재생된 식물체를 신장 및 발달시키는 단계를 포함하는 갈대의 미성숙 화기를 이용한 갈대 식물체의 대량 생산 방법.
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