KR101151397B1 - 피부재생용 기능성화장료조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기능성 화장료조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 5-아미노레불린산 에스터 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 기능성화장료조성물 및 피부재새용 기능성화장료조성물의 사용방법에 관한 것이다.

본 발명의 피부재생용 기능성화장료조성물은 피부에 도포시 경피흡수가 용이하고 세포독성이 적을 뿐만 아니라, 피부재생 효과가 우수하여 노화 방지 및 피부관리에 유용한 우수한 효과를 갖는다.

5-아미노레불린산 에스터, 피부재생, 기능성화장료

Description

피부재생용 기능성화장료조성물{Functional cosmetic composition for renewing skin}

본 발명은 기능성 화장료조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 5-아미노레불린산 에스터 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 기능성화장료조성물 및 피부재새용 기능성화장료조성물의 사용방법에 관한 것이다.

일반적으로, 5-아미노레불린산 (5-aminolevulinic acid; 이하 "ALA"라 약칭함)은 모든 생물계에서 헴(heme), 박테리오-클로로필, 코리노이드 등 테트라피롤 화합물의 주요 전구물질로서, 사람, 동물 및 농작물 등에는 피해를 주지 않으면서 잡초를 선택적으로 고사시키는 환경친화성의 제초제로 활용될 수 있다(Rebeiz C.A.,Montazer-Zouhoor A., Hopen H., and Wu S.M., Enzyme Microb. Technol., 6:390, 1984).

그밖에 ALA는 피부암 치료제 및 미생물 저항성 약품 등 의학 분야에서도 생물활성 물질로 사용될 수 있다고 보고되고 있는데, ALA을 이용한 광역학 (photodynamics) 치료는 자외선 각화증 (actinic keratoses), 건선 (psoriasis), 사마귀 (verrucae) 및 피부암 (skin cancer) 등의 피부질환에 사용되어 왔으며, 최 근 영국 광피부과학 학회 (British Photodermatology Group)의 워크샵에서는, ALA-광역학 치료가 자외선 각화증, 보웬병 (Bowen's disease) 및 표재 기저 세포암 (superficial basal cell carcinoma)에 효과를 나타낸다는 우수한 증거가 제시된 바 있다.

이와 같이 광선역학요법(photodynamic therapy, PDT)의 국소용 광민감제로 사용되고 있는 5-아미노레불린산은 현재 세계적으로 FDA (food and drug administration)공인의 국소용 광민감제로 여드름과 피부암의 치료에 사용되고 있다. 5-아미노레불린산은 광선역학요법에 사용되는 광민감제의 전구물질이다. ALA를 피부에 도포하면 세포 내로 이동하여 ALA가 Heme (헴)의 생합성 과정을 통해 프로토포피린 IX (Protoporphyrin IX, PpIX)라는 광선역학요법에 이용되는 실질적인 광민감제로 변화된다.

PpIX는 아주 효과적인 광 감광제로 빛 에너지에 의해 삼중항(triplet) 상태로 여기되며 주위의 산소와 반응하여 발생기 산소를 생산한다. 생성된 발생기 산소는 세포막의 상해와 세포의 사멸을 초래하여 위와 같은 피부질병들을 치료할 수 있다. 한편, ALA는 피부암 또는 기타 병적인 상태에서 비교적 선택적으로 흡수되므로 주변의 정상 조직에는 거의 해를 비치지 않는다.

즉, PpIX가 높은 농도로 축적된 세포 또는 조직(피부)에 가시광선(400nm-650nm) 파장의 광선(빛)을 조사하면 PpIX가 선택적으로 빛을 흡수한 다음 singlet oxygen 등의 자유활성산소를 생성하여 세포를 선택적으로 파괴하게 되기 때문이다.

그러나, ALA의 사용이 당해 분야에서 상당히 진보된 것 같지만, ALA를 사용 하는 광화학 치료에서 항상 전적으로 만족스러운 것은 아니다. ALA는 광범위한 종양 또는 다른 상태를 치료하기에 충분한 효율로 모든 종양 및 다른 조직에 침투될 수 없고, 또한 ALA는 약제학적 제형에서 불안정해지는 문제점이 있기 때문이다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 보다 안정한 광화학 치료제로서 5-아미노레불린산 에스터가 제안되어 사용되고 있으나, 5-아미노레불린산 에스터는 5-아미노레불린산과 마찬가지로 광선역학요법(photodynamic therapy, PDT)의 국소용 광민감제로 사용되고 있을 뿐이다.

화장품은 크림ㆍ로션 등 화장하는데 쓰이는 온갖 물건을 총칭하는 말이며 약사법에서 정해진 화장품의 정의는 "인체를 청결 또는 미화하기 위하여 도찰(塗擦)ㆍ살포 기타 이와 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 적은 것을 말한다." 그와 동시에 제조ㆍ판매, 그에 따르는 광고 등 모든 면에서 규제를 받는 상품이다.

화장품이란 1차적으로 인간의 신체를 건강한 상태로 유지시켜줄 수 있는 수단이라고 할 수 있으나, 점차 노화, 자외선, 각종 오염물질 및 건조함으로부터 신체를 보호하고, 나아가 아름답고, 매력적으로 만들어 심리적인 만족을 느끼게 해주는 것으로 그 의미가 확대되고 있다. 이에 따라 자외선 차단, 미백, 주름개선, 피부보습력 증대 등 각종 기능성을 갖는 화장품이 개발되고 있으며, 이러한 화장품은 각각의 기능을 함유하고 있는 성분들로써 그 효과가 구현되게 된다.

특히, 피부주름을 개선하기 위한 화장품이나 의약품은 지금까지 지속적으로 개발되어 왔으며, 최근 인기있는 화장품종류는 외적 요인에 의한 주름방지를 위해 자외선 차단제, 보습제, 항산화제 등의 화장품이 널리 사용되고 있으나, 이들 제품이 실질적으로 주름을 개선할 수 있는 효과는 아직 미미한 편이다. 따라서 피부 주름개선을 통해 노화를 예방하거나 개선할 수 있는 신규한 기능성화장료조성물에 대한 개발의 필요성이 존재한다.

본 발명자들은 피부 주름개선을 통해 노화를 예방할 수 있는 신규한 기능성화장료조성물을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, ALA 에스터에 의해 합성된 PpIX가 활성화되면 피부재생주기를 빠르게 한다는 ALA 에스터의 새로운 용도를 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 5-아미노레불린산 에스터 또는 이의 염을 피부재생의 유효성분으로 포함하는 피부재생용 기능성 화장료조성물을 제공하는 것으로, 5-아미노레불린산 에스터 또는 그 염의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피부에 도포시 경피흡수가 용이하고 세포독성이 적을 뿐만 아니라, 피부재생 효과가 우수하여 노화 방지 및 개선과 피부관리에 유용한 피부재생용 기능성화장료조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 별도의 광선요법을 수행하지 않고 햇빛 또는 실내등에 특정시간 노출되는 것만으로도 5-아미노레불린산 에스터에 의해 합성된 PpIX를 활성화시켜 피부재생효과를 얻을 수 있는 피부재생용 기능성화장료조성물을 제 공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 5-아미노레불린산 에스터 또는 이의 염이 유효성분으로 포함된 피부재생용 기능성화장료조성물을 피부에 도포하여 피부재생주기를 빠르게 하여 효과적으로 노화를 방지하거나 개선할 수 있는 피부재생용 기능성화장료조성물의 사용방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 5-아미노레불린산 에스터 또는 화장품학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 기능성화장료조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 5-아미노레불린산 에스터의 화장품학적으로 허용되는 염은 하기 화학식을 갖는 화합물이다.

화학식(Ⅱ) R₂ㆍ NH₂-CH₂-CO-CH₂-CH₂-CO-O-R₁

여기서, R₁은 2-프로페닐기 (CH₂-CH=CH₂), 3-부테닐기 (CH₂-CH₂-CH=CH₂), 4-펜테닐기 (CH₂-CH₂-CH₂-CH=CH₂), 5-헥세닐기 (CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH=CH₂), 메칠기 (CH₃), 그리고 알킬기로 이루어진 군에서 선택되고, R₂는 HCl, H₂SO₄, H₃PO_4, 아세트산, 벤조산, 벤젠 술폰산 등의 무기산 또는 유기산으로 이루어진 군에서 선택된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 5-아미노레블린산 에스터 또는 화장품학적으로 허용되는 이의 염은 화장료베이스 100중량부당 5 내지 15중량부로 포함된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 화장료베이스는 스테아릴알코올, 폴리에틸렌글리콜 또는 정제수를 포함하는 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 5-아미노레블린산 에스터의 화장품학적으로 허용되는 염은 염산염이다.

본 발명은, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 피부재생용 기능성 화장료조성물의 1회 사용분량에 포함된 5-아미노레블린산 에스터 또는 이의 염은 50 내지 75mg인 것을 특징으로 하는 피부재생용 기능성화장료조성물의 사용방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 피부재생용 기능성화장료조성물을 피부에 도포하고 일정시간이 지난 후 실외에서는 햇빛에 1시간 내지 2시간 노출시키거나 실내에서는 실내등에 2시간 이상 노출시킨다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 가진다.

먼저, 본 발명의 피부재생용 기능성 화장료조성물은 5-아미노 레불린산 에스터 또는 이의 염을 피부재생의 유효성분으로 포함하게 되므로, 5-아미노레불린산 에스터 또는 그 염의 새로운 용도를 제공한다.

본 발명의 피부재생용 기능성 화장료조성물은 피부에 도포시 경피흡수가 용이하고 세포독성이 적을 뿐만 아니라, 피부재생 효과가 우수하여 노화 방지 및 개선과 피부관리에 유용하다.

본 발명의 피부재생용 기능성화장료조성물은 별도의 광선요법을 수행하지 않고 햇빛 또는 실내등에 특정시간 노출되는 것만으로도 5-아미노레불린산 에스터에 의해 합성된 PpIX를 활성화시켜 피부재생효과를 얻을 수 있으므로 사용편리성을 갖는다.

본 발명의 피부재생용 기능성화장료조성물의 사용방법에 의해 5-아미노 레불린산 에스터 또는 이의 염이 유효성분으로 포함된 피부재생용 기능성화장료조성물을 피부에 도포하여 피부재생주기를 빠르게 하여 효과적으로 노화를 방지하거나 개선할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

먼저, 본 발명은 ALA 에스터가 피부에 도포된 후 별도의 광선요법을 수행하지 않고 햇빛 또는 실내등에 특정시간 노출되는 것만으로도 상기 ALA 에스터에 의해 합성된 PpIX가 활성화되어 피부재생주기를 빠르게 함으로써 피부재생에 유효한 효과가 있다는 ALA 에스터 및/또는 그 염의 새로운 용도를 이용한 것이다. 즉, 본 발명의 피부재생용 기능성화장료조성물을 피부에 도포하고 일정시간, 바람직하게는 1시간 정도 지난 후 실외에서는 햇빛에 1시간 내지 2시간 노출시키거나 실내에서는 실내등에 2시간 이상 노출시키는 것만으로도 PpIX를 활성화시킬 수 있기 때문이다.

따라서, 본 발명은 5-아미노레불린산 에스터 또는 이의 염을 피부재생의 유효성분으로 포함하는 피부재생용 기능성 화장료조성물을 제공하는데, 본 발명에 의해 제공되는 기능성 화장료조성물은 피부에 도포시 경피흡수가 용이하고 세포독성이 적을 뿐만 아니라, 피부재생주기를 빠르게 하여 효과적으로 노화를 방지하거나 개선할 수 있다.

특히, 본 발명의 피부재생용 기능성화장료조성물에 피부재생의 유효성분으로 포함되는 5-아미노레불린산 에스터는 하기의 화학식을 갖는 것이 바람직하다.

화학식(Ⅰ)

NH₂-CH₂-CO-CH₂-CH₂-CO-O-R₁

여기서, R₁은 2-프로페닐기 (CH₂-CH=CH₂), 3-부테닐기 (CH₂-CH₂-CH=CH₂), 4-펜테닐기 (CH₂-CH₂-CH₂-CH=CH₂), 5-헥세닐기 (CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH=CH₂), 메칠기 (CH₃), 그리고 일반적인 알킬기로 이루어진 군에서 선택된다.

또한 화장품학적으로 허용되는 5-아미노레불린산 에스터의 염은 하기의 화학식(Ⅱ)을 갖는 것이 바람직하다.

화학식(Ⅱ)

R₂ㆍ NH₂-CH₂-CO-CH₂-CH₂-CO-O-R₁

여기서, R₁은 화학식(I)과 같고, R₂는 화장품학적으로 허용 가능한 염을 형성하는 무기산과 유기산들로서, 바람직하게는 HCl, H₂SO₄, H₃PO_4, 아세트산, 벤조산, 벤젠 술폰산 등의 무기산 또는 유기산으로 이루어진 군에서 선택되며, 특히 HCl이 선택되는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 기능성화장료조성물에는 5-아미노레불린산 에스터 또는 이의 염이 화장료베이스 100중량부당 5 내지 15중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 5-아미노레블린산 에스터 또는 화장품학적으로 허용되는 이의 염의 함량이 5중량부 미만이면 사용자의 간단한 시술을 통해 피부재생효과를 얻기 어렵고 15중량부를 초과하게 되면 효과의 현저한 향상 없이 고농도로 인해 안전성이 떨어질 뿐만 아니라 비용이 상승하기 때문이다.

한편, 본 발명의 피부재생용 기능성화장료조성물은 통상의 방법에 따라 제조한다. 즉, ALA 에스터 또는 화장품학적으로 허용 가능한 이의 염을 포함하는 기능성화장료조성물은 화장품학적 또는 피부학적으로 허용 가능한 각종 첨가제를 포함하는 공지된 화장료베이스를 적용하여 크림, 에센스 등의 제형으로 제조할 수 있기 때문이다.

여기서, 화장료베이스는 ALA 에스터 또는 화장품학적으로 허용 가능한 이의 염의 용해도 특성(후술함)에 따라 물 및/또는 알콜계 용제를 포함하는데, 스테아릴알코올, 폴리에틸렌글리콜 또는 정제수로 포함된 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다. 그리고 첨가제는 화장품학적으로 허용 가능한 피부 연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농후제, 및 용매 등을 포함할 수 있는데, 경우에 따라서는 콜라겐과 같은 피부미용에 효과적인 각종 기능성 성분이 포함될 수도 있을 것이다.

실시예 1

공지된 방법으로 ALA 메틸에스터 염산염을 실험실에서 합성하였는데, ALA 메틸에스터 염산염은 분말형태로 생성되었다.

하기의 표 1에 나타난 바와 같이 구성된 화장료베이스 100중량부 당 생성된 ALA 메틸에스터 염산염 5중량부가 포함되도록 하여 에센스조성물1을 제조하였다.

즉, 정제수에 점증제를 천천히 교반하면서 가하여 균일하게 분산시킨다. 수상성분들은 혼합하여 수상을 제조한다. 유화제(글리세린), 피부유연제(위치하젤), 향, 보존제 등을 포함한 기타 화장료베이스에 소디움하이마루네이트를 가하여 용해시킨다. 수상에 알코올상을 교반하면서 가하고 알칼리제를 첨가하여 에센스 조성물1을 완성하였다.

성분	함량(%)
정제수	73.9
폴리에틸렌글리콜	5.0
스테아릴알콜	2.0
비테이인	3.0
글리세린	5.0
스디움하이마루네이트	5.0
카스트 오일	0.4
위치하젤	2.0
기타 화장료베이스	3.7
합계	100

실시예 2

화장료베이스 100중량부 당 생성된 ALA 메틸에스터 염산염이 7.5중량부가 포함되도록 한 것을 제외하면 실시예1과 동일한 방법으로 에센스조성물2를 제조하였다.

실시예 3

화장료베이스 100중량부 당 생성된 ALA 메틸에스터 염산염이 10중량부가 포함되도록 한 것을 제외하면 실시예1과 동일한 방법으로 에센스조성물3을 제조하였다.

실시예 4

화장료베이스 100중량부 당 생성된 ALA 메틸에스터 염산염이 15중량부가 포함되도록 한 것을 제외하면 실시예1과 동일한 방법으로 에센스조성물4를 제조하였다.

이하에서는 본 발명의 기능성화장료조성물의 인체안정성 및 피부재생효과를 확인하기 위한 각종 실험을 수행하였는데, 실험예에서 사용된 ALA와 ALA 에스터는 ALA의 염산염과 ALA 에스터의 염산염을 의미하는 것이고, 경우에 따라서는 PpIX를 활성화시키기 위해 햇빛 또는 실내등 대신 LED(25J)을 10분 동안 조사하여 신속한 실험을 수행하였다.

실험예 1

ALA-에스터의 용해도 실험

공지된 방법으로 제조된 ALA 및 ALA-에스터는 분말형태로 생성되므로 이를 화장료조성물로 사용하기 위해서 용해도 실험을 수행하였으며 그 결과는 표 2에 나타내었다.

표 2로부터 ALA 또는 ALA-에스터는 알코올과 물에 잘 용해됨을 알 수 있다. 따라서, 화장료조성물로 사용하기 위해서는 상기화합물을 수용성 용제를 매개제 (vehicle)로 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있다.

실험예 2

ALA-에스터의 피부세포 독성실험

피부의 정상세포인 인체 각질형성세포(human keratinocyte)와 인체 진피섬유모세포(human fibroblast)를 사용하여 ALA 및 ALA-에스터의 세포독성을 실험하여 그 결과를 표3 및 도1에 나타내었다. 이 때 세포에 투여한 ALA (5-aminolevulinic acid)와 ALA 에스터로는 ALA, ALA methylester(ALA-me), ALA butenylester (ALA-bu), ALA pentenylester(ALA-pe), ALA hexenylester (ALA-hx)를 사용하였고, 사용 전에 serum free medium에 10mM - 0.01mM에 걸친 여러 농도를 만들어 세포에 투여하였다.

즉, ALA 및 ALA 에스터에 의한 세포독성을 확인하기 위하여 세포 생존율을 검사할 수 있는 Colorimetric (MTT) kit (CHEMICON International Inc., USA)을 이용하여 제조자의 지시대로 시행하였다. 보다 구체적으로 살펴보면, 세포를 96 well plate에 분주 후 농도별로 ALA 및 ALA 에스터가 포함된 배지 100ul씩을 처리하여 24시간 추가 배양하였다. MTT (3,-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide) 반응액 각 well당 10ul씩 첨가하여 2시간 동안 반응시켜 well의 바닥에 진보라색을 띤 Formazan 결정체가 형성되도록 하였다. 형성된 결정체를 DMSO (dimethylsulfoxide) 100ul로 녹여 균질한 용액 상태가 되면 570nm 파장 하에 ELISA 판독기 (Molecular Device, USA)에서 흡광도 측정하였다.

표 3과 도 1에서 보여주는 바와 같이 피부 인체 각질형성세포 (도1의 A)와 섬유모세포 (도1의 B)에서 ALA 에스터들은 1mM 이하의 농도에서 세포 생존율 80% 이상을 유지하였다. 결론적으로 본 발명의 ALA 에스터들은 기존의 ALA에 비해 세포의 생존율에 미치는 영향이 농도가 각 세포마다 약간의 차이를 보여 주였으나 일반적으로 1mM이하일 때에는 세포독성이 없어 세포 생존율에 영향이 적었다.

실험예 3

PpIX 합성량의 측정은 본 발명의 ALA에스터가 효과적인 광민감물질인지에 대한 중요한 척도가 되므로 ALA 에스터에 의해 실제적인 광민감물질인 PpIX가 세포에서 얼마나 합성되는지 확인하기 위하여, 세포에서 protoporphyrin IX (PpIX) 합성량을 측정하는 실험을 수행하였으며 그 결과를 도2 및 표4와 표5에 나타내었다.

즉, 세포에서 합성된 PpIX의 양을 측정하기 위하여 2×10⁵개 세포를 10 cm² dishes (Falcon)에 분주한 후 70-80% 융합된 상태(confluent state)가 되었을 때 배지에 ALA-에스터를 0.001-1mM까지 투여하고 4시간동안 배양한다. 다음, PBS로 수세 후 1M HClO₄이 함유된 50% methanol 용액을 넣고 cell scraper로 포집하였다. 실온에서 5분간 방치한 후 원심분리하여 상층액에서 PpIX 추출하였다.

표 4, 표 5 및 도 2로부터 본 발명의 ALA 에스터와 기존에 개발된 ALA에 의해 유도되는 PpIX 합성량과 비교한 결과, 정상 및 암세포주에서 합성된 PpIX의 양은 기존의 광민감물질 ALA 에 비해 저농도(0.01-0.1mM)에는 더 효과적으로, 고농도 (0.5-1mM)에서는 거의 동일한 양의 PpIX합성이 정상 피부세포들에서 이루어짐을 확인할 수 있었다.

실험예 4

피부조직에서 protoporphyrin IX (PpIX) 합성량을 측정하는 실험을 수행하였는데, 피부조직에서 ALA 및 ALA 에스터에 의해 생성된 PpIX의 양은 세포에서 보다도 훨씬 더 많이 생성되었음을 알 수 있었다. 실험예3과 동일한 시료 채취 방법에 따라 채취한 시료 2 mL을 형광세기에 따라 적당량으로 희석한 다음, 8.4 x 10^-6 아크리딘 50ul를 첨가하여 형광분광광도계의 excitation과 emission의 slit을 10, 10으로 정하고, 들뜸파장으로 408 nm를 사용하여 형광스펙트럼을 측정하였으며 그 결과를 표 6 내지 표 8과 도3a 내지 도3c에 각각 나타내었다.

표 6 내지 표 8과 도 3a 내지 도 3c로부터, ALA 및 ALA 에스테르를 도포한 시간 경과 및 농도에 따른 PpIX 합성량을 비교해 보면, 시간에 따른 PpIX 합성량은 ALA와 ALA-에스터의 종류나 농도에 상관없이 합성되는 PpIX의 양은 도포한 후 1시간보다 3시간이 경과했을 때 PpIX의 양이 증가하였으나, 표본의 크기가 작고 표준편차가 큰 관계로 ALA와 4종류의 ALA 에스터 모두에서 유의한 증가는 보이지 않았음을 알 수 있다.

또한, 농도 별 (5%, 7.5%, 10%: 이 때 농도는 무게/무게 페센트로서, 기제 1 g에 혼합되는 ALA에스터의 무게를 백분율로 환산하여 계산한 농도이다. 즉, 기제 1 g과 75 mg의 ALA에스터를 혼합하면 농도가 7.5%가 되는 것이다.)로 도포하여 1시간이 경과한 후에 생성되는 PpIX의 양을 비교한 결과, ALA와 ALA-에스터를 도포한 후 5%에서 10%로 농도가 높아질수록 ALA-pe만 PpIX 합성량이 증가하였으나 ALA는 5%보다 10%에서 PpXI 합성량이 감소하였고, 나머지 ALA-에스터는 10%에서는 PpXI 합성량이 증가하였다. 표본의 크기와 표준편차가 큰 관계로 ALA와 4종류의 ALA 에스터 모두에서 유의한 변화는 없었다. 농도 별(5%, 7.5%, 10%)로 도포하여 3시간이 경과한 후에 합성되는 PpIX의 양을 비교한 결과, 5%농도 보다 10%농도에서 PpIX 양은 증가하였다. 도포 후 1시간이 경과했을 때와 마찬가지로 통계적으로 유의하지는 않았다(ALA p=0.491, ALA-me p=0.252, ALA-bu p=0.252). 하지만 ALA-pe와 ALA-hx를 도포한 후 3시간이 경과한 경우에는 PpIX 합성량은 통계학적으로 유의하게 증가하였다 (ALA-pe p=0.045, ALA-he p=0.041 ). 결과적으로 5% 농도로 도포 했을 때는 시간이 경과하여도 ALA와 ALA 에스터에 합성되는 PpIX의 양은 큰 차이를 보이지 않았으나, 7.5%이상의 농도로 도포 했을 때는 시간이 경과함에 따라 ALA 에스테르에서 합성되는 PpIX의 양이 ALA보다 많은 것으로 관찰 되었다. ALA 에스터 종류별로는 10% 농도에서는 ALA-me와 ALA-bu에서 합성되는 PpIX의 양이 가장 많았다. 역시 표본의 숫자가 적고 표준편차 값이 큰 관계로 통계학적인 의의는 없었다(p>0.05). 이를 토대로, 본 발명의 ALA-me, ALA-bu, ALA-pe, ALE-hx가 ALA보다는 많은 PpIX을 합성할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 5

본 발명의 ALA-에스터 또는 그의 염을 포함하는 기능성화장료조성물이 피부재생기능성을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 실시예2에서 제조된 에센스조성물2를 실험동물의 피부에 도포한 후 햇빛에 30분 노출시킨 후 관찰하였고 그 결과는 도4에 나타내었다. 또한, 대조군 마우스는 에센스조성물2의 도포 없이 LED(25J)만을 조사하였다.

이 때 실험동물로 암컷 8 주령 ICR 마우스를 사용하였는데, 에센스조성물2를 도포하기 전에 마우스의 등 부위의 털을 제모기와 제모제를 사용하여 피부에 손상을 주지 않게 털을 제거한 후 3일 후에 실험에 사용하였다.

처치 1, 2, 4, 8, 12, 16, 21 일 후에 ICR 마우스의 배부에서 피부 생검을 시행하였다. 생검 조직은 일부는 파라핀 포매 조직으로 처리하였고 나머지 부위는 액화 질소를 이용하여 동결 조직으로 보관하였다. 파라핀 포매된 조직을 Hematoxylin-Eosin으로 염색하였고, N- & C-terminus of procollagens type 1 항체를 이용하여 프로콜라젠type의 발현을 확인하였다.

시간에 따른 변화를 H & E stain 을 통해 관찰한 결과, 도 4로부터 PDT 처치 1일 후 표피 기저세포층의 공포화 및 약간의 염증세포 침윤을 동반한 표피 괴사가 관찰되고, 2일째부터 표피 기저층으로부터 재생되는 소견이 관찰되었다. 4일째부터 완전하게 표피가 회복되고 진피내 기질층이 이 두꺼워지기 시작하였다. 8일 째 시행한 조직 소견상 PDT 를 시행한 군에서는 표피 및 진피 내 기질의 변화가 현저하게 관찰된 반면, 대조군인 red LED light만 조사한 군에서는 현저한 변화는 관찰되지 않았음을 알 수 있다.

실험예 6

본 발명의 에센스조성물2가 도포된 마우스와 대조군 마우스의 mRNA 발현을 확인하기 위해서 RT-PCR을 실행하였으며 그 결과를 도5에 나타내었다. 이 때, 대조군 마우스는 에센스조성물2가 도포되고 LED에 노출되지 않은 것과, 에센스조성물2의 도포 없이 LED(25J)만을 조사한 것이다.

1.마우스 피부 조직 단백 균질액 제조

대조군 마우스와 에센스조성물2를 바른 마우스의 등 피부 조직을 잘라 내어서 막사사발에 넣고 액화질소를 첨가한 상태에서 작은 절편상태까지 분쇄하였다. 이를 다시 적당량의lysis buffer (1% Triton X-100, 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 5% glycerol, 1 mM EDTA, pH 8.0, protease inhibitor cocktail)를 넣어 조직 분쇄기(Ultra Turrax^ㄾ, KikaLaboritechnik T25, Malaysia)로 균질화시켰다. 이를 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 한 다음, 상층액을 새로운 tube에 옮긴 후 다시 14,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상 층액을 피부 균질액으로 사용하였다. 위의 모든 과정은 단백변성을 막기 위하여 4℃에서 시행하였다.

2. Total RNA 분리 및 RT-PCR

Total RNA 분리는 RNeasy mini kit (Qiagen, CA, USA)를 사용하여 마우스 피부 조직으로부터 분리하여 UV-spectrophotometer (Beckman)를 이용하여 정량하였다 (OD₂₆₀/OD₂₈₀). 그 결과 비율이 1.8에서 2.0사이에 있는 total RNA를 실험에 이용하였다. Omniscript RT kit (Qiagen, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다(조건: 1μg RNA, 10Xbuffer, dNTP, oligodT, inhibitor, reverse trascriptase, 37℃에서 1시간, 93℃에서 5분). 합성된 cDNA를 각각 희석하여, PCR-premixture kit (ELPIS, Taejeon, Korea)를 이용하여 PCR를 실행하였다. Perkin Elmer 9600(Shelton, CT, USA)기기를 사용하였다. mcollagen type I alpha1 (336bp)는 5'-gat gtg cca ctc tga ctg gaa-3', 5'-ggc tac gct gtt ctt gca gtg-3' (60℃), mProcollagen III (443bp)는 5'- cca ccc cga act caa gag tgg -3', 5'- cca tcc tct aga act gtg taa gtg-3' (60 ℃), mMMP2 (396bp)는 5'- aga aaa gat tga cgc tgt gt -3',5'- ctt cac gct ctt gag act tt -3' (56 ℃), mMMP3는 5'- tgt acc cag tct aca agt cct cca -3', 5'- ctg cga aga tcc act gaa gaa -3 (62 ℃),는5'- gca tac ttg tac cgc tat gg -3', 5'- tgt gat gtt atg atg gtc cc -3' (57 ℃), mMMP13 (307bp)는 5'- gac ttc tac cca ttt gat gg -3', 5'- tta ggg ttg ggg tct tca tc -3' (59 ℃), mTGF-β1(169bp)는 5'-tga cgt cac tgg agt tgt acg g-3', 5'-ggt tca tgt cat gga tgg tgc-3' (60 ℃) 그리고 mTNF-α는 5' gga ggt cta ctt tgg agt cat tga 3', 5' tcc ctt tgc aga act cag gaa tgg 3', (60 ℃)로 실행하였다. 증폭된 PCR 절편들은 1.5% agarose gel 전기영동을 통해 확인하였다.

그 결과 도5에 도시된 바와 같이 에센스조성물2(ALA-methylester포함)가 도포된 후 LED가 조사한 그룹의 mRNA 발현에 있어서 염증성 사이토카인인 TNF-α와 TGF-β1은 초기에 발현이 증가한 후 감소하였다. 또한 MMP-2, MMP-3, MMp-9은 1일부터 강하게 발현되어 8일 이후에 감소하였다. MMP-13은 2일에 강하게 발현한 후 바로 감소하였다. Collagen I과 III의 mRNA 발현은 ALA-1과 LED를 조사한 그룹에서 collagen I과 III은 4일에부터 강하게 발현되기 시작하여 12일에 최대로 증가하였다. 에센스조성물2(ALA-me)만 도포되었거나, LED만을 조사한 각각의 대조군 그룹에서는 MMP-2, MMP-9, MMP-3, MMP-13의 mRNA 발현의 변화가 미미하였다. 결론적으로 PDT 시행 초기에는 TNF-a, TGF-β1, MMP-2, 3, 9의 염증 및 콜라겐의 remodelling에 관여하는 시토카인과 MMP가 관여하고, 이후에는 procollagen type I의 증가가 이루어짐을 확인하였다 .

실험예 7

본 발명의 에센스조성물2가 도포된 마우스와 에센스조성물4가 도포된 마우스 및 에센스조성물이 도포되지 않은 대조군마우스에 red 파장의 LED (25J)를 조사하고 시간경과에 따라 조직 균질액을 만들어 western blot시행하고 분석한 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

이 때, Procollagen I과 MMPs에 대한 Western blot analysis는 하기와 같이 수행하였다.

마우스 피부 조직 단백 균질액의 단백 정량은 bovine serum albumin (BSA, Pierce, Rockford, IL, USA)을 표준 단백으로 사용하여 BCA^TM protein assay kit (Pierce)로 정량한 다음 실험에 이용하기 전까지 -70℃에 보관하여 사용하였다. 전기영동은 Laemmli (1970)의 방법에 의하여 시행하였다. 세포 균질액을 1 × SDS sample buffer (50mM Trix HCl, pH 6.8, 10 % glycerol, 2% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol)를 넣은 다음 5분 동안 끓인 후 ice에 5분 동안 두었다. 각 sample은 6%와 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동 후 0.45 μm 크기의 PVDF membrane (Millipore, MA, USA)으로 전이시켰다. Ponceau'S solution (Sigma, MO, USA)을 사용하여 membrane으로 옮겨졌는지 확인한 후 blocking 용액 (5% skim milk, PBS, 0.1% tween-20, PBS-T)으로 실온에서 1시간 동안 반응 시켰다. TBS-T로 4번 5분 동안 세척한 후 Procollagen type I(Y-18, N-terminus, sc-8787, Santacruz, 1: 200 D), Procollagen type I(A-17, C-terminus, sc-25973, Santacruz, 1: 200 D), MMP-9 (AF911, R&D, 1:100 D), MMP-3 (ab53015, abcam, 1: 1,000 D), MMP-2 (MAB3308, Chemicon, 1:1,000 D) 그리고 β-actin (abcam, 1: 5,000 D)을 각각 희석한 다음 4℃에서 overnigt 동안 반응시켰다. 그런 다음 PBS-T로 4번 세척 한 후horseradish peroxidase-conjugated goat anti-goat IgG, anti-mouse IgG 그리고 anti-rabbit IgG를 각각 1:5,000으로 희석하여 1시간 동안 반응 시킨 후 ECL kit (Amersham, UK)를 이용하여 발색시켜 확인하였다. 크기 확인을 위한 standard marker는 pre-stained protein ladder (10-180 kDa, IBM, USA)를 사용하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, 마우스 등에 에센스조성물2와 에센스조성물4를 바른 후 red 파장의 LED (25J)를 조사하고 시간경과에 따라 조직 균질액을 만들어 western blot시행하고 분석한 결과 에센스조성물을 도포한 후 LED를 조사한 그룹에서는 MMP-3와 MMP-2 그리고 MMP-9의 단백 발현이 1일부터 최대로 증가하여 2일 이후부터 감소하기 시작하였다. LED만을 조사한 그룹에서는 발현 양이 미미하였다. Collagen type I (N-terminus)은 4일부터 증가하기 시작하여 8일과 12일부터 collagen 발현이 현저히 증가하였다. 또한 LED만을 조사한 그룹에서는 시간이 경과함에 따라 4일에 발현이 약간 증가하였으나 증가 양이 미미하였다.

또한 collagen type I (C-terminus)은 8일과 12일에 발현이 증가하였으나, LED만 조사한 대조군 그룹에서는 발현이 약하였다. 이는 마우스 피부에 에센스조성물을 도포한 후 LED가 조사되면 초기에는 염증성 사이토카인을 분비하며 MMPs의 발현을 유도함을 확인할 수 있었다. 그런 다음 MMPs들의 발현이 감소하면서 피부 재생에 필요한 콜라겐의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.

한편, 도 7에 도시된 바와 같이, 마우스 등에 에센스조성물2와 에센스조성물4를 바른 후 동일한 red 파장의 LED (25J)를 조사하고 시간경과에 따라 조직 균질액을 만들어 western blot 결과를 분석한 결과 에센스조성물4와 비교해 에센스조성물2는 콜라겐이 생성되는 양이 적었으나 거의 동일한 시기와 양상으로 콜라겐이 생성됨을 확인할 수 있었다. 결론적으로 본 발명의 기능성화장료조성물은 대조군에 비해 현저하게 피부에서 콜라겐을 생성할 수 있어 피부재생 즉, 피부노화의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 8

50명의 정상인을 대상으로 실시예1 내지 실시예4에서 제조된 에센스조성물1 내지 4에 대한 알레르기성 및 원발성 접촉피부염(allergic and primary contact dermatitis)을 일으키는지에 대해서 알아보기 위해서 에센스조성물1 내지 4를 정상인 등의 피부에 붙여 첩포검사를 시행하였다. 48시간 후에 첩포를 제거하고 피부반응 유무를 관찰한 후 그 결과를 판독하였다.

이와 같이 ALA-메틸에스터를 포함한 에센스조성물1 내지 4에 대한 첩포검사를 시행하여 알레르기성 접촉피부염이나 원발성 접촉피부염 발생여부를 측정한 결과, 정상인의 어떠한 사람에게도 알레르기성이나 원발성 접촉피부염을 일으키지 않는 안전한 화장료조성물임을 알 수 있었다.

실험예 9

얼굴에 주름 및 잡티 등 피부트러블이 있는 정상인 50명을 대상으로 에센스조성물2를 도포한 후 실내등에 3시간 노출시키는 시술을 통해 에센스조성물2의 피부재생효과를 관찰하였다. 추적관찰을 위해 시술 전과 시술 2주후에 각각 사진을 촬영하여 임상효과를 관찰하였고 그 중 일부의 사진을 도 8 내지 도 12에 도시하였다.

이와 같이 ALA-메틸에스터를 포함한 에센스조성물2를 1회 시술하여 피부재생효과를 측정한 결과, 실험 대상자 중 90%이상이 주름 및 피부트러블이 감소되었음을 인식하였다고 답변하여 본 발명의 피부재생용 기능성화장료조성물이 피부재생효과가 우수함을 알 수 있었다.

특히, 도 8 내지 12에 도시된 사진들은 에센스조성물2의 1회 시술 전에 비해 시술 후에 피부의 색깔이 밝아지고, 모공이 감소하여 피부의 색깔 및 피부 주름이 개선되었음을 알 수 있을 뿐만 아니라 여드름에도 효과가 있었음을 알 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 도 8은 시술 전인 좌측에 비해 시술 후인 우측이 피부의 색깔 및 피부 주름이 개선되었음을 보여주고, 도 9는 시술 전인 좌측에 비해 시술 후인 우측이 피부의 색깔이 밝아지고, 모공이 감소하였음을 보여주며, 도 10은 시술 전인 좌측에 비해 시술 후인 우측사진에서 모공의 크기가 감소하였음을 보여준다.

또한, 도 11은 시술 전인 좌측에 비해 시술 후인 우측사진에서 여드름이 개선되고 피부 색깔이 호전되었음을 보여주며, 도 12는 시술 전인 좌측에 비해 시술 후인 우측이 피부가 맑아지면서 여드름도 호전되었음을 보여주고 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

도 1은 피부 인체 각질형성세포와 섬유모세포에 대한 ALA 에스터의 독성실험 결과를 나타낸 그래프,

도 2는 피부 인체 각질형성세포와 섬유모세포에서 PpIX의 합성량을 나타낸 그래프,

도 3a 내지 3c는 피부에 도포된 기능성화장료조성물에 포함된 ALA, ALA 에스터들의 농도 및 시간 경과에 따른 PpIX의 합성량을 비교하여 도시한 그래프,

도 4는 에센스조성물2를 실험동물의 피부에 도포한 후 ALA 에스터의 피부노화 치료효과를 나타낸 사진,

도 5는 mRNA 발현을 확인하기 위한 RT-PCR 실험결과사진,

도 6은 western blot시행하고 분석한 결과사진,

도 7은 western blot시행하고 분석한 결과사진 및 콜라겐 생성량 그래프,

도 8 내지 도 12는 에센스조성물2의 피부재생효과를 알아보기 위해 에센스조성물2를 얼굴에 도포한 실험자들의 시술전 및 시술후 사진들이다.

Claims (7)

1. 5-아미노레불린산 에스터 또는 화장품학적으로 허용되는 이의 염을 피부재생의 유효성분으로 포함하는 피부재생용 기능성화장료조성물로서,

   상기 5-아미노레불린산 에스터 또는 화장품학적으로 허용되는 이의 염은 화장료베이스 100중량부당 5 내지 10중량부로 포함되고,

   상기 기능성화장료조성물을 피부에 도포하고 실외에서는 햇빛에 1시간 내지 2시간 노출시키거나 실내에서는 실내등에 2시간 이상 노출시키게 되면 피부재생주기를 촉진시키고 콜라겐을 생성하는데,

   상기 5-아미노레불린산 에스터는 하기 화학식을 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는 피부재생용 기능성화장료조성물.

   화학식(Ⅰ)

   NH₂-CH₂-CO-CH₂-CH₂-CO-O-R₁

   여기서, R₁은 2-프로페닐기 (CH₂-CH=CH₂), 3-부테닐기 (CH₂-CH₂-CH=CH₂), 4-펜테닐기 (CH₂-CH₂-CH₂-CH=CH₂), 5-헥세닐기 (CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH=CH₂), 메칠기 (CH₃)를 포함하는 알킬기(C1-C6 )로 이루어진 군에서 선택된다.
2. 제1항에 있어서,

   상기 5-아미노레불린산 에스터의 화장품학적으로 허용되는 염은 하기 화학식을 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는 피부재생용 기능성화장료조성물.

   화학식(Ⅱ) R₂ㆍNH₂-CH₂-CO-CH₂-CH₂-CO-O-R₁

   여기서, R₁은 2-프로페닐기 (CH₂-CH=CH₂), 3-부테닐기 (CH₂-CH₂-CH=CH₂), 4-펜테닐기 (CH₂-CH₂-CH₂-CH=CH₂), 5-헥세닐기 (CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH=CH₂), 메칠기 (CH₃)를 포함하는 알킬기(C1-C6)로 이루어진 군에서 선택되고, R₂는 HCl, H₂SO₄, H₃PO_4, 아세트산, 벤조산, 벤젠 술폰산을 포함하는 무기산 또는 유기산으로 이루어진 군에서 선택된다.
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 화장료베이스는 스테아릴알코올, 폴리에틸렌글리콜 또는 정제수를 포함하는 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부재생용 기능성화장료조성물.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 5-아미노레블린산 에스터의 화장품학적으로 허용되는 염은 염산염인 것을 특징으로 하는 피부재생용 기능성화장료조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 피부재생용 기능성 화장료조성물의 1회 사용분량에 포함된 5-아미노레블린산 에스터 또는 이의 염은 50 내지 75mg인 것을 특징으로 하는 피부재생용 기능성화장료조성물.
7. 삭제

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