KR101145365B1 - 생물전환공정에 의한 감마-아미노부틸산의 무염 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루타메이트 또는 글루탐산을 기질로 하여 생물전환 방법으로 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 반응 중 글루타메이트 디카복실레이즈 효소 활성에 적합한 pH 를 맞추기 위해 반응 매질에 용해되지 않는 고체산을 첨가함으로써 기존 pH 조절제의 문제인 염의 생성 없이 감마-아미노부틸산을 효율적으로 생산할 수 있다. 반응 후 고체산은 여과나 원심분리를 통해 쉽게 제거할 수 있기 때문에 본 발명을 통해 기존의 복잡한 염 제거공정이 필요 없어진다. 이로 인해 정제공정이 간단해져 보다 경제적이고 효율적인 감마-아미노부틸산의 제조가 가능하다.

Description

생물전환공정에 의한 감마-아미노부틸산의 무염 제조방법 {Method for salt-free production of gamma-aminobutyric acid by biotransformation process}

본 발명은 글루타메이트 또는 글루탐산을 기질로 하여 생물전환 방법으로 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

감마-아미노부틸산(GABA)은 4개의 탄소로 구성되어 있는 비단백질 구성 아미노산의 억제성 신경전달물질로서 신경안정 작용, 스트레스 해소, 기억력 증진, 혈압강하 작용, 우울증 완화, 중풍과 치매 예방, 불면, 비만, 갱년기 장애 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 뇌졸중 및 결장암, 대장암 세포의 전이 및 증식 억제 효과도 있는 것으로 밝혀진 세계적인 식품소재이다. 또한 최근 바이오매스 유래 소재에 대한 관심이 증가하고 있는데, GABA는 바이오매스로부터 생산될 수 있는 유용한 플라스틱인 폴리아미드 4를 얻기 위한 중요한 단량체이다.

GABA 생산을 위한 공업적 방법은 합성법, 추출법, 생물전환법 등이 있다. 합성법의 경우 사용하는 용매가 주로 유독하고, 추출법의 경우는 폐기물의 발생량이 많으며 GABA의 제조단가가 높은 단점이 있다. 생물전환법은 바이오촉매(biocatalyst)인 분리 효소(isolated enzyme)나 효소를 함유한 전세포(whole cell)를 촉매로 사용하여 글루타메이트의 탈탄산 반응으로부터 GABA를 생산하는 방법이다.

산업적인 측면에서 볼 때 글루타메이트와 같은 값싼 원료로부터 환경친화적인 생물전환공정을 통해 GABA를 생산하는 것은 매우 합리적이고 가치 있는 공정이다.

GABA로의 전환 반응에 사용되는 효소는 피리독살 5-포스페이트 (PLP)-의존형 글루타메이트 디카복실레이즈 (glutamate decarboxylase; EC 4.1.1.15)이며, 이 효소는 유산균, 대장균, 바실러스 등 미생물 유래의 것이 많이 사용된다. 박테리아 글루타메이트 디카복실레이즈의 최적 pH는 3.8~4.6 이며, pH가 6.0 이상이 되면 반응은 거의 일어나지 않는다. 이 효소는 글루타메이트의 α-탄소에 결합되어 있는 카복실 그룹으로부터 이산화탄소(CO₂)를 제거하는데, 이 과정에서 pH가 증가하게 된다. 생물전환법의 경우 효소 촉매에 의해 GABA가 생성됨에 따라 pH가 증가하게 되는데, 이로 인해 반응이 점점 느려지다가 결국 반응이 멈추게 된다. 따라서 계속 반응을 진행시키기 위해서는 산을 투입하여 반드시 pH를 낮춰주어야 한다.

종래에는 완충용액이나 기질을 사용하여 최적 pH 로 맞춘 후, 반응이 진행함에 따라 염산, 황산, 질산, 초산 등과 같은 산을 pH 조절제로 투입하여 반응액의 pH를 맞추었다. 그러나 기존 방법은 반응 중 생성되는 GABA의 양에 비례하여 산을 첨가함으로써 염(salt)이 다량으로 생성되는 문제점이 있다. 생성된 염을 제거하기 위해서는 이온교환수지 공정, 재결정과 같은 정제공정이 필요하게 되고, 반응액 중의 다량의 염은 수율 저하, 폐수 발생 등과 같은 문제를 수반하게 됨으로써, 염 발생은 GABA의 생산 단가를 높이는 중요한 원인이 되어 왔다.

본 발명은 글루타메이트 또는 글루탐산을 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 생물전환 방법으로 제조함에 있어서, 효소 반응 중의 pH 를 조절할 뿐만 아니라 반응 후 염 생성이 없는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 글루타메이트 디카복실레이즈를 이용하여 글루타메이트 또는 글루탐산을 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 생물전환 방법으로 제조함에 있어서, 전환반응 중에 고체산을 첨가하는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 감마-아미노부틸산 생산 반응 중 효소 활성에 적합한 pH 를 맞추기 위해 반응 매질에 용해되지 않는 고체산을 첨가함으로써 기존 pH 조절제의 문제인 염의 생성 없이 감마-아미노부틸산을 효율적으로 생산할 수 있다. 반응 후 고체산은 여과나 원심분리를 통해 쉽게 제거할 수 있기 때문에 본 발명을 통해 기존의 복잡한 염 제거공정이 생략된다. 이로 인해 정제공정이 간단해져 보다 경제적이고 효율적인 감마-아미노부틸산의 제조가 가능하다.

도 1은 글루타메이트 디카복실레이즈 효소의 pH 의존성 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 완충용액 내에서 pH 조절제(산)가 첨가되지 않은 1 M L-MSG의 효소적 전환 반응 결과를 나타낸다 (효소액 농도: 0.02 ml/ml 반응액).
도 3은 완충용액 내에서 pH 조절제(산)가 첨가되지 않은 1 M L-MSG의 효소적 전환 반응 결과를 나타낸다 (효소액 농도: 0.05 ml/ml 반응액).
도 4는 완충용액 내에서 강산성 양이온 교환수지(Amberlyst 15)가 첨가된 글루타메이트의 효소적 전환 반응 결과를 나타낸다.
도 5는 완충용액 내에서 약산성 양이온 교환수지(Amberlite IRP-64)가 첨가된 글루타메이트의 효소적 전환 반응 결과를 나타낸다.
도 6은 완충용액 내에서 약산성 양이온 교환수지(Amberlite IRC-86)가 첨가된 글루타메이트의 효소적 전환 반응 결과를 나타낸다.
도 7은 완충용액 없이 증류수 내에서 약산성 양이온 교환수지 (Amberlite IRC-86, 0.2 g)을 이용한 생물전환적 감마-아미노부틸산의 무염 제조 결과를 나타낸다.
도 8은 완충용액 없이 증류수 내에서 약산성 양이온 교환수지 (Amberlite IRC-86, 0.6 g)을 이용한 생물전환적 감마-아미노부틸산의 무염 제조 결과를 나타낸다.

본 발명은 글루타메이트 디카복실레이즈를 이용하여 글루타메이트 또는 글루탐산을 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 생물전환 방법으로 제조함에 있어서, 전환반응 중에 고체산을 첨가하는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 생물전환 방법은 효소적 방법일 수 있다. 감마-아미노부틸산을 제조하기 위한 생물전환 방법 중 효소적 방법은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 글루타메이트의 α-탄소에 결합되어 있는 -COOH가 글루타메이트 디카복실라제의 촉매작용에 의해 탈탄산됨으로써 감마-아미노부틸산을 생합성 하는 방법이다. 이러한 효소 반응에 의해 감마-아미노부틸산이 생성되어 감에 따라 반응액 중의 pH는 점점 올라가게 된다.

[반응식 1]

본 발명은 글루타메이트 또는 글루탐산을 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 생물전환 방법으로 제조함에 있어서, 효소 반응 중에 pH 조절제로서 반응 매질에 용해되지 않는 고체산을 첨가함으로써 반응액의 pH를 낮춰줄 뿐만 아니라 반응 중에 염의 생성이 전혀 없는 것을 특징으로 한다. 반응 후 고체산은 여과나 원심분리를 통해 쉽게 제거할 수 있기 때문에, 본 발명에 따르면 복잡한 염 제거 공정이 필요 없어지게 되어 경제적이고 효율적인 감마-아미노부틸산의 제조가 가능해진다.

본 발명에 있어서 글루타메이트 디카복실레이즈의 기질은 글루타메이트 또는 글루탐산이다. 상기 글루타메이트는 예를 들어 글루탐산의 무기염일 수 있으며, 구체적으로 글루탐산의 소듐염일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 소듐염 중에서도 모노소듐 글루타메이트(monosodium glutamate, MSG)일 수 있다.

본 발명의 한 구체 예에서, 상기 고체산은, 예를 들어 양이온 교환수지, 활성백토, 산성백토, 제올라이트, 실리카, 알루미나, 실리카-알루미나, 헤테로폴리산 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고체산은 양이온 교환수지일 수 있으며, 강산성 양이온 교환수지 또는 약산성 양이온 교환수지일 수 있고,구체적인 양이온 교환수지의 종류는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 감마-아미노부틸산의 제조방법은 상기 생물전환 반응 중에 완충용액을 첨가하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

생물전환 방법으로 감마-아미노부틸산을 제조함에 있어서, 초기 효소 활성에 필요한 pH를 맞추기 위하여 일반적으로 생물전환 반응 중에 완충용액을 사용한다. 그러나 완충용액에도 염이 포함되어 있기 때문에 완충용액을 사용할 경우 염의 제거를 위한 별도의 염 제거공정이 필요하게 된다. 따라서 본 발명에 따라 감마-아미노부틸산을 효소적으로 제조함에 있어서 효소 반응 중에 완충용액을 사용하지 않으면, 감마-아미노부틸산 제조시 염이 전혀 없는 효과를 얻을 수 있다.

즉 본 발명에 따른 감마-아미노부틸산의 제조방법은 구체적으로 글루타메이트 디카르복실라아제를 상기 고체산의 존재 하에 글루타메이트 또는 글루탐산과 접촉시키는 단계를 포함하며, 이 때 상기 반응이 일어나는 반응액은 완충용액을 포함할 수도 있지만, 완충용액을 포함하지 않고 대신 증류수를 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 글루타메이트 디카복실레이즈 효소의 pH 의존성

글루타메이트 디카복실레이즈 활성이 우수한 재조합 대장균을 통상적인 방법으로 액체 배지에서 배양하고, 원심 분리기를 이용해 세포를 수집한 후, 인산염 완충용액(pH 7.3)으로 세척하였다. 세척 후 회수된 세포를 인산염 완충용액(pH 7.3) 내에서 초음파분쇄기를 이용하여 파쇄하였다 (1분씩 5번). 세포 파쇄 후, 상층액에 존재하는 단백질들을 20%, 40%, 60%로 포화된 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 용액을 이용하여 분리하였다. 최종 침전 분리된 효소는 pH 7.3 인 인산염 완충용액에 녹여 냉장 보관하였다. 이렇게 분리 정제된 글루타메이트 디카복실레이즈의 비역가(specific activity)는 약 80 U/mg 이었다. 단백질 량은 Micro BCA^TM Protein Assay Kit (Pierce, USA)를 사용하여 측정하였으며, 글루타메이트 디카복실레이즈 반응에 의해 생성된 감마-아미노부틸산(GABA)은 Gabase (SigmaAldrich, USA)를 이용해 정량화 하였다.

20 mM L-모노소듐 글루타메이트(L-monosodium glutamate, L-MSG)를 사용해 37°C에서 pH 에 따른 글루타메이트 디카복실레이즈 효소의 활성을 조사하였다. 도 1을 보면, 이미 알려진 바와 같이 pH 6 이상에서는 효소 활성이 거의 없어 반응이 진행되지 않았다. 따라서 글루타메이트로부터 효소적 감마-아미노부틸산(GABA) 생산을 위해서는 pH가 적어도 6 이하로 유지되어야 함을 알 수 있다.

실시예 2: pH 조절제가 첨가되지 않은 효소적 감마-아미노부틸산( GABA ) 생산

pH 조절제(산)를 사용하지 않고 생물전환법에 의해 효소적 감마-아미노부틸산(GABA) 생산 반응을 수행하였다. 1 M L-MSG, 0.1 mM PLP (pyridoxal-5'-phosphate), 0.2 mM DTT (dithiothreitol)가 포함된 아세테이트 완충용액 (0.2 M, pH 4.6)에 0.04 ml 글루타메이트 디카복실레이즈 용액을 첨가하여 37°C 에서 전환 반응을 수행하였다 (총 반응액의 부피: 2.0 ml).

도 2에 나타난 바와 같이, 1 M L-MSG를 사용할 경우 10시간 반응 후의 최종 GABA 전환율은 12%에 불과하였다. 기질인 L-MSG 에 의해 초기 pH는 4.6에서 5.3으로 증가하였고, 반응 7시간 후에는 pH가 6.1까지 올라가 글루타메이트 디카복실라제의 촉매 활성이 떨어져 반응이 더 이상 진행되지 않은 것으로 보인다.

동일한 조건하에서 효소 용액의 양을 0.1 ml로 증가한 경우에도, 반응 속도는 증가하였으나 그만큼 pH가 6.0에 빨리 도달하여 반응 전환율은 24시간 후에도 13%에 불과하였다 (도 3).

이로부터 반응 중 적절한 pH의 조절이 효소적 감마-아미노부틸산(GABA) 생산 공정에 필수적인 것을 알 수 있다.

실시예 3: 고체산이 첨가된 효소적 감마-아미노부틸산( GABA ) 생산

반응 중 증가하는 pH를 낮추기 위해 pH 조절제로서 고체산의 일종인 양이온 교환수지를 이용하여 효소적 감마-아미노부틸산(GABA) 생산 반응을 수행하였다. 실시예 2와 동일한 실험 조건하(효소 용액의 양은 0.1 ml)에서 강산성 양이온 교환수지인 Amberlyst 15를 0.2 g 첨가하여 효소적 전환 반응을 수행하였다. 강산성 양이온 교환수지의 영향으로 pH는 고체산을 첨가하지 않은 반응에 비해 전반적으로 낮아졌으며, 낮아진 pH로 인해 효소 활성은 증가되어 최종 GABA 전환율이 13%에서 67%로 크게 향상되었다(도 3과 도 4 비교).

또한 고체산으로 약산성 양이온 교환수지인 Amberlite IRP-64 혹은 Amberlite IRC-86을 0.2 g 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 마찬가지로 약산성 양이온 교환수지를 첨가한 경우의 pH는 고체산을 첨가하지 않은 반응에 비해 전체적으로 낮아졌으며, 그 결과 GABA 최종 전환율이 약 65% 정도로 크게 향상되었다(도 3과 도 5 및 6 비교).

실시예 4: 고체산을 이용한 효소적 감마-아미노부틸산( GABA )의 무염 생산

초기 효소 활성에 필요한 pH를 맞추기 위해 아세테이트 완충용액(0.2 M, pH 4.6)을 사용하였으나, 완충용액에도 염이 포함되어 있으므로 완충용액 없이 고체산만을 이용하여 효소적 감마-아미노부틸산(GABA) 생산 반응을 수행하였다. 실시예 3과 동일한 반응 조건이지만, 아세테이트 완충용액(0.2 M, pH 4.6) 대신 증류수를 사용하였다. 즉, 1 M L-MSG, 0.1 mM PLP, 0.2 mM DTT 가 포함된 1.9 ml 증류수에 0.1 ml 글루타메이트 디카복실레이즈 용액을 첨가하여 37°C에서 전환 반응을 수행하였다. 고체산으로는 약산성 양이온 교환수지인 Amberlite IRC-86을 0.2 g 첨가하였다. 고체산을 넣기 전 반응 매질 내 pH는 기질인 1 M L-MSG로 인해 중성이었으나, 고체산을 넣음으로써 pH는 효소 활성에 적합한 약산성으로 감소하였다. 이후 효소 반응에 의해 pH가 증가하였으나, 최종 전환율은 약 60%로 완충용액을 사용하지 않고 증류수에서도 염 생성 없이 감마-아미노부틸산(GABA)을 생산할 수 있었다(도 7).

증류수에서도 염 생성 없이 100% 전환율이 가능한지 확인하기 위해 Amberlite IRC-86의 양을 0.6 g으로 증가시켜 다시 실험을 수행하였다. 양이온 교환수지 첨가 후, 초기 pH는 4.6으로 효소 활성을 위한 최적 pH가 되었으며 24시간 후에도 pH는 6을 넘지 않았다. 그 결과, 24시간 후 전환율은 거의 100%에 다다랐다(도 8).

Claims (3)

1. 글루타메이트 디카복실레이즈를 이용하여 글루타메이트 또는 글루탐산을 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 생물전환 방법으로 제조함에 있어서, 반응이 진행함에 따라 pH가 증가하는 생물전환 반응 중에 수불용성 고체산을 첨가하는 감마-아미노부틸산의 무염 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 고체산이 양이온 교환수지인 감마-아미노부틸산의 무염 제조방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 생물전환 반응 중에 완충용액을 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산의 무염 제조방법.

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