KR101127120B1 - 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역력 증강, 암 예방 및 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 누에고치 또는 부잠사를 정련하여 세리신을 제거한 후, 1차 중화 및 역중화를 통하여 제조한 면역력 증강, 암 예방 및 개선용 조성물에 대한 것이다.

Description

실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역력 증강, 암 예방 및 개선용 조성물{COMPOSITION FOR ENHANCING IMMUNE ACTIVITY, PREVENTING AND IMPROVING CANCER WHICH CONTAINS SILK HYDROLYSATE AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역력 증강용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.

실크는 의류용 고급소재로 주로 이용되어 왔으나 최근에 화학적 조성이 밝혀지면서 기능성 식품 소재로 개발이 활발히 진행이 되고 있다. 특히 실크는 천연 단백질로서 순도가 높으면서도 다량 생산이 가능한 장점이 있다. 실크 단백질은 세리신과 피브로인으로 구성되어 있으며, 이를 가수분해하면 올리고펩타이드가 포함된 아미노산 혼합물을 얻을 수 있다. 상기 실크 유래의 아미노산 혼합물, 즉 실크 가수분해물은 일반적으로 실크 펩타이드라고 부르기는 하나, 실제로는, 약 3중량%의 올리고펩타이드 및 약 97중량%의 아미노산의 조성을 갖는, 올리고펩타이드가 포함된 아미노산 혼합물의 형태이다.

한편 실크 가수분해물은 실크의 가수분해방법 및 잔류물을 여과하는 방법에 따라 아미노산의 조성 및 올리고펩타이드의 분자량에 차이가 나며 실크 가수분해물 특유의 생리활성도 상당히 달라지게 된다. 현재 개발되어 있는 실크 가수분해물은 대부분 누에고치를 산 및 알카리 가수분해한 것이다.

그러나 종래 실크 가수분해물의 생리 활성은 이러한 실크 가수분해물의 제조 방법에 따른 생리 활성의 차이를 고려하지 않고, 특정 방법으로 제조된 실크 가수분해물에 국한된 활성을 타 방법으로 제조된 일반적인 실크 가수분해물들도 갖는 것으로 여기는 문제점이 있었다. 예컨대, 선행 특허출원 10-2008-0098150호(실크 펩타이드 및 사이토카인을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 증강 또는 항암용 조성물)에는 실크 펩타이드, 즉 실크 가수분해물의 면역 증강 및 항암 활성에 대하여 기재되어 있으나, 실크 가수분해물의 면역 증강 및 항암 활성은 실크 가수분해물의 제조 방법 등에 따라 활성의 편차가 상당히 크고, 더군다나 일반적인 산 가수분해 방법에 의하여 제조된 실크 가수분해물 등은 면역 증강 활성이 거의 없는데도 불구하고, 명세서 내에 구체적인 실크 가수분해물의 제조 공정이 나타나 있지 않아 실제로 발명을 실시하기에 어려움이 있었다.

본 발명자들은 다양한 방법을 이용하여 실크 단백질로부터 실크 가수분해물을 제조하고, 이들의 생리 활성을 연구하던 중, 특정 방법으로 제조한 실크 가수분해물이 면역 증강 효능 및 항암 효능이 높은 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 면역력 증강 및 암 예방, 치료 및 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실크 단백질을 정련한 후 산 가수분해하여, pH 9.2~9.3으로 1차 중화시킨 후, pH 7.4~7.6으로 역중화하여 제조한 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역력 증강, 암 예방, 치료 및 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 면역력 증강 및 항암 활성을 갖는다.

도 1은 실크 가수분해물의 제조 방법에 따른 면역력 증강 효능을 나타낸다.
도 2는 실크 가수분해물의 제조 방법에 따른 항암 활성을 나타낸다.
도 3은 실크 가수분해물 및 사이토카인의 복합 처리에 따른 항암 활성을 나타낸다.

본 발명은 누에고치 또는 부잠사를 정련하여 세리신을 제거한 후, 이를 가수분해하여 제조한 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물로서,

상기 실크 가수분해물은,

1) 누에고치 또는 부잠사를 정련하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제조된 정련물을 가수분해하는 단계;

3) 상기 가수분해한 정련물을 pH 9.2～9.3으로 1차 중화시키는 단계;및

4) 상기 단계 3)에서 제조된 1차 중화물을 pH7.4~7.6으로 역중화시키는 단계를 포함하는 실크 가수분해물의 제조방법을 통하여 제조된 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 1) 누에고치 또는 부잠사를 정련하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제조된 정련물을 가수분해하는 단계;

3) 상기 가수분해한 정련물을 pH 9.2～9.3으로 1차 중화시키는 단계;및

4) 상기 단계 3)에서 제조된 1차 중화물을 pH7.4~7.6으로 역중화시키는 단계를 포함하는, 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물의 제조 방법을 제공한다.

아울러 본 발명은 누에고치 또는 부잠사를 정련하여 세리신을 제거하고 피브로인만을 가수분해하여 제조한 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역력 증강 및 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역력 증강 및 항암용 약학적 조성물로서,

상기 실크 가수분해물은,

1) 누에고치 또는 부잠사를 정련하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제조된 정련물을 가수분해하는 단계;

3) 상기 가수분해한 정련물을 pH 9.2～9.3으로 1차 중화시키는 단계;및

4) 상기 단계 3)에서 제조된 1차 중화물을 pH7.4~7.6으로 역중화시키는 단계를 포함하는 실크 가수분해물의 제조방법을 통하여 제조된 것을 특징으로 하는 면역력 증강 및 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 1) 누에고치 또는 부잠사를 정련하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제조된 정련물을 가수분해하는 단계;

3) 상기 가수분해한 정련물을 pH 9.2～9.3으로 1차 중화시키는 단계;및

4) 상기 단계 3)에서 제조된 1차 중화물을 pH7.4~7.6으로 역중화시키는 단계를 포함하는, 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역력 증강 및 항암용 약학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 실크 가수분해물은 누에고치 또는 부잠사로부터 제조된다. 바람직하게는 본 발명의 실크 가수분해물은 누에고치 또는 부잠사를 정련하여 세리신을 제거하여 사용한다. 본 발명에 있어서, "부잠사"란, 누에고치로부터 견사를 뽑을 때 나오는 부산물 일체를 가리키는 것으로, 여기에는 비수, 돌려낸 고치, 풀솜, 구멍고치, 견면, 생피저, 실켜기를 할 수 없는 얇은 고치 등이 포함된다.

본 발명의 식품 조성물은 면역력 증강용 식품 조성물; 또는, 암 예방 및 개선용 식품 조성물이다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 2)는 상기 단계 1)에서 제조된 정련물을 세척 및 탈수하고, 이를 건조시킨 다음 가수분해하여 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 실크 단백질의 가수분해는 산 또는 염기 가수분해일 수 있으며, 바람직하게는 산 가수분해이다. 이때 사용되는 산 및 염기는 특별히 제한되지 않으며, 당업자는 적절한 산 및 염기를 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 3)의 1차 중화 단계는 33% 수산화나트륨 용액을 사용하고, pH9.2~9.3을 1차 중화점으로 하여, 중화 후 MCPD와 DCP류의 물질생성을 억제하도록 4시간을 교반하여 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 4)의 역중화 단계는 2N-염산 용액을 사용하고, pH7.5을 중화점으로 하여 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 식품 및 약학적 조성물은 실크 가수분해물을 유효성분으로 포함하며, 바람직하게는 실크 가수분해물 및 사이토카인을 유효성분으로 포함한다. 이때, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IFN-γ 등일 수 있으며, 바람직하게는 상기 사이토카인은 IL-15이다.

본 발명의 상기 식품 및 약학적 조성물에 있어서, 그 유효성분인 실크 가수분해물의 제조 방법은,

5) 상기 단계 4)에서 제조된 역중화물을 탈색 및 탈취하는 단계;

6) 상기 탈색 및 탈취된 역중화물을 여과하는 단계;

7) 상기 여과물을 탈염하는 단계;

8) 상기 탈염된 여과물을 농축하는 단계;및

9) 상기 농축물을 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 상기 식품 및 약학적 조성물의 제조방법은,

5) 상기 단계 4)에서 제조된 역중화물을 탈색 및 탈취하는 단계;

6) 상기 탈색 및 탈취된 역중화물을 여과하는 단계;

7) 상기 여과물을 탈염하는 단계;

8) 상기 탈염된 여과물을 농축하는 단계;및

9) 상기 농축물을 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 항암 및 암 치료는 암의 개선, 치료, 전이의 억제 등을 의미한다.

본 발명의 암은 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 암은 폐암, 난소암, 췌장암, 결장암, 위암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 뇌종양, 간암, 유방암, 자궁암, 고환암, 신암, 담관암, 백혈병, 소화기암, 자궁목암, 비뇨기암, 식도암, 악성 임파종, 신경아종, 웃턱암, 구강암, 방광암, 조혈기 신경아세포종, 세포암, 융털 돌기암 등이 될 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 면역 기능이 저하된 환자, 암 환자 등에게 투여할 수 있으며, 면역 능이 저하되어 질병에 걸릴 위험이 높은 대상에게도 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 실크 가수분해물을 0.01 내지 99.99 중량부 포함할 수 있으며, 바람직하게는 60 내지 98 중량부 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 실크 가수분해물을 90 내지 95 중량부 포함할 수 있다. 그러나 이는 투약자의 필요에 따라 증감할 수 있으며, 식생활, 영양 상태, 병의 진행 정도, 뇌 기능 장애 정도 등 상황에 따라 적절히 증감할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 실크 가수분해물 외 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 실크 가수분해물을 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 5g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 환자식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 실크 가수분해물을 첨가하는 것도 포함된다.

본 발명의 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 실크 가수분해물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 상기 실크 가수분해물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 실크 가수분해물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

본 실험에서 사용한 자연살해세포는 인간 말초혈액으로부터 Histopaque(Sigma, 미국) 및 human NK Cell Isolation Kit(Miltenyi, 독일)를 이용하여 자연살해세포를 분리하고, 이를 원심분리하여 -70 ℃에서 보관하여 이용하였다. 한편, 수컷 6주령 BALB/c 마우스(BALB/c mouse)는 5주령 때 수령 후 일주일 간 온도 21~22℃, 습도 50~60%, 명암 12 h-light/dark cycle인 환경에서 적응시켰다.

<실시예 1>

탈각 누에고치 100g을 2% 중탄산나트륨용액 1,000㎖에 넣고, 1시간 동안 정련하여 세리신 성분을 제거하였다. 정련물을 꺼내어 60℃ 정제수로 30분씩 3회 세척을 하였다. 세척된 정련물을 원심분리하여 탈수를 하고, 함수율이 10%이하가 되도록 건조시켰다. 건조된 정련물은 70.5g이었다. 건조된 정련물에 705 ㎖의 2N염산용액을 넣고 용기에 컨덴서를 장착하고 컨덴서에 냉각수를 공급하면서 120 ℃에서 48시간 가열하여 가수분해시켰다. 가수분해가 완료된 용액에 33%수산화나트륨용액 199.1㎖를 첨가하여 pH9.2가 되도록 한 후 5 시간 동안 교반하였다. 교반 후 2N염산용액 123 ㎖를 첨가하여 pH7.5로 역중화시켰다. 역중화된 용액에 활성탄 56 g을 투입하여 1시간 동안 교반한 후 원심분리에 의해 여과하여 활성탄을 제거하였다. 여과된 용액을 전기투석하여 용액속에 포함된 염을 제거하고, 50 ℃에서 진공농축하였다. 농축된 용액을 열풍 스프레이 건조하여 실크 가수분해물 52.9 g을 얻었다(실시예 1).

<실시예 2>

탈각 누에고치 150g을 2% 중탄산나트륨용액 1,500 ㎖에 넣고, 1시간 동안 정련하여, 정련액 1,310 ㎖를 수득하였다. 상기 정련액을 마이크로 필터(pore size:20-25㎛)로 여과하여 폐액중에 함유된 이물질을 제거하였다. 이물질이 제거된 폐액을 포피반응기에서 냉각수를 사용하여 25 ℃로 냉각시키면서 2N 염산용액 393㎖를 첨가하여 중화시켰다. 중화 후 마이크로 필터(pore size: 5-10㎛)를 사용하여 중화된 정련액을 여과함으로써, 중화액 속에 침전물로 형성된 세리신을 회수하였다. 상기 회수된 여과물을 정제수로 4회 세척하여, 세리신 속에 묻어 있는 미량의 염화나트륨을 제거하였다. 세척에 의해 염화나트륨을 제거한 후 여과물을 스팀 건조오븐을 이용하여 건조시켜 세리신 31 g을 얻었다.

상기 세리신 31 g에 310㎖의 2N 염산용액을 넣고 용기에 컨덴서를 장착하고 컨덴서에 냉각수를 공급하면서 120 ℃에서 48시간 가열하여 가수분해시켰다. 가수분해가 완료된 용액에 33%수산화나트륨용액 86㎖를 첨가하여 pH 9.2가 되도록 한 후 5 시간 동안 교반하였다. 교반 후 2N 염산용액 53 ㎖를 첨가하여 pH7.5로 역중화시켰다. 역중화된 용액에 활성탄 23.2 g을 투입하여 1시간 동안 교반한 후 원심분리에 의해 여과하여 활성탄을 제거하였다. 여과된 용액을 전기투석하여 용액속에 포함된 염을 제거하고, 50 ℃에서 진공농축하였다. 농축된 용액을 열풍 스프레이 건조하여 실크 가수분해물 23.31 g을 얻었다(실시예 2).

<실시예 3>

탈각 누에고치 150g을 정련하지 않고, 60℃ 정제수로 30분씩 3회 세척을 하였다. 세척된 누에고치를 원심분리하여 탈수를 하고, 함수율이 10 %이하가 되도록 건조시켰다. 상기 건조된 누에고치 141 g에 1,410㎖의 2N 염산용액을 넣고 용기에 컨덴서를 장착하고 컨덴서에 냉각수를 공급하면서 120 ℃에서 48시간 가열하여 가수분해시켰다. 가수분해가 완료된 용액에 33% 수산화나트륨용액 390.1 ㎖를 첨가하여 pH 9.2가 되도록 한 후 5 시간 동안 교반하였다. 교반 후 2N 염산용액을 첨가하여 pH7.5로 역중화시켰다. 역중화된 용액에 활성탄 108.9 g을 투입하여 1시간 동안 교반한 후 원심분리에 의해 여과하여 활성탄을 제거하였다. 여과된 용액을 전기투석하여 용액속에 포함된 염을 제거하고, 50 ℃에서 진공농축하였다. 농축된 용액을 열풍 스프레이 건조하여 실크 가수분해물 107.4 g을 얻었다(실시예 3).

<비교예 1>

탈각 누에고치 100g을 가늘게 절단한 후 0.5% 탄산 나트륨 용액에서 98 ℃에서 30분간 2회 정련을 하였다. 정련을 한 후, 4.8 L의 염산 수용액(2.7N)에서 110 ℃에서 48시간 동안 가수분해한 후 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 7.1로 중화하였다. 상기 중화액으로부터 염분을 제거한 후 농축 냉동 건조하여, 실크 가수분해물 48.1 g을 수득하였다(비교예 1).

<비교예 2>

탈각 누에고치 150g을 2% 중탄산나트륨용액 1,500 ㎖에 넣고, 1시간 동안 정련하여, 정련 폐액 1,310 ㎖를 수득하였다. 상기 정련 폐액을 마이크로 필터(pore size:20-25㎛)로 여과하여 폐액중에 함유된 이물질을 제거하였다. 이물질이 제거된 폐액을 포피반응기에서 냉각수를 사용하여 25 ℃로 냉각시키면서 2N 염산용액 393㎖를 첨가하여 중화시켰다. 중화 후 마이크로 필터(pore size: 5-10㎛)를 사용하여 중화된 폐액을 여과함으로써, 중화액 속에 침전물로 형성된 세리신을 회수하였다. 상기 회수된 여과물을 증류수로 4회 세척하여, 세리신 속에 묻어 있는 미량의 염화나트륨을 제거하였다. 세척에 의해 염화나트륨을 제거한 후 여과물을 스팀 건조오븐을 이용하여 건조시켜 세리신 31 g을 얻었다.

상기 건조된 세리신 31 g을 1.9 L의 염산 수용액(2.7N)에서 110 ℃에서 48시간 동안 가수분해한 후 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 7.1로 중화하였다. 상기 중화액으로부터 염분을 제거한 후 농축 냉동 건조하여, 실크 가수분해물 25.1 g을 수득하였다(비교예 2).

<비교예 3>

탈각 누에고치 150g을 정련하지 않고, 깨끗한 열수로 30분씩 3회 세척을 하였다. 세척된 누에고치를 원심분리하여 탈수를 하고, 함수율이 10 %이하가 되도록 건조시켰다. 상기 건조된 누에고치 141 g을 9.3 L의 염산 수용액(2.7N)에서 110 ℃에서 48시간 동안 가수분해한 후 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 7.1로 중화하였다. 상기 중화액으로부터 염분을 제거한 후 농축 냉동 건조하여, 실크 가수분해물 98.7 g을 수득하였다(비교예 3).

<실험예 1>

Histopaque(Sigma, 미국) 및 human NK Cell Isolation Kit(Miltenyi, 독일)를 이용하여 인간 말초혈액으로부터 자연살해세포를 분리하고, 이를 원심분리하여 -70 ℃에서 보관하였다. 상기 자연살해세포에 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3의 실크 가수분해물을 각각 12.5 ㎍/㎖ 및 25 ㎍/㎖씩 처리하고, 5일 후 자연살해세포의 증식 여부를 확인하였다. 이때, 상기 자연살해세포의 증식 여부는 자연살해세포의 활성화 표면 단백질인 NKG2D의 발현량을 통하여 확인하였으며, 구체적으로는 형광물질(phycoerythrin(PE))이 붙은 마우스 항 인체 NKG2D 항체(BD pharmingen, 미국)를 이용하여 NKG2D의 발현량을 측정하였다.

그 결과, 실크 가수분해물들은 대체로 자연살해세포 증식능을 가지며, 25 ㎍/㎖을 처리시, 12.5 ㎍/㎖ 처리한 때보다 자연살해세포가 더욱 증식하는 것으로 확인되었다. 특히 실크 단백질을 1차 중화 및 역중화시켜 제조한 실시예 1 내지 3의 자연살해세포 증식능이 뛰어났으며, 그 중에서도 정련 누에고치를 사용한 실시예 1이 제일 높은 효과를 보였다(표 1, 도 1).

자연살해세포 증식능(%, relative to control)

<실험예 2>

림포마 암세포주(Daudi 및 Raji, ATCC, 미국)들은 RPMI 1640에서 배양하였으며, CFSE를 이용하여 형광 표지하였다.

인간 말초혈액으로부터 Histopaque(Sigma, 미국) 및 human NK Cell Isolation Kit(Miltenyi, 독일)를 이용하여 자연살해세포를 분리하고, 이를 원심분리하여 -70 ℃에서 보관하였다. 상기 자연살해세포에 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3을 50 ㎍/㎖씩 처리하거나, 상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3을 50 ㎍/㎖씩 10 ng/㎖의 IL-15와 함께 처리하였다. 또한 IL-15 10 ng/㎖만을 자연살해세포에 처리하였으며, 그 외 대조군으로는 무처리 자연살해세포를 사용하였다.

상기 실크 가수분해물 및/또는 IL-15 등이 처리된 자연살해세포들 및 대조군을 상기 림포마 암세포주들과 함께 동량으로 배양하고, 배양 2시간 후 7-ADD(BD pharmingen^？을 첨가하고, 그로부터 2시간 후 CFSE와 7-AAD가 동시에 염색된 세포를 유세포 분석기(ELITE ESP, USA)를 이용하여 사멸한 암세포의 수를 측정하고, 암세포 사멸율을 분석하였다.

그 결과, 정련 누에고치를 사용한 실시예 1이 제일 높은 항암 활성을 갖는 것으로 확인되었다(표 2, 도 2).

<실험예 3>

Histopaque(Sigma, 미국) 및 human NK Cell Isolation Kit(Miltenyi, 독일)를 이용하여 인간 말초혈액으로부터 자연살해세포를 분리하고, 이를 원심분리하여 -70 ℃에서 보관하였다. 상기 실험예 2에서 항암 활성이 가장 높은 것으로 확인된 실시예 1의 실크 가수분해물을 사용하여, IL-15 외의 사이토카인과의 복합 사용 시 항암활성 증가 여부를 측정하였다.

이를 구체적으로 살펴보면, 상기 자연살해세포에 사이토카인을 단독 처리하거나 25㎍/ml의 실시예 1의 실크 가수분해물과 함께 처리하고, 동량의 암세포주와 함께 배양하여, 유세포 분석기를 이용하여 암세포 사멸능을 측정하여 수행하였다. 이때, 사이토카인으로는 0.5ng/ml의 IL-2, 1000u/ml의 IL-6, 5ng/ml의 IL-12, 50ng/ml의 IL-18, 1ng/ml의 IFN-γ을 사용하였으며, 이들을 각각 폐암 세포주인 A549에 처리하였다.

그 결과, 각 사이토카인의 단독 사용시보다, 실시예 1의 실크 가수분해물와의 복합 사용 시 암세포 사멸능이 유의적으로 증가하는 것으로 확인되었다(표 3 및 도 3).

<실험예 4>

상기 실험예 2에서 항암 활성이 가장 높은 것으로 확인된 실시예 1의 실크 가수분해물을 사용하여, 암세포의 종류에 따른 항암활성 여부를 측정하였다. 이를 구체적으로 살펴보면, 실험예 2의 방법과 동일한 방법을 사용하여 말초혈액으로부터 자연살해세포를 분리하고, 10ng/ml의 IL-15를 자연살해세포에 단독처리, 또는 10ng/ml의 IL-15와 실시예 1의 실크 가수분해물 25㎍/ml를 복합 처리하여, 동량의 암세포주와 함께 배양하여 2 시간 후 유세포 분석기를 사용하여 항암 효과를 확인하였다. 이때 사용한 암세포주는 간암세포주 Hep3B, 위암세포주 SNU0719, 자궁암세포주 HeLa, 유방암 세포주인 MCF-7 및 대장암세포주인 HT-29이었다. 각 실험군들의 암세포 사멸능은, 실크 가수분해물 및 사이토카인을 처리하지 않은 자연살해세포와 각각의 암세포주를 배양시 암세포 사멸능을 control로 하고, 이에 대한 실험군들의 상대적인 암세포 사멸능으로 나타내었다.

상기 암세포주들은 한국세포주은행에서 분양 받아 실험에 사용하였으며, 위암세포주인 SNU-719, 대장암세포주인 HT-29, 자궁암세포주 HeLa는 RPMI-1640 배지에 10% FBS를 첨가하고 1% penicillin-streptomycin, 2-mercaptoethanol 250㎕를 첨가하여 실험에 사용하였고, 유방암 세포주인 MCF-7과 간암세포주인 Hep3B 세포는 DMEM 배지에 10% FBS를 첨가하고 1% penicillin-streptomycin, 2-mercaptoethanol 250㎕를 첨가하였다. 세포배양은 T-75 culture flask 에 이식하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 수행하였다.

또한 위의 세포주들은 일주일에 2~3회 정도 새로운 배지로 교환하고 flask에 암세포주가 5ⅹ10⁴ cells/ml 정도로 증식되면 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.0)으로 2번 세척한 후 trypsin-EDTA를 처리하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 배양액으로 암세포가 골고루 분산되도록 희석하여 T-75 culture flask에 10ml씩 분주하여 4~5일마다 계대배양하며 실험에 사용하였다.

그 결과 림프종과 폐암 이외의 암세포주에서도 사이토카인을 단독 처리 시 보다 실시예 1의 실크 가수분해물을 함께 처리 하였을 시 암세포에 대한 자연살해세포의 살상력이 유의적으로 증가한다는 것을 알 수 있었다(표 4).

Claims (12)

1) 누에고치 또는 부잠사를 정련하여 세리신을 제거하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조된 정련물을 세척 및 탈수하고, 이를 건조시킨 다음 가수분해하는 단계;
3) 상기 가수분해한 정련물을 33% 수산화나트륨 용액을 사용하고, pH9.2~9.3을 1차 중화점으로 하여 1차 중화시키고, 중화 후 MCPD와 DCP류의 물질생성을 억제하도록 4시간을 교반하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 제조된 1차 중화물을 pH7.4~7.6으로 역중화시키는 단계;
5) 상기 단계 4)에서 제조된 역중화물을 탈색 및 탈취하는 단계;
6) 상기 탈색 및 탈취된 역중화물을 여과하는 단계;
7) 상기 여과물을 탈염하는 단계;
8) 상기 탈염된 여과물을 농축하는 단계;및
9) 상기 농축물을 건조시키는 단계를 포함하는 암 예방 또는 개선능을 갖는면역력 증강용 식품 조성물의 제조 방법.

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