KR101110598B1 - Ａｋｔ 활성의 억제제 - Google Patents

Ａｋｔ 활성의 억제제 Download PDF

Info

Publication number
KR101110598B1
KR101110598B1 KR1020097011729A KR20097011729A KR101110598B1 KR 101110598 B1 KR101110598 B1 KR 101110598B1 KR 1020097011729 A KR1020097011729 A KR 1020097011729A KR 20097011729 A KR20097011729 A KR 20097011729A KR 101110598 B1 KR101110598 B1 KR 101110598B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
phenyl
alkyl
cancer
compounds
akt
Prior art date
Application number
KR1020097011729A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090086095A (ko
Inventor
마이클 제이. 3세 켈리
마크 이. 레이튼
필립 이. 샌더슨
Original Assignee
머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 filed Critical 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Publication of KR20090086095A publication Critical patent/KR20090086095A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101110598B1 publication Critical patent/KR101110598B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D471/14—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

본 발명은 Akt 활성을 억제하는 치환된 나프티리딘 화합물을 제공한다. 특히, 기술된 화합물은 하나 또는 2개의 Akt 동형을 선택적으로 억제한다. 본 발명은 또한 이러한 억제성 화합물을 포함하는 조성물 및 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 당해 화합물을 투여함으로써 Akt 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
치환된 나프티리딘 화합물, Akt 활성의 억제, Akt 억제제, 암의 치료

Description

Ａｋｔ 활성의 억제제{Inhibitors of Akt activity}
본 발명은 세린/트레오닌 키나제, Akt(또한 PKB로 공지됨; 이하, "Akt"로 언급됨)의 동형(isoform) 중 하나 이상의 활성의 억제제인 치환된 나프티리딘 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 암의 치료시 당해 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
아폽토시스(apoptosis)(프로그램화된 세포 사멸)는 배아 발생 및 퇴행성 신경병, 심혈관병 및 암과 같은 각종 질병의 발병기전에 있어 필수적인 역할을 한다. 최근 연구는 프로그램화된 세포 사멸을 조절하거나 수행하는데 관련된 각종 아폽토시스-촉진 및 항-아폽토시스 유전자 생성물의 확인을 가져왔다. Bcl2 또는 Bcl-xL과 같은, 항-아폽토시스 유전자의 발현은 각종 자극에 의해 유발된 아폽토시스성 세포 사멸을 억제한다. 한편, Bax 또는 Bad와 같은 아폽토시스-촉진 유전자의 발현은 프로그램화된 세포 사멸을 초래한다[참조: Adams et al. Science, 281:1322-1326 (1998)]. 프로그램화된 세포 사멸의 수행은 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8 및 카스파제-9 등을 포함하는, 카스파제-1 관련 프로테이나제에 의해 매개된 다[참조: Thornberry et al. Science, 281:1312-1316 (1998)].
포스파티딜이노시톨 3'-OH 키나제(PI3K)/Akt 경로는 세포 생존/세포 사멸을 조절하는데 중요한 것으로 여겨진다[참조: Kulik et al. Mol. Cell. Biol. 17:1595-1606 (1997); Franke et al, Cell, 88:435-437 (1997); Kauffmann-Zeh et al. Nature 385:544-548 (1997) Hemmings Science, 275:628-630 (1997); Dudek et al., Science, 275:661-665 (1997)]. 혈소판 기원 성장 인자(PDGF), 신경 성장 인자(NGF) 및 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1)과 같은 생존 인자들은 PI3K의 활성을 유도함으로써 각종 조건하에서 세포 생존을 촉진한다[참조: Kulik et al. 1997, Hemmings 1997]. 활성화된 PI3K는 포스파티딜이노시톨(3,4,5)-트리포스페이트(PtdIns(3,4,5)-P3)의 생산을 초래하며, 이는 이어서 플렉스트린(pleckstrin) 동족체(PH)-도메인을 함유하는 세린/트레오닌 키나제 Akt에 결합하여 이의 활성을 촉진한다[참조: Franke et al Cell, 81:727-736 (1995); Hemmings Science, 277:534 (1997); Downward, Curr. Opin. Cell Biol. 10:262-267 (1998), Alessi et al., EMBO J. 15: 6541-6551 (1996)]. PI3K 또는 우성 음성 Akt 돌연변이체의 특이적 억제제는 이들 성장 인자 또는 사이토카인의 생존-촉진 활성을 무효화한다. PI3K(LY294002 또는 워트만닌(wortmannin))의 억제제가 상류 키나제에 의해 Akt의 활성화를 차단했다는 것은 이미 기술되어 있다. 또한, 구성적으로 활성인 PI3K 또는 Akt 돌연변이체의 도입은, 세포가 정상적으로 아폽토시스성 세포 사멸을 겪는 상태에서 세포 생존을 촉진한다(참조: Kulik et al. 1997, Dudek et al. 1997).
제2-메신저 조절된 세린/트레오닌 단백질 키나제의 Akt 하위계열의 3개의 구 성원은 확인되어 있으며 Akt1/PKBα, Akt2/PKBβ 및 Akt3/PKBγ(이하, "Akt1", "Akt2" 및 "Akt3"으로 언급됨)로 각각 명명된다. 동형들은 특히 촉매 도메인을 암호화하는 영역내에서 상동성이다. Akt는 PI3K 시그날링에 대한 반응시 일어나는 인산화 현상에 의해 활성화된다. PI3K는 막 이노시톨 인지질을 인산화하여 제2 메신저인 포스파티딜-이노시톨 3,4,5-트리포스페이트 및 포스파티딜이노시톨 3,4-비스포스페이트를 생성하며, 이들은 Akt의 PH 도메인에 결합하는 것으로 밝혀졌다. Akt 활성화의 현재 모델은 3'-인산화된 포스포이노시티드에 의한 막으로의 효소의 동원을 제안하며, 여기서, 상류 키나제에 의해 Akt의 조절 부위의 인산화가 일어난다[참조: B.A. Hemmings, Science 275:628-630 (1997); B.A. Hemmings, Science 276:534 (1997); J. Downward, Science 279:673-674 (1998)].
Akt1의 인산화는 2개의 조절 부위, 즉 촉매 도메인 활성화 루프내 Thr308 및 카복시 말단 근처의 Ser473 상에서 일어난다[참조: D. R. Alessi et al . EMBO J. 15:6541-6551 (1996) 및 R. Meier et al . J. Biol . Chem . 272:30491-30497 (1997)]. 동등한 조절 인산화 부위가 Akt2 및 Akt3에 존재한다. 활성화 루프 부위에서 Akt를 인산화하는 상류 키나제가 클로닝되었고 3'-포스포이노시티드-의존성 단백질 키나제 1(PDK1)로 명명되었다. PDK1은 Akt만을 인산화하는 것이 아니라, p70 리보좀 S6 키나제, p90RSK, 혈청 및 글루코코르티코이드-조절된 키나제(SGK) 및 단백질 키나제 C도 인산화한다. 카복시 말단 근처의 Akt의 조절 부위를 인산화하는 상류 키나제는 여전히 확인되지 않았으나, 최근 보고는 인테그린-연결된 키나 제(ILK-1), 세린/트레오닌 단백질 키나제 또는 자가인산화에 대한 역할을 시사한다.
사람 종양에서 Akt 수준의 분석은, Akt2가 상당한 수의 난소암[참조: J. Q. Cheng et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 89:9267-9271(1992)] 및 췌장암[참조: J. Q. Cheng et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3636-3641 (1996)]에서 과발현되고 있음을 나타내었다. 유사하게, Akt3은 유방암 및 전립선암 세포주에서 과발현됨이 밝혀졌다[참조: Nakatani et al. J. Biol . Chem. 274:21528-21532 (1999].
종양 억제제 PTEN, 단백질 및 PtdIns(3,4,5)-P3의 3' 포스페이트를 특이적으로 제거하는 지질 포스파타제는 PI3K/Akt 경로의 음성적 조절인자이다[참조: Li et al. Science 275:1943-1947 (1997), Stambolic et al. Cell 95:29-39 (1998), Sun et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:6199-6204 (1999)]. PTEN의 배선(germline) 돌연변이는 코우덴병(Cowden disease)과 같은 사람 암 증후군에 관여한다[참조: Liaw et al. Nature Genetics 16:64-67 (1997)]. PTEN은 높은 비율의 사람 종양에서 고갈되어 있으며 기능성 PTEN이 없는 종양 세포주는 활성화된 Akt의 상승된 수준을 나타낸다[참조: Li et al. supra, Guldberg et al. Cancer Research 57:3660-3663 (1997), Risinger et al. Cancer Research 57:4736-4738 (1997)].
이러한 관찰은, PI3K/Akt 경로가 종양 형성에 있어 세포 생존 또는 아폽토시스를 조절하는데 중요한 역할을 함을 입증한다.
Akt 활성화 및 활성의 억제는 PI3K를 LY294002 및 워트만닌과 같은 억제제로 억제함으로써 달성할 수 있다. 그러나, PI3K 억제는 모든 3개의 Akt 동종 효소뿐 아니라 타이로신 키나제의 Tec 계열과 같은 PdtIns(3,4,5)-P3에 의존성인 다른 PH 도메인-함유 시그날링 분자에 무차별적으로 영향을 미칠 가능성을 지닌다. 또한, Akt는 PI3K와는 독립적인 성장 시그날에 의해 활성화될 수 있음이 기술되어 있다.
달리는, Akt 활성은 상류 키나제 PDK1의 활성을 차단함으로써 억제될 수 있따. 기술된 특이적인 PDK1 억제제는 없다. 또한, PDK1의 억제는, 비정형(atypical) PKC 동형, SGK 및 S6 키나제와 같이 활성이 PDK1에 의존적인 다수의 단백질 키나제의 억제를 초래할 수 있다[참조: Williams et al. Curr . Biol. 10:439-448 (2000)].
본 발명의 화합물은 제WO 2006/135627호에 구체적으로 기술된 사이클로프로필 치환된 나프티리딘 화합물 이상의 예상치못한 유리한 특성을 갖는다.
본 발명의 목적은 Akt의 억제제인 신규 화합물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 Akt의 억제제인 신규 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 이러한 Akt 활성의 억제제를 투여함을 포함하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 Akt 활성을 억제하는 치환된 나프티리딘 화합물을 제공한다. 특히, 기술된 화합물은 Akt 동형 중 1개 또는 2개를 선택적으로 억제한다. 본 발명 은 또한 이러한 억제성 화합물을 포함하는 조성물 및 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 당해 화합물을 투여함으로써 Akt 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물은 세린/트레오닌 키나제 Akt의 활성을 억제하는데 유용하다.
하나의 양태에서, 본 발명의 억제제는 화학식 C의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 토토머 또는 입체이성체로 나타낸다:
Figure 112009049190501-pct00028
상기 화학식 C에서,
a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이며; m은 0, 1 또는 2이고; p는 0, 1 또는 2이고;
점선은 임의의 이중결합을 나타내고;
R2는 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, CO2H, 할로, OH 및 NH2로부터 독립적으로 선택되며;
환 Y는 (C4-C7)사이클로알킬이고;
R1은 H, 옥소, (C=O)aOb(C1-C10)알킬, (C=O)aOb-아릴, (C=O)aOb(C2-C10)알케닐, (C=O)aOb(C2-C10)알키닐, CO2H, 할로, OH, Ob(C1-C6)퍼플루오로알킬, (C=O)aNR7R8, CN, (C=O)aOb(C3-C8)사이클로알킬, S(O)mNR7R8, SH, S(O)m-(C1-C10)알킬 및 (C=O)aOb-헤테로사이클릴 중에서 선택되며, 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴은 R6으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고;
R6은 (C=O)aObC1-C10 알킬, (C=O)aOb아릴, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, (C=O)aOb 헤테로사이클릴, CO2H, 할로, CN, OH, ObC1-C6 퍼플루오로알킬, Oa(C=O)bNR7R8, 옥소, CHO, (N=O)R7R8, S(O)mNR7R8, SH, S(O)m-(C1-C10)알킬 또는 (C=O)aObC3-C8 사이클로알킬이고, 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로사이클릴 및 사이클로알킬은 R6a로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되며;
R6a는 (C=O)aOb(C1-C10)알킬, Oa(C1-C3)퍼플루오로알킬, (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, SH, 옥소, OH, 할로, CN, (C2-C10)알케닐, (C2-C10)알키닐, (C3-C6)사이클로알킬, (C0-C6)알킬렌-아릴, (C0-C6)알킬렌-헤테로사이클릴, (C0-C6)알킬렌-N(Rb)2, C(O)Ra, (C0- C6)알킬렌-CO2Ra, C(O)H 및 (C0-C6)알킬렌-CO2H로부터 선택되고, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로사이클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, Oa(C=O)b(C1-C6)알킬, 옥소 및 N(Rb)2로부터 선택된 3개 이하의 치환체로 임의로 치환되며;
R7 및 R8은 H, (C=O)aOb(C1-C10)알킬, (C=O)aOb(C3-C8)사이클로알킬, (C=O)aOb-아릴, (C=O)aOb-헤테로사이클릴, (C2-C10)알케닐, (C2-C10)알키닐, SH, SO2Ra 및 (C=O)aNRb 2로부터 독립적으로 선택되고, 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 알케닐 및 알키닐은 R6a로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되거나, 또는 R7 및 R8은, 이들이 결합하고 있는 질소와 함께, 질소 외에도 N, O 및 S 중에서 선택된 1개 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 3원 내지 7원의 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있으며, 상기 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 헤테로사이클은 R6a로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고;
Ra는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴이며;
Rb는 독립적으로 H, (C1-C6)알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, (C3-C6)사이클로알킬, (C=O)aOb(C1-C6)알킬 또는 S(O)mRa이다.
본 발명의 다른 양태에서, Akt 활성의 억제제는 화학식 E의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 나타낸다:
Figure 112009034291316-pct00002
상기 화학식 E에서,
Figure 112009034291316-pct00003
는
Figure 112009034291316-pct00004
또는
Figure 112009034291316-pct00005
이고;
환 Y는 사이클로부틸이고;
R1은 H, 피리미딜, 메틸이미다졸, OH, 메틸 또는 사이클로프로필이다.
본 발명의 화합물은 1-{4-[3-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일]페닐}사이클로부탄아민 디하이드로클로라이드 (1-9); 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물은 3급-부틸{1-[4-(9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-15); 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물은 1-[4-(9-페닐-3-피리미딘-2-일[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 (1-10); 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물은 8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-3(2H)-온(1-16); 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물은 1-[4-(3-메틸-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민(1-17); 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물은 1-[4-(3-사이클로프로필-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 (1-23); 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물은 비대칭 중심, 키랄축 및 키랄면(문헌: E.L. Eliel and S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, 페이지 1119-1190에 기술된 바와 같은)을 가질 수 있으며, 라세미체, 라세미 혼합물로서 및 각각의 부분입체이성체로서 존재할 수 있고, 광학 이성체를 포함하 는 모든 가능한 이성체 및 혼합물, 모든 이러한 입체이성체는 본 발명에 포함된다.
또한, 본원에 기술된 화합물은 토토머로 존재할 수 있으며 토토머 형태 둘다는, 단지 하나의 토토머 구조만 묘사되어 있다고 해도, 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들면:
Figure 112009034291316-pct00006
테트라졸은 1H/2H 토토머의 혼합물로 존재한다. 테트라졸 잔기의 토토머 형태 또한 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 화합물의 전구약물을 포함하는 것으로 의도된다. 특정 화합물의 전구약물은 익히 공지된 약리학적 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
임의의 변수(예를 들면, R2 등)가 임의의 구성으로 1회 이상 존재하는 경우, 각각의 존재에 대한 이의 정의는 존재할 때마다 독립적이다. 또한, 치환체 및 변수의 조합은, 이러한 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용된다. 치환체로부터 환 시스템내로 그어진 선은, 나타낸 결합이 임의의 치환가능한 환 원자에 부착될 수 있음을 나타낸다. 환 시스템이 바이사이클릭인 경우, 결합은 바이사이 클릭 잔기의 어느 하나의 환의 임의의 적합한 원자에 부착되는 것으로 의도된다.
하나 이상의 규소(Si) 원자는 당업자에 의해 하나 이상의 탄소 원자대신에 본 발명의 화합물내로 혼입되어 화학적으로 안정하며 당해 분야에 공지된 기술에 의해 용이하게 이용가능한 출발 물질로부터 용이하게 합성될 수 있는 화합물을 제공하는 것으로 이해된다. 탄소 및 규소는 자체의 공유 반경이 상이함으로써 유사한 C-원소 및 Si-원소 결합과 비교하는 경우 결합 거리 및 입체적 배열에 있어 차이를 초래한다. 이러한 차이는 탄소와 비교하는 경우 규소-함유 화합물의 크기 및 형태에 있어 미묘한 변화를 초래한다. 당해 분야의 숙련자는 효능, 가용성, 표적 활성의 결여, 패키징 특성 등에 있어 미묘하거나 현저한 변화를 초래할 수 있음을 이해할 것이다[참조: Diass, J. O. et al. Organometallics (2006) 5:1188-1198; Showell, G.A. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2006) 16:2555-2558].
본 발명의 화합물에 있어 치환체 및 치환 패턴은 당해 분야의 숙련자에 의해 선택되어 화학적으로 안정하고 당해 분야에 공지된 기술, 및 하기 제시된 방법에 의해 용이하게 이용가능한 출발 물질로부터 용이하게 합성될 수 있음이 이해된다. 치환체 자체가 하나 이상의 그룹으로 치환되는 경우, 이들 다수 그룹은 안정한 구조가 수득되는 한 동일한 탄소 또는 상이한 탄소상에 존재할 수 있음이 이해된다. "하나 이상의 치환체로 임의로 치환된"이란 말은 "하나 이상의 치환체로 임의로 치환된"이란 말과 동등한 것으로 고려되어야 하며, 이러한 경우에 바람직한 양태는 0개 내지 4개의 치환체를 가질 것이며, 보다 바람직한 양태는 0개 내지 3개의 치환 체를 가질 것이다.
본원에 사용된 "알킬"은 특정 갯수의 탄소 원자를 갖는 측쇄 및 직쇄의 포화된 지방족 탄화수소 그룹 둘다를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "(C1-C10)알킬"에서와 같이 C1-C10의 경우는 직쇄 또는 측쇄 배열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 탄소를 갖는 그룹을 포함하는 것으로 정의된다. 예를 들면, "(C1-C10)알킬"은 구체적으로 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, t-부틸, i-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함한다.
용어 "사이클로알킬"은 특정 갯수의 탄소 원자를 갖는 모노사이클릭의 포화된 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 예를 들면, "사이클로알킬"은 사이클로프로필, 메틸-사이클로프로필, 2,2-디메틸-사이클로부틸, 2-에틸-사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함한다.
"알콕시"는 산소 브릿지를 통해 부착된 탄소 원자의 특정 갯수의 사이클릭 또는 비-사이클릭 알킬 그룹을 나타낸다. 따라서, "알콕시"는 상기 알킬 및 사이클로알킬의 정의를 포함한다.
탄소 원자의 수가 정의되지 않은 경우, 용어 "알케닐"은 2개 내지 10개의 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 비-방향족의, 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 말한다. 바람직하게는 하나의 탄소-탄소 이중 결합이 존재하며, 4개 이하의 비-방향족 탄소-탄소 이중 결합이 존재할 수 있다. 따라서, "(C2-C10)알케닐"은 2개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 라디칼을 의 미한다. 알케닐 그룹은 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 2-메틸부테닐 및 사이클로헥세닐을 포함한다. 알케닐 그룹의 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 부위는 이중 결합을 함유할 수 있으며 치환된 알케닐 그룹을 나타내는 경우 치환될 수 있다.
용어 "알키닐"은 2개 내지 10개의 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭의 탄화수소 라디칼을 말한다. 3개 이하의 탄소-탄소 삼중 결합이 존재할 수 있다. 따라서, "(C2-C10)알키닐"은 2개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 라디칼을 의미한다. 알키닐 그룹은 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 3-메틸부티닐 등을 포함한다. 알키닐 그룹의 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 부위는 삼중 결합을 함유할 수 있으며 치환된 알키닐 그룹이 존재하는 경우 치환될 수 있다.
특정 예에서, 치환체들은 (C0-C6)알킬렌-아릴과 같이 0을 포함하는 탄소의 범위로 정의될 수 있다. 아릴이 페닐로 취해지는 경우, 이의 정의는 페닐 자체, 및 -CH2Ph, -CH2CH2Ph, CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph 등을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "아릴"은 각각의 환내에 7개 이하의 원자를 갖는 임의의 안정한 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 탄소 환을 의미하는 것으로 의도되며, 여기서, 하나 이상의 환은 방향족이다. 이러한 아릴 요소의 예는 페닐, 나프틸, 테트라하이드로-나프틸, 인다닐 및 비페닐을 포함한다. 아릴 치환체가 바이사이클릭이고 하나의 환이 비-방향족인 경우, 방향족 환을 통해 부착되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 헤테로아릴은 각각의 환내에 7개 이하의 원자를 갖는 안 정한 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 환을 나타내며, 여기서, 하나 이상의 환은 방향족이고 O, N 및 S로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자를 함유한다. 당해 정의의 범위내에서 헤테로아릴 그룹은 아크리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 피라졸릴, 인돌릴, 벤조트리아졸릴, 푸라닐, 티에닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 인돌릴, 피라지닐, 피리다지닐, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤릴, 테트라하이드로퀴놀린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하기 헤테로사이클의 정의에서와 같이, "헤테로아릴"은 또한 임의의 질소-함유 헤테로아릴의 N-옥사이드 유도체를 포함하는 것으로 이해된다. 헤테로아릴 치환체가 바이사이클릭이고 하나의 환이 비-방향족이거나 헤테로원자를 함유하지 않는 경우에, 각각은 방향족 환 또는 헤테로원자 함유 환을 통해 부착되는 것으로 이해된다. 치환체 Q에 대한 이러한 헤테로아릴 잔기는 2-벤즈이미다졸릴, 2-퀴놀리닐, 3-퀴놀리닐, 4-퀴놀리닐, 1-이소퀴놀리닐, 3-이소퀴놀리닐 및 4-이소퀴놀리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릴"은 O, N 및 S로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 3원 내지 10원의 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클을 의미하는 것으로 의도되며 바이사이클릭 그룹을 포함한다. 따라서, "헤테로사이클릴"은 상기 언급한 헤테로아릴, 및 이의 디하이드로 및 테트라하이드로 유사체를 포함한다. "헤테로사이클릴"의 추가의 예는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 벤조이미다졸릴, 벤조이미다졸로닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라자닐, 벤조피라졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 벤즈옥 사졸릴, 카르바졸릴, 카르볼리닐, 신놀리닐, 푸라닐, 이미다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 인돌라지닐, 인다졸릴, 이소벤조푸라닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 나프트피리디닐, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 옥사졸린, 이소옥사졸린, 옥세타닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도피리디닐, 피리다지닐, 피리딜, 피리미딜, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라졸릴, 테트라졸로피리딜, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 아제티디닐, 1,4-디옥사닐, 헥사하이드로아제피닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피리딘-2-오닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디하이드로벤조이미다졸릴, 디하이드로벤조푸라닐, 디하이드로벤조티오페닐, 디하이드로벤즈옥사졸릴, 디하이드로푸라닐, 디하이드로이미다졸릴, 디하이드로인돌릴, 디하이드로이소옥사졸릴, 디하이드로이소티아졸릴, 디하이드로옥사디아졸릴, 이하이드로옥사졸릴, 디하이드로피라지닐, 디하이드로피라졸릴, 디하이드로피리디닐, 디하이드로피리미디닐, 디하이드로피롤릴, 디하이드로퀴놀리닐, 디하이드로테트라졸릴, 디하이드로티아디아졸릴, 디하이드로티아졸릴, 디하이드로티에닐, 디하이드로트리아졸릴, 디하이드로아제티디닐, 메틸렌디옥시벤조일, 테트라하이드로푸라닐 및 테트라하이드로티에닐 및 이의 N-옥사이드. 헤테로사이클릴 치환체는 탄소 원자 또는 헤테로원자를 통해 부착될 수 있다.
당해 분야의 숙련자에 의해 인지되는 바와 같이, 본원에 사용된 "할로" 또는 "할로겐"은 클로로(Cl), 플루오로(F), 브로모(Br) 또는 요오도(I)를 포함하는 것으로 의도된다.
한가지 양태에서, R1은 옥소, NH2, OH, SH 및 Oa(C1-C6)알킬 중에서 선택되며, 당해 알킬은 R6a로 임의로 치환된다.
한가지 양태에서, Rb는 H 및 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 C의 한가지 양태에서, R1은 옥소, (C=O)aOb(C1-C10)알킬, (C=O)aOb-아릴, (C=O)aOb(C2-C10)알케닐, (C=O)aOb (C2-C10)알키닐, CO2H, 할로, OH, Ob(C1-C6)퍼플루오로알킬, (C=O)aNR7R8, CN, (C=O)aOb(C3-C8)사이클로알킬, S(O)2NR7R8, SH, S(O)2-(C1-C10)알킬 및 (C=O)aOb-헤테로사이클릴 중에서 선택되며, 당해 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴은 R6a로 임의로 치환된다.
화학식 C의 다른 양태에서, R1은 옥소, (C=O)aOb(C1-C10)알킬, CO2H, 할로, OH, CN, (C1-C6)알콕시, S(O)2NR7R8, SH, S(O)2-(C1-C10)알킬, O(C=O)(C1-C6)알킬 및 N(Rb)2로부터 선택되며, 당해 알킬은 R6a로 임의로 치환된다.
화학식 C의 다른 양태에서, R1은 옥소, NH2, OH, SH 및 Oa(C1-C6)알킬로부터 선택되고, 당해 알킬은 R6a로 임의로 치환된다.
화학식 C의 다른 양태에서, R2는 옥소, (C=O)aOb(C1-C10)알킬, CO2H, 할로, OH, CN, (C1-C6)알콕시, O(C=O)(C1-C6)알킬, (C2-C10)알케닐 및 N(Rb)2로부터 선택되고, 당해 알킬은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, O(C=O)(C1-C6)알킬, 옥소 및 N(Rb)2로 임의로 치환된다.
화학식 C의 다른 양태에서, R1은 H, 헤테로사이클릴, (C3-C6)사이클로알킬, OH, (C1-C6)알킬, NH(C1-C6)알킬, NH-헤테로사이클릴 및 NH-사이클로알킬 중에서 선택되고, 당해 헤테로사이클릴, 사이클로알킬 및 알킬은 할로, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬-NH2, OH, O(C1-C6)알킬로 임의로 치환되고 R2는 H 및 할로겐으로부터 선택된다.
화학식 C의 다른 양태에서, 환 Y는 사이클로부틸이고; R1은 H, 헤테로사이클릴, (C3-C6)사이클로알킬, OH, (C1-C6)알킬, NH(C1-C6)알킬, NH-헤테로사이클릴 및 NH-사이클로알킬 중에서 선택되며, 상기 헤테로사이클릴, 사이클로알킬 및 알킬은 할로, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬-NH2, OH, O(C1-C6)알킬로 임의로 치환되고 R2는 H 또는 F이다.
화학식 C의 다른 양태에서, 환 Y는 사이클로부틸이고; R1은 H 또는 (C1-C6)알킬이며; R2는 H 또는 F이다.
화학식 C 또는 E의 유리 형태 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 입체이성체가 본 발명에 포함된다. 본원에 예시된 분리된 특정 화합물 중 일부는 아민 화합물의 양성자화된 염이다. 용어 "유리 형태"는 비-염 형태의 아민 화합물을 말한다. 포함된 약제학적으로 허용되는 염은 본원에 기술된 특정 화합물에 대해 예시된 분리된 염 뿐만 아니라, 화학식 C 또는 E의 유리 형태의 모든 통상적인 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 기술된 특정 염 화합물의 유리 형태는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 유리 형태는 염을 묽은 수성 NaOH, 탄산칼륨, 암모니아 및 중탄산나트륨과 같은 적합한 묽은 수성 염기 용액으로 처리하여 재생시킬 수 있다. 유리 형태는 이들 각각의 염 형태로부터 극성 용매 중에서의 가용성과 같은 특정한 물리적 특성에 있어서 어느 정도 상이할 수 있으나, 산 및 염기 염은 또한 본 발명의 목적상 이들의 각각의 유리 형태와 약제학적으로 동등하다.
본 발명의 약제학적으로 허용되는 염은 통상의 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 잔기를 함유하는 본 발명의 화합물로부터 합성할 수 있다. 일반적으로, 염기성 화합물의 염은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 또는 유리 염기를 화학량론적 양 또는 적합한 용매 또는 용매들의 각종 조합 중의 과량의 목적한 염-형성 무기 또는 유기 산과 반응시킴으로써 제조한다. 유사하게, 산성 화합물의 염은 적 절한 무기 또는 유기 염기와 반응시켜 형성한다.
따라서, 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 본 발명의 염기성 화합물을 무기 또는 유기 산과 반응시킴에 의해 형성된 것으로서 본 발명의 화합물의 통상의 무독성 염을 포함한다. 예를 들면, 통상의 무독성 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜삼, 인산, 질산 등과 같은 무기 산으로부터 기원한 것들, 및 아세트산, 프로피온산, 석신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모익산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시-벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이세티온산, 트리플루오로아세트산(TFA) 등과 같은 유기산으로부터 제조된 염을 포함한다.
본 발명의 화합물이 산성인 경우, 적합한 "약제학적으로 허용되는 염"은 무기 염기 및 유기 염기를 포함하는 약제학적으로 허용되는 무독성 염기로부터 제조된 염을 말한다. 무기 염기로부터 유도된 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 망간 염, 망간, 칼륨, 나트륨, 아연 등을 포함한다. 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 칼륨 및 나트륨 염이 특히 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 유기 무독성 염기로부터 유도된 염은 1급, 2급 및 3급 아민, 천연적으로 존재하는 치환된 아민, 사이클릭 아민을 포함하는 치환된 아민, 아르기닌, 베타인 카페인, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이소프로필아민, 라이신, 메틸글루 카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민 트리프로필아민, 트로메타민 등과 같은 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지를 포함한다.
위에서 기술된 약제학적으로 허용되는 염 및 기타 대표적인 약제학적으로 허용되는 염의 제조는 문헌(참조: Berg et al ., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm . Sci., 1977:66:1-19)에 보다 상세히 기술되어 있다.
생리학적 조건하에서, 카복실 그룹과 같이 화합물내 탈양성자화된 산성 잔기는 음이온성일 수 있고, 당해 전자 하전은 이후에 4급 질소 원자와 같은 양성자화되거나 알킬화된 염기성 잔기의 양이온성 하전에 대해 내부적으로 균형이 깨질 수 있으므로, 본 발명의 화합물이 잠재적으로 내부 염 또는 양쪽성이온임이 또한 주목될 것이다.
유용성
본 발명의 화합물은 Akt의 활성의 억제제이므로 암, 특히 Akt의 활성 및 하류 세포 표적에 있어서의 불규칙과 관련된 암의 치료에 유용하다. 이러한 암은 난소암, 췌장암, 유방암 및 전립선암, 및 종양 억제제 PTEN이 돌연변이된 암(교아세포종 포함)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다[참조: Cheng et al., Proc . Natl . Acad . Sci. (1992) 89:9267-9271; Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93:3636-3641; Bellacosa et al., Int. J. Cancer (1995) 64:280-285; Nakatani et al., J. Biol. Chem. (1999) 274:21528-21532; Graff, Expert. Opin. Ther. Targets (2002) 6(1):103-113; 및 Yamada and Araki, J. Cell Science. (2001) 114:2375-2382; Mischel and Cloughesy, Brain Pathol. (2003) 13(1):52-61].
본원에 제공된 화합물, 조성물 및 방법은 암의 치료에 특히 유용한 것으로 고려된다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 암은 심장암: 육종(혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐암: 비-소세포 폐암, 기관지원성 암종(편평 세포, 분화되지 않은 소 세포, 분화되지 않은 거대 세포, 선암종), 폐포(기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골과오종, 중피종; 위장관암: 식도암(편평세포 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위암(암종, 림프종, 평활근육종), 췌장암(도관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 카르시노이드 종양, VIP종), 소장암(선암종, 림프종, 카르시노이드 종양, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종증, 섬유종), 대장암(선암종, 관상선종, 융모선종, 과오종, 평활근종), 결장암, 직장결장암, 직장암: 비뇨생식관암: 신장암(선암종, 윌름스 종양(Wilm's tumor)[신장모세포종], 림프종, 백혈병), 방광암 및 요도암(편평세포 암종, 이행세포 암종, 선암종), 전립선암(선암종, 육종), 고환암(고환종, 기형종, 배아암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 사이질세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 선양종양, 지방종); 간암: 간암(간세포 암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 골암: 골원성 육종(골육종), 섬유육종, 악성섬유조직구종, 연골육종, 유윙 육종, 악성 림프종(그물세포 육종), 다발골수종, 악성 거대 세포 종양 또는 척삭종, 골연골종(골연골성 외골증), 양성 콘드로마(chondroma), 연골모세포종, 연골점액유사섬유종, 유골 골 종 및 거대 세포 종양; 신경계암: 두개골암(골연화증, 혈관종, 육아종, 황색종, 변성 골염), 수막암(수막종, 수막육종, 신경아교종증), 뇌암(별아교세포종, 속질모세포종, 신경아교종, 뇌실막세포종, 종자세포종[솔방울선종], 다형성아교모세포종, 희소돌기아교세포종, 신경집종, 망막모세포종, 선천성 두개내종양), 척수 신경섬유종증, 수막종, 신경아교종, 육종); 부인과암: 자궁암(내막 암종), 경부암(경부 암종, 전-종양 경부 이형성), 난소암(난소 암종[심각한 낭선암종, 점액낭선종, 분류되지 않은 암종], 과립층 세포 종양, 세르톨리-레이디그(Sertoli-Leydig) 세포 종양, 미분화세포종, 악성 기형종), 음문암(편평세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질암(투명세포 암종, 편평세포 암종, 포도육종(배아포도 횡문근육종), 자궁관암(암종); 혈액암: 혈액암(골수성 백혈병[급성 및 만성], 급성 림프모구 백혈병, 만성림프성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발 골수종, 골수형성이상증후군), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)[악성 림프종]; 피부암: 악성 흑색종, 기저세포 암종, 편평세포 암종, 카포시 육종(Karposi's sarcoma), 형성이상모반, 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 및 부신암: 신경모세포종. 따라서, 본원에 제시된 용어 "암성 세포"는 상기-확인된 조건 중 어느 하나에 의해 영향받은 세포를 포함한다.
본 발명의 화합물, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암은, 유방암, 전립선암, 결장암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 뇌암, 고환암, 위암, 췌장암, 피부암, 소장암, 대장암, 인후암, 두경부암, 구강암, 골암, 간암, 방광암, 신장암, 갑상선암 및 혈액암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암은 유방암, 전립선암, 결장암, 난소암, 직장결장암, 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함한다.
본 발명의 화합물, 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 암은 유방암, 결장암(결장직장암) 및 폐암(비-소세포 폐암)을 포함한다.
본 발명의 화합물, 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 암은 림프종 및 백혈병을 포함한다.
본 발명의 화합물은 유방암의 치료에 유용하다.
본 발명의 화합물은 전립선암의 치료에 유용하다.
Akt 시그날링은 혈관형성(angiogenesis)에서 다수의 주요 단계를 조절한다(참조: Shiojima and Walsh, Circ. Res. (2002) 90:1243-1250). 암의 치료시 혈관형성 억제제의 용도는 문헌[참조: J. Rak et al. Cancer Research, 55:4575-4580, 1995 및 Dredge et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2002) 2(8):953-966]에 공지되어 있다. 암에서 혈관형성의 역할은 다수 유형의 암 및 조직에서 밝혀졌다: 유방 암종(참조: G. Gasparini and A.L. Harris, J. Clin. Oncol., 1995, 13:765-782; M. Toi et al., Japan. J. Cancer Res., 1994, 85:1045-1049); 방광 암종(참조: A.J. Dickinson et al., Br. J. Urol., 1994, 74:762-766); 결장 암종(참조: L.M. Ellis et al., Surgery, 1996, 120(5):871-878); 및 구강 종양(참조: J.K. Williams et al., Am. J. Surg., 1994, 168:373-380). 기타 암은 진행성 종양, 모세포 백혈병, 흑색종, 진행성 두경부암, 전이성 신장 종양, 비-호지킨 림프종, 전이성 유방암, 유방 선암종, 진행성 흑색종, 췌장암, 위암, 아교모세포종, 폐암, 난소암, 비-소세포 폐암, 전립선암, 소 세포 폐암, 신장 세포 암종, 각종 고형 암, 다발골수종, 전이성 전립선암, 악성 신경아교종, 신장암, 림프종, 불응기 전이성 질환, 불응기 다발경화증, 경부암, 카포시육종, 재발 역형성 신경아교종 및 전이성 결장암을 포함한다[참조: Dredge et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2002) 2(8):953-966]. 따라서, 본원에 기술된 Akt 억제제는 또한 이러한 혈관형성 관련 암의 치료에 유용하다.
혈관신생을 겪은 종양은 증가된 전이 가능성을 나타낸다. 실제로, 혈관형성은 종양 성장 및 전이에 필수적이다[참조: S.P. Cunningham, et al., Can . Research, 61: 3206-3211 (2001)]. 따라서, 본원에 기술된 Akt 억제제는 또한 종양 세포 전이를 예방하거나 감소시키는데 유용하다.
본 발명의 범위내에는, 혈관형성이 관여된 질병을 치료하거나 예방하는 방법이 포함되며, 이는 이러한 치료를 필요로 하는 포유동물에게 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 안구 신생혈관 질환은, 발생하는 많은 조직 손상의 원인이 안구내 혈관의 비정상적인 침윤일 수 있는 상태의 예이다(참조: 2000년 6월 2일 공개된 제WO 00/30651호). 바람직하지 않은 침윤은 당뇨병성 망막병증, 미숙아망막병증, 망막정맥폐색 등으로부터 발생하는 것과 같은 허혈성 망막병증, 또는 노화-관련 황반 변성에서 관찰되는 맥락막 혈관신생과 같은 변성 질환에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물의 투여에 의한 혈관 성장의 억제는 혈관의 침윤을 예방하고, 망막 혈관형성, 당뇨병성 망막증, 노화-관련 황반 변성 등과 같은 안구 질환과 같이, 혈관형성이 관여된 질병을 예방하거나 치료한다.
또한, 본 발명의 범위내에는 혈관형성이 관여된 비-악성 질병을 치료하거나 예방하는 방법이 포함되며, 이에는 안구질환(예를 들면, 망막 혈관형성, 당뇨병성 망막증 및 노화-관련 황반 변성), 죽상경화증, 관절염, 건선, 당뇨병 및 알츠하이머병이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다[참조: Dredge et al., Expert Opin . Biol. Ther. (2002) 2(8):953-966]. 다른 양태에서, 혈관형성이 관여된 질병을 치료하거나 예방하는 방법은 안구 질환(예를 들면, 망막 혈관형성, 당뇨병성 망막병증 및 노화-관련 황반 변성), 죽상경화증, 관절염 및 건선을 포함한다.
또한 본 발명의 범위내에는 재협착, 염증, 자가면역 질환 및 알레르기/천식과 같은 과증식성 질환을 치료하는 방법이 포함된다.
또한, 본 발명의 범위내에는 스텐트를 피복하기 위한 본 발명의 화합물의 용도 및 따라서 재협착의 치료 및/또는 예방용의 피복된 스텐트상에서의 본 발명의 화합물의 용도가 포함된다(참조: 제WO03/032809호).
또한, 본 발명의 범위내에는 골관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 화합물의 용도가 포함된다(제WO03/035048호).
또한, 본 발명의 범위내에는 고인슐린증의 치료방법이 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 위에서 기술된 질병, 특히 암을 치료하는데 있어서 유용한 약제를 제조하는데 유용하다.
본 발명의 양태에서, 본 발명의 화합물은, 억제 효능이 PH 도메인에 의존적인 선택적 억제제이다. 당해 양태에서, 본 화합물은 PH 도메인을 결여하고 있는 절두된(truncated) Akt 단백질에 대해 시험관내 억제 활성에 있어서의 감소를 나타 내거나 시험관내 억제 활성을 나타내지 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명의 화합물은 Akt1의 선택적인 억제제, Akt2의 선택적인 억제제 및 Akt1 및 Akt2 둘다의 선택적인 억제제의 그룹 중에서 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 Akt1의 선택적인 억제제, Akt2의 선택적인 억제제, Akt3의 선택적인 억제제 및 3개의 Akt 동형 중 2개의 선택적인 억제제의 그룹 중에서 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 모든 3개의 Akt 동형의 선택적인 억제제이나, PH 도메인, 힌지 영역 또는 PH 도메인 및 힌지 영역 둘다를 결실하도록 변형된 Akt 동형 중 1개, 2개 또는 모두의 억제제가 아니다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 포유동물에게 약제학적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함하여, Akt 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 사람을 포함하는 포유동물에게 단독으로, 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 표준 약제학적 방법에 따라 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 당해 화합물은 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여 경로를 포함하여 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.
활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물은 예를 들면, 정제, 트로키제, 로젠지제, 수성 또는 오일성 현탁액제, 분산성 산제 또는 입제, 유제, 경질 또는 연질 캅셀제 또는 시럽제 또는 엘릭시르제로서 경구용에 적합한 형태일 수 있다. 경구용으로 의도된 조성물은 약제학적 조성물의 제조를 위해 당해 분야에 공지된 어떠 한 방법에 따라서도 제조할 수 있으며, 당해 조성물은 약제학적으로 우수하고 맛이 좋은 제제로 제공하기 위해 감미제, 풍미제, 착색제 및 보존제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적합한 무독성의 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 활성 성분을 함유한다. 당해 부형제는 예를 들면, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토즈, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제, 예를 들면, 미세결정성 셀룰로즈, 나트륨 크로스카르멜로즈, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들면, 전분, 젤라틴, 폴리비닐-피롤리돈 또는 아카시아, 및 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석과 혼합된 활성 성분을 함유한다. 정제는 피복되지 않거나 또는 이들은 공지된 기술에 의해 약물의 불쾌한 맛을 차폐시키거나 위장관내에서 붕해 및 흡수를 지연시킴으로서 장기간에 걸친 지속적인 작용을 제공하기 위하여 피복시킬 수 있다. 예를 들면, 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 하이드록시프로필셀룰로즈와 같은 수용성 맛 차폐 물질, 또는 에틸 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트 부티레이트와 같은 시간 지연 물질을 사용할 수 있다.
경구용 제형은, 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들면, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합되는, 경질 젤라틴 캅셀제로서, 또는 활성 성분이 폴리에틸렌글리콜과 같은 수용성 담체 또는 오일성 매질, 예를 들면, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 같은 수용성 담체와 혼합된 연질 젤라틴 캅셀제로서 제공될 수 있다.
수성 현탁액제는 수성 현탁액제의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질 을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아이고; 분산제 또는 습윤제는 천연적으로 존재하는 포스파티드, 예를 들면, 레시틴 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올, 예를 들면, 헵타데카에틸렌-옥시세탄올의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산으로부터 기원한 부분 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트와 같은 헥시톨의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물, 예를 들면, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물이다. 수성 현탁액제는 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들면, 에틸, 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 풍미제, 및 슈크로즈, 사카린 또는 아스파르탐과 같은 하나 이상의 감미제를 함유할 수 있다.
오일성 현탁액제는 활성 성분을 식물성 오일, 예를 들면, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일 속에, 또는 액체 파라핀과 같은 광유 중에 현탁시켜 제형화할 수 있다. 오일성 현탁액제는 증점제, 예를 들면, 밀납, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 위에서 제시한 것들과 같은 감미제, 및 풍미제를 가하여 맛이 좋은 경구 제제를 제조할 수 있다. 이들 조성물은 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 알파-토코페롤과 같은 항산화제를 첨가하여 보존시킬 수 있다.
물을 첨가하여 수성 현탁액제를 제조하기에 적합한 분산성 산제 및 입제는 분산제 또는 습윤제, 현탁화제 및 하나 이상의 보존제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제는 상기에 이미 언급한 것들에 의해 예시된다. 추가의 부형제, 예를 들면, 감미제, 풍미제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다. 당해 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가하여 보존할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 수중유형 에멀젼의 형태일 수 있다. 오일 상은 식물성 오일, 예를 들면, 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 또는 광유, 예를 들면, 액체 파라핀 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연적으로 존재하는 포스파티드, 예를 들면, 대두 레시틴, 및 지방산 및 헥시톨 무수물, 예를 들면, 소르비탄 모노올레이트로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트의 축합 생성물일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미제, 풍미제, 보존제 및 항산화제를 함유할 수 있다.
시럽제 및 엘릭시르제는 감미제, 예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 슈크로즈와 함께 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한 점활제, 보존제, 풍미제 및 착색화제 및 항산화제를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 멸균 주사 수용액의 형태일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다.
멸균 주사 제제는 또한 멸균 주사가능한 수중유형 마이크로에멀젼일 수 있으 며, 여기서, 활성 성분은 오일 상 속에 분산된다. 예를 들면, 활성 성분은 우선 대두 오일 및 레시틴의 혼합물 속에 용해될 수 있다. 이후에, 오일 용액을 물과 글리세롤 혼합물내로 도입시키고 가공하여 마이크로에멀젼을 형성한다.
주사가능한 액제 또는 마이크로에멀젼은 국소 일시 주사에 의해 환자의 혈류내로 도입시킬 수 있다. 달리는, 본 화합물의 일정한 순환 농도를 유지하도록 하는 방식으로 액제 또는 마이크로에멀젼을 투여하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 일정한 농도를 유지하기 위하여, 연속적인 정맥내 전달 장치가 이용될 수 있다. 이러한 장치의 예는 Deltec CADD-PLUS™ 모델 5400 정맥내 펌프이다.
약제학적 조성물은 근육내 및 피하 투여용의 멸균 주사가능한 수성 또는 오일성 현탁액제의 형태일 수 있다. 당해 현탁액제는 공지된 문헌에 따라 적합한 분산제 또는 습윤제 및 위에서 언급한 현탁화제를 사용하여 제형화할 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 액제 또는 현탁액제, 예를 들면, 1,3-부탄 디올 중의 용액으로서 존재할 수 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 용매 또는 현탁화 매질로서 통상적으로 사용된다. 당해 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 혼합 고정 오일을 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조시 유용하다.
화학식 C 또는 E의 화합물은 약물의 직장 투여용 현탁액제의 형태로 투여할 수 있다. 당해 조성물은 약물을 통상의 온도에서의 고체이나 직장 온도에서는 액체이므로 직장내에서 용융되어 약물을 방출할 적합한 비-자극성 부형제와 약물을 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터, 글리세린화된 젤라틴, 수소화된 식물성 오일, 분자량이 다양한 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스테르의 혼합물을 포함한다.
국소용을 위해, 화학식 C 또는 E의 화합물을 함유하는 크림제, 연고제, 젤리제, 액제 또는 현탁액제 등을 사용한다(본 출원의 목적상, 국소 적용은 구강 세척액 및 가글을 포함한다).
본 발명의 화합물은 적합한 비강내 비히클 및 전달 장치를 통해, 또는 경피 경로를 통해 비강내 형태로 당해 분야의 숙련자에게 익히 공지된 경피 피부 패취의 형태를 사용하여 투여할 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여하는 경우에는, 물론 용량 투여는 투여 방법 전체에서 간헐적이라기 보다는 연속적일 것이다. 본 발명의 화합물은 또한 코코아 버터, 글리세린화된 젤라틴, 수소화된 식물성 오일, 분자량이 다양한 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스테르의 혼합물과 같은 염기를 사용하는 좌제로서 전달될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물이 사람 대상체내로 투여되는 경우, 1일 용량은 일반적으로 개개 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자 증상의 중증도에 따라 일반적으로 상이한 용량을 사용하여 처방하는 의사가 결정할 것이다.
본 발명의 화합물을 사용하는 투여 방법은 종류, 연령, 체중, 성별 및 치료되는 암의 유형; 치료되는 암의 중증도(즉, 병기); 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용된 특정 화합물 또는 이의 염을 포함하는 각종 인자에 따라 선택될 수 있다. 숙련된 의사 또는 수의사는 예를 들면, 질병의 진행을 예방하고, 억제 (완전히 또는 부분적으로)하거나 정지시키는데 요구되는 약물의 유효량을 용이하게 결정하여 처방할 수 있을 것이다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 10,000mg 이하의 총 1일 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 1일 1회(QD)로 투여되거나 또는 1일 2회(BID), 및 1일 3회(TID)와 같은 다수의 1일 투여량으로 분할될 수 있다. 본 발명의 화합물은 10,000 mg 이하, 예를 들면, 2,000 mg, 3,000 mg, 4,000 mg, 6,000 mg, 8,000 mg 또는 10,000 mg의 총 1일 용량으로 투여될 수 있으며, 이는 1일 1회 투여량으로 투여될 수 있거나 위에서 기술한 바와 같이 다수의 1일 투여량으로 분할될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 화합물은 1,000 mg 이하의 총 1일 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 1일 1회(QD) 투여될 수 있거나, 또는 1일 2회(BID), 및 1일 3회(TID)와 같은 다수의 1일 투여량으로 분할될 수 있다. 본 발명의 화합물은 1,000 mg 이하, 예를 들면, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 600 mg, 800 mg 또는 1,000 mg의 총 1일 용량으로 투여될 수 있으며, 이는 1일 1회 투여량으로 투여될 수 있거나 위에서 기술한 바와 같이 다수 1일 투여량으로 분할될 수 있다.
또한, 투여는 연속적, 즉, 매일, 또는 간헐적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "간헐적" 또는 "간헐적으로"는 규칙적 또는 불규칙적 간격으로 정지 및 출발함을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물의 간헐적 투여는 주당 1일 내지 6일 투여일 수 있거나 이는 주기적 투여(예를 들면 2 내지 8주 연속 1일 투여후, 1주 이하 동안 투여가 없는 휴약 기간)를 의미하거나 격일 투여를 의미할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 위에서 기술한 스케줄 중 어느 것에 따라 수주 동 안 연속적으로 투여된 후 휴약 기간을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 위에서 기술한 스케줄 중 어느 하나에 따라서 2주 내지 8주에 이어 1주의 휴약 기간, 또는 주당 3 내지 5일 동안 100 내지 500mg의 투여량으로 매일 2회 투여할 수 있다. 다른 특정 양태에서, 본 발명의 화합물은 연속된 2주 동안 매일 3회 투여 후 1주 동안 휴약 기간을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물의 임의의 하나 이상의 특정 용량 및 투여 스케줄을 또한 병용 치료에 사용될 치료제(이후, "제2 치료제"로 언급) 중 임의의 하나 이상에 적용될 수 있다.
또한, 당해 제2 치료제의 특정 용량 또는 투여 스케줄은 또한 변할 수 있으며, 최적 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로는 사용되는 특정한 제2 치료제를 기준으로 결정될 것이다.
물론, 본 발명의 화합물의 투여 경로는 제2 치료제의 투여 경로와는 독립적이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 화합물에 대한 투여는 경구 투여이다. 다른 양태에서, 본 발명의 화합물에 대한 투여는 정맥내 투여이다. 즉, 당해 양태에 따라서, 본 발명의 화합물은 경구 또는 정맥내 투여되며, 제2 치료제는 경구, 비경구, 복강내, 정맥내, 동맥내, 경피, 설하, 근육내, 직장, 경볼, 비강내, 리포좀으로, 흡입을 통해, 질내, 안구내, 카테터 또는 스텐트에 의한 국소 전달을 통해, 지방내, 관절내, 수막공간내, 또는 서방성 투여형으로 투여한다.
또한, 본 발명의 화합물 및 제2 치료제는 동일한 투여 방식으로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 제제 둘다는 에를 들면 경구적으로, 정맥내로 투여될 수 있다. 그러나, 본 발명의 화합물을 하나의 투여 방식, 예를 들면 경구로 투여하고 제2 치료제를 다른 투여 방식, 예를 들면, 정맥내 또는 위에서 기술된 투여 방식중 어떠한 다른 것에 의해 투여하는 것도 또한 본 발명의 범위내에 있다.
제1 치료 과정, 본 발명의 화합물의 투여는 제2 치료 과정 전에 실시할 수 있는데, 예를 들면, 제2 치료제, 제2 치료제를 사용한 치료 후, 제2 치료제를 사용한 치료와 동시에, 또는 이들의 조합으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 총 치료 기간은 본 발명의 화합물에 대해 결정될 수 있다. 제2 치료제는 본 발명의 화합물을 사용한 치료 개시 전 또는 본 발명의 화합물을 사용한 치료 후에 투여될 수 있다. 또한, 항암 치료제를 본 발명의 화합물의 투여 기간 동안 투여할 수 있으나 본 발명의 화합물의 전체 치료기간에 걸쳐 투여할 필요는 없다.
본 발명의 화합물은 또한 치료학적 화학치료제 및 항암제와의 병용으로 유용하다. 본 발명의 기술된 화합물과 치료학적, 화학치료제 및 항암제의 병용은 본 발명의 범위내에 있다. 이러한 제제의 예는 문헌[참조: Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers]에서 발견할 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자들은 제제의 어떠한 병용이 관여된 암 및 약물의 특정 특징을 기준으로 하여 유용할지를 인지할 수 있을 것이다. 이러한 제제는 다음을 포함한다: 에스트로겐 수용체 조절인자, 안드로겐 수용체 조절인자, 레티노이드 수용체 조절인자, 세포독성제/세포정지제, 항증식제, 페닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제 및 다른 혈관형성 억제제, HIV 프로테아제 억제 제, 역전사효소 억제제, 세포 증식 및 생존 시그날링의 억제제, 비스포스포네이트, 아로마타제 억제제, siRNA 치료제, γ-세크레타제 억제제, 수용체 타이로신 키나제(RTK)를 방해하는 제제 및 세포 주기 체크포인트(checkpoint)를 방해하는 제제. 본 발명의 화합물은 방사선 치료요법과 함께 공동-투여하는 경우 특히 유용하다.
본 발명의 화합물은 또한 다음 치료제와 함께 암을 치료하는데 유용할 수 있다: 아바렉릭스(Plenaxis depot®); 알데스류킨(Prokine®); 알데스류킨(Proleukin®); 알렘투주마즈(Campath®); 알리트레티노인(Panretin®); 알루푸리놀(Zyloprim®); 알트레타민(Hexalen®); 아미포스틴(Ethyol®); 아나스트로졸(Arimidex®); 아세닉 트리옥사이드(Trisenox®); 아스파라기나제(Elspar®); 아자시티딘(Vidaza®); 베바쿠지마브(Avastin®); 벡사로텐 캅셀제(Targretin®); 벡사로텐 겔제(Targretin®); 블레오마이신(Blenoxane®); 보르테조미브(Velcade®); 부설판 정맥내(Busulfex®); 부설판 경구(Myleran®); 칼루스테론(Methosarb®); 카페시타빈(Xeloda®); 카르보플라틴(Paraplatin®); 카르무스틴(BCNU®, BiCNU®); 카르무스틴(Gliadel®); 폴리페프로산 20 임플란트를 가진 카르무스틴(Gliadel Wafer®); 셀레콕시브(Celebrex®); 세툭시마브(Erbitux®); 클로람부실(Leukeran®); 시스플라틴(Platinol®); 클라드리 빈(Leustatin®, 2-CdA®); 클로파라빈(Clolar®); 사이클로포스파미드(Cytoxan®, Neosar®); 사이클로포스파미드(시톡산 주사®); 사이클로포스파미드(Cytoxan Tablet®); 사이타라빈(Cytosar-U®); 사이타라빈 리포소말(DepoCyt®); 다카르바진(DTIC-Dome®; 닥티노마이신, 악티노마이신 D(Cosmegen®); 다르베포에틴 알파(Aranesp®); 다우노루비신 리포소말(DanuoXome®); 다우노루비신, 다우노마이신(Daunorubicin®; 다우노루비신, 다우노마이신(Cerubidine®); 데니류킨 디프티톡스(Ontak®); 덱스라족산(Zinecard®); 독세탁셀(Taxotere®); 독소루비신(Adriamycin PFS®); 독소루비신(Adriamycin®, Rubex®); 독소루비신(Adriamycin PFS Injection®); 독소루비신 리포소말(Doxil®); 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone®); 드로모스타놀론 프로피오네이트(masterone injection®); 엘리어트 B 용액(Elliott's B Solution®); 에피루비신(Ellence®); 에포에틴 알파(epogen®); 에를로티니브(Tarceva®); 에스트라무스틴(Emcyt®); 에토포시드 포스페이트(Etopophos®); 에토포시드, VP-16 (Vepesid®); 엑세메스탄(Aromasin®); 필그라스팀(Neupogen®); 플록수리딘(동맥내) (FUDR®); 플루다라빈(Fludara®); 플루오로우라실, 5-FU (Adrucil®); 풀베스트란 트(Faslodex®); 게피티니브(Iressa®); 겜시타빈(Gemzar®); 겜투주마브 오조가미신(Mylotarg®); 고세렐린 아세테이트(Zoladex Implant®); 고세렐린 아세테이트(Zoladex®); 히스트렐린 아세테이트(Histrelin implant®); 하이드록시우레아(Hydrea®); 이브리투모마브 티욱세탄(Zevalin®); 이다루비신(Idamycin®); 이포스파미드(IFEX®); 이마티니브 메실레이트(Gleevec®); 인터페론 알파 2a(Roferon A®); 인터페론 알파-2b (Intron A®); 이리노테칸(Camptosar®); 레날리도마이드(Revlimid®); 레트로졸(Femara®); 류코보린(Wellcovorin®, Leucovorin®); 류프롤라이드 아세테이트(Eligard®); 레바니솔(Ergamisol®); 로무스틴, CCNU (CeeBU®); 메클로레타민, 질소 무스타드(Mustargen®); 메게스트롤 아세테이트(Megace®); 멜팔란, L-PAM(Alkeran®); 머캅토퓨린, 6-MP(Purinethol®); 메스나(Mesnex®); 메스나(Mesnex tabs®); 메토트렉세이트(Methotrexate®); 메톡살렌(Uvadex®); 미토마이신 C(Mutamycin®); 미토탄(Lysodren®); 미톡산트론(Novantrone®); 난드롤론 펜프로피오네이트(Durabolin-50®); 넬라라빈(Arranon®); 노페투모마브(Verluma®); 오프렐베킨(Neumega®); 옥사리플라틴(Eloxatin®); 파클리탁셀(Paxene®); 파클리탁셀(Taxol ？); 파클리탁셀 단백질-결합된 입자(Abraxane®); 팔리페르민(Kepivance®); 팔미드로네이트(Aredia®); 페가데마제(Adagen (Pegademase Bovine)®); 페가스파르가제(Oncaspar®); 페그필그라스팀(Neulasta®); 페메트렉세드 이나트륨(Alimta®); 펜토스타틴(Nipent®); 피포브로만(Vercyte®); 플리카마이신, 미트라마이신(Mithracin®); 포르피머 나트륨(Photofrin®); 프로카르바진(Matulane®); 퀴나크린(Atabrine®); 라스부리카제(Elitek®); 리툭시마브(Rituxan®); 사르그라모스팀(Leukine®); 사르그라모스팀(Prokine®); 소라페니브(Nexavar®); 스트렙토조신(Zanosar®); 수니티니브 말레에이트(Sutent®); 활석(Sclerosol®); 타목시펜(Nolvadex®); 테모졸로마이드(Temodar®); 테니포시드, VM-26 (Vumon®); 테스톨락톤(Teslac®); 티오구아닌, 6-TG (Thioguanine®); 티오테파(Thioplex®); 토포테칸(Hycamtin®); 토레미펜(Fareston®); 토시투모마브(Bexxar®); 토시투모마브/I-131 토시투모마브(Bexxar®); 트라스투주마브(Herceptin®); 트레티노인, ATRA (Vesanoid®); 우라실 무스터드(Uracil Mustard Capsules®); 발루비신(Valstar®); 빈블라스틴(Velban®); 빈크리스틴(Oncovin®); 비노렐빈(Navelbine®); 졸레드로네이트(Zometa®) 및 보리노스타 트(Zolinza®).
본 발명의 화합물은 탁산과 함께 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 화합물은 도세탁셀(Taxotere®)과 함께 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 화합물은 보리노스타트(Zolinza®)와 함께 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 화합물은 오로라 키나제 억제제, MK-0457과 함께 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 화합물은 mTor 억제제, AP 23573과 함께 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 화합물은 IGF1R 억제제, MK-0646과 함께 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 화합물은 사트라플라틴과 함께 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 화합물은 라파티니브(Tykerb®)와 함께 암을 치료하는데 유용하다.
따라서, 본 발명의 범위는 다음 중에서 선택된 제2 화합물과 함께 청구한 화합물의 용도를 포함한다: 에스트로겐 수용체 조절인자, 안드로겐 수용체 조절인자, 레티노이드 수용체 조절인자, 세포독성제/세포정지제, 항증식제, 페닐-단백질 트랜 스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, HIV 프로테아제 억제제, 역 전사효소 억제제, 혈관형성 억제제, PPAR-γ 효능제, PPAR-δ효능제, 고유의 다중약물 내성의 억제제, 항-구토제, 빈혈 치료시 유용한 제제, 호중성백혈구감소증 치료시 유용한 제제, 면역-증진 약물, 세포 증식 및 생존 시그날링의 억제제, 비스포스포네이트, 아로마타제 억제제, siRNA 치료제, γ-세크레타제 억제제, 수용체 타이로신 키나제(RTK)를 방해하는 제제, 세포 주기 체크포인드를 방해하는 제제 및 상기 열거된 치료제 중 임의의 것.
본 발명의 화합물과 관련하여 용어 "투여" 및 이의 변형어(예를 들면, 화합물의 "투여")는 화합물의 프로드럭을 치료를 필요로 하는 동물의 시스템내로 도입함을 의미한다. 본 발명의 화합물 또는 이의 프로드럭이 하나 이상의 다른 활성제(예를 들면, 세포독성제 등)와 함께 제공되는 경우, "투여" 및 이의 변형어는 각각 화합물 또는 이의 프로드럭 및 기타 제제의 동시 및 연속적인 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "조성물"은 특정량의 특정 성분을 포함하는 생성물, 및 특정량의 특정 성분의 조합으로부터 간접적으로 또는 직접적으로 수득되는 임의의 생성물을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 고려하고 있는 조직, 시스템, 동물 또는 사람에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 활성 화합물 또는 약제의 양을 의미한다.
용어 "암을 치료하는" 또는 "암의 치료"는 암성 조건으로 영향받은 포유동물 에 대한 투여를 말하며 암성 세포를 사멸시킴에 의해 암 조건을 완화시키는 효과 뿐만 아니라, 암의 성장 및/또는 전이의 억제를 초래하는 효과를 말한다.
하나의 양태에서, 제2 화합물로서 사용될 혈관형성 억제제는 타이로신 키나제 억제제, 상피-기원 성장 인자의 억제제, 섬유아세포-기원 성장 인자의 억제제, 혈소판 기원 성장 인자의 억제제, MMP(매트릭스 메탈로프로테아제) 억제제, 인테그린 차단제, 인터페론-α, 인터루킨-12, 펜토산 폴리설페이트, 사이클로옥시게나제 억제제, 카복시아미도트리아졸, 콤브레타스타틴 A-4, 스쿠알라민, 6-O-클로로아세틸-카보닐)-푸마길롤, 탈리도마이드, 안기스스타틴, 트로포닌-1 또는 VEGF에 대한 항체 중에서 선택된다. 하나의 양태에서, 에스트로겐 수용체 조절인자는 타목시펜 또는 랄록시펜이다.
또한 본 발명의 범위내에는 방사선 치료요법과 함께 및/또는 다음 중에서 선택된 제2 화합물과 함께 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함하는, 암의 치료 방법이 포함된다: 에스트로겐 수용체 조절인자, 안드로겐 수용체 조절인자, 레티노이드 수용체 조절인자, 세포독성제/세포정지제, 항증식제, 페닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, HIV 프로테아제 억제제, 역 전사효소 억제제, 혈관형성 억제제, PPAR-γ 효능제, PPAR-δ 효능제, 고유의 다중약물 내성의 억제제, 항-구토제, 빈혈의 치료시 유용한 제제, 호중성백혈구감소증 치료시 유용한 제제, 면역-증진 약물, 세포 증식 및 생존 시그날링의 억제제, 비스포스포네이트, 아로마타제 억제제, siRNA 치료제, γ-세크레타제 억제제, 수용체 타이로신 키나제(RTK)를 방해하는 제제, 세포 주기 체크포인드를 방해하는 제제 및 상기 열거된 치료제 중 임의의 것.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물 및 다음 중에서 선택된 제2 화합물을 포함하는 암의 치료 또는 예방에 유용한 약제학적 조성물을 포함한다: 에스트로겐 수용체 조절인자, 안드로겐 수용체 조절인자, 레티노이드 수용체 조절인자, 세포독성제/세포정지제, 항증식제, 페닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, HIV 프로테아제 억제제, 역 전사효소 억제제, 혈관형성 억제제, PPAR-γ 효능제, PPAR-δ 효능제, 세포 증식 및 생존 시그날링의 억제제, 비스포스포네이트, 아로마타제 억제제, siRNA 치료제, γ-세크레타제 억제제, 수용체 타이로신 키나제(RTK)를 방해하는 제제, 세포 주기 체크포인드를 방해하는 제제 및 상기 열거된 치료제 중 임의의 것.
명시된 모든 특허, 공보 및 특허원은 본원에 참조로 인용된다.
이하 실시예 및 화학 기술에서 사용된 약어는 다음과 같다: AEBSF (p-아미노에틸벤젠설포닐 플루오라이드); BSA (소 혈청 알부민); BuLi (n-부틸 리튬); CDCl3 (클로로포름-d); CuI (요오드화구리); CuSO4 (황산구리); DCE (디클로로에탄); DCM (디클로로메탄); DEAD (디에틸 아조디카복실레이트); DMF (N,N-디메틸포름아미드); DMSO (디메틸 설폭사이드); DTT (디티오트레이톨); EDTA (에틸렌-디아민-테트라-아세트산); EGTA (에틸렌-글리콜-테트라-아세트산); EtOAc (에틸 아세테이트); EtOH (에탄올); HOAc (아세트산); HPLC (고성능 액체 크로마토그래피); HRMS (고 해상 질량 스펙트럼); IPA (이소프로필 알코올); LCMS (액체 크로마토그래프-질량 분광 기); LHMDS (리튬 비스(트리메틸실릴)아미드); LRMS (저 해상 질량 스펙트럼); MeOH (메탄올); MP-B(CN)H3 (거대다공성 시아노보로하이드라이드); NaHCO3 (중탄산나트륨); Na2SO4 (황산나트륨); Na(OAc)3BH (나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드); NH4OAc (암모늄 아세테이트); NBS (N-브로모석신이미드); NMR (핵 자기 공명); PBS (포스페이트 완충된 염수); PCR (폴리머라제 연쇄 반응); Pd(dppf) ([1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐); Pd(Ph3)4 (팔라듐(0) 테트라키스-트리페닐포스핀); POCl3 (옥시염화인); PS-DIEA (폴리스티렌 디이소프로필에틸아민); PS-PPh3 (폴리스티렌-트리페닐 포스핀); TBAB (테트라부틸암모늄 브로마이드); TBAF (테트라부틸암모늄 플루오라이드); THF (테트라하이드로푸란); TFA (트리플루오로아세트산); TMSCH2N2 (트리메틸실릴디아조메탄) 및 Ac(아세틸); BOC (t-부톡시카보닐); Bu (부틸); Cal (계산치); Calc'd (계산치); DIEA (디이소프로필에틸아민); DMAP (4-디메틸아미노피리딘); EDC (N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드); Eq (등량); Et (에틸); HOBT (하이드록시벤조트리아졸); IPA (이소프로판올); LC/MS (액체 크로마토그래프-질량 분광법); Me (메틸); MeCN (아세토니트릴); NMP (N-메틸피롤리디논); Pr (프로필); Pyr (피리딘); Sat (포화됨), Tosic (p-톨루엔설폰산) 및 Bn (벤질); t-Bu (3급-부틸); dba (디벤질리덴아세톤); DIPEA (디이소프로필에틸아민); IPAC (이소프로필 아세테이트); MTBE (3급-부틸 메틸 에테르); OAc (아세테이트); RT (실온); Wt (중량); 및 XRPD (x-선 분말 회절).
본 발명의 화합물은 시험 과정에서 예시되거나 문헌에 공지된 다른 표준 조작외에, 다음 반응식에 나타낸 바와 같은 반응을 사용하여 제조할 수 있다. 따라서, 하기 예시적인 반응식은 열거된 화합물 또는 예시 목적으로 사용된 임의의 특정 치환체에 의해 한정되지 않는다. 반응식에 나타낸 치환체 번호매김은 청구의 범위에서 사용된 것에 필수적으로 관련되지는 않으며, 흔히 명확성을 위해, 다수의 치환체가 하기 화학식 C 또는 E의 정의하에 허용되는 경우, 단일 치환체가 화합물에 부착된 것으로 나타난다.
반응식의 개요
다음 반응식, 반응식 I 내지 III은 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 유용한 세부사항을 제공한다. 필수적인 중간체는 일부 경우에 시판되거나 문헌 과정에 따라 제조할 수 있다.
반응식 I에 예시되어 있는 바와 같이, 사이클로알킬(페닐)아세트산 유도체, 본 경우에 사이클로부틸을 우선 쿠르티우스-형 조건(Curtius-type condition)하에 반응시키고 재배열시켜 카바메이트 I-1을 수득한다. 당해 경우에 팔라듐으로 촉매된 시안화로 니트릴 I-2를 수득한다. 화합물 I-2의 탈양성자화에 이어 친핵성 벤질 그리냐드 시약과 반응시키고 가수분해적 후처리하여 케톤 I-3을 수득한다. 화합물 I-3을 알데하이드 I-4로 염기성 조건하에 축합시켜 클로로나프티리딘 I-5을 수득한다. 염소를 하이드라진으로 치환시켜 하이드라지드 I-6을 수득한다. 아실화시켜 아시클 하이드라지드 I-7을 수득하고 이를 산성 조건하에 폐환시켜 트리아 졸로나프티리딘 I-8을 수득한다. 아민을 당해 경우에 HCl로 탈보호시켜 화합물 I-9를 수득한다.
융합된 트리아졸은 하이드라지드 I-6을 카보닐디이미다졸과 같은 활성화된 카보닐 등량체 또는 포름산으로 카보디이미드의 존재하에 아실화시켜 폐환 단계를 필요로 하지 않고서 제조할 수 있다. 달리는, 클로로나프티리딘 1-5를 알킬 하이드라진 카복실레이트와 같은 유도체화된 하이드라진과 산 촉매하에 반응시켜 하이드라진 부가물을 수득하고 이를 폐환시켜 염기성 조건하에 트리아졸로 폐환시킨다.
R1이 아미노알킬 그룹인 본 발명의 화합물은 반응식 II에 요약된 과정에 따라서 제조할 수 있다. 하이드라지드 I-6을 카보디이미드와 반응시켜 우레아를 생성시키고 이를 반응계내에서 산성 조건하에 폐환시켜 알킬아미노트리아졸 II -1을 수득한다. 이후 탈보호시켜 화합물 II-2를 수득한다.
클로로나프티리딘 I-5의 대안적인 합성은 반응식 III에 요약되어 있다. (4-할로페닐)아세토니트릴 유도체 III-1, 당해 경우에 브로모를 우선 염기성 조건하에 알킬화시켜 사이클로부탄 III -2를 수득하고 이를 과산화수소로 염기의 존재하에 수화시켜 아미드 III -3을 수득한다. 이후에, 당해 아미드를 t-부탄올의 존재하에 산화적으로 재배열시켜 카르바메이트 III -4를 수득한다. 당해 경우에 팔라듐으로 촉매된 시안화로 니트릴 I-2를 수득한다. 니트릴 I-2를 과량의 친핵성 벤질 그리나드 시약과 반응시키고 가수분해적 후처리하여 케톤 I-3을 수득한다. 알데하이드 I-4를 TFA와 같은 산으로 탈보호시켜 아미노피리딘 III-5를 수득한다. 케톤 I-3을 알데하이드 III -5와 염기성 조건하에 축합시켜 클로로나프티리딘 I-5를 수득한다.
Figure 112009034291316-pct00007
Figure 112009034291316-pct00008
Figure 112009034291316-pct00009
제공된 실시예 및 반응식은 본 발명의 추가적 이해를 돕기 위한 것이다. 사용된 특정 물질, 종 및 조건은 본 발명을 추가로 예시하기 위함이며 본 발명의 적절한 범위를 한정하지 않는다.
Figure 112009034291316-pct00010
3급 -부틸[1-(4-클로로페닐)사이클로부틸]카바메이트 ( 1-1 )
둥근 바닥 플라스크에 1-(4-클로로페닐)사이클로부탄카복실산 (40.4 g, 192 mmol), 디-3급-부틸 디카보네이트 (46.0 g, 211 mmol), 나트륨 아지드 (43.6 g, 671 mmol), 테트라부틸암모늄 브로마이드 (9.27 g, 28.7 mmol), 아연 트리플루오로 메탄설포네이트 (2.30 g, 6.32 mmol), 및 THF (1L)를 가하였다. 반응 혼합물을 수냉식 환류 응축기가 부착된 뜨거운 유조 속에서 질소 대기하에 18시간 동안 교반하면서 60℃로 가열하였다. 조 반응 혼합물에 중탄산나트륨 포화 용액을 가하고, 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 (0-3% IPA/DCM)로 정제하여 3급-부틸 [1-(4-클로로페닐)사이클로부틸]카바메이트 (1-1)를 백색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+Na)+: 실측치 = 304.1075, 계산치 = 304.1075.
3급-부틸 [1-(4-시아노페닐)사이클로부틸]카바메이트 ( 1-2 )
무수 1,4-디옥산 (70 mL) 중 3급-부틸 [1-(4-클로로페닐)사이클로부틸]카바메이트 (1-1) (5.32 g, 18.9 mmol)의 용액에 시안화아연 (2.44 g, 20.8 mmol)을 가한 후, 비스(트리-t-부틸포스핀)팔라듐(0) (0.965 g, 1.89 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 수냉식 환류 응축기가 부착된 뜨거운 유조 속에서 질소 대기하에 1.5시간 동안 교반하면서 100℃로 가열하였다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 (0-5% IPA/DCM)로 여과하여 3급-부틸 [1-(4-시아노페닐)사이클로부틸] (1-2)을 왁스성 회백색/황색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 273.1598, 계산치 = 273.1597.
3급-부틸 {1-[4-(페닐아세틸)페닐]사이클로부틸}카바메이트 ( 1-3 )
무수 THF (300 mL) 중 3급-부틸 [1-(4-시아노페닐)사이클로부틸]카바메이트 (1-2) (16.6 g, 61.0 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시키면서 질소 대기하에 교반하였다. 이후에, THF (30.5 mL, 61.0 mmol) 중 이소프로필마그네슘 클로라이드의 2.0M 용액을 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 질소 대기하에 10분 동안 교반하도록 하였다. 이후에, THF (116 mL, 232 mmol) 중 벤질마그네슘 클로라이드의 2.0M 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 가온되도록 하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 염화암모늄의 포화된 용액을 첨가하여 0℃에서 퀀칭시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고, 염화암모늄의 포화 용액, 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어서 물로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 (1-40% EtOAc/5% DCM/헥산)로 정제하여 3급-부틸 {1-[4-(페닐아세틸)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-3)를 왁스성 회백색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+Na)+: 실측치 = 388.1892, 계산치 = 388.1883.
3급-부틸 {1-[4-(5-클로로-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸} 카바메이트 ( 1-5 )
둥근 바닥 플라스크에 3급-부틸 {1-[4-(페닐아세틸)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-3) (2.7 g, 6.1 mmol), 3급-부틸 (2-클로로-3-포르밀피리딘-4-일)카바메이트 (1-4) (1.6 g, 6.1 mmol), 탄산칼륨 (5.0 g, 6.0 mmol), 및 DMF ( 20 mL)를 가하였다. 반응 혼합물을 뜨거운 유조 속에서 질소 대기하에 15시간 동안 교반하면서 80℃로 가열하였다. 이후에, 반응 혼합물을 120℃로 1시간 동안 가온시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각되도록 하고, 물을 가하고, 에틸 아세테이트중에 현탁 시키고, 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어, 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 (5-50% EtOAc/5%DCM/헥산)로 정제하여 3급-부틸 {1-[4-(5-클로로-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-5)를 회백색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 486.1954, 계산치 = 486.1943.
3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸} 카바메이트 ( 1-6 )
마이크로파 바이알에 3급-부틸 {1-[4-(5-클로로-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-5) (4.05 g, 8.34 mmol), 무수 하이드라진 (5.24 mL, 167 mmol), 및 1,4-디옥산 (15 mL)을 가하였다. 이후에, 반응 혼합물을 마이크로파 조사하에 15분 동안 100℃ (고 흡수)에서 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각되도록 하고, 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고, 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어서, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켜 3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6)를 오렌지색 고체/포말로서 수득하였다. MS (M+H)+: 실측치 = 482.3, 계산치 = 482.59.
3급-부틸 {1-[4-(5-{2-[(1-메틸-1 H -이미다졸-4-일)카보닐]하이드라지노}-3- 페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트.( 1-7 )
둥근 바닥 플라스크에 3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리 딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6) (3.94 g, 8.18 mmol), EDC (1.34 g, 10.6 mmol), HOBt (1.44 g, 10.6 mmol), 1-메틸-1H-이미다졸-4-카복실산 (1.34 g, 10.6 mmol), 및 DMF (40 mL)를 가하였다. 반응 혼합물을 질소 대기하에 뜨거운 유조 속에서 교반하면서 60℃로 가열하였다. 45분 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각되도록 하고, 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고, 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켜 3급-부틸 {1-[4-(5-{2-[(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)카보닐]하이드라지노}-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-7)를 적색 포말로서 수득하였다. MS (M+H)+: 실측치 = 590.3, 계산치 = 590.69.
3급-부틸 (1-{4-[3-(1-메틸-1 H -이미다졸-4-일)-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6-나프티리딘-8-일]페닐}사이클로부틸)카바메이트 ( 1-8 )
둥근 바닥 플라스크에 3급-부틸 {1-[4-(5-{2-[(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)카보닐]하이드라지노}-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트(1-7) (2.73 g, 4.63 mmol), 아세트산 (5.30 mL, 93 mmol), 및 1,4-디옥산 (20 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 뜨거운 유조 속에서 대기에 개방하여(뚜껑을 씌움) 교반하면서 80℃로 가열하였다. 3시간 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각되도록 하고, 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고, 중탄산나트륨의 포화용액에 이어, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 1-15% IPA/DCM로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 진공하에 제거하였다. 수득되는 잔사를 역상 컬럼 크로마토그 래피[선파이어(Sunfire) C18]로 5 내지 95% 아세토니트릴 / (0.1% TFA / 물) 구배로 용출시켜 재정제하였다. 적절한 분획은 에틸 아세테이트 중에 현탁시킴에 의해 유리 염기화하고, 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켜 3급-부틸 (1-{4-[3-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일]페닐}사이클로부틸)카바메이트 (1-8)를 회백색 고체로서 수득하였다. MS (M+H)+: 실측치 = 572.3, 계산치 = 572.7.
1-{4-[3-(1-메틸-1 H -이미다졸-4-일)-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6- 나프티리딘-8-일]페닐}사이클로부탄아민 디하이드로클로라이드 ( 1-9 )
MeOH (5 mL) 및 DCM (15 mL) 중 3급-부틸 (1-{4-[3-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일]페닐}사이클로부틸)카바메이트 (1-8) (2.52 g, 4.41 mmol)의 용액을 EtOAc (22 mL, 88 mmol) 중 HCl의 4N 용액에 가하였다. 밀봉된 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축시켜 1-{4-[3-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일]페닐}사이클로부탄아민 디하이드로클로라이드 (1-9)를 황색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 472.2249, 계산치 = 472.2244.
다음 화합물을 실시예 1-9와 유사한 방식으로 제조하였다:
Figure 112009034291316-pct00011
Figure 112009034291316-pct00012
Figure 112009034291316-pct00013
Figure 112009034291316-pct00014
Figure 112009034291316-pct00015
8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-3-올 ( 1-16 )
둥근 바닥 플라스크에 1,4 디옥산 (30 mL) 중 3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6) (2.77 g, 5.75 mmol), 및 1,1'-카보닐비스(1H-이미다졸) (4.10 g, 4.40 mmol)을 가하였다. 이후에 밀봉된 반응 혼합물을 95℃에서 질소 대기하에 가열하였다. 조 반응 혼합물에 중탄산나트륨 (100 mL)의 포화 용액 및 에틸 아세테이트를 가하였다. 유기 층을 중탄산나트륨 포화 용액에 이어, 물, 이후에 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 이후에, 수득되는 잔사를 0-10% IPA/DCM으로 용출시키는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 이후에, 적절한 분획을 합하고 용매를 진공하에 제거하여 3급-부틸 {1-[4-(3-하이드록시-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6a)를 갈색 고체로서 수득하였다. MS (M+H)+: 실측치 =508.1, 계산치 = 508.6.
MeOH (5 mL) 및 DCM (15 mL) 중 3급-부틸 {1-[4-(3-하이드록시-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6a) (1.14 g, 2.25 mmol)의 용액에 EtOAc (22 mL, 88 mmol) 중 HCl의 4N 용액을 실온에서 가하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축시켜 8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-3-올 하이드 로클로라이드 (1-16)를 황색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 408.1803, 계산치 = 408.1819.
후속적으로, 황색 고체의 X-선 결정학 분석은, 고체 화합물 1-16이 다음 화학 구조로 나타남을 나타낸다:
8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-3(2H)-온 하이드로클로라이드
Figure 112009034291316-pct00016
Figure 112009034291316-pct00017
3급-부틸 {1-[4-(9- 페닐[1,2,4]트리아졸로 [3,4- f ]-1,6- 나프티리딘 -8-일) 페닐 ] 사이클로부틸 } 카바메이트 ( 1-15 )
둥근 바닥 플라스크에 EDC (569 mg, 2.97 mmol), HOBt (401 mg, 10.6 mmol), 포름산 (248 mg, 5.40 mmol), DCM (20 mL), 및 NMP (2.5 mL)를 가하였다. 이후에, 반응 혼합물을 실온에서 질소 대기하에 30분 동안 교반하였다. 이후에 3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6) (1.30 g, 2.70 mmol)를 가하였다. 이후에, 반응 혼합물을 실온에서 질소 대기하에 밤새 교반하였다. 이후에, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고, 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 50-90% EtOAc/DCM에 이어, 1-15% IPA/DCM으로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 진공하에 제거하여 3급-부틸 {1-[4-(9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6b)를 갈색 고체로서 수득하였다. MS (M+H)+: 실측치 = 492.2, 계산치 = 492.6.
1-[4-(9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 하이드로클로라이드 ( 1-15 )
MeOH (5 mL) 및 DCM (15 mL) 중 3급-부틸 {1-[4-(9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6b) (1.07 g, 2.177 mmol)의 용액에 EtOAc (5.44 mL, 21.77 mmol) 중 HCl의 4N 용액을 가하였다. 밀봉된 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후 반응 혼합물을 여과하여 1-[4-(9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 하이드로클로라이드 (1-15)를 갈색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 392.1872, 계산치 = 392.1870.
Figure 112009034291316-pct00018
1-(4-브로모페닐)사이클로부탄카보니트릴 ( 1-2c )
TBAB (1.61 g, 0.5 mmol), 디브로모프로판 (22.2 g, 110 mmol), 및 니트릴 1-1c (19.6 g, 100 mmol)를 15 mL의 물 및 200 mL의 톨루엔(온도를 72 내지 79℃로 유지함)의 혼합물에 가하였다. 혼합물을 스팀으로 가열하고 99-108℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 80℃로 냉각시키고 200 mL의 헵탄을 가하였다. 수득되는 혼합물을 교반하면서 실온으로 냉각시킨 후, 상부의 투명한 용액을 여과하고, 물(3X30 mL)로 세척하고 진공하에 농축시켜 오일성 생성물 1-2c를 수득하였다.
1-(4-브로모페닐)사이클로부탄카복스아미드 ( 1-3c )
H2O2 (30% 11.3 mL, 118 mmol)를 3시간에 걸쳐 59 mL의 DMSO 중 니트릴 1-2c (13.88 g, 약 58.9 mmol) 및 K2CO3 (1.62 g, 11.8 mol)의 교반 용액에 40 내지 87℃에서, 수조로 냉각시키면서 가하였다. 수득되는 혼합물을 27℃로 냉각시키고 물(100 mL)을 30분에 걸쳐 가하였다. 결정성 생성물 1-3c가 형성되었다. 보다 많 은 물(100 mL)을 1시간에 걸쳐 가하였다. 수득되는 슬러리를 실온에서 16시간 동안 숙성시킨 후 여과하였다. 케이크를 100 mL의 물로 세정한 후 100 mL의 헵탄으로 세정하였다. 진공 오븐 속에서 50℃로 건조시킨 후, 생성물 1-3c를 백색 고체로서 수득하였다.
3급-부틸 [1-(4-브로모페닐)사이클로부틸]카바메이트 ( 1-4c )
Pb(OAc)4 (25.7 g, 25.7 mmol)를 64 mL의 t-BuOH 중 아미드 1-3c (12.7 g, 50 mmol)의 교반 용액에 57℃ 내지 86℃에서 수조로 냉각시키면서 가하였다. 수득되는 혼합물을 65 내지 86℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 26℃로 냉각시키고 12.7 g의 Na2CO3에 이어 65 mL의 MTBE를 가하였다. 10분 후, 혼합물을 여과하였다. 케이크를 10 L의 MTBE로 세정하고 합한 여액을 20 mL의 물로 세척하고 유기 층을 이후에 3 X 10 mL의 10% KHCO3 (주의: 버블링)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고 진공하에 농축시켰다. 수득되는 고체를 8 mL의 IPAc 및 8 mL의 헵탄으로 세정하고 진공 오븐 속에서 40℃로 건조시켜 생성물 1-4c를 회색 고체로서 수득하였다.
3급-부틸 [1-(4-시아노페닐)사이클로부틸]카바메이트 ( 1-2 )
DMF (25 mL) 중 Pd2dba3 (101 mg; 1 mol%) 및 dppf (122 mg; 2 mole%)의 교반 슬러리를 질소로 5분 동안 살포한 후 65℃로 가온시키고 30분 동안 숙성시켰다. 당해 온도에서 아릴 브로마이드 1-4c (3.6 g, 11 mmol), 아연 분말 (51 mg; 6 mol%) 및 시안화아연 (777 mg; 0.60 당량)을 DMF (5 mL)로 세정시키면서 가하였다. 당해 용액을 92-95℃로 가열하고 4시간 동안 숙성시켰다. 용액을 실온으로 밤새 냉각시키고 솔카 플록(Solka Floc)의 패드를 통해, 케이크를 DMF (5 mL)로 세정하면서 여과하였다. 물(30 mL)을 3.5시간 동안 25 내지 33℃에서 씨드와 함께 가하였다. 실온에서 밤새 숙성시킨 후, 수득되는 결정성 용액을 여과하고 수성 메탄올로 세척하며 밤새 건조시켜 생성물 1-2를 황색 고체로서 수득하였다.
3급-부틸 {1-[4- 페닐아세틸 ) 페닐 ] 사이클로부틸 } 카바메이트 ( 1-3 )
벤질 그리나드(19 mL, 38.5 mmol)를 약 -20℃로 냉각시킨 THF (25 mL) 중 니트릴 1-2 (3 g, 11 mmol)의 교반된 약간 불투명한 용액에 반응 온도가 약 -10℃이상 가온되지 않도록 하는 속도로 가하였다. 용액을 3 내지 4시간 동안 반응 온도를 -10℃ 내지 -20℃로 유지시키면서 숙성시켰다. 교반된 용액을 -30℃로 냉각시키고 미리 5 내지 10℃로 냉각시킨 15 중량% 수성 시스트산 용액(60 mL)에 온도를 15℃ 이하로 유지시키면서 가하였다. 층을 분리하고 수성 층을 MTBE로 세척하였다.
유기 층을 합하고, 반 포화된 염수(60 mL)로 세척하고, 감압하에 농축시켰다. 헵탄을 가하고 혼합물을 슬러리로 농축시키고 이를 여과하고, 헵탄 (15 mL)으로 세척하고 질소하에 건조시켜 생성물 1-3을 수득하였다.
4-아미노-2-클로로니코틴알데하이드( 1-5c )
트리플루오로아세트산 (17.4 mL, 234 mmol)을 Boc 알데하이드 1-4 (20 g, 78.1 mmol) 및 디클로로메탄 (60 mL)의 교반된 혼합물에 온도를 25℃ 이하로 유지시키면서 조심스럽게 가하였다. 용액을 35℃로 가온시키로, 밤새 숙성(격렬하게 탈기됨)시킨 후 실온으로 냉각시켰다. 25 mL의 MTBE를 가하고 수득되는 백색 슬러리를 1시간 동안 숙성시키고, 여과시키고, 여과 케이크를 MTBE (10 mL x 2)로 세정하였다. 고체 1-5c TFA 염을 진공하에 건조시켰다.
3급-부틸 {1-[4-(5-클로로-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸} 카바메이트 ( 1-5 )
45중량% 수산화칼륨 용액(18 mL; 5 당량)을 20분에 걸쳐 클로로피리딘 TFA 염 1-5c (19.5 g), 사이클로부틸아미노 케톤 1-3 (26 g) 및 이소프로판올 (200 mL)의 교반 혼합물에 온도를 24℃ 이하로 유지시키면서 조심스럽게 가하였다. 1시간 후, 물(100 mL)을 가하고 추가로 1시간 후, 수득되는 슬러리를 여과하고, 2:1 IPA/물(30 mL에 이어, 24 mL)에 이어 물(80 mL에 이어 2 x 60 mL)로 세척하였다. 고체를 질소 유동하에 건조시켜 생성물 1-5를 회백색 고체로서 수득하였다.
3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 ( 1-6)
무수 하이드라진 (25 mL, 797 mmol)을 1,4-디옥산 (200 mL) 중 클로로나프티리딘 (1-5) (25.12 g, 51.7 mmol)의 교반 용액에 질소 대기하에 가하고 반응 혼합물을 95℃로 가열하였다. 30분 후, 용액을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트 (400 mL)를 가하고 용액을 중탄산나트륨 포화 용액에 이어 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켜 생성물 (1-6)을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
Figure 112009034291316-pct00019
3급-부틸 {1-[4-(9-페닐-3-피리미딘-2-yl[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 ( 1-6d )
둥근 바닥 플라스크에 3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6) (267 mg, 0.554 mmol), EDC (138 mg, 0.721 mmol), HOBt (97 mg, 0.721 mmol), 피리미딘-2-카복실산 (89 mg, 0.721 mmol), DIPEA (0.367 mL, 2.218 mmol), 및 DMF (3 mL)를 가하였다. 이후에, 반응 혼합물을 밀봉하고 마이크로파 조사하에 100℃에서 5분 동안 가하였다. 혼합물을 냉각시키고, 아세트산 (0.476 mL, 8.32 mmol)을 가한 후, 반응 혼합물을 밀봉하고 마이크로파 조사하에 80℃에서 5분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고, 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 0-10% IPA/DCM으로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 진공하에 제거하여 3급-부틸 {1-[4-(9-페닐- 3-피리미딘-2-일[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6d)를 오렌지색 고체로서 수득하였다. MS (M+H)+: 실측치 = 570.2, 계산치 = 570.7.
1-[4-(9-페닐-3-피리미딘-2-일[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 하이드로클로라이드 ( 1-10 )
MeOH (2 mL) 및 DCM (3 mL) 중 3급-부틸 {1-[4-(9-페닐-3-피리미딘-2-yl[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6d) (71 mg, 0.125 mmol)의 용액에 EtOAc (3 mL, 12 mmol) 중 HCl의 4N 용액을 가하였다. 밀봉된 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 4시간 후 반응 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 1 내지 50% 아세토니트릴 / (0.1% TFA / 물) 구배로 용출시키는 역상 컬럼 크로마토그래피(썬파이어 C18)로 정제하였다. 적절한 분획을 진공하에 농축시켰다. 이후에, 수득되는 잔사를 DCM (5 mL) 및 MeOH (5 mL) 속에 용해한 후, EtOAc (5 mL, 20 mmol) 중 HCl의 4N의 용액을 가한 후, 진공하에 농축시켜 1-[4-(9-페닐-3-피리미딘-2-일[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 하이드로클로라이드 (1-10)를 갈색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 470.2098, 계산치 = 470.2088.
Figure 112009034291316-pct00020
(화합물 1-16의 대안적 합성)
중간체 ( 1-5e )
클로로나프티리딘 1-5 (1.8 g), 메틸 하이드라진 카복실레이트(0.318 g) 및 이소프로판올 (20 L)의 교반 슬러리를 66℃로 가온시킨 후 균질하게 하였다. IPA (0.05 ml) 중 5-6 N HCl을 가하고 온도를 70℃로 16시간 동안 승온시킨 후 실온으로 냉각시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 45중량% 수산화칼륨 용액(0.52 mL)을 물(5.5 mL)과 혼합하고 15분에 걸쳐 가하였다. 30분 후, 수성 아세트산 (6 mL의 물중 0.7 mL)에 이어 물(2 mL)을 가하였다. 수득되는 슬러리를 실온에서 3시간 동안 숙성시키고, 여과시키고, 1:1 IPA/물(2 x 2.4 mL)로 세척하였다. 생성물을 질소 유동하에 건조시킨 후 염화 메틸렌 속에서 20℃로 4시간 동안 슬러리화한 후, 여과하고 질소 유동하에 건조시켜 생성물 1-5e를 회백색 고체로서 수득하였다.
8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6-나프티리딘-3(2 H )-온 ( 1-16 )
에탄올(2.0 mL) 중 수성 농축된 HCl (12.1 M, 1.64 mL)을 30분에 걸쳐 에탄올(1.7 mL) 및 물(0.2 mL) 중 생성물 1-5e (500 mg, 0.985 mol)의 교반 슬러리에 50℃에서 적가하였다. 산을 첨가한 지 3시간 후, 혼합물을 씨딩하고 밤새 50℃에서 숙성시키고, 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 염화아세틸(0.5 g, 7 mmol)을 1시간에 걸쳐 에탄올(2 mL)에 0℃에서 가하였다. 이후에, 용액을 실온으로 냉각시키고 30분 동안 숙성시켰다. 여과 케이크를 당해 용액(1 mL x 2)으로 세척한 후, 에틸 아세테이트 (4 mL x 2)로 세척하고, 여과시키고, 최종적으로 진공 오븐 속에서 75.0℃에서 질소 스윕(50 torr)을 사용하여 생성물 1-16 제IV형으로부터 제II형으로의 완전한 전환이 XRPD에 의해 관측될 때까지 건조시켰다.
반응식 1A에 사용된 방법으로 제I형으로 명명된 결정성 비스-HCl 염 1-16이 수득되었다. 반응식 1E에 기술된 과정으로 제II형, 제III형 및 제IV형으로 명명된 결정성 비스-HCl 염 1-16의 3개의 새로운 다형체가 생성되었다. 감압하에서 제III형 또는 제IV형의 질소 스윕하의 건조로 이들을 제II형으로 완전히 전환시킬 수 있음이 밝혀졌다. 산성 에탄올 속에서 제I형 및 제II형의 혼합물을 슬러리함으로써 슬러리 속에서 제III형이 생성되었다. 제III형을 슬러리화하고 위에서 기술한 바와 같이 건조시켜 제II형을 생성하였다.
생성물 1-16의 모노-HCl 버젼은 또한 물에 용해하여 생성하였다. 6시간 후, 수성 슬러리는 담황색으로 되고 이를 여과하였다. 당해 고체의 염화은 적정은 1 당량의 클로라이드의 존재를 나타낸다. 최종적으로 비스-HCl 염 1-16을 수성 KOH (2 당량)로 처리하여 클로라이드 적정으로 측정되는 중성의 화합물 1-16을 생성한 다.
Figure 112009034291316-pct00021
3급-부틸 {1-[4-(3- 메틸 -9- 페닐[1,2,4]트리아졸로 [3,4- f ]-1,6- 나프티리딘 -8-일) 페닐 ] 사이클로부틸 } 카바메이트 ( 1-6f )
둥근 바닥 플라스크에 EDC (4.63 g, 24.17 mmol), HOBt (3.27 g, 24.17 mmol), 무수 DCM (50 mL) 및 아세트산 (13.2 mL, 13.86 mmol)을 가하였다. 이후에, 반응 혼합물을 실온에서 질소 대기하에 30분 동안 교반하였다. 이후에, 3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6) (10.58 g, 21.97 mmol)를 가하였다. 이후에, 반응 혼합물을 밤새(18 시간) 실온에서 질소 대기하에 교반한 후, 80℃로 2시간 동안 가열하였다. 이후에, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고, 중탄산나트륨의 포화 용액에 이어 물 및 염수 속에 붓고 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 1-20% IPA/DCM로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 진공하에 제거하여 3급-부틸 {1-[4-(3-메틸-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이 트 (1-6f) 갈색 고체로서 수득하였다. MS (M+H)+: 실측치 = 506.2, 계산치 = 506.6.
1-[4-(3-메틸-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 하이드로클로라이드 ( 1-17 )
MeOH (20 mL) 및 DCM (100 mL) 중 3급-부틸 {1-[4-(3-메틸-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6f) (9.23 g, 18.26 mmol)의 용액에 EtOAc (91 mL, 365 mmol) 중 HCl의 4N 용액을 가하였다. 밀봉된 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 18시간 후 반응 혼합물을 여과하여 1-[4-(3-메틸-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 하이드로클로라이드 (1-17)을 회백색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 406.2047, 계산치 = 406.2026.
Figure 112009034291316-pct00022
3급-부틸 {1-[4-(3-사이클로프로필-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 ( 1-6g )
둥근 바닥 플라스크에 EDC (535 mg, 2.79 mmol), HOBt (377 mg, 2.79 mmol), 무수 DCM (17.5 mL), 무수 NMP (2.5 mL), 및 사이클로프로판카복실산 (248 mg, 5.40 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 질소 대기하에 30분 동안 교반하였다. 이후에, 3급-부틸 {1-[4-(5-하이드라지노-3-페닐-1,6-나프티리딘-2-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6) (1.221 g, 2.54 mmol)를 가하였다. 이후에, 반응 혼합물을 밤새(18 시간) 실온에서 질소 대기하에 교반하였다. 아세트산 (2.178 mL, 38.0 mmol)을 가하고 반응 혼합물을 뜨거운 유조 속에서 80℃로 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 에틸 아세테이트를 가하고 혼합물을 중탄산나트륨의 포화 용액, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 90% EtOAc/DCM (등장성)로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 진공하에 제거하여 3급-부틸 {1-[4-(3-사이클로프로필-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (1-6g)를 분홍색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 532.2729, 계산치 = 532.2707.
1-[4-(3-사이클로프로필-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4- f ]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 하이드로클로라이드 ( 1-23 )
MeOH (5 mL) 및 DCM (15 mL) 중 3급-부틸 {1-[4-(3-사이클로프로필-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트 (MJK-9)(899.4 mg, 18.26 mmol)의 용액에 EtOAc (4.23 mL, 16.92 mmol) 중 HCl의 4N 용액을 가하였다. 밀봉된 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 18시간 후 반응 혼합물을 여과하여 1-[4-(3-메틸-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민 하이드로클로라이드 (1-23)를 황색 고체로서 수득하였다. HRMS (M+H)+: 실측치 = 432.2186, 계산치 = 432.2183.
실시예 1
사람 Akt 동형 및 △ PH - Akt1 의 클로닝
pS2neo 벡터(2001년 4월 3일자로 ATCC에 제ATCC PTA-3253호로 기탁됨)를 다음과 같이 제조하였다: pRmHA3 벡터[문헌: Nucl. Acid Res. 16:1043-1061 (1988)에 기술된 바와 같이 제조]를 BglII로 절단하고 2734 bp 단편을 분리하였다. pUChsneo 벡터[문헌 EMBO J. 4:167-171 (1985)에 기술된 바와 같이 제조]를 또한 BglII로 절단하고 4029 bp 밴드를 분리하였다. 이들 2개의 분리된 단편을 함께 연결시켜 pS2neo-1으로 명명된 벡터를 생성시켰다. 당해 플라스미드는 메탈로티오닌 프로모터와 알코올 데하이드로게나제 폴리 A 부가 부위 사이에 폴리링커를 함유한다. 이는 또한 열 쇼크 프로모터에 의해 구동되는 neo 내성 유전자를 갖는다. pS2neo-1 벡터를 Psp5II 및 BsiWI로 절단하였다. 2개의 상보성 올리고뉴클레오타이드를 합성한 후 어닐링하였다(CTGCGGCCGC (서열번호 1) 및 GTACGCGGCCGCAG (서열번호 2)). 절단된 pS2neo-1 및 어닐링된 올리고뉴클레오타이드를 함께 연결시켜 제2 벡터, pS2neo를 수득하였다. S2 세포내로 형질감염시키기 전에 선형화를 돕기 위해 당해 전환물에 NotI 부위를 부가하였다.
사람 Akt1 유전자를 5' 프라이머: 5'CGCGAATTCAGATCTACCATGAGCGACGTGGCTATTGTG 3'(서열번호 3), 및 3' 프라이머: 5'CGCTCTAGAGGATCCTCAGGCCGTGCTGCTGGC3'(서열번호 4)를 사용하여 사람 비장 cDNA[제조원: 클론테크(Clontech)]로부터 PCR (제조원: 클론테크)로 증폭시켰다. 5' 프라이머는 EcoRI 및 BglII 부위를 포함하였다. 3' 프라이머는 클로닝 목적을 위한 XbaI 및 BamHI 부위를 포함하였다. 수득되는 PCR 생성물을 pGEM3Z[제조원: 프로메가(Promega)]내로 EcoRI/XbaI 단편을 사용하여 서브클로닝하였다. 발현/정제 목적을 위해, 중간 T 태그를 완전한 길이의 Akt1 유전자의 5' 말단에 PCR 프라이머: 5'GTACGATGCTGAACGATATCTTCG 3'(서열번호 5)를 사용하여 부가하였다. 수득되는 PCR 생성물은 5' KpnI 부위 및 3' BamHI 부위를 포함하며, 이들은 비오틴 태그를 함유하는 곤충 세포 발현 벡터, pS2neo와 프레임을 유지하며 단편을 서브클로닝하는데 사용하였다.
Akt1의 플렉스트린(pleckstrin) 동족체 도메인(PH) 결실된(△aa 4-129, 이는 Akt1 힌지 영역의 부위의 결실을 포함한다) 버젼의 발현을 위해, PCR 결실 돌연변이유발을 pS2neo 벡터내의 완전한 길이의 Akt1 유전자를 주형으로 사용하여 수행하였다. PCR은 오버랩핑된 내부 프라이머(5'GAATACATGCCGATGGAAAGCGACGGGGCTGAAGAGATGGAGGTG 3'(서열번호 6), 및 5'CCCCTCCATCTCTTCAGCCCCGTCGCTTTCCATCGGCATGTATTC 3'(서열번호 7))를 사용하여 2 단계로 수행하였으며, 당해 프라이머는 결실과 5' 말단상에 KpnI 부위 및 중간 T 태그를 포함하는 5' 및 3' 플랭킹 프라이머를 포함하였다. 최종 PCR 생성물을 KpnI 및 SmaI으로 분해하고 pS2neo 완전한 길이의 Akt1 KpnI/SmaI 절단 벡터내로 연결하고 클론의 5' 말단을 결실된 버젼으로 효과적으로 대체하였다.
사람 Akt3 유전자를 성인 뇌 cDNA(제조원; 클론테크)의 PCR에 의해 아미노 말단 올리고 프라이머: 5'GAATTCAGATCTACCATGAGCGATGTTACCATTGTG 3'(서열번호 8); 및 카복시 말단 올리고 프라이머: 5'TCTAGATCTTATTCTCGTCCACTTGCAGAG 3'(서열번호 9)를 사용하여 증폭시켰다. 이들 프라이머는 클로닝 목적을 위한 5' EcoRI/BglII 부위 및 3' XbaI/BglII 부위를 포함하였다. 수득되는 PCR 생성물을 pGEM4Z[제조원: 프로메가(Promega)]의 EcoRI 및 XbaI 부위내로 클로닝하였다. 발현/정제 목적을 위해, 중간 T 태그를 완전한 길이의 Akt3 클론의 5' 말단에 PCR 프라이머: 5'GGTACCATGGAATACATGCCGATGGAAAGCGATGTTACCATTGTGAAG 3'(서열번호 10)을 사용하여 부가하였다. 수득되는 PCR 생성물은 비오틴 태그를 함유하는 곤충 세포 발현 벡터, pS2neo와 프레임내 클로닝을 허용한 5' KpnI 부위를 포함하였다.
사람 Akt2 유전자를 PCR에 의해 사람 전립선 cDNA(제조원: 클론테크)로부터 아미노 말단 올리고 프라이머: 5'AAGCTTAGATCTACCATGAATGAGGTGTCTGTC 3'(서열번호 11); 및 카복시 말단 올리고 프라이머: 5'GAATTCGGATCCTCACTCGCGGATGCTGGC 3'(서열번호 12)를 사용하여 증폭시켰다. 이들 프라이머는 클로닝 목적을 위한 5'HindIII/BglII 부위 및 3'EcoRI/BamHI 부위를 포함하였다. 수득되는 PCR 생성물을 pGem3Z[제조원: 프로메가(Promega)]의 HindIII/EcoRI 부위내로 서브클로닝시켰다. 발현/정제 목적을 위해, 중간 T 태그를 완전한 길이의 Akt2의 5' 말단에 PCR 프라이머: 5'GGTACCATGGAATACATGCCGATGGAAAATGAGGTGTCTGTCATCAAAG 3'(서열번호 13)를 사용하여 부가하였다. 수득되는 PCR 생성물을 pS2neo 벡터내로 위에서 기술한 바와 같이 서브클로닝하였다.
실시예 2
사람 Akt 동형 및 △ PH - Akt1 의 발현
pS2neo 발현 벡터내에 클로닝된 Akt1, Akt2, Akt3 및 DPH-Akt1 유전자를 함유하는 DNA를 정제하고 드로소필라(Drosophila) S2 세포(ATCC)를 인산칼슘 방법에 의해 형질감염시키는데 사용하였다. 항생제(G418, 500 ㎍/ml) 내성 세포의 혼주물을 선별하였다. 세포를 1.0 L 용적(약 7.0 x 106 / ml)으로 확장시키고, 비오틴 및 CuSO4를 각각 50 μM 및 50 mM의 최종 농도로 가하였다. 세포를 72시간 동안 27℃에서 성장시키고 원심분리하여 수거하였다. 세포 페이스트를 필요할 때까지 -70℃에서 동결시켰다.
실시예 3
사람 Akt 동형 및 △PH-Akt1의 정제
실시예 2에 기술된 1리터의 S2 세포로부터의 세포 페이스트를 초음파처리에 의해 완충액 A: (50mM 트리스 pH 7.4, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM AEBSF, 10㎍/ml 벤즈아미딘, 5㎍/ml의 류펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴 각각, 10% 글리세롤 및 1mM DTT) 중 1% CHAPS 50 ml로 용해하였다. 가용성 분획을 9mg/ml 항-중간 T 모노클로날 항체로 로딩된 단백질 G 세파로즈 패스트 유동[제조원: 파마시아(Pharmacia)] 컬럼 상에서 정제하고 25% 글리세롤을 함유하는 완충액 A 중 75 mM EYMPME (서열 14) 펩타이드로 용출시켰다. Akt/PKB 함유 단편을 혼주시키고 단백질 순도를 SDS-PAGE로 평가하였다. 정제된 단백질을 표준 브래드포드 프로토콜(Bradford protocol)을 사용하여 정량하였다. 정제된 단백질을 액체 질소상에서 급속 동결시키고 -70℃에서 저장하였다.
S2 세포로부터 정제된 Akt 및 Akt 플렉스트린 동족체 도메인 결실체는 활성화에 필요하였다. Akt 및 Akt 플렉스트린 동족체 도메인 결실을 10 nM PDK1[제조원; 업스테이트 바이오테크놀로지, 인코포레이티드(Upstate Biotechnology, Inc.)], 지질 비히클(10 μM 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트, 제조원: 메트레야 인코포레이티드(Metreya, Inc), 100 μM 포스파티딜콜린 및 100 μM 포스파티딜세린, 제조원: 아방띠 폴라 리피드 인코포레이티드(Avanti Polar lipids, Inc.)] 및 활성화 완충액(50 mM 트리스 pH7.4, 1.0 mM DTT, 0.1 mM EGTA, 1.0 μM 마이크로크리스틴-LR, 0.1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 333 ㎍/ml BSA 및 0.1mM EDTA)를 함유하는 반응물 속에서 활성화시켰다(참조: Alessi et al. Current Biology 7:261-269). 반응물을 22℃에서 4시간 동안 항온처리하였다. 분취량을 액체 질소 속에서 급속 동결시켰다.
실시예 4
Akt 키나제 검정
활성화된 Akt 동형 및 플렉스트린 동족체 도메인 결실 작제물을 GSK-기원한 비오티닐화된 펩타이드 기질을 사용하여 분석하였다. 펩타이드 인산화의 정도를 균일 시간 분해 형광성(Homogeneous Time Resolved Fluorescence (HTRF))에 의해 펩타이드상에서 비오틴 잔기에 결합한 스트렙타비딘-결합된 알로피코시아닌(SA-APC) 형광단과 함께 포스포펩타이드에 대해 특이적인 란타나이드 킬레이트(Lance)-커플링된 모노클로날 항체를 사용하여 측정하였다. 란스(Lance)와 APC가 근접한 경우(즉, 동일한 포스포펩타이드 분자에 결합한 경우), 비-조사 에너지 전달이 란스로부터 APC로 일어난 후 APC로부터 665 nm에서 광이 방사된다.
검정에 필요한 재료:
A. 활성화된 Akt 동질효소 또는 플렉스트린 동족체 도메인 결실된 작제물
B. Akt 펩타이드 기질: GSK3a (S21) 펩타이드 #3928 비오틴-GGRARTSSFAEPG (서열번호 15), 거대분자 공급원.
C. 항-포스포 GSK3α 모노클로날 항체로 표지된 란스[제조원: 셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 클론 # 27).
D. SA-APC[제조원: 프로자임(Prozyme) 제품 번호 제PJ25S호 lot # 896067].
E. Microfluor®B U 바닥 미세역가 플레이트(Bottom Microtiter Plate)[제조원: 다이넥스 테크놀로지스(Dynex Technologies), 제품 번호 제7205호).
F. Discovery® HTRF 마이크로플레이트 분석기[제조원: 패커드 인스트루먼트 캄파니(Packard Instrument Company)].
G. 100 X 프로테아제 억제제 칵테일(PIC): 1 mg/ml 벤즈아미딘, 0.5 mg/ml 펩스타틴, 0.5 mg/ml 류펩틴, 0.5 mg/ml 아프로티닌.
H. 10X 검정 완충액: 500 mM HEPES, pH 7.5, 1% PEG, mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% BSA, 20 mM 9-글리세롤 포스페이트.
I. 퀀칭 완충액(Quench Buffer): 50 mM HEPES pH 7.3, 16.6 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.1% 트리톤 X-100, 0.17 nM 란스로 표지된 모노클로날 항체 클론 번호 # 27, 0.0067 mg/ml SA-APC.
J. ATP/MgCl2 작업 용액: 1X 검정 완충액, 1 mM DTT, 1X PIC, 125 mM KCl, 5% 글리세롤, 25 mM MgCl2, 375 TM ATP
K. 효소 작업 용액: 1X 검정 완충액, 1 mM DTT, 1X PIC, 5% 글리세롤, 활성 Akt. 최종 효소 농도를 선택하여 검정이 선형 반응 범위내 있도록 하였다.
L. 펩타이드 작업 용액: 1X 검정 완충액, 1 mM DTT, 1X PIC, 5% 글리세롤, 2 TM GSK3 비오티닐화된 펩타이드 # 3928.
반응을 16TL의 ATP/MgCl2 작업 용액을 96-웰 미세역가 플레이트의 적절한 웰에 가하여 조립하였다. 억제제 또는 비히클(1.0 Tl)을 가한 후 10 Tl의 펩타이드 작업 용액을 가하였다. 반응을 13 Tl의 효소 작업 용액을 가하고 혼합하여 개시하였다. 반응이 50분 동안 진행되도록 한 후 60 Tl HTRF 적정 완충액을 첨가하여 중 지시켰다. 중지된 반응물을 실온에서 적어도 30분 동안 항온처리한 후 디스커버리 인스트루먼트(Discovery instrument) 상에서 판독하였다.
스트렙타비딘 플래시 플레이트 검정 과정:
단계 1:
100% DMSO 중 1 ㎕의 시험 화합물의 용액을 20 ㎕의 2X 기질 용액(20 μM GSK3 펩타이드, 300 μM ATP, 20 mM MgCl2, 20 μCi / ml [γ33P] ATP, 1X 검정 완충액, 5% 글리세롤, 1 mM DTT, 1X PIC, 0.1% BSA 및 100 mM KCl)에 가하였다. 인산화 반응을 19㎕의 2X 효소 용액(6.4 nM 활성 Akt/PKB, 1X 검정 완충액, 5% 글리세롤, 1 mM DTT, 1X PIC 및 0.1% BSA)을 가하여 개시하였다. 이후에, 반응물을 실온에서 45분 동안 항온처리하였다.
단계 2:
반응을 170 ㎕의 125 mM EDTA를 가하여 중지하였다. 200 ㎕의 중지된 반응물을 스트렙타비딘 Flashplate？ PLUS[제조원: 뉴 라이프 사이언스(NEN Life Sciences), 제품 번호 SMP103)에 이동시켰다. 플레이트를 >10 분 동안 실온에서 플레이트 진탕기상에서 항온처리하였다. 각각의 웰의 성분을 통기시키고, 웰을 웰당 200 ㎕의 TBS로 세척하였다. 이후에, 웰을 웰당 200 ml의 TBS를 사용하여 5분 동안 3회 세척하면서 당해 플레이트를 실온에서 플랫폼 진탕기 상에서 세척 단계 동안 항온처리하였다.
플레이트를 밀봉 테이프로 덮고 패커드 톱카운트(Packard TopCount)를 사용하여 플래시플레이트내에서 [33P]를 계수하기 위한 적절한 세팅을 사용하여 계수하였다.
스트렙타비딘 필터 플레이트 검정 과정:
단계 1:
상기 스트렙타비딘 플래시 플레이트 검정의 단계 1에 기술된 바와 같은 효소 반응을 수행하였다.
단계 2:
반응을 20 ㎕의 7.5M 구아니딘 하이드로클로라이드를 가하여 중지시켰다. 50 ㎕의 중지된 반응물을 스트렙타비딘 필터 플레이트[SAM2TM 비오틴 캡쳐 플레이트, 제조원: 프로메가(Promega), 제품 번호 V7542]에 이동시키고 반응물을 필터상에서 1 내지 2분 동안 항온처리한 후 진공에 적용시켰다.
이후에, 플레이트를 다음과 같이 진공을 수회 사용하여 세척하였다: 1) 4 x 200 ㎕/웰의 2M NaCl; 2) 6 x 200 ㎕/웰의 2M NaCl과 1% H3PO4; 3) 2 x 200 ㎕/웰의 diH20; 및 4) 2 x 100 ㎕/웰의 95% 에탄올. 이후에, 막을 완전히 공기 건조시킨 후 섬광제를 가하였다.
플레이트의 바닥을 백색 백킹 테이프(backing tape)로 밀봉하고, 30 ㎕/웰의 마이크로씬트(Microscint) 20[제조원: 패커드 인스트루먼츠(Packard Instruments), 제품 번호 6013621]을 가하였다. 플레이트의 상부를 투명한 실링 테이프로 밀봉한 후, 플레이트를 패커드 톱카운트(Packard TopCount)를 사용하여 [33P]에 대해 적절한 셋팅과 액체 섬광제를 사용하여 계수하였다.
포스포셀룰로즈 필터 플레이트 검정 과정:
단계 1:
효소 반응을 비오틴-GGRARTSSFAEPG 대신에 기질로서 KKGGRARTSSFAEPG (서열번호 16)을 사용하는 스트렙타비딘 플래시 플레이트 검정(상기)의 단계 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.
단계 2:
반응을 20 ㎕의 0.75% H3PO4를 가하여 중지시켰다. 50 ㎕의 중지된 반응물을 필터 플레이트[UNIFILTERTM, 와트만 P81 강력한 양이온 교환, 백색 폴리스티렌 96 웰 플레이트, 제조원: 폴리필트로닉스(Polyfiltronics), 제품 번호 7700-3312]로 이동시키고 반응물을 필터 상에서 1 내지 2분 동안 항온처리한 후 진공에 적용하였다.
이후에, 플레이트를 다음과 같이 진공을 수회 사용하여 세척하였다: 1) 9 x 200 ㎕/웰의 0.75% H3PO4; 및 2) 2 x 200 ㎕/웰의 diH20. 플레이트의 바닥을 백색 백킹 테이프로 밀봉한 후, 30 ㎕/웰의 마이크로씬트 20을 가하였다. 플레이트의 상부를 투명한 밀봉 테이프로 밀봉하고, 플레이트를 패커드 톱카운트를 사용하여 [33P]에 대한 적절한 셋팅 및 액체 섬광제로 계수하였다.
PKA 검정:
각각의 개개의 PKA 검정은 다음 성분들로 이루어진다:
A. 5X PKA 검정 완충액(200 mM 트리스 pH7.5, 100 mM MgCl2, 5mM β-머캅토에탄올, 0.5 mM EDTA)
B. 물에 희석시킨 50 μM 스톡의 켐타이드(Kemptide)[제조원: 시그마(Sigma)]
C. 1.0 ㎕의 33P-ATP [10 mCi/ml]를 200 Tl의 표지되지 않은 ATP의 50 μM 스톡으로 희석시켜 제조한 33P-ATP
D. 0.5mg/ml BSA 중에 희석시킨 10 ㎕의 PKA 촉매 서브유닛의 70 nM 스톡(UBI 제품 번호 14-114)
E. PKA/켐타이드 작업 용액: 동일한 용적의 5X PKA 검정 완충액, 켐타이드 용액 및 PKA 촉매 서브유닛.
반응물을 96 깊은-웰 검정 플레이트 속에서 조립한다. 억제제 또는 비히클(10 Tl)을 10 Tl의 33P-ATP 용액에 가하였다. 반응을 30 Tl의 PKA/켐타이드 작업 용액을 각각의 웰에 가하여 개시한다. 반응물을 혼합하고 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 반응을 50 Tl의 100 mM EDTA 및 100 mM 나트륨 피로포스페이트를 가하고 혼합하여 중지시켰다.
효소 반응 생성물(인산화된 켐타이드)을 p81 포스포셀룰로즈 96 웰 필터 플레이트[제조원: 밀리포어(Millipore)] 상에서 수집하였다. 플레이트를 제조하기 위해, 각각의 웰의 p81 필터 플레이트를 75 mM 인산으로 여과하였다. 웰을 필터를 통해 진공을 플레이트의 바닥에 적용시켜 비웠다. 인산(75 mM, 170 ㎕)을 각각의 웰에 가하였다. 각각의 중지된 PKA 반응물로부터 30 ㎕ 분취량을 상응하는 웰에 인산을 함유하는 필터 플레이트 상에서 가하였다. 펩타이드를 필터 상에서 트랩(trap)한 후 진공을 적용시키고 필터를 75 mM 인산으로 5회 세척하였다. 최종 세척 후, 필터를 공기 건조시켰다. 섬광 유액(30 ㎕)을 각각의 웰에 가하고 필터를 톱카운트(제조원: 패커드) 상에서 계수하였다.
PKC 검정:
각각의 PKC 검정은 다음 성분들로 이루어진다:
A. 10X PKC 공동-활성화 완충액: 2.5 mM EGTA, 4mM CaCl2
B. 5X PKC 활성화 완충액: 1.6 mg/ml 포스파티딜세린, 0.16 mg/ml 디아실글리세롤, 100 mM 트리스 pH 7.5, 50 mM MgCl2, 5 mM β-머캅토에탄올
C. 1.0 ㎕의 33P-ATP [10 mCi/ml]를 100㎕의 표지되지 않은 ATP의 100 mM 스톡으로 희석시켜 제조한33P-ATP
D. 물에 희석시킨 미엘린 염기성 단백질(350 ㎍/ml, UBI)
E. 0.5 mg/ml BSA로 희석시킨 PKC (50ng/ml, UBI 제품번호 14-115)
F. PKC/미엘린 염기성 단백질 작업 용액: 각각의 PKC 공동-활성화 완충액과 미엘린 염기성 단백질을 10 용적의 각각의 PKC 활성화 완충액 및 PKC와 혼합하여 제조함
검정을 96 깊은-웰 검정 플레이트 속에서 조립하였다. 억제제 또는 비히클(10 Tl)을 5.0 ㎕의 33P-ATP에 가하였다. 반응을 PKC/미엘린 염기성 단백질 작업 용액을 첨가하고 혼합하여 개시하였다. 반응물을 30℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 반응을 50 Tl의 100 mM EDTA 및 100 mM 나트륨 피로포스페이트를 가하여 중지시켰다. 인산화된 미엘린 염기성 단백질을 PVDF 막 상에서 96 웰 필터 플레이트 속에서 수집하고 섬광 계수로 정량화하였다.
반응식 및 표에 기술된 본 발명의 화합물을 상기 기술된 검정에서 시험하였으며 하나 이상의 Akt1, Akt2 및 Akt3에 대해 < 50 μM의 IC50을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 5
Akt / PKB 의 억제를 측정하기 위한 세포 기반 검정
세포(예를 들면, 활성화된 Akt/PKB를 갖는 LnCaP 또는 PTEN(-/-) 종양 세포주)를 100 mM 디쉬에 플레이팅하였다. 세포가 대략 70 내지 80% 컨플루언트(confluent)할 때, 세포에 5 ml의 새로운 배지를 재공급하고 시험 화합물을 용액 속에 가하였다. 대조군은 처리되지 않은 세포, 비히클 처리된 세포 및 LY294002(제조원: 시그마) 또는 워트만닌(wortmanin)(제조원: 시그마)을 각각 20 μM 또는 200 nM에서 처리한 세포를 포함하였다. 세포를 2, 4 또는 6시간 동안 항온배양하고, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 스크래핑하여 원심분리 튜브로 이동시켰다. 이들을 펠릿화하고 PBS로 다시 세척하였다. 최종적으로, 세포 펠릿을 용해 완충액(20 mM 트리스 pH8, 140 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% 트리톤, 1 mM Na 피로포스페이트, 10 mM β-글리세롤 포스페이트, 10 mM NaF, 0.5 mm NaVO4, 1 μM 마이크로시스틴, 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일) 속에 재현탁시키고, 빙상에 15분 동안 두고 서서히 와동시켜 세포를 용해하였다. 분해물을 벡크만 테이블톱 울트라 원심분리기(Beckman tabletop ultra centrifuge) 속에서 100,000 x g로 4℃에서 20분 동안 회전시켰다. 상청액 단백질을 표준 브래드포드 프로토콜(standard Bradford protocol)[제조원: 바이로라드(BioRad)]로 정량화하고 필요할 때까지 -70℃에서 저장하였다.
단백질을 다음과 같이 투명한 용해물로부터 면역침전(IP)시켰다: Akt1/PKBα의 경우, 용해물을 NETN (100mM NaCl, 20mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA, 0.5% NP-40) 중 산타 크루즈(Santa Cruz) sc-7126 (D-17)과 혼합하고 단백질 A/G 아가로즈(산타 크루즈 sc-2003)를 가하였다. Akt2/PKBβ의 경우, 용해물을 NETN 속에서 항-Akt2 아가로즈[제조원: 업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology) 제품 번호 16-174)와 혼합하고 Akt3/PKBγ의 경우, 용해물을 NETN와 항-Akt3 아가로즈(제조원: 업스테이트 바이오테크놀로지, 제품 번호 16-175)와 혼합하였다. IP를 밤새 4 ℃에서 항온처리하고, 세척하며, SDS-PAGE로 분리하였다.
웨스턴 블롯을 사용하여 총 Akt, pThr308 Akt1, pSer473 Akt1, 및 Akt2 및 Akt3 상의 상응하는 인산화 부위, 및 Akt의 하류 표적을 특이적 항체[제조원: 셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)]: 항-총 Akt (제품 번호 9272), 항-포스포 Akt 계열 473 (제품 번호 9271), 및 항-포스포 Akt 트레오닌 308 (제품 번호 9275)를 사용하여 분석하였다. PBS + 0.5% 탈지 분유(NFDM) 속에서 4℃로 밤새 희석시킨 적절한 1차 항체와 항온처리한 후, 블롯을 세척하고, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-태그화된 제2 항체와 함께 PBS + 0.5% NFDM 속에서 1시간 동안 실온으로 항온처리하였다. 단백질을 ECL 시약[제조원: 애머샴/파마시아 바이오테크(Amersham/Pharmacia Biotech) RPN2134]을 사용하여 검출하였다.
실시예 6
헤레굴린 자극된 Akt 활성화
MCF7 세포(PTEN+/+인 사람 유방암 세포주)를 1x106 세포/100mM 플레이트로 플레이팅하였다. 세포가 70 내지 80% 컨플루언트(confluent)할 때, 이들에 5 ml의 혈청 유리된 배지를 재공급하고 밤새 항온배양하였다. 다음날 아침, 화합물을 가하고 세포를 1 내지 2시간 동안 항온배양한 후, 이때 헤레굴린을 30분 동안 가하여 Akt의 활성화를 유도하고 세포를 위에서 기술한 바와 같이 분석하였다.
실시예 7
종양 성장의 억제
암 세포의 성장의 억제제의 생체내 효능을 당해 분야에 익히 공지된 몇가지 프로토콜에 의해 확인할 수 있다.
PI3K 경로(예를 들면, LnCaP, PC3, C33a, OVCAR-3, MDA-MB-468, A2780 등)의 탈조절을 나타내는 사람 종양 세포를 6 내지 10주령의 암컷 누드(또는 10 내지 14주령의 수컷 마우스)의 좌측 옆구리에 피하주사하여 0일째에 전립선 종양 이종이식[LnCaP 및 PC3] 마우스[제조원: 하를란(Harlan)]에 사용한다. 마우스를 비히클, 화합물 또는 병용 치료 그룹으로 무작위적으로 배정한다. 매일 피하 투여를 1일 째에 시작하여 시험 동안 지속한다. 달리는, 억제제 시험 화합물을 연속 주입 펌프로 투여할 수 있다. 화합물, 화합물 조합 또는 비히클을 총 0.2ml의 용적으로 전달한다. 모든 비히클-처리된 동물이, 세포를 주사한 후 통상적으로 4 내지 5.5주째에 직경이 0.5 내지 1.0cm의 병변을 나타내는 경우 종양을 절개하여 칭량한다. 각각의 처리 그룹에서 각각의 세포주에 대해 종양의 평균 중량을 계산한다.
실시예 8
스폿 멀티플렉스 검정(Spot Multiplex Assay )
당해 과정은 96 웰 포맷 플레이트의 동일한 웰 속에서 다수의 인산화된 단백질을 검출하는데 사용된 샌드위치 면역검정(sandwich immunoassay)을 기술한다. 세포 용해물을, 상이한 포획 항체가 동일한 웰내 공간적으로 상이한 스폿상에 위치하는 96-웰 플레이트 속에서 항온처리한다. 인산화-특이적인 토끼 폴리클로날 항 체를 가하고 복합체를 전기화학발광 태그로 표지한 항-토끼 항체로 검출한다.
96-웰 LNCaP 플레이트 +/- 화합물:
벡크만(Beckman J6) 속에서 1200 rpm으로 10분 동안 회전시키고, 배지를 통기시킨다. 50㎕/웰: TBS[제조원: 피어스(Pierce) #28376-20mM 트리스 pH 7.5, 150mM NaCl] + 1% 트리톤 X-100 + 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 가한다. 플라스틱 랩으로 랩핑하고, -70℃ 동결건조기 속에 완전히 동결할 때까지 둔다. 1X 트리스 세척 완충액, 150㎕/웰 속에 3% 블록커 A를 사용하여 멀티플렉스 플레이트(Multiplex Plates)[제조원: 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) 미국 매릴랜드주 게이터스부르그 소재]를 차단시킨다. 플레이트 밀봉기로 덮고, 마이크로믹스 진탕기 상에서 실온으로 2시간(최소) 항온처리한다. 1X RCM 51(TTBS)로 세척한다. 세포 용해물 플레이트를 빙상에서 해동시키고, 40㎕의 분해물/웰을 차단된 플레이트에 가한다. 플레이트 밀봉기를 덮고, 마이크로믹스 진탕기 상에서 4℃ O/N 상에서 항온처리하고 1X RCM 51으로 세척하였다. 제2 항체를 1X 트리스 세척 완충액[항 포스포 AKT(T308), 항 포스포 투베린(T1462) 단독 또는 함께] 속에서 1% 차단제(Blocker) A에 희석시켰다. 25㎕/웰을 가하고, 플레이트 밀봉기로 덮고, 마이크로믹스 진탕기 상에서 실온으로 3시간 동안 항온처리한다. 1X RCM 51로 세척한다. Ru-GAR을 1X 트리스 세척 완충액 중 1% 차단제 A 속에서 희석한다. 25㎕/웰을 가하고, 플레이트 밀봉기로 덮고, 마이크로믹스 진탕기 상에서 실온으로 1시간 동안 항온처리한다. 1X RCM 51로 세척한다. 4X 판독 완충액 T를 1X로 물을 사용하여 희석시키고, 200㎕의 희석된 판독 완충액/웰을 가한다.
Sector 6000 Imager에서 판독한다.
프로테아제 및 포스파타제 억제제:
마이크로크리스틴-LR, [제조원: 칼바이오켐(Calbiochem), 제품 번호 475815 1μM 최종 농도(스톡 = 500μM)
칼바이오켐 제품 번호 524624, 100X 세트 I
칼바이오켐 제품 번호 524625, 100X 세트 II
칼바이오켐 제품 번호 539134, 100X 세트 III
항 포스포 AKT ( T308 ):
셀 시그날링 테크놀로지즈(Cell Signaling Technologies) 제품 번호 9275
항 포스포 투베린 ( T1462 ):
정제된 코반스 친화성(Covance Affinity)(토끼 MS 2731/2732)
Ru - GAR = 루테닐화된 염소 항 토끼
10X 트리스 세척 완충액 , 차단제 A 및 4X 판독 완충액 T
10X RCM 51 (10X TTBS , RCM 51)
1X = 20mM 트리스 pH 7.5, 140mM NaCl, 0.1% 트윈-20
실시예 9
세포-기반( 생체내 ) 검정
당해 과정은 Akt 세린/트레오닌 키나제에 대한 세포-기반(생체내) 활성 검정 을 기술한다. 활성화된 내인성 Akt는 비오티닐화된 특이적 Akt 기질(GSK3β) 펩타이드를 인산화할 수 있다. 검출은 균일 시간 분해 형광성(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)(HTRF)에 의해 펩타이드상의 비오틴 잔기에 결합한 포스포펩타이드에 대해 특이적인 유로피움 크립테이트(Europium Kryptate) [Eu(K)] 커플링된 항체 및 스트렙타비딘 결합된 XL665 형광단을 사용하여 수행한다. [Eu(K)]와 XL665가 근접한 경우(즉, 동일한 포스포펩타이드 분자에 결합한 경우), 비-조사 에너지 전달은 Eu(K)로부터 XL665로 일어난 후 XL665로부터 665 nm에서 광이 방사된다.
당해 검정을 사용하여 특이 항체가 각각 존재하는 경우 다수의 상이한 종으로부터의 모든 3개의 Akt 동질효소(Akt1, Akt2, 및 Akt3)의 억제제를 검출할 수 있다.
재료 및 시약
A. 세포 배양 미세역가 평저 96 웰 플레이트[제조원: 코닝 코스타(Corning Costar), 제품 번호 3598]
B. 리엑티-결합(Reacti-Bind) 단백질 A 피복된 96-웰 플레이트[제조원: 피어스(Pierce), 제품 번호 15130].
C. 리엑티-결합 단백질 G 피복된 96-웰 플레이트(제조원: 피어스, 제품 번호 15131).
D. 마이크로믹스 5 진탕기.
E. Microfluor® U 바닥 미세역가 플레이트[제조원: 다이넥스 테크놀로지스(Dynex Technologies), 제품 번호 7205].
F. 96 웰 플레이트 세척기[제조원: 바이오-테크 인스트루먼츠(Bio-Tek Instruments), 제품 번호 EL 404).
G. Discovery® HTRF 마이크로플레이트 분석기[제조원: 패커드 인스트루먼트 캄파니(Packard Instrument Company)].
완충액 용액
A. IP 키나제 세포 용해 완충액: 1X TBS; 0.2% 트윈 20; 1X 프로테아제 억제제 칵테일 III(스톡은 100X, 제조원: 칼바이오켐, 539134); 1X 포스파타제 억제제 칵테일(스톡은 100X, 칼바이오켐, 524624); 및 1X 포스파타제 억제제 칵테일 II(스톡은 100X, 칼바이오켐, 524625).
B. 10X 검정 완충액: 500 mM 헤페스(Hepes) pH 7.5; 1% PEG; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 및 20 mM β-글리세로포스페이트.
C. IP 키나제 검정 완충액: 1X 검정 완충액; 50 mM KCl; 150 μM ATP; 10 mM MgCl2; 5% 글리세롤; 1 mM DTT; 1개 정제 프로테아제 억제제 칵테일/50 ml 검정 완충액; 및 0.1% BSA
D. GSK3β 기질 용액: IP 키나제 검정 완충액; 및 500 nM 비오티닐화된 GSK3β 펩타이드.
E. 란스(Lance) 완충액: 50 mM 헤페스 pH 7.5; 0.1% BSA; 및 0.1% 트리톤 X-100.
F. 란스 정지 완충액: 란스 완충액; 및 33.3 mM EDTA.
G. 란스 검출 완충액: 란스 완충액; 13.3 ㎍/ml SA-APC; 및 0.665 nM EuK Ab a-포스포(Ser-21) GSK3β
다-단계 면역침전 Akt 키나제 검정
1일째
A. C33a 세포 씨딩 단계: 96 웰 미세역가 플레이트 속에 60,000개 C33a 세포/웰을 플레이팅한다.
B. 세포를 밤새 37℃에서 항온배양한다.
2일째
D. 화합물 첨가 단계: 신선한 배지(알파-MEM/10% FBS, 실온) 중 화합물을 상기로부터의 96 웰 플레이트에 가하고 5시간 동안 조직 배양 항온배양기 속에서 항온배양한다.
E. 세포 용해 단계: 배지를 통기시키고 100㎕의 IP 키나제 세포 용해 완충액을 가한다.
F. 96 웰 미세역가 플레이트를 -70℃에서 동결시킨다(주: 당해 단계는 최소 1시간 또는 밤새 수행할 수 있다).
3일째
G. 단백질 A/G 96 웰 플레이트 피복 단계: 100㎕의 PBS 중 적절한 농도의 α-Akt 항체(Akt1, Akt2, 또는 Akt3)를 다음 웰에 가한다:
α-Akt 1(20 ng/웰/100㎕) B2 >>>>>> B10/B - G 행/Akt1 플레이트
α-Akt 2(50 ng/웰/100㎕) B2 >>>>>> B10/B - G 행/Akt2 플레이트
토끼-IgG (150 ng/웰/100 ㎕): 각각의 플레이트 상의 B11 - G11(Akt1 및 Akt2)
H. 냉실(+4℃)에서 4시간 동안 마이크로믹스 5(제20형; 애티튜드(Attitude) 2) 상에서 항온배양한다(주: 애티튜드는 마이크로믹스 5 기계에 의존한다).
I. α-Akt 항체 용액을 통기 제거하고 100㎕의 PBS를 각각의 웰에 가한다.
J. Akt 면역침전 단계: 단계 (I)로부터의 PBS 100㎕에 5㎕의 해동된 세포 용해물을 Akt1 플레이트에 대해 및 10㎕의 해동된 세포 용해물을 Akt2 플레이트에 대해 가한다. 주: 세포 용해물을 빙상에서 해동한다. 해동된 분해물을 10회 상하로 피펫팅하여 혼합한 후 항체 플레이트로 이동시킨다. 세포 용해물 플레이트를 빙상에서 유지시킨다. 세포 용해물을 항체 플레이트로 이동시킨 후 세포 용해물 플레이트를 -70℃에서 재동결시킨다.
K. 냉실(+4℃)에서 밤새 마이크로믹스 5 진탕기(제20형, 애티튜드 3) 상에서 항온처리한다.
4일째
L. 면역침전 플레이트 세척 단계: 96 웰 플레이트 1X를 TTBS (RCM 51, 1X = 2 주기)로 96-웰 플레이트 세척기를 사용하여 세척한다. 웰을 TTBS로 여과하고 10 분 동안 항온처리한다. 96 웰 플레이트 2X를 TTBS로 세척한다(주: 사용 전에 플레이트 세척기를 프라이밍한다: 1. 완충액 저장기를 점검하여 이들이 충진되어 있음을 확인하고 2. 세척물 용기를 비운다).
M. 수동식 플레이트 세척 단계: 180㎕의 IP 키나제 검정 완충액을 가한다.
N. Akt 효소 반응을 개시한다: 상청액을 통기시킨다. 60㎕의 GSK3β 기질 용액을 가한다.
O. 2.5시간 동안 마이크로믹스(Micromix) 5 진탕기 상에서 실온으로 항온처리한다. 주: 항온처리 시간을 조절하여 컬럼 10/컬럼 11의 비가 >10이 되지 않도록 한다.
P. 30㎕의 란스 검출 완충액을 30㎕의 란스 정지 완충액(총 60㎕/웰)과 합하고 마이크로플루오르 U 바닥 96 웰 차단 플레이트에 가한다.
Q. Akt 효소 반응을 정지시킨다: 단계 (O)로부터의 40㎕의 Akt 효소 반응 혼합물/G 96 웰 플레이트를 단계 (P)로부터의 마이크로플루오르 U 바닥 96 웰 차단 플레이트로 이동시킨다.
U. 실온에서 1 내지 2시간 동안 마이크로믹스 5 진탕기(제20형, 애티튜드 3) 상에서 항온처리한 후, 디스커러리(Discovery) HTRF 마이크로플레이트 분석기를 사용하여 Akt 프로그램으로 판독한다.
IP 키나제 세포 용해 완충액
100㎕ / 웰
8ml
(1개 플레이트)		 45ml
(6개 플레이트)
1X TBS
트윈 20
1X 프로테아제 억제제 칵테일 III
1X 포스파타제 억제제 칵테일
I
1X 포스파타제 억제제 칵테일
II
마이크로크리스틴 LR(500X)		 7744㎕
20㎕
80㎕

80㎕

80㎕		 NA
NA
NA
450㎕
450㎕
450㎕

90㎕
IP 키나제 검정 완충액
100㎕ / 웰
8ml
(1개 플레이트)		 50ml
(3개 플레이트)
10X 검정 완충액
1M KCl
250mM ATP
1M MgCl2
글리세롤
1M DTT
프로테아제 억제제 칵테일
10% BSA
di dH2O		 800㎕
400㎕
4.8㎕
80㎕
400㎕
8㎕
1정제/50ml
80㎕
6227.2㎕		 5ml
2.5ml
30㎕
500㎕
2.5ml
50㎕
1
500㎕
38.9ml
GSK3 β 기질 용액
60㎕ / 웰
5ml
(1개 플레이트)		 7ml
IP 키나제 검정 완충액
1mM GSK3β 펩타이드		 5ml
2.5㎕		 -
3.5㎕
란스 정지 완충액
30㎕ / 웰
3ml
(1개 플레이트)		 5ml 5ml
1X 란스 완충액
EDTA 0.5M		 2800.2㎕
199.8㎕
란스 검출 완충액
30㎕ / 웰
3ml
(1개 플레이트)		 5ml
SA-APC(ddH2O중 1mg/ml, 란스 완충액 속에서 1/75.2로 희석)
EuK Ab a-포스포(Ser 21)GSK3β(680 nM, 란스 완충액 속에서 1/1133으로 희석)		 40㎕

2.7㎕		 66.7㎕

4.5㎕
<110> Merck & Co., Inc. <120> Inhibitors of Akt activity <130> 22304YS <150> US 60/873,198 <151> 2006-12-06 <150> US 60/880,661 <151> 2007-01-16 <150> US 60/967,872 <151> 2007-09-06 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 1 ctgcggccgc 10 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 2 gtacgcggcc gcag 14 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 3 cgcgaattca gatctaccat gagcgacgtg gctattgtg 39 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 4 cgctctagag gatcctcagg ccgtgctgct ggc 33 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 5 gtacgatgct gaacgatatc ttcg 24 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 6 gaatacatgc cgatggaaag cgacggggct gaagagatgg aggtg 45 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 7 cccctccatc tcttcagccc cgtcgctttc catcggcatg tattc 45 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 8 gaattcagat ctaccatgag cgatgttacc attgtg 36 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 9 tctagatctt attctcgtcc acttgcagag 30 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 10 ggtaccatgg aatacatgcc gatggaaagc gatgttacca ttgtgaag 48 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 11 aagcttagat ctaccatgaa tgaggtgtct gtc 33 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 12 gaattcggat cctcactcgc ggatgctggc 30 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic DNA Sequence <400> 13 ggtaccatgg aatacatgcc gatggaaaat gaggtgtctg tcatcaaag 49 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic Amino Acid Sequence <400> 14 Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic Amino Acid Sequence <400> 15 Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic Amino Acid Sequence <400> 16 Lys Lys Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly 1 5 10 15

Claims (10)

  1. 화학식 C의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 토토머 또는 입체이성체.
    [화학식 C]
    Figure 112009049190501-pct00029
    상기 화학식 C에서,
    a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이며; m은 0, 1 또는 2이고; p는 0, 1 또는 2이고;
    점선은 임의의 이중결합을 나타내고;
    R2는 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, CO2H, 할로, OH 및 NH2로부터 독립적으로 선택되며;
    환 Y는 (C4-C7)사이클로알킬이고;
    R1은 H, 옥소, (C=O)aOb(C1-C10)알킬, (C=O)aOb-아릴, (C=O)aOb(C2-C10)알케닐, (C=O)aOb(C2-C10)알키닐, CO2H, 할로, OH, Ob(C1-C6)퍼플루오로알킬, (C=O)aNR7R8, CN, (C=O)aOb(C3-C8)사이클로알킬, S(O)mNR7R8, SH, S(O)m-(C1-C10)알킬 및 (C=O)aOb-헤테로사이클릴 중에서 선택되며, 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴은 R6으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고;
    R6은 (C=O)aObC1-C10 알킬, (C=O)aOb아릴, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, (C=O)aOb 헤테로사이클릴, CO2H, 할로, CN, OH, ObC1-C6 퍼플루오로알킬, Oa(C=O)bNR7R8, 옥소, CHO, (N=O)R7R8, S(O)mNR7R8, SH, S(O)m-(C1-C10)알킬 또는 (C=O)aObC3-C8 사이클로알킬이고, 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로사이클릴 및 사이클로알킬은 R6a로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되며;
    R6a는 (C=O)aOb(C1-C10)알킬, Oa(C1-C3)퍼플루오로알킬, (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, SH, 옥소, OH, 할로, CN, (C2-C10)알케닐, (C2-C10)알키닐, (C3-C6)사이클로알킬, (C0-C6)알킬렌-아릴, (C0-C6)알킬렌-헤테로사이클릴, (C0-C6)알킬렌-N(Rb)2, C(O)Ra, (C0-C6)알킬렌-CO2Ra, C(O)H 및 (C0-C6)알킬렌-CO2H로부터 선택되고, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로사이클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, Oa(C=O)b(C1-C6)알킬, 옥소 및 N(Rb)2로부터 선택된 3개 이하의 치환체로 임의로 치환되며;
    R7 및 R8은 H, (C=O)aOb(C1-C10)알킬, (C=O)aOb(C3-C8)사이클로알킬, (C=O)aOb-아릴, (C=O)aOb-헤테로사이클릴, (C2-C10)알케닐, (C2-C10)알키닐, SH, SO2Ra 및 (C=O)aNRb 2로부터 독립적으로 선택되고, 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 알케닐 및 알키닐은 R6a로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되거나, 또는 R7 및 R8은, 이들이 결합하고 있는 질소와 함께, 질소 외에도 N, O 및 S 중에서 선택된 1개 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 3원 내지 7원의 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있으며, 상기 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 헤테로사이클은 R6a로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고;
    Ra는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클릴이며;
    Rb는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬이다.
  2. 화학식 E의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    [화학식 E]
    Figure 112009034291316-pct00024
    상기 화학식 E에서,
    Figure 112009034291316-pct00025
    는
    Figure 112009034291316-pct00026
    또는
    Figure 112009034291316-pct00027
    이고;
    환 Y는 사이클로부틸이고;
    R1은 H, 피리미딜, 메틸이미다졸, OH, 메틸 또는 사이클로프로필이다.
  3. 1-{4-[3-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일]페닐}사이클로부탄아민 디하이드로클로라이드인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  4. 3급-부틸{1-[4-(9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부틸}카바메이트인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  5. 1-[4-(9-페닐-3-피리미딘-2-일[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  6. 8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-3(2H)-온인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  7. 1-[4-(3-메틸-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  8. 1-[4-(3-사이클로프로필-9-페닐[1,2,4]트리아졸로[3,4-f]-1,6-나프티리딘-8-일)페닐]사이클로부탄아민인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  9. 삭제
  10. 삭제
KR1020097011729A 2006-12-06 2007-12-03 Ａｋｔ 활성의 억제제 KR101110598B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87319806P 2006-12-06 2006-12-06
US60/873,198 2006-12-06
US88066107P 2007-01-16 2007-01-16
US60/880,661 2007-01-16
US96787207P 2007-09-06 2007-09-06
US60/967,872 2007-09-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090086095A KR20090086095A (ko) 2009-08-10
KR101110598B1 true KR101110598B1 (ko) 2012-03-08

Family

ID=39492823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097011729A KR101110598B1 (ko) 2006-12-06 2007-12-03 Ａｋｔ 활성의 억제제

Country Status (30)

Country Link
US (3) US7576209B2 (ko)
EP (1) EP2104669B1 (ko)
JP (2) JP4431636B1 (ko)
KR (1) KR101110598B1 (ko)
CN (1) CN101600706B (ko)
AR (1) AR064010A1 (ko)
AU (1) AU2007328286B2 (ko)
BR (1) BRPI0719580A2 (ko)
CA (1) CA2670760C (ko)
CL (1) CL2007003495A1 (ko)
CO (1) CO6190528A2 (ko)
CR (1) CR10851A (ko)
EA (1) EA016195B1 (ko)
EC (1) ECSP099376A (ko)
ES (1) ES2527567T3 (ko)
GE (1) GEP20125469B (ko)
GT (1) GT200900146A (ko)
HK (1) HK1137758A1 (ko)
HN (1) HN2009001112A (ko)
IL (2) IL198826A (ko)
MA (1) MA31027B1 (ko)
MX (1) MX2009006052A (ko)
NI (1) NI200900106A (ko)
NO (1) NO20092569L (ko)
NZ (2) NZ577470A (ko)
PE (1) PE20081341A1 (ko)
SV (1) SV2009003283A (ko)
TN (1) TN2009000224A1 (ko)
TW (1) TWI386410B (ko)
WO (2) WO2008070016A2 (ko)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2007015578A (es) * 2005-06-10 2008-03-06 Merck & Co Inc Inhibidores de la actividad akt.
AR064010A1 (es) * 2006-12-06 2009-03-04 Merck & Co Inc Inhibidores de la actividad de la akt
EP2120951A4 (en) * 2006-12-06 2012-02-15 Merck Sharp & Dohme INHIBITORS OF AKT ACTIVITY
US20100048914A1 (en) 2008-03-14 2010-02-25 Angela Brodie Novel C-17-Heteroaryl Steroidal Cyp17 Inhibitors/Antiandrogens, In Vitro Biological Activities, Pharmacokinetics and Antitumor Activity
US8207169B2 (en) * 2008-06-03 2012-06-26 Msd K.K. Substituted [1,2,4]triazolo[4′,3′:1,6]pyrido[2,3-b]pyrazines of the formula D
EP2299825B1 (en) * 2008-06-03 2013-07-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of akt activity
CA2729412A1 (en) 2008-07-04 2010-01-07 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Novel spirochromanone carboxylic acids
BRPI0917936A2 (pt) * 2008-08-25 2017-07-11 Irm Llc Moduladores de via hedgehog
DE102008043724A1 (de) * 2008-11-13 2010-05-20 Biotronik Vi Patent Ag Erhöhung der Effizienz pharmazeutische Wirkstoffe-freisetzender Medizinprodukte durch Kombination mit einem Inhibitor des Transportproteins P-Glycoprotein
WO2010088177A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of akt activity
EP3023433A1 (en) 2009-02-05 2016-05-25 Tokai Pharmaceuticals, Inc. Novel prodrugs of steroidal cyp17 inhibitors/antiandrogens
EP2403339B1 (en) * 2009-03-06 2017-01-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Combination cancer therapy with an akt inhibitor and other anticancer agents
WO2010104705A1 (en) 2009-03-12 2010-09-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of akt activity
WO2010114780A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of akt activity
CN102625807B (zh) 2009-09-08 2016-03-09 霍夫曼-拉罗奇有限公司 4-取代的吡啶-3-基-甲酰胺化合物和使用方法
EP2473495A1 (en) 2009-09-18 2012-07-11 Almac Discovery Limited Pharmaceutical compounds
GB0919380D0 (en) 2009-11-04 2009-12-23 Almac Discovery Ltd Pharmaceutical compouds
GB0922589D0 (en) 2009-12-23 2010-02-10 Almac Discovery Ltd Pharmaceutical compounds
WO2011130921A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of akt activity
JP2013526578A (ja) 2010-05-21 2013-06-24 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 組合せ
CA2804845A1 (en) * 2010-07-12 2012-01-19 Stuart Ince Substituted imidazo[1,2-a]pyrimidines and -pyridines
CA2805015A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Stuart Ince Bicyclic pyrimidines
WO2012013713A2 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Substituted imidazo[1,2-b]pyridazines
CN103370321B (zh) * 2010-12-16 2015-07-29 拜耳知识产权有限责任公司 取代的嘧啶并[1,2-b]吲唑及其作为PI3K/AKT途径的调节剂的用途
SG10201600077RA (en) * 2011-01-11 2016-02-26 Glaxosmithkline Llc Combination
MY163187A (en) 2011-04-06 2017-08-15 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Novel imidazo-oxazine compound or salt thereof
CN103596957B (zh) 2011-04-07 2016-12-07 拜耳知识产权有限责任公司 作为akt激酶抑制剂的咪唑并哒嗪
CA2837727C (en) * 2011-06-24 2019-12-03 Arqule, Inc. Substituted imidazopyridinyl-aminopyridine compounds
US8815854B2 (en) 2011-06-24 2014-08-26 Arqule, Inc. Substituted imidazopyridinyl compounds
US9408885B2 (en) 2011-12-01 2016-08-09 Vib Vzw Combinations of therapeutic agents for treating melanoma
CN104066735B (zh) 2012-01-10 2016-08-31 拜耳知识产权有限责任公司 作为akt激酶抑制剂的取代的咪唑并吡嗪
US9370517B2 (en) 2012-01-10 2016-06-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Substituted pyrazolopyrimidines as Akt kinase inhibitors
EP2804616B1 (en) 2012-01-20 2018-07-18 Board of Supervisors of Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College Enhanced glycemic control using ad36e4orf1 and akt1 inhibitor
GB201205164D0 (en) 2012-03-23 2012-05-09 Almac Discovery Ltd Pharmaceutical compounds
HUE036188T2 (hu) 2012-07-02 2018-06-28 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Egy imidazooxazin vegyületet tartalmazó tumorellenes hatás potenciátor
EP2968370A4 (en) 2013-03-14 2016-09-21 Univ Maryland AGENT FOR ANDROGEN RECEPTOR DOWNWARD CONTROL AND USES THEREOF
CA2938626A1 (en) 2013-07-26 2015-01-29 John Rothman Compositions to improve the therapeutic benefit of bisantrene
BR112016002970A2 (pt) 2013-08-12 2017-09-12 Tokai Pharmaceuticals Inc biomarcadores para o tratamento de distúrbios neoplásicos que usa terapias direcionadas ao androgênio
RU2016116915A (ru) 2013-10-01 2017-11-13 Новартис Аг Комбинация
CA2923899A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Novartis Ag Enzalutamide in combination with afuresertib for the treatment of cancer
WO2015094928A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Liposomal compositions for allosteric akt inhibitors
RU2716256C2 (ru) 2014-01-28 2020-03-11 Бак Инститьют Фо Ресеч Он Эйджинг Способы и композиции для уничтожения стареющих клеток и для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных со старением
AU2015228475B9 (en) 2014-03-12 2017-09-21 Novartis Ag Combination comprising a BTK inhibitor and an AKT inhibitor
EP3119395B1 (en) * 2014-03-17 2021-04-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Polymeric nanoparticles and methods of making and using same
CN111943962A (zh) 2015-02-27 2020-11-17 大鹏药品工业株式会社 咪唑并噁嗪晶体、含有所述晶体的药物组合物和制备所述晶体的方法
FR3033499A1 (fr) 2015-03-11 2016-09-16 Centre Leon-Berard Composition pour le traitement des tumeurs neuroendocrines pancreatiques
EP3372601B1 (en) 2015-10-22 2022-09-21 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Novel bicyclic heterocyclic compound
US11883404B2 (en) 2016-03-04 2024-01-30 Taiho Pharmaceuticals Co., Ltd. Preparation and composition for treatment of malignant tumors
WO2017156350A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 K-Gen, Inc. Methods of cancer treatment
CN108426971B (zh) * 2018-03-09 2020-03-20 浙江中一检测研究院股份有限公司 一种快速检测水中微囊藻毒素的方法
WO2019221755A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Bioventures, Llc Piperlongumine analogues and uses thereof
EP4073102A4 (en) 2019-12-12 2024-05-08 Ting Therapeutics LLC COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HEARING LOSS
BR112022022327A2 (pt) * 2020-05-08 2023-01-03 Georgiamune Llc Moduladores de akt3 e métodos de uso dos mesmos
WO2024083716A1 (en) 2022-10-17 2024-04-25 Astrazeneca Ab Combinations of a serd for the treatment of cancer

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002083064A2 (en) * 2001-04-10 2002-10-24 Merck & Co., Inc. A method of treating cancer
WO2002083138A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
US20030187026A1 (en) 2001-12-13 2003-10-02 Qun Li Kinase inhibitors
CA2480880C (en) 2002-04-08 2011-03-22 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
US20050182256A1 (en) 2002-04-08 2005-08-18 Duggan Mark E. Inhibitors of akt activity
CA2480800C (en) 2002-04-08 2008-09-23 Mark T. Bilodeau Inhibitors of akt activity
AU2003226271B2 (en) 2002-04-08 2007-10-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused quinoxaline derivatives as inhibitors of Akt activity
EP1558586B1 (en) 2002-10-30 2011-03-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of akt activity
WO2004096129A2 (en) 2003-04-24 2004-11-11 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
DE602004023838D1 (de) 2003-04-24 2009-12-10 Merck & Co Inc Hemmer der akt aktivität
US7579355B2 (en) 2003-04-24 2009-08-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of Akt activity
US7638530B2 (en) * 2003-04-24 2009-12-29 Merck & Co., Inc. Inhibitors of Akt activity
WO2005007099A2 (en) 2003-07-10 2005-01-27 Imclone Systems Incorporated Pkb inhibitors as anti-tumor agents
JP2007008816A (ja) * 2003-10-15 2007-01-18 Ube Ind Ltd 新規イソキノリン誘導体
ES2426288T3 (es) * 2003-10-15 2013-10-22 Ube Industries, Ltd. Novedoso derivado de imidazol
CA2561311A1 (en) 2004-04-09 2005-10-27 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
AU2005233569B2 (en) 2004-04-09 2010-08-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of Akt activity
US7544677B2 (en) 2004-08-23 2009-06-09 Merck & Co., Inc. Inhibitors of Akt activity
US20080015212A1 (en) 2004-12-02 2008-01-17 Barnett Stanley F Inhibitors Of Akt Activity
CN101242834A (zh) 2004-12-15 2008-08-13 默克公司 Akt活性抑制剂
CN101115479A (zh) 2005-02-14 2008-01-30 默克公司 Akt活性抑制剂
AU2006235314B2 (en) * 2005-04-12 2011-01-20 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of Akt activity
MX2007015578A (es) 2005-06-10 2008-03-06 Merck & Co Inc Inhibidores de la actividad akt.
CA2636043A1 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Amira Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic inhibitors of 5-lipoxygenase
AR064010A1 (es) * 2006-12-06 2009-03-04 Merck & Co Inc Inhibidores de la actividad de la akt
US7776857B2 (en) * 2007-04-05 2010-08-17 Amgen Inc. Aurora kinase modulators and method of use

Also Published As

Publication number Publication date
NZ577470A (en) 2011-11-25
IL198826A (en) 2010-11-30
US7576209B2 (en) 2009-08-18
ECSP099376A (es) 2009-07-31
GEP20125469B (en) 2012-04-10
GT200900146A (es) 2010-04-13
JP5364454B2 (ja) 2013-12-11
WO2008070016A2 (en) 2008-06-12
EP2104669A2 (en) 2009-09-30
AU2007328286B2 (en) 2011-01-20
CA2670760C (en) 2012-01-24
SV2009003283A (es) 2009-11-09
WO2008070041A3 (en) 2008-08-28
CN101600706B (zh) 2013-10-16
KR20090086095A (ko) 2009-08-10
AU2007328286A1 (en) 2008-06-12
NO20092569L (no) 2009-07-06
US20080161317A1 (en) 2008-07-03
JP2009298786A (ja) 2009-12-24
TN2009000224A1 (en) 2010-10-18
PE20081341A1 (es) 2008-10-19
EA016195B1 (ru) 2012-03-30
CL2007003495A1 (es) 2008-05-30
TW200831509A (en) 2008-08-01
CN101600706A (zh) 2009-12-09
WO2008070016A3 (en) 2008-09-12
ES2527567T3 (es) 2015-01-26
WO2008070041A2 (en) 2008-06-12
EA200970542A1 (ru) 2009-12-30
EP2104669B1 (en) 2014-10-15
TWI386410B (zh) 2013-02-21
NI200900106A (es) 2010-01-20
CR10851A (es) 2009-06-25
CO6190528A2 (es) 2010-08-19
IL205220A0 (en) 2011-07-31
HK1137758A1 (en) 2010-08-06
CA2670760A1 (en) 2008-06-12
AR064010A1 (es) 2009-03-04
MA31027B1 (fr) 2009-12-01
HN2009001112A (es) 2011-07-22
US20110160183A1 (en) 2011-06-30
MX2009006052A (es) 2009-06-17
JP4431636B1 (ja) 2010-03-17
US8288407B2 (en) 2012-10-16
US20090253734A1 (en) 2009-10-08
AU2007328286A2 (en) 2009-08-06
BRPI0719580A2 (pt) 2013-12-17
JP2010511703A (ja) 2010-04-15
NZ595829A (en) 2013-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101110598B1 (ko) Ａｋｔ 활성의 억제제
KR100959771B1 (ko) Ａｋｔ 활성의 억제제
EP2299825B1 (en) Inhibitors of akt activity
US20110288090A1 (en) Inhibitors of AKT Activity
JP2011522048A (ja) Ａｋｔ活性の阻害剤
JP2010512312A (ja) Ａｋｔ活性の阻害剤
CN101374515B (zh) Akt活性抑制剂

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141230

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151230

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161229

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171228

Year of fee payment: 7

LAPS Lapse due to unpaid annual fee