KR20230064952A - 생리 활성을 갖는 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 생리 활성을 갖는 신규 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 펩타이드는 연골세포에서 관절의 구성성분의 증가를 유도하고, 중간엽 줄기세포의 연골분화와 세포외 매트릭스의 생성을 증가시킬 뿐만 아니라, 염증성 사이토카인이나 염증성 단백질의 증가를 억제하고, 또한 파골세포의 분화 및 형성을 억제할 수 있으므로, 연골을 재생하거나, 염증성 질환 또는 골다공증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물이나 상기 증상을 개선하기 위한 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생리 활성을 갖는 펩타이드 및 그의 용도{Peptide Having Physiological Activity and Use Thereof}
본 발명은 다양한 생리 활성을 갖는 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 척추동물의 관절을 이루는 연골 조직에는 혈관, 신경 및 임파조직이 없어서 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골 조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성 관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다. 그러므로 손상된 관절 연골은 스스로 회복 및 재생이 매우 제한될 수 밖에 없다. 의학적으로 여러 가지 방법이 도모되지만 아직 관절 연골인 초자연골을 자연과 같은 상태로 회복하기에는 부족한 실정이다.
임상적으로 연골을 재생시키는 수술 방법으로는 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 방법, 골 연골 이식술(osteochondral transplantation)로 자가 혹은 동종의 연골조직을 연골 결손 부위에 이식하는 방법, 미세 골절술(microfracture)로 손상된 연골을 잘 긁어내어 제거하고 연골하골이 노출되면 여기에 일정한 간격으로 구멍을 뚫고 이를 통해서 흘러나온 골수세포가 연골 조직으로 재생되는 것을 도모하는 방법, 연골세포 이식술(chondrocyte transplantation)로 연골 결손부위에 연골세포를 이식함으로써 연골 재생을 유도하는 방법, 손상된 관절 연골의 치료를 위해 자기유래 연골세포 이식술을 이용하는 방법 등이 사용되고 있다.
그러나, 상기 방법들을 이용할 경우 연골세포를 채취할 때나 체외에서 배양된 연골세포를 다시 관절 연골손상 부위에 이식할 때 각각 수술이 필요하므로, 결국 2차례에 걸친 수술에 의해 환자의 고통, 후유증 및 경제적 부담이 크며, 시술 과정 또한 복잡하다. 또한, 채취된 연골세포는 대부분은 이미 성장이 다 이루어진 성인으로부터 얻은 것이므로, 채취된 세포의 증식 및 성장이 왕성하지 않아 세포의 체외 배양 시 이식에 필요한 만큼의 세포 수를 얻기까지 상당한 기간이 걸리며, 세포가 분화능력을 잃어 아예 증식하지 않는 경우에는 치료 자체가 이루어질 수 없고, 연골세포를 체외에서 배양하기 때문에 세포의 표현형이 변화되곤 하는 문제점이 있으므로, 보다 효과적으로 연골 조직을 재생할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 염증 반응(inflammation)은 조직이나 세포에 손상 또는 상처가 발생하거나 외부감염원(바이러스, 박테리아, 곰팡이, 알레르기 유발물질 등)에 의해 감염되어 나타나는 생체 조직의 방어 반응의 일종으로, 손상된 부위나 감염된 부위를 중심으로 모여드는 각종 면역 반응에 관여하는 면역 세포와 이들이 분비하는 염증 인자들에 의해 발생하는 일련의 복합적인 상태를 의미한다.
현재 알려진 염증성 질환의 치료제로는 부신피질 호르몬 성분을 이용한 덱사메타손, 코티손 등이 있으나, 이들의 경우 치료제로서의 활성은 있으나 독성이 강하고 부종과 같은 부작용을 유발할 수 있는 문제점이 있다. 또한, 염증을 유발한 원인에 대하여 선택적인 작용을 하는 것이 아니므로, 심한 수준의 면역 억제 현상이 발생할 수 있어 문제가 발생할 수 있다는 점이 보고되어 왔다. 상기와 같이 스테로이드 성분을 이용한 약제를 이용하여 염증성 질환을 치료하고자 하는 데에는 부작용과 문제점들이 수반되므로, 비스테로이드 성분의 약제를 이용하여 부작용이 없으면서 안정적인 염증 억제 치료 효과를 낼 수 있는 염증성 질환의 치료제 개발이 시급한 실정이다.
아울러, 현재 골다공증의 치료제로서 골흡수를 억제하거나 골형성을 촉진하는 다양한 종류의 화합물들이 공개되어 있으나, 이러한 종래 치료제들은 독성 및 부작용이 있는 경우가 많아 이를 대체할 신물질의 개발이 요구되고 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1957230호 대한민국 공개특허공보 제1996-0021028호 대한민국 등록특허공보 제10-0484319호
본 발명의 목적은 다양한 생리 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 연골 재생용, 또는 염증성 질환 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 연골 재생용, 또는 염증성 질환 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 연골 재생 활성, 항염증 활성, 골다공증 억제 활성 등과 같은 다양한 생리 활성을 가질 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 줄기세포, 예컨대 제대혈 유래 줄기세포, 말초혈액 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진할 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 연골세포에서 세포외 매트릭스(Extracellular Matrix, ECM)의 합성을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 연골세포에서 콜라겐 타입 II(COL2A1), COMP(Cartilage Oligomeric Matrix Protein), PCP(Proteoglycan Core Protein) 등과 같은 ECM의 생성과 연관된 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있다. 상기 염증성 사이토카인로는 TNFα, IL-6, IL-17, IL-1β, IFNγ를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는, 예컨대 대식세포로부터 파골세포로의 분화를 촉진할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용, 또는 염증성 질환 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용, 또는 염증성 질환 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 연골세포에서 관절의 구성성분의 증가를 유도하고, 중간엽 줄기세포의 연골분화와 세포외 매트릭스(Extracellular Matrix, ECM)의 생성을 증가시키며, 염증성 사이토카인이나 염증성 단백질의 증가를 억제하고, 또한 파골세포의 분화 및 형성을 억제할 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 연골을 재생하거나, 염증성 질환 또는 골다공증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물이나 상기 증상을 개선하기 위한 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 본 기술분야의 통상의 기술자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 펩타이드가 연골세포에서 ECM의 합성에 미치는 영향을 보여주는 알시안 블루(Alcian blue) 염색 사진으로서, Non은 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 펩타이드가 연골세포에서 ECM 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진 및 그래프로서, Non은 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 펩타이드가 연골세포에서 ECM의 합성의 조절인자인 SOX5, SOX6 및 SOX9 단백질의 생산에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진 및 그래프로서, (A), (B), 및 (C)는 각각 본 발명의 펩타이드 처리 3일, 5일, 및 7일 후의 결과이며, Non은 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 펩타이드가 연골세포의 3차원 배양에서 ECM 분자의 합성에 미치는 영향을 보여주는 툴루이딘 블루(Toluidine blue) 및 알시안 블루 염색 사진으로서, Non은 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 펩타이드가 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)의 연골세포로의 분화 및 ECM의 생성에 미치는 영향을 보여주는 알시안 블루 염색 사진이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드가 중간엽 줄기세포에서 ECM 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진 및 그래프로서, (A), (B), 및 (C)는 각각 본 발명의 펩타이드 처리 3일, 7일, 및 14일 후의 결과이며, Non은 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 펩타이드가 중간엽 줄기세포에서 ECM의 합성의 조절인자인 SOX9 단백질의 생산에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진 및 그래프로서, (A), (B), 및 (C)는 각각 본 발명의 펩타이드 처리 3일, 7일, 및 14일 후의 결과이며, Non은 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군을 나타내고, CM은 양성 대조군을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 펩타이드가 염증 반응이 유도된 대식세포에서 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진 및 그래프로서, CON은 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 펩타이드가 염증 반응이 유도된 대식세포에서 염증성 단백질인 COX의 생산에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진 및 그래프이다.
도 10은 본 발명의 펩타이드가 대식세포로부터 파골세포로의 분화에 미치는 영향을 보여주는 염색 사진 및 그래프로서, Non은 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 펩타이드가 대식세포로부터 파골세포로의 분화에 필수적인 액틴 고리(actin ring)의 형성에 미치는 영향을 보여주는 면역형광 염색 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 본 발명의 펩타이드
본 발명은 유용한 생리 활성, 예컨대 연골 재생 활성, 항염증 활성, 또는 골다공증 억제 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
상기 펩타이드는 펩타이드 결합으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미하는데, 펩타이드 자체 크기가 너무 크면 표적 조직 또는 세포에 효과적으로 유입되지 못하거나 반감기가 짧아 단기간에 체내에서 소멸되는 단점이 있으므로, 본 발명의 펩타이드는 20개 이하, 예컨대 15개 이하, 또는 12개 이하의 아미노산으로 이루어진다.
본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 유용한 생리 활성, 예컨대 연골 재생 활성, 항염증 활성, 또는 골다공증 억제 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 변형되어 서열번호 1과 상이한 서열을 갖는 아미노산의 변이체들 또는 단편들도 모두 본 발명의 펩타이드에 포함될 수 있다. 상기 펩타이드의 생리 활성, 예컨대 연골 재생 활성, 항염증 활성, 또는 골다공증 억제 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 본 기술분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 예컨대, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 펩타이드는 본 기술분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보(in vivo)에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, "연골 재생 활성"은 연골의 형성에 필요한 일련의 생체내 또는 시험관내 활성을 제한없이 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 연골 재생 활성은 연골세포에서 연골을 구성하는 성분, 예컨대 ECM의 합성을 촉진하는 활성을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 연골 재생 활성은 연골세포에서 ECM 조절인자의 발현을 증가시키는 활성을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 연골 재생 활성은 줄기세포, 예컨대 제대혈 유래 줄기세포, 말초혈액 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진하는 활성을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 연골 재생 활성은 연골세포 또는 줄기세포, 바람직하게는 중간엽 줄기세포에서 ECM 및 ECM 조절 인자의 생성을 촉진하거나, 이와 관련된 유전자의 발현을 촉진하는 활성을 포함할 수 있다.
본 발명의 펩타이드가 갖는 연골 재생 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 인간 연골세포에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 처리하여 ECM의 형성을 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드의 처리에 의해 연골세포의 ECM 생성이 촉진됨을 확인하였다(도 1 참고).
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 인간 연골세포에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 처리하여 ECM의 형성에 관여하는 유전자의 발현 정도를 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드의 처리에 의해 연골세포에 존재하는 COL2A1, COMP, 및 PCP 유전자의 발현이 촉진됨을 확인하였다(도 2 참고).
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 인간 연골세포에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 처리하여 ECM의 형성을 조절하는 단백질의 발현 정도를 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드의 처리에 의해 연골세포에서 ECM의 형성에 관여하는 다양한 신호전달 단백질의 발현을 증가시킴을 확인하였다(도 3 참고).
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 인간 연골세포의 3차원 배양에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 처리를 통한 ECM의 형성을 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드의 처리에 의해 연골세포에서 ECM의 형성에 관여하는 신호전달 단백질의 생성이 증가되었음을 확인하였다(도 4 참고).
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화 및 ECM 생성 여부를 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드의 처리에 의해 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화와 ECM의 생성을 촉진시킴을 확인하였다(도 5 참고).
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 중간엽 줄기세포에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 처리하여 ECM의 생성과 ECM의 형성에 관여하는 유전자의 발현 정도를 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드의 처리에 의해 중간엽 줄기세포에 존재하는 ECM의 생성과 ECM의 생성을 조절하는 유전자 및 단백질의 발현이 촉진됨을 확인하였다(도 6 및 도 7 참고).
한편, 본 발명의 펩타이드는 연골 재생 이외의 생리 활성, 예컨대 항염증 활성을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, "항염증 활성"은 염증을 억제하는 활성을 제한없이 포함하는 의미로 사용되며, 상기 염증은 어떠한 자극에 대한 생체 조직의 방어 반응의 일종으로 조직이나 세포가 손상되거나 외부로부터 유래된 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 알레르기 유발원 등의 다양한 감염원에 감염되었을 때 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미한다. 또한, 상기 염증 반응은 국소 혈관과 체액에 염증 매개 인자와 면역세포가 관련되어 나타나는 효소의 활성화, 염증 매개 물질의 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등의 외적 증상을 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 염증을 억제하는 활성이 있으므로 상기와 같은 일련의 병리적 상태와 증상을 감소시키고 개선할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 염증성 사이토카인 또는 염증성 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 염증 반응에서 상처가 생기거나 상처부위에 침입한 외부 감염체가 체내로 들어왔을 때, 상처부위나 감염체의 주변으로 초기 단계의 면역 반응을 담당하는 백혈구가 모이게 되고, 염증 관련 사이토카인이나 단백질을 발현시켜 분비하여 염증 반응을 유발하게 되므로, 염증성 사이토카인 또는 염증성 단백질의 발현을 억제함으로써 항염증 활성을 나타낼 수 있으며 또한 상기 염증성 사이토카인이나 단백질의 발현량을 확인함으로써, 본 발명의 펩타이드의 항염증 활성과 염증 억제 효과를 확인할 수 있다.
상기 염증성 사이토카인은 TNFα, IL-6, IL-17, IL-1β, 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 TNFα는 '종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor) α'의 약어로 세균의 감염이나 종양 질환에 대한 면역 반응 중에 활성화되는 대식세포 및 다양한 세포로부터 생성되어 분비되는 사이토카인으로, 염증 반응의 주요한 매개체로 알려져 있으며, 류마티스성관절염(RA), 건선성 관절염, 크론병, 건선, 강직성척수염(AS)과 같은 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다. 상기 IL-6(interleukin 6)는 대식세포와 다양한 림프구 등에서 생산되는 사이토카인으로 염증 반응을 촉진하는 역할을 하며 과다하게 생성될 경우 염증성 질환을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기 IL-17(interleukin 17)도 마찬가지로 염증 촉진 사이토카인에 해당하며 Th17 세포로부터 생성되어 염증 반응을 유발하거나 매개하는 역할을 하게 된다. 상기 IFNγ(interferon γ)는 T 림프구와 대식세포에서 생성될 수 있고 외부로부터 침입한 바이러스나 세균의 감염에 대응하여 분비되며 자가면역 또는 자가염증 질환과 관련하여 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 상기와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 발현된 사이토카인의 분비를 억제하는 활성을 통해 염증을 억제하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 Cox2의 발현을 억제할 수 있다. 상기 Cox2(cyclooxygenase 2)는 프로스타글란딘의 생합성 과정을 자극하여 관여하는 효소로, NF-κB에 의해 조절되어 발현될 수 있으며 염증 반응을 조절한다. Cox2는 정상 상태에서는 거의 발현되어 있지 않으나, 사이토카인, 염증인자, 엔도 톡신 등의 자극에 의하여 급격하게 발현되는 단백질인바, Cox2 유전자의 발현량이나 Cox2 단백질의 양을 확인함으로써, 본 발명의 펩타이드의 항염증 활성을 확인할 수 있으며, 본 발명의 펩타이드는 Cox2의 발현을 억제함으로써 염증을 억제하는 효과를 나타낸다.
본 발명의 펩타이드가 갖는 염증 억제 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서는 마우스 대식세포에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 함께 염증 유도 사이토카인을 처리하여 Cox2 단백질의 양을 확인한 결과, 상기 처리된 염증 유도 사이토카인에 의하여 세포의 염증 반응이 유도되었음에도, Cox2 단백질의 양이 본 발명의 펩타이드 처리에 따라 감소하였음을 확인하였다(도 8 참고).
또한, 본 발명의 상기 펩타이드 처리에 따른 염증 관련 유전자의 발현량 감소 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서는 마우스 대식세포에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 함께 염증 유도 사이토카인을 처리하여 TNFα, IL-1β, Cox2 유전자의 mRNA 양을 확인한 결과, 상기 처리된 염증 유도 사이토카인에 의하여 세포의 염증 반응이 유도되었음에도, 상기와 같은 염증 유도 사이토카인이나 관련 효소 유전자의 발현량이 본 발명의 펩타이드 처리에 따라 감소하였음을 확인하였다(도 9 참고).
따라서, 본 발명의 상기 펩타이드는 염증 반응을 촉진할 수 있는 TNFα, IL-6, IL-17, IL-1β 및 IFNγ와 같은 염증성 사이토카인의 발현이나 분비를 감소시키고, Cox2와 같은 염증 관련 인자의 발현을 억제함으로써 염증 반응을 감소시키고 개선할 수 있는 항염증 활성을 가짐이 분명하고, 따라서 본 발명의 상기 펩타이드는 염증에 의해 유발되거나 염증 반응을 수반하는 염증성 질환의 예방이나 치료, 개선을 위한 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명의 펩타이드는 연골 재생 이외의 생리 활성, 예컨대 파골세포 억제 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 마우스 대식세포에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 함께 파골세포로의 분화를 유도하는 RANKL(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B ligand)을 처리하여, 파골세포로의 분화 및 파골세포 분화와 관련된 단백질의 활성을 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드 처리에 따라 파골세포로의 분화 및 이와 관련된 단백질의 발현이 감소하였고, 또한 파골세포의 분화에 필수적인 액틴 고리의 형성을 억제하였음을 확인하였다(도 10 및 도 11 참고).
파골세포의 활성 증가는 골다공증과 밀접한 관련이 있으며, 따라서 본 발명의 펩타이드는 파골세포의 활성을 억제함으로써 골다공증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
2. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물
본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 상기 '1. 본 발명의 펩타이드' 항목에서 설명한 펩타이드와 동일한바, 구체적인 설명은 위 '1. 본 발명의 펩타이드' 항목을 원용하고, 이하에서는 약학적 조성물에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 펩타이드는 연골 재생을 촉진하는 효과가 있는바, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 연골을 재생하기 위한 용도로 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 펩타이드는 염증 관련 사이토카인이나 염증 관련 인자의 발현 또는 분비를 저해하는 효과가 있는바, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염증성 질환을 예방하거나 치료하는 용도로 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 펩타이드는 파골세포의 분화 및 활성을 억제하는 효과가 있는바, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 골다공증을 예방하거나 치료하는 용도로 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 백혈구 중에서 호중구 주화성(neutrophil chemotaxis)에 의해 유발되는 염증을 발생시키는 병적 상태를 가리킬 수 있으며, 염증 반응에 의해 발병하거나 염증 반응을 수반하는 어떠한 질병도 제한없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 염증성 질환은 비염, 기관지염, 치주염, 췌장염, 위염, 위궤양, 염증성 피부질환, 아토피 피부염, 엔세필리티스(encephilitis), 패혈증, 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크로씨병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병 또는 다발경화증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 연골의 재생을 촉진하거나, 염증 반응을 유발하는 인자의 발현이나 분비를 억제함으로써 염증성 질환이 발생하지 않도록 예방하거나, 파골세포의 분화를 억제함으로써 골다공증이 발생하지 않도록 예방하거나, 상기 염증성 질환 환자의 손상되거나 상처가 발생한 세포에서 추가적으로 발생하는 염증 반응이나 골다공증 환자에서 파골세포로의 분화를 억제함으로써, 병세의 악화를 저해하고 질환을 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물이 포함하는 상기 펩타이드는 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 염증성 질환의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 일례로 본 발명의 펩타이드를 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.0001 ㎍ 내지 500 ㎎, 예컨대 0.01 ㎍ 내지 100 ㎎ 투여할 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 예컨대 하루 2회 내지 3회 분할 투여될 수 있다.
3. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 건강기능식품
본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 상기 '1. 본 발명의 펩타이드' 항목에서 설명한 펩타이드와 동일한바, 구체적인 설명은 위 '1. 본 발명의 펩타이드' 항목을 원용하고, 이하에서는 건강기능식품의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
상기 약학적 조성물에서와 마찬가지로, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 연골의 재생이나 염증성 질환 또는 골다공증의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품에서, 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들면, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
[실시예 1] 펩타이드의 제작
자동 펩타이드 합성기(Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기의 표 1에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(Waters Associates, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 ㎜×100 ㎜, 1.7 ㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.
서열번호 펩타이드 서열
1 NAISVLYFDDS
[실험예 1] 펩타이드 처리에 따른 연골세포의 ECM 생성 촉진 확인
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 펩타이드 처리에 따른 연골 재생 효과를 확인하기 위하여, 인간 유래 연골세포에서 서열번호 1의 펩타이드를 처리한 후, ECM의 구성성분인 글리코사미노글리칸 형성의 증가 여부를 확인하였다.
이를 위하여, 인간 C28/I2 연골세포주를 3×103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 DMEM 배지(cat. 11995-065, Gibco)에서 배양하였다. 새로운 배지로 교체한 후, 서열번호 1의 펩타이드를 30, 50, 100 및 150 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 3일에 한번씩 배지를 교환하면서 서열번호 1의 펩타이드를 상기 농도 별로 처리하였다. 7일에 배지를 제거한 후, 3.7% 포르말린 60 ㎕를 염색할 96-웰 플레이트에 넣고 1분 동안 고정하였다. 상기 3.7% 포르말린을 제거한 후, 70 ㎕의 알시안 블루 염색 용액(3% 아세트산 50 ㎖ + 1% 아시안 블루 8GX 0.5 g, pH 2.5)을 넣었고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상기 염색 용액을 제거하였고, 3차 증류수로 세척 및 건조시킨 후, 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 연골세포에서 ECM의 생성을 촉진시켰음을 확인하였다(도 1 참고).
[실험예 2] 펩타이드 처리에 따른 연골세포의 ECM 유전자 발현 촉진 확인
인간 유래 연골세포에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 처리한 후, ECM의 구성성분인 콜라겐 타입 II(COL2A1, Collagen type II), 연골 올리고머성 매트릭스 단백질(COMP, Cartilage oligomeric matrix protein), 프로테오글리칸 코어 단백질(PCP, proteoglycan core protein)과 대조군인 GAPDH 유전자의 mRNA 발현 증가 여부를 확인하였다.
이를 위하여, 인간 C28/I2 연골세포주를 8.9×104 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 DMEM 배지(cat. 11995-065, Gibco)에서 배양하였다. 새로운 배지로 교체한 후, 서열번호 1의 펩타이드를 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 3일에 한번씩 배지를 교환하면서 서열번호 1의 펩타이드를 상기 농도 별로 처리하였다. 9일에 배지를 제거한 후, 세포를 수확하고 RNA를 단리하였다. cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용해 cDNA를 합성한 후, PCR 프리-믹스(Intron, Korea)를 이용해 콜라겐 타입 II, COMP, PCP 및 GAPDH 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 상기 콜라겐 타입 II, COMP, PCP 및 GAPDH에 특이적인 프라이머는 하기 표 2 나타낸 바와 같다:
유전자 프라이머 서열
hCOL2A1 F: CTATCTGGACGAAGCAGCTGGCA (서열번호 2)
R: ATGGGTGCAATGTCAATGATGG (서열번호 3)
hCOMP F: AACTCAGGGCAGGAGGATGT (서열번호 4)
R: TGTCCTTTTGGTCGTCGTTC (서열번호 5)
hPCP F: TGAGTCCTCAAGCCTCCTGT (서열번호 6)
R: GTGCCAGATCATCACCACAC (서열번호 7)
GAPDH F: ACCACAGTCCATGCCATCAC (서열번호 8)
R: TCCACCACCCTGTTGCTGTA (서열번호 9)
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 연골세포에서 ECM의 생성과 연관된 콜라겐 타입 II, COMP 및 PCP 유전자의 발현을 촉진시켰음을 확인하였다(도 2 참고).
[실험예 3] 펩타이드 처리에 따른 연골세포의 ECM 조절인자의 발현 확인
인간 유래 연골세포에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 처리한 후, ECM의 조절인자인 SOX((sex determining region Y)-box)5, SOX6 및 SOX9 단백질의 발현 증가 여부를 확인하였다.
이를 위하여, 인간 C28/I2 연골세포주를 8.9×104 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 DMEM 배지(cat. 11995-065, Gibco)에서 배양하였다. 새로운 배지로 교체한 후, 서열번호 1의 펩타이드를 30, 50, 100 및 150 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 3일에 한번씩 배지를 교환하면서 서열번호 1의 펩타이드를 상기 농도 별로 처리하였다. 3일, 7일 및 9일에 배지를 제거한 후, 세포를 수확하였고, 세포 파쇄물(lysate)을 준비한 후, 상기 단백질들에 대한 항체를 이용해 웨스턴 블롯(Western Blot)을 수행하였다. 실험에 사용한 항체의 구입처는 다음과 같다: Sox5; Santacruz biotechnology, USA, Sox6; Santacruz biotechnology, USA, Sox9; millipore, USA.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 연골세포에서 ECM의 조절인자인 SOX5, SOX6 및 SOX9 단백질의 발현을 증가시킴을 확인하였다(도 3 참고).
[실험예 4] 펩타이드 처리에 따른 연골세포의 3차원 배양에서 ECM 생성 촉진 확인
인간 유래 연골세포의 3차원 배양에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 처리한 후, ECM의 구성성분인 글리코사미노글리칸의 형성 증가 여부를 확인하였다.
이를 위하여, 인간 C28/I2 연골세포주 3×106 세포를 알기네이트 용액(1.25% 알긴산, 20 mM HEPES, 150 mM Nacl, pH 7.4) 1 ㎖에 현탁시켰고, 상기 세포를 함유하는 알기네이트 용액을 중합화 용액(100 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4)에 한 방울씩 떨어뜨려 비드를 만들었다. 만들어진 비드를 DPBS로 2회 세척한 후, DMEM 배지(5% FBS)가 담긴 코니칼 튜브에 상기 비드를 분배하였다. 서열번호 1의 펩타이드를 30, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였고, 3일에 한번씩 배지를 교환하면서 서열번호 1의 펩타이드를 상기 농도 별로 처리하였다. 14일에 배지를 제거한 후, 3.7% 포름알데히드를 넣고 6시간 동안 고정하였다. 조직 처리기(Tissue processor)를 이용하여 탈수시켰고(EtOH 70%, 80%, 90%, 100% I, II, 자일렌 I, II 순으로 30분씩), 임베딩(Embedding)하여 파라핀 블록을 제조하였다. 상기 파라핀 블록을 0.4 ㎛의 두께로 유리 슬라이드 상에 절편화한 후, 24시간 이상 완전히 건조시켰다. 상기 절편을 수화시켰고(자일렌 I, II, EtOH 100% I, II, 90%, 80%, 70% 순으로 3분씩), 흐르는 물에 10초 동안 침지시켜 3회 세척하였다. 1시간 동안 알시안 블루 또는 톨루이딘 블루로 염색한 후, 흐르는 물에 10초 동안 침지시켜 3회 세척하였다. EtOH 90%, 100% I, II에 10초 동안 침지시킨 후, 자일렌 I, II에 3분씩 침지시켰고, 이후 마운팅하였다. 24시간 이상 건조시킨 후 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 연골세포의 3차원 배양에서 ECM의 구성성분인 글리코사미노글리칸의 생성을 촉진시켰음을 확인하였다(도 4 참고).
[실험예 5] 펩타이드 처리에 따른 중간엽 줄기세포의 연골세포 분화 및 ECM 생성 촉진 확인
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 지방 유래 중간엽 줄기세포에 처리한 후, 상기 줄기세포의 연골 분화와 ECM 생성에 미치는 영향을 확인하였다.
이를 위하여, 인간 AD-MSC(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell) 세포를 1.5×103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 DMEM 배지(cat. 11995-065, Gibco)에서 배양하였다. 5% FBS를 함유하는 DMEM 배지로 교체한 후, 서열번호 1의 펩타이드를 30, 50, 100 및 150 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 3일에 한번씩 배지를 교환하면서 서열번호 1의 펩타이드를 상기 농도 별로 처리하였다. 21일에 배지를 제거한 후, 3.7% 포르말린 60 ㎕를 염색할 96-웰 플레이트에 넣고, 1분 동안 고정하였다. 3.7% 포르말린을 제거한 후, 70 ㎕의 알시안 블루 염색 용액(3% 아세트산 50 ㎖ + 1% 알시안 블루 8GX 0.5 g, pH 2.5)을 넣은 후, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상기 염색 용액을 제거하였고, 3차 증류수로 세척 및 건조시킨 후, 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 지방 유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화와, ECM의 구성성분인 글리코사미노글리칸의 생성을 촉진시켰음을 확인하였다(도 5 참고).
[실험예 6] 펩타이드 처리에 따른 중간엽 줄기세포의 ECM 조절인자 및 ECM 유전자 발현 촉진 확인
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 지방 유래 중간엽 줄기세포에 처리한 후, ECM의 생성과 연관된 COL2A1, COMP, 콜라겐 타입 11A(COL 11A), ACP(Aggrecan core protein), PCP, 및 ACAN(aggrecan) 유전자와, ECM의 조절인자인 Sox9 유전자의 발현 증가 여부를 확인하였다.
이를 위하여, 인간 AD-MSC 세포를 1.5×103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지(cat. 11995-065, Gibco)에서 배양하였다. 5% FBS를 함유하는 DMEM 배지로 교체한 후, 서열번호 1의 펩타이드를 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 3일에 한번씩 배지를 교환하면서 서열번호 1의 펩타이드를 상기 농도 별로 처리하였다. 3, 7, 및 11일에 배지를 제거한 후, 세포를 수확하고 RNA를 단리하였다. cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용해 cDNA를 합성한 후, PCR 프리-믹스(Intron, Korea)를 이용해 COL2A1, COMP, Sox9, COL 11A, ACP, PCP, ACAN 및 GAPDH 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 상기 COL2A1, COMP, Sox9, COL 11A, ACP, PCP, ACAN 및 GAPDH 에 특이적인 프라이머는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다:
유전자 프라이머 서열
hCOL2A1 F: CTATCTGGACGAAGCAGCTGGCA (서열번호 2)
R: ATGGGTGCAATGTCAATGATGG (서열번호 3)
hCOMP F: AACTCAGGGCAGGAGGATGT (서열번호 4)
R: TGTCCTTTTGGTCGTCGTTC (서열번호 5)
hSox9 F: GCG GAG GAA GTC GGT GAA GA (서열번호 10)
R: CCC TCT CGC TTC AGG TCA GC (서열번호 11)
hCOL 11A F: CCAGCCCGAACTTGTAAAGA (서열번호 12)
R: TGGACGCACAACCATCATAC (서열번호 13)
hACP F: CACTGTTACCGCCACTTCCC (서열번호 14)
R: ACCAGCGGAAGTCCCCTTCG (서열번호 15)
hPCP F: TGAGTCCTCAAGCCTCCTGT (서열번호 6)
R: GTGCCAGATCATCACCACAC (서열번호 7)
hACAN F: GCAGGCTATGAGCAGTGTGA (서열번호 16)
R: GCATACCTCGGAAGCAGAAG (서열번호 17)
GAPDH F: ACCACAGTCCATGCCATCAC (서열번호 8)
R: TCCACCACCCTGTTGCTGTA (서열번호 9)
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 지방 유래 중간엽 줄기세포에 있어서 ECM의 생성과 연관된 COL2A1, COMP, COL 11A, ACP, PCP, 및 ACAN 유전자와, ECM의 조절인자인 Sox9 유전자의 발현을 촉진시켰음을 확인하였다(도 6 참고).
[실험예 7] 펩타이드 처리에 따른 펩타이드 처리에 따른 중간엽 줄기세포의 ECM 조절인자의 발현 확인
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 지방 유래 중간엽 줄기세포에 처리한 후, ECM의 조절인자인 SOX9 단백질의 발현 증가 여부를 확인하였다.
이를 위하여, 인간 AD-MSC 세포를 1.5×103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지(cat. 11995-065, Gibco)에서 배양하였다. 5% FBS를 함유하는 DMEM 배지로 교체한 후, 서열번호 1의 펩타이드를 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 3일에 한번씩 배지를 교환하면서 서열번호 1의 펩타이드를 상기 농도 별로 처리하였다. 이때, 양성 대조군(CM)으로는 덱사메타손(100 nM) + 아스코르브산(50 μM) + 프롤린(40 μM) + TGFβ1(10 ng/㎖) + 1X ITS를 포함하는 용액을 사용하였다. 3일, 7일 및 14일에 배지를 제거한 후, 세포를 수확하였고, 세포 파쇄물을 준비한 후, 상기 SOX9 단백질에 대한 항체(Millipore, USA)를 이용해 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 ECM의 조절인자인 SOX9 단백질의 생성을 증가시킴을 확인하였다(도 7 참고).
상기와 같은 실험예 1 내지 실험예 7의 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열을 갖는 펩타이드는 연골세포의 활성을 증가시켜 ECM의 합성을 촉진하고, 상기 ECM의 생성과 연관된 유전자 및 ECM 조절인자 유전자의 발현을 증가시키며, 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진하고, 또한 중간엽 줄기세포에서도 ECM의 생성과 연관된 유전자 및 ECM 조절인자 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 뛰어난 연골 재생 효과가 있음을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 더 많은 양으로 처리하는 경우 상기와 같은 효과가 더 높게 나타나는바, 상기 실험예들의 결과에서 볼 수 있는 연골 재생 효과는 본 발명의 펩타이드에 의한 효과임을 알 수 있다.
[실험예 8] TNFα로 염증 유도된 세포에서의 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 확인
상기 실험예 1 내지 실험예 7에서 확인한 연골 재생 활성에 더하여, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 처리에 따른 항염증 효과를 확인하기 위하여, 마우스 RAW264.7 대식세포주를 대상으로 TNFα를 처리하여 염증을 유도하고, 염증성 사이토카인인 TNFα, IL-1β, 염증 유도 마커인 Cox2 유전자의 발현량을 확인하였다. 염증의 유도를 위하여 사이토카인 TNFα를 처리하였으며, TNFα는 염증 반응과 관련된 신호 전달 단백질에 해당하고 IL-1β는 염증 반응을 촉진하는 사이토카인에 해당하며, Cox2는 염증 관련 단백질인바, TNFα, Cox2 및 IL-1β 유전자의 발현량을 측정함으로써 염증 반응의 정도를 확인할 수 있다.
이를 위하여, 마우스 RAW264.7 세포주를 2×105 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 동안 10% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에서 배양하였다. 무혈청 α-MEM 배지(1% 페니실린)로 교체한 후, 6시간 동안 절식시켰다. 서열번호 1의 펩타이드를 100 및 150 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, TNF-α를 20 nM로 처리하였고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 수확하고, RNA를 단리하였다. cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용해 cDNA를 합성한 후, PCR 프리-믹스(Intron, Korea)를 이용해 TNFα, IL-1β, Cox2, 및 GAPDH 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 상기 TNFα, IL-1β, Cox2, 및 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다:
유전자 프라이머 서열
TNFα F: CGT CAG CCG ATT TGC TAT CT (서열번호 18)
R: CGG ACT CCG CAA AGT CTA AG (서열번호 19)
IL-1β F: CAA GGA GAA CCA AGC AAC GA (서열번호 20)
R: TTG GCC GAG GAC TAA GGA GT (서열번호 21)
Cox2 F: TGA GTG GTA GCC AGC AAA GC (서열번호 22)
R: CTG CAG TCC AGG TTC AAT GG (서열번호 23)
GAPDH F: ACCACAGTCCATGCCATCAC (서열번호 8)
R: TCCACCACCCTGTTGCTGTA (서열번호 9)
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 마우스 대식세포에서 염증성 사이토카인의 처리에 의해 유발된 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 억제하였음을 확인하였다(도 8 참고).
[실험예 9] TNFα로 염증 유도된 세포에서의 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 확인
상기 실험예 9의 결과에 더하여 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 처리에 따른 항염증 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 마우스 RAW264.7 대식세포주를 대상으로 TNFα를 처리하여 염증을 유도하고, 염증 유도 마커인 COX2 단백질의 발현량을 확인하였다.
이를 위하여, 마우스 RAW264.7 세포주를 2×105 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 동안 10% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에서 배양하였다. 무혈청 α-MEM 배지(1% 페니실린)로 교체한 후, 6시간 동안 절식시켰다. 서열번호 1의 펩타이드를 100 및 150 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, TNF-α를 20 nM로 처리하였고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 수확하였고, 세포 파쇄물을 준비한 후, 상기 COX2 단백질에 대한 항체(Cell Signaling Technology, USA)를 이용해 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 마우스 대식세포에서 염증성 사이토카인의 처리에 의해 유발된 염증성 단백질의 증가를 억제하였음을 확인하였다(도 9 참고).
상기와 같은 실험예 8 및 실험예 9의 결과를 종합하여 볼 때, 염증 반응이 유도된 세포에서도 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 처리하면 염증 반응과 관련된 단백질의 양이나 유전자의 발현량이 감소되어 염증 반응의 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 더 많은 양으로 처리하는 경우 상기와 같은 효과가 더 높게 나타나는바, 상기 실험예들의 결과에서 볼 수 있는 염증 반응의 억제 효과는 본 발명의 펩타이드에 의한 효과임을 알 수 있다.
[실험예 10] RANKL에 의해 유도된 파골세포 분화 억제 효과 확인
상기 실험예 1 내지 실험예 7에서 확인한 연골 재생 활성과 실험예 8 및 실험예 9에서 확인한 항염증 효과에 더하여, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 처리에 따른 파골세포 분화 억제 효과를 확인하였다.
<10-1> 본 발명의 펩타이드의 파골세포 분화 억제 효과 확인
마우스 RAW264.7 세포주를 1.7×103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 동안 DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 후, RANKL과 함께 서열번호 1의 펩타이드를 10, 30, 30, 100 및 150 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 4일 동안 파골세포의 분화를 유도하였다. 상기 배지를 제거한 후, 30초 동안 고정하였고, 2차 증류수로 2회 세척하였다. 100 ㎕의 TRAP 염색 용액(산 포스파타아제 키트, Sigma aldrich)으로 37℃에서 30분 동안 염색을 진행하였다. 이후, 상기 염색 용액을 제거하였고, 2차 증류수로 2회 세척 및 건조시킨 후, 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 마우스 대식세포에서 RANKL에 의해 유도된 파골세포로의 분화를 억제하였음을 확인하였다(도 10의 (A) 참고).
<10-2> 본 발명의 펩타이드의 세포 독성 확인
CCK-8 분석법을 이용해 본 발명의 펩타이드가 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. CCK-8 시약은 세포의 탈수소화효소에 의해 환원되어 발색 생성물을 생산하게 되며, 이를 이용한 흡광도 차이를 통해 세포의 증식 여부를 확인할 수 있다.
이를 위하여, 마우스 RAW264.7 세포주를 1.7×103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 동안 DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 후, 서열번호 1의 펩타이드를 10, 30, 30, 100 및 150 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 3일 동안 인큐베이션하였다. 상기 배지를 제거한 후, CCK-8 용액(Dojindo, CCK-8 kit)을 배양액에 10배 희석하여 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 인큐베이션하면서, 30분 간격으로 마이크로플레이트 판독기를 이용해 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 처리한 경우 오히려 흡광도가 더 높은 것으로 나타나, 본 발명의 펩타이드가 마우스 대식세포에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 10의 (B) 참고).
<10-1> 본 발명의 펩타이드의 파골세포 분화와 관련된 TRAP 활성 억제 효과 확인
마우스 RAW264.7 세포주를 1.7×103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 동안 DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 후, RANKL과 함께 서열번호 1의 펩타이드를 10, 30, 30, 100 및 150 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 4일 동안 파골세포의 분화를 유도하였다. 100 ㎕의 TRAP 활성 용액(TRAP 버퍼(0.1 sodium citrate + 50 μM sodium tartrate [pH 5.0]) 15 ㎖ + 4-Nitrophenly phosphate disodium salt hexahydrate, sigma, 1 tablet mix)을 처리한 후, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 10 ㎕의 2 N NaOH를 처리하였다. 플레이트 판독기를 이용해 405 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 마우스 대식세포에서 파골세포의 마커인 TRAP의 활성을 농도 의존적으로 억제하였음을 확인하였다(도 10의 (C) 참고).
[실험예 11] RANKL에 의해 유도된 파골세포의 액틴 고리 형성 억제 확인
상기 실험예 10의 결과에 더하여 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 처리에 따른 파골세포 분화 억제 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 마우스 RAW264.7 대식세포주를 대상으로 RANKL을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도하고, 본 발명의 펩타이드가 파골세포의 분화에 필수적인 액틴 고리(actin ring)의 형성을 억제하는지 여부를 확인하였다.
이를 위하여, 마우스 RAW264.7 세포주를 5×103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 동안 DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 후, RANKL과 함께 서열번호 1의 펩타이드를 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 4일 동안 파골세포의 분화를 유도하였다. 상기 배지를 제거한 후, 냉각된 PBS로 3회 세척하였고, 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정하였다. 냉각된 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, PBS 내의 0.3% Triton X-100으로 30분 동안 침투시켰다. 냉각된 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, PBS 내의 여과된 3% BSA로 1시간 동안 교반 하에 블록킹하였다. 차단 배지로 1:100으로 희석된 1차 항체(Rhodamin (Red) [Invitrogen™])로 2시간 동안 교반 하에 인큐베이션하였다. 빛을 차단하고 PBS로 15분동안 교반 하에 3회 세척한 후, DAPI 마운팅 배지(VECTASHIELD® MOUNTING MEDIUM with DAPI)를 첨가하였고, 각각의 웰에 커버 슬립을 덮은 후, 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 마우스 대식세포에서 파골세포로의 분화에 필수적인 액틴 고리의 형성을 억제하였음을 확인하였다(도 11 참고).
상기와 같은 실험예 10 및 실험예 11의 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 파골세포로의 분화를 억제할 수 있고, 이를 통해 골다공증의 예방 또는 치료에 적용될 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 더 많은 양으로 처리하는 경우 상기와 같은 효과가 더 높게 나타나는바, 상기 실험예들의 결과에서 볼 수 있는 파골세포 분화 억제 효과는 본 발명의 펩타이드에 의한 효과임을 알 수 있다.
[제조예 1] 약학적 조성물의 제조
<1-1> 산제의 제조
실시예 1의 펩타이드 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
실시예 1의 펩타이드 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
실시예 1의 펩타이드 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
실시예 1의 펩타이드 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
실시예 1의 펩타이드 150 ㎎
대두 추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
[제조예 2] 건강기능식품 조성물의 제조
<2-1> 밀가루 식품의 제조
실시예 1의 펩타이드 0.5 ∼ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
<2-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조
실시예 1의 펩타이드 0.1 ∼ 5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
<2-3> 유제품의 제조
실시예 1의 펩타이드 5 ∼ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<2-4> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 실시예 1의 펩타이드를 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부), 종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부), 실시예 1의 펩타이드(3 중량부), 영지(0.5 중량부), 지황(0.5 중량부)
<2-5> 건강음료의 제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 실시예 1의 펩타이드 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
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Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 연골 재생 활성, 항염증 활성, 및 골다공증 억제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생리 활성을 갖는 펩타이드.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진하는 펩타이드.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포, 말초혈액 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 펩타이드.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 연골세포에서 세포외 매트릭스(Extracellular Matrix, ECM)의 합성을 증가시키는 펩타이드.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 연골세포에서 콜라겐 타입 II(COL2A1), COMP(Cartilage Oligomeric Matrix Protein), 및 PCP(Proteoglycan Core Protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 펩타이드.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 펩타이드.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인은 TNFα, IL-6, IL-17, IL-1β 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 펩타이드.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 대식세포로부터 파골세포로의 분화를 억제하는 펩타이드.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 약학적 조성물.
  11. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 건강기능식품.
  14. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  15. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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