TWI386410B - Ａｋｔ活性抑制劑 - Google Patents

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TWI386410B
TWI386410B TW096145487A TW96145487A TWI386410B TW I386410 B TWI386410 B TW I386410B TW 096145487 A TW096145487 A TW 096145487A TW 96145487 A TW96145487 A TW 96145487A TW I386410 B TWI386410 B TW I386410B
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Mark E Layton
Philip E Sanderson
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Merck Sharp & Dohme
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Description

AKT活性抑制劑
抑制劑之活體內功效。本發明係關於經取代啶化合物，其為絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt(亦稱為PKB；在下文稱為"Akt")之同功異型物之一或多者的活性抑制劑。本發明亦係關於包含該等化合物之醫藥組合物及在治療癌症中使用本化合物之方法。
細胞凋亡(漸進式細胞死亡)在胚胎發育及諸如退化性神經元疾病、心血管疾病及癌症之各種疾病之發病機制中起基本作用。近來的研究已導致識別出涉及漸進式細胞死亡之調節或執行之各種促細胞凋亡及抗細胞凋亡基因產物。諸如Bcl2或Bcl－xL 之抗細胞凋亡基因之表現抑制藉由各種刺激誘導之凋亡性細胞死亡。另一方面，諸如Bax或Bad之促細胞凋亡基因之表現導致漸進式細胞死亡(Adams等人Science ,281：1322－1326(1998))。漸進式細胞死亡之執行係藉由卡斯蛋白酶－1有關蛋白酶，包括卡斯蛋白酶－3、卡斯蛋白酶－7、卡斯蛋白酶－8及卡斯蛋白酶－9等等來介導(Thornberry等人Science ,281：1312－1316(1998))。
磷脂醯肌醇3'－OH激酶(PI3K)/Akt路徑對調節細胞存活/細胞死亡顯得重要(Kulik等人Mol.Cell.Biol .17：1595－1606(1997)；Franke等人，Cell ,88：435－437(1997)；Kauffmann－Zeh等人Nature 385：544－548(1997)HemmingsScience ,275：628－630(1997)；Dudek等人，Science ,275：661－665(1997))。諸如血小板衍生生長因子(PDGF)、神經生長因子(NGF)及胰島素類生長因子－1(IGF－1)之存活因子藉由誘導PI3K活性而促進各種條件下之細胞存活(Kulik等人1997,Hemmings 1997)。經活化PI3K引起磷脂醯肌醇(3,4,5)－三磷酸酯(PtdIns(3,4,5)－P3)之產生，其又結合於絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt，且促進絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt之活化，該絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt含有pleckstrin同源(PH)域(Franke等人Cell ,81：727－736(1995)；HemmingsScience ,277：534(1997)；Downward,Curr.Opin.Cell Biol .10：262－267(1998)，Alessi等人，EMBO J .15：6541－6551(1996))。PI3K或顯性負性Akt突變株之特定抑制劑廢除該等生長因子或細胞激素之促存活活性。先前已揭示，PI3K之抑制劑(LY294002或渥曼青黴素(wortmannin))阻斷上游激酶對Akt之活化。另外，原構性活性PI3K或Akt突變株之引入促進了在其中細胞通常經歷凋亡性細胞死亡之條件下之細胞存活(Kulik等人1997，Dudek等人1997)。
已識別第二訊息調節之絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之Akt亞科的3個成員且分別稱為Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ及Akt3/PKBγ(在下文稱為"Akt1"、"Akt2"及"Akt3")。同功異型物尤其在編碼催化域之區域中為同源的。Akts藉由回應PI3K信號傳輸而發生之磷酸化事件來活化。PI3K磷酸化膜肌醇磷脂，產生第二訊息磷脂醯肌醇3,4,5－三磷酸酯及磷脂醯肌醇3,4－雙磷酸酯，已展示其結合於Akt之PH域。Akt活化之當前模型建議藉由3'－磷酸化磷酸肌醇將酶募集於膜，在膜處發生上游激酶對Akt之調節位點之磷酸化(B.A.Hemmings,Science 275：628－630(1997)；B.A.Hem mings,Science 276：534(1997)；J.Downward,Science 279：673－674(1998))。
Akt1之磷酸化作用發生在2個調節位點上，即催化域活化環中之Thr308 及接近羧基末端之Ser473 上(D.R.Alessi等人EMBO J .15：6541－6551(1996)及R.Meier等人J.Biol.Chem .272：30491－30497(1997))。等價調節磷酸化作用位點發生在Akt2及Akt3中。已選殖在活化環位點處磷酸化Akt之上游激酶且將之稱為3'－磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)。PDK1不僅磷酸化Akt，而且磷酸化p70核糖體S6激酶、p90RSK、血清及糖皮質激素調節激酶(SGK)及蛋白激酶C。尚未識別出磷酸化接近羧基末端之Akt之調節位點的上游激酶，但近期報導暗示整合素連接激酶(ILK－1)、絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶或自體磷酸化之作用。
對人類腫瘤中之Akt含量之分析展示，Akt2過度表現於顯著數量之卵巢癌(J.Q.Cheng等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A .89：9267－9271(1992))及胰腺癌中(J.Q.Cheng等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A .93：3636－3641(1996))。相似地，發現Akt3過度表現於乳癌及前列腺癌細胞株中(Nakatani等人J.Biol.Chem .274：21528－21532(1999))。
腫瘤抑制基因PTEN，一種特定移除PtdIns(3,4,5)－P3之3'磷酸酯之蛋白質及脂質磷酸酶，為PI3K/Akt路徑之負性調節劑(Li等人Science 275：1943－1947(1997)，Stambolic等人Cell 95：29－39(1998)，Sun等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A .96：6199－6204(1999))。PTEN之生殖系突變是造成諸如考登疾病(Cowden disease)之人類癌症症候群的原因(Liaw等人Nature Genetics 16：64－67(1997))。PTEN在大百分比之人類腫瘤中缺失，且無功能性PTEN之腫瘤細胞株展示高含量之活化Akt(Li等人supra,Guldberg等人Cancer Research 57：3660－3663(1997)，Risinger等人Cancer Research 57：4736－4738(1997))。
該等觀察證明，PI3K/Akt路徑對調節腫瘤形成中之細胞存活或細胞凋亡起重要作用。
Akt活化及活性之抑制可藉由用諸如LY294002及渥曼青黴素之抑制劑抑制PI3K來達到。然而，PI3K抑制具有不加區別地不僅影響所有3種Akt同功酶而且影響其它含PH域之信號傳輸分子之可能，該等含PH域之信號傳輸分子依賴於諸如酪胺酸激酶之Tec家族之PdtIns(3,4,5)－P3。此外，已揭示，Akt可藉由不依賴於PI3K之生長信號來活化。
或者，可藉由阻斷上游激酶PDK1之活性來抑制Akt活性。未揭示特定PDK1抑制劑。再一次，對PDK1之抑制將產生對多蛋白質激酶之抑制，該等蛋白質激酶之活性依賴於諸如非典型PKC同功異型物之PDK1、SGK及S6激酶(Williams等人Curr.Biol .10：439－448(2000))。
本發明之化合物具有超過WO 2006/135627中特定所述之經環丙基取代之啶化合物的意外有利性質。
本發明之一目標為，提供為Akt抑制劑之新穎化合物。
本發明之一目標亦為，提供醫藥組合物，其包含為Akt抑制劑之新穎化合物。
本發明之一目標亦為，提供治療癌症之方法，其包含投與該等Akt活性抑制劑。
本發明提供抑制Akt活性之經取代啶化合物。詳言之，所揭示之化合物選擇性地抑制Akt同功異型物之一或兩者。本發明亦提供包含該等抑制性化合物之組合物，及藉由向需要治療癌症之患者投與化合物來抑制Akt活性之方法。
本發明之化合物適用於抑制絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt之活性。
在一實施例中，本發明之抑制劑係藉由式C說明：
其中：a為0或1；b為0或1；m為0、1或2；p為0、1或2；虛線代表視需要之雙鍵；R2 係獨立地選自：(C1 -C6 )烷基、(C1 -C6 )烷氧基、CO2 H、鹵基、OH及NH2 ；環Y為(C4 -C7 )環烷基；R1 係選自：H、側氧基、(C＝O)a Ob (C1 －C10 )烷基、(C＝O)a Ob －芳基、(C＝O)a Ob (C2 －C10 )烯基、(C＝O)a Ob (C2 －C10 )炔基、CO2 H、鹵基、OH、Ob (C1 －C6 )全氟烷基、(C＝O)a NR7 R8 、CN、(C＝O)a Ob (C3 －C8 )環烷基、S(O)m NR7 R8 、SH、S(O)m －(C1 －C10 )烷基及(C＝O)a Ob －雜環基，該烷基、芳基、烯基、炔基、環烷基及雜環基視需要經一或多個選自R6 之取代基取代；R6 為：(C＝O)a Ob C1 －C10 烷基、(C＝O)a Ob 芳基、C2 －C10 烯基、C2 －C10 炔基、(C＝O)a Ob 雜環基，CO2 H、鹵基、CN、OH、Ob C1 －C6 全氟烷基、Oa (C＝O)b NR7 R8 、側氧基、CHO、(N＝O)R7 R8 、S(O)m NR7 R8 、SH、S(O)m－(C1 －C10 )烷基或(C＝O)a Ob C3 －C8 環烷基，該烷基、芳基、烯基、炔基、雜環基及環烷基視需要經一或多個選自R6a 之取代基取代；R6a 係選自：(C＝O)a Ob (C1 －C10 )烷基、Oa (C1 －C3 )全氟烷基、(C0 －C6 )伸烷基－S(O)m Ra 、SH、側氧基、OH、鹵基、CN、(C2 －C10 )烯基、(C2 －C10 )炔基、(C3 －C6 )環烷基，(C0 －C6 )伸烷基－芳基、(C0 －C6 )伸烷基－雜環基、(C0 －C6 )伸烷基－N(Rb )2 、C(O)Ra 、(C0 －C6 )伸烷基－CO2 Ra 、C(O)H及(C0 －C6 )伸烷基－CO2 H，該烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基及雜環基視需要經至多3個選自以下者之取代基取代：Rb 、OH、(C1 －C6 )烷氧基、鹵素、CO2 H、CN、Oa (C＝O)b (C1 －C6 )烷基、側氧基及N(Rb )2 ；R7 及R8 係獨立地選自：H、(C＝O)a Ob (C1 －C10 )烷基、(C=O)a Ob (C3 -C8 )環烷基，(C=O)a Ob -芳基、(C=O)a Ob -雜環基，(C2 -C10 )烯基、(C2 -C10 )炔基、SH、SO2 Ra 及(C=O)a NRb 2 ，該烷基、環烷基、芳基、雜環基、烯基及炔基視需要經一或多個選自R6a 之取代基取代：或R7 及R8 可連同其所連接之氮一起形成單環或雙環雜環，其在各環中具有3-7個成員且視需要含有除氮外之一或兩個選自N、O及S之額外雜原子，該單環或雙環雜環視需要經一或多個選自R6a 之取代基取代；Ra 為(C1 -C6 )烷基、(C3 -C6 )環烷基、芳基或雜環基；且Rb 獨立地為：H、(C1 -C6 )烷基、芳基、雜環基、(C3 -C6 )環烷基、(C=O)a Ob (C1 -C6 )烷基或S(O)m Ra ；或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體或立體異構體。
在本發明之另一實施例中，Akt活性之抑制劑係藉由式E說明：
其中： 為 環Y為環丁基；R1 為H、嘧啶基、甲基咪唑、OH、甲基或環丙基；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之化合物為：1－{4－[3－(1－甲基－1H －咪唑－4－基)－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－8－基]苯基}環丁胺二鹽酸鹽(1－9 )；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之化合物為：{1－[4－(9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－15 )；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之化合物為：1－[4－(9－苯基－3－嘧啶－2－基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁胺(1－10 )；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之化合物為：8－[4－(1－胺基環丁基)苯基]－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－3(2H )－酮(1－16 )；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之化合物為：1－[4－(3－甲基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁胺(1－17 )；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之化合物為：1－[4－(3－環丙基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁胺(1－23 )；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之化合物可具有不對稱中心、掌性軸及掌性平面(如E.L.Eliel及S.H.Wilen,Stereochemistry of Carbon Compounds ,John Wiley & Sons,New York,1994，第1119－1190頁中所述)，且作為外消旋物、外消旋混合物且作為個別非對映體，所有可能異構體及其混合物，包括光學異構體而存在，所有該等立體異構體包括在本發明中。
另外，本文中揭示之化合物可作為互變異構體存在，且即使僅描述一個互變異構結構，兩個互變異構形式都欲由本發明之範疇涵蓋。舉例而言：
四唑作為1H/2H互變異構體之混合物存在。四唑部分之互變異構形式亦在本發明之範疇內。
本發明亦欲涵蓋本文中揭示之化合物的前藥。化合物之任何者之前藥可使用熟知藥理技術來製造。
當任何變數(例如R2 等等)在任何組分中出現超過1次時，其在各次出現時之定義不依賴於所有其它之出現。又，取代基及變數之組合僅當該等組合產生穩定化合物時才為許可的。自取代基畫入環系統中之線表示所指示鍵可連接於可取代環原子之任何原子。若環系統為雙環，則希望鍵連接於雙環部分之任一環上之適合原子中的任何原子。
應瞭解，一或多個矽(Si)原子可由熟習此項技術者併入本發明之化合物中替代一或多個碳原子，以提供化學上穩定且可易藉由此項技術中已知之技術自易購得的起始物質來合成之化合物。碳及矽在其共價半徑上不同，導致當比較類似之C元素及Si元素鍵時，鍵距及空間排列之差異。該等差異導致當與碳比較時，含矽化合物之尺寸及形狀之細微改變。熟習此項技術者應瞭解，尺寸及形狀差異可產生效能、溶解性、標靶活性(off target activity)缺乏、包裝性質等等之細微或顯著改變。(Diass,J.O.等人Organo metallics(2006)5：1188－1198；Showell,G.A.等人Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters(2006)16：2555－2558)。
應瞭解，本發明之化合物上之取代基及取代類型可由熟習此項技術者來選擇，以提供化學上穩定且可易藉由此項技術中已知之技術以及下文陳述之彼等方法自易購得的起始物質來合成之化合物。若取代基自身經超過1個基團取代，則應瞭解，該等多個基團可在相同碳或不同碳上，只要得到穩定結構即可。詞語"視需要經一或多個取代基取代"應相當於詞語"視需要經至少一個取代基取代"且在該等狀況下，較佳實施例將具有0至4個取代基，且更佳實施例將具有0至3個取代基。
如本文中所使用，"烷基"欲包括具有規定數量之碳原子之支鏈及直鏈飽和脂族烴基。舉例而言，如"(C1 －C10 )烷基"中之C1 －C10 經定義以包括在直鏈或支鏈排列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳之基團。舉例而言，"(C1 －C10 )烷基"特定包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、異丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等等。
術語"環烷基"意謂具有規定數量之碳原子之單環飽和脂族烴基。舉例而言，"環烷基"包括環丙基、甲基－環丙基、2,2－二甲基－環丁基、2－乙基－環戊基、環己基等等。
"烷氧基"表示具有所指示數量之碳原子之經由氧橋連接的環狀或非環狀烷基。"烷氧基"因此涵蓋上文烷基及環烷基之定義。
若不規定碳原子之數量，則術語"烯基"係指含有2至10個碳原子及至少一個碳碳雙鍵之直鏈、支鏈或環狀非芳族烴基。較佳地，存在1個碳碳雙鍵，且可存在至多4個非芳族碳碳雙鍵。因此，"(C2 －C10 )烯基"意謂具有2至10個碳原子之烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、2－甲基丁烯基及環己烯基。烯基之直鏈、支鏈或環狀部分可含有雙鍵，且若指示經取代烯基，則其可為經取代的。
術語"炔基"係指含有2至10個碳原子及至少一個碳碳參鍵之直鏈、支鏈或環狀烴基。可存在至多3個碳碳參鍵。因此，"(C2 －C10 )炔基"意謂具有2至10個碳原子之炔基。炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、3－甲基丁炔基等等。炔基之直鏈、支鏈或環狀部分可含有參鍵，且若指示經取代炔基，則其可為經取代的。
在某些情況下，取代基可用包括0之一定範圍之碳來定義，諸如(C0 －C6 )伸烷基－芳基。若芳基為苯基，則該定義將包括苯基自身以及－CH2 Ph、－CH2 CH2 Ph、CH(CH3 )CH2 CH(CH3 )Ph等等。
如本文中所使用，"芳基"欲意謂在各環中具有至多7個原子之任何穩定單環或雙環碳環，其中至少一個環為芳族。該等芳基元件之實例包括苯基、萘基、四氫－萘基、二氫茚基及聯二苯。在其中芳基取代基為雙環且一個環為非芳族之狀況下，應瞭解，連接係經由芳族環。
如本文中所使用，術語雜芳基表示在各環中具有至多7個原子之穩定單環或雙環，其中至少一個環為芳族且含有1至4個選自由O、N及S組成之群之雜原子。該定義之範疇內之雜芳基包括(但不限於)：吖啶基、咔唑基、喏啉基、喹喏啉基、吡唑基、吲哚基、苯幷三唑基、呋喃基、噻吩基、苯幷噻吩基、苯幷呋喃基、喹啉基、異喹啉基、噁唑基、異噁唑基、吲哚基、吡嗪基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氫喹啉。如下文雜環之定義，"雜芳基"亦理解為包括任何含氮雜芳基之N－氧化物衍生物。在其中雜芳基取代基為雙環且一個環為非芳族或不含雜原子之狀況下，應瞭解，連接係分別經由芳族環或經由含雜原子之環。取代基Q之該等雜芳基部分包括(但不限於)：2－苯幷咪唑基、2－喹啉基、3－喹啉基、4－喹啉基、1－異喹啉基、3－異喹啉基及4－異喹啉基。
如本文中所使用之術語"雜環"或"雜環基"欲意謂含有1至4個選自由O、N及S組成之群之雜原子且包括雙環基團的3至10員芳族或非芳族雜環。"雜環基"因此包括上述雜芳基以及其二氫及四氫類似物。"雜環基"之其他實例包括(但不限於)以下者：苯幷咪唑基、苯幷咪唑酮基、苯幷呋喃基、苯幷呋吖基、苯幷吡唑基、苯幷三唑基、苯幷噻吩基、苯幷噁唑基、咔唑基、咔啉基、喏啉基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、吲哚嗪基、吲唑基、異苯幷呋喃基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、異噁唑基、萘吡啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、異噁唑啉、氧呾基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、吡多幷吡啶基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喏啉基、四氫哌喃基、四唑基、四唑幷吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、吖丁啶基、1,4－二氧雜環己烷基、六氫氮雜卓基、哌嗪基、哌啶基、吡啶－2－酮基、吡咯啶基、嗎啉基、硫嗎啉基、二氫苯幷咪唑基、二氫苯幷呋喃基、二氫苯幷噻吩基、二氫苯幷噁唑基、二氫呋喃基、二氫咪唑基、二氫吲哚基、二氫異噁唑基、二氫異噻唑基、二氫噁二唑基、二氫噁唑基、二氫吡嗪基、二氫吡唑基、二氫吡啶基、二氫嘧啶基、二氫吡咯基、二氫喹啉基、二氫四唑基、二氫噻二唑基、二氫噻唑基、二氫噻吩基、二氫三唑基、二氫吖丁啶基、亞甲基二氧基苯甲醯基、四氫呋喃基及四氫噻吩基，及其N－氧化物。雜環基取代基之連接可經由碳原子或經由雜原子發生。
如由熟習此項技術者所瞭解，如本文中所使用之"鹵基"或"鹵素"欲包括氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)及碘(I)。
在一實施例中，R1 係選自：側氧基、NH2 、OH、SH、Oa (C1 －C6 )烷基，該烷基視需要經R6a 取代。
在一實施例中，Rb 係獨立地選自H及(C1 －C6 )烷基。
在式C之一實施例中，R1 係選自：側氧基、(C＝O)a Ob (C1 －C10 )烷基，(C＝O)a Ob －芳基、(C＝O)a Ob (C2 －C10 )烯基、(C＝O)a Ob (C2 －C10 )炔基、CO2 H、鹵基、OH、Ob (C1 －C6 )全氟烷基、(C＝O)a NR7 R8 、CN、(C＝O)a Ob (C3 －C8 )環烷基，S(O)2 NR7 R8 、SH、S(O)2 －(C1 －C10 )烷基及(C＝O)a Ob －雜環基，該烷基、芳基、烯基、炔基、環烷基及雜環基視需要經R6a 取代。
在式C之另一實施例中，R1 係選自：側氧基、(C＝O)a Ob (C1 －C10 )烷基，CO2 H、鹵基、OH、CN、(C1 －C6 )烷氧基、S(O)2 NR7 R8 、SH、S(O)2 －(C1 －C10 )烷基、O(C＝O)(C1 －C6 )烷基及N(Rb )2 ，該烷基視需要經R6a 取代。
在式C之另一實施例中，R1 係選自：側氧基、NH2 、OH、SH、Oa (C1 －C6 )烷基，該烷基視需要經R6a 取代。
在式C之另一實施例中，R2 係選自：側氧基、(C＝O)a Ob (C1 －C10 )烷基，CO2 H、鹵基、OH、CN、(C1 －C6 )烷氧基、O(C＝O)(C1 －C6 )烷基，(C2 －C10 )烯基及N(Rb )2 ，該烷基視需要經以下者取代：Rb 、OH、(C1 －C6 )烷氧基、鹵素、CO2 H、CN、O(C＝O)(C1 －C6 )烷基、側氧基及N(Rb )2 。
在式C之另一實施例中，R1 係選自：H、雜環基、(C3 －C6 )環烷基、OH、(C1 －C6 )烷基，NH(C1 －C6 )烷基，NH－雜環基、NH－環烷基，該雜環基、環烷基及烷基視需要經以下者取代：鹵基、(C1 －C6 )烷基，(C1 －C6 )烷基－NH2 、OH、O(C1 －C6 )烷基且R2 係選自：H及鹵素。
在式C之另一實施例中，環Y為環丁基；R1 係選自：H、雜環基、(C3 －C6 )環烷基、OH、(C1 －C6 )烷基，NH(C1 －C6 )烷基，NH－雜環基、NH－環烷基，該雜環基、環烷基及烷基視需要經以下者取代：鹵基、(C1 －C6 )烷基，(C1 －C6 )烷基－NH2、OH、O(C1 －C6 )烷基且R2 為H或F。在式C之另一實施例中，環Y為環丁基；R1 為：H或(C1 －C6 )烷基；且R2 為H或F。
本發明中包括的為式C或E之化合物之游離形式以及其醫藥學上可接受之鹽及立體異構體。本文中例證之一些經分離特定化合物為胺化合物之質子化鹽。術語"游離形式"係指呈非鹽形式之胺化合物。所涵蓋之醫藥學上可接受之鹽不僅包括對本文中描述之特定化合物所例示之分離鹽，而且包括式C或E之化合物之游離形式的所有典型醫藥學上可接受之鹽。所述特定鹽化合物之游離形式可使用此項技術中已知之技術來分離。舉例而言，可藉由用諸如稀NaOH、碳酸鉀、氨及重碳酸鈉水溶液之適合稀鹼水溶液處理鹽來再生游離形式。游離形式可在諸如於極性溶劑中之溶解性之某些物理性質上稍微不同於其各別鹽形式，但就本發明之目的而言，酸式及鹼式鹽另外在醫藥學上等價於其各別游離形式。
本化合物之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法，自含有鹼性或酸性部分之本發明之化合物合成。通常，鹼性化合物之鹽係藉由離子交換層析或藉由在適合溶劑或溶劑之各種組合中，使游離鹼與化學計量之量或與過量之所要的形成鹽的無機或有機酸反應來製備。相似地，酸性化合物之鹽係藉由與適當無機或有機鹼之反應來形成。
因此，本發明之化合物之醫藥學上可接受之鹽包括如藉由使本鹼性化合物與無機或有機酸反應而形成之本發明之化合物之習知無毒鹽。舉例而言，習知無毒鹽包括得自諸如鹽酸、溴化氫、硫酸、胺磺酸、磷酸、硝酸及其類似物之無機酸之彼等鹽，以及自諸如以下者之有機酸製備之鹽：乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、雙羥酸、順丁烯二酸、羥基順丁烯二酸、苯基乙酸、麩胺酸、苯甲酸、柳酸、對胺基苯磺酸、2－乙醯氧基－苯甲酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙基磺酸、三氟乙酸(TFA)及其類似物。
當本發明之化合物為酸性時，適合的"醫藥學上可接受之鹽"係指自包括無機鹼及有機鹼之醫藥學上可接受之無毒鹼製備的鹽。得自無機鹼之鹽包括鋁鹽、銨鹽、鈣鹽、銅鹽、三價鐵鹽、亞鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、錳鹽、亞錳鹽、鉀鹽、鈉鹽、鋅鹽及其類似物。尤其較佳者為銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽及鈉鹽。得自醫藥學上可接受之有機無毒鹼之鹽包括以下者之鹽：一級、二級及三級胺，包括天然存在之經取代胺之經取代胺、環胺及鹼離子交換樹脂，諸如精胺酸、甜菜鹼、咖啡鹼、膽鹼、N,N1 －二苄基乙二胺、二乙胺、2－二乙基胺基乙醇、2－二甲基胺基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N－乙基嗎啉、N－乙基哌啶、葡糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、組胺酸、海卓胺(hydrabamine)、異丙胺、離胺酸、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、多元胺樹脂、普魯卡因(procaine)、嘌呤、可可豆鹼、三乙胺、三甲胺、三丙胺、緩血酸胺及其類似物。
上文所述醫藥學上可接受之鹽及其他典型醫藥學上可接受之鹽之製備由Berg等人，"Pharmaceutical Salts,"J.Pharm.Sci .,1977：66：1－19更完全地描述。
亦應注意，本發明之化合物可能為內鹽或兩性離子，因為在生理條件下，化合物中之去質子化酸性部分，諸如羧基，可為陰離子性的，且該電子電荷可隨後在內部相對於諸如四級氮原子之質子化或烷基化鹼性部分之陽離子電荷而平衡。
實用性
本發明之化合物為Akt活性抑制劑且因此適用於治療癌症，尤其為與Akt及Akt之下游細胞標靶之活性的不規則性相關之癌症。該等癌症包括(但不限於)卵巢癌、胰腺癌、乳癌及前列腺癌，以及其中腫瘤抑制基因PTEN突變之癌症(包括惡性膠質瘤)(Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci. (1992)89：9267－9271；Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci. (1996)93：3636－3641；Bellacosa等人，Int.J.Cancer (1995)64：280－285；Nakatani等人，J.Biol.Chem .(1999)274：21528－21532；Graff,Expert.Opin.Ther.Targets (2002)6(1)：103－113；及Yamada及Araki,J.Cell Science .(2001)114：2375－2382；Mischel及Cloughesy,Brain Pathol .(2003)13(1)：52－61)。
認為本文中提供之化合物、組合物及方法尤其適用於治療癌症。可藉由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括(但不限於)：心臟： 肉瘤(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤)，黏液瘤，橫紋肌瘤，纖維瘤，脂肪瘤及畸胎瘤；肺： 非小細胞肺癌，支氣管癌瘤(扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌)，肺泡(支氣管)癌瘤、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨瘤錯構瘤、間皮瘤；胃腸道： 食管(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)，胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)，胰腺(管腺癌、胰島瘤、血糖激素瘤、胃激素瘤、類癌腫瘤、激脈腸多勝瘤)，小腸(腺癌、淋巴瘤、類癌腫瘤、Karposi氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)，大腸(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)，結腸，結腸直腸，直腸；泌尿生殖道： 腎(腺癌、威耳姆氏腫瘤(Wilm's tumor)[腎胚瘤]、淋巴瘤、白血病)，膀胱及尿道(鱗狀細胞癌、過渡細胞癌、腺癌)，前列腺(腺癌、肉瘤)，睾丸(精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、惡性合胞體瘤、肉瘤、間質細胞癌瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣瘤、脂肪瘤)；肝： 肝癌(肝細胞癌)、膽管癌、肝芽細胞癌、血管肉瘤、肝細胞腺瘤、血管瘤；骨： 骨肉瘤(osteogenic sarcoma)(骨肉瘤(osteosarcoma))、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨性外生骨疣)、良性軟骨瘤、成軟骨細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨樣骨瘤及巨細胞瘤；神經系統： 顱骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黃瘤、畸形性骨炎)，腦膜(腦膜瘤、腦膜肉瘤(meningiosarcoma)、神經膠瘤病)，腦(星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、胚組織瘤[松果腺瘤]、神經膠母細胞瘤多形、少枝膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜胚細胞瘤、先天性腫瘤)，脊髓神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)；婦科病： 子宮(子宮內膜癌)，子宮頸(宮頸癌、前腫瘤子宮頸發育不良)，卵巢(卵巢癌[漿液性囊腺癌、黏液性囊性腺癌、未分類癌]、粒層泡膜細胞瘤、支持－間質細胞瘤、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)，陰門(鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑素瘤)，陰道(透明細胞癌、鱗狀細胞癌、葡萄形肉瘤(胚胎性橫紋肌肉瘤))，輸卵管(癌瘤)；血液病： 血液(骨髓白血病[急性及慢性]、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、脊髓增生疾病、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群)，霍奇金病(Hodgkin's disease)，非霍奇金淋巴瘤[惡性淋巴瘤]；皮膚： 惡性黑色素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、Karposi氏肉瘤、莫耳發育不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕瘤、牛皮癬；及腎上腺：神經母細胞瘤。因此，如本文中提供之術語"癌細胞"包括受上述所識別之病狀之任一者折磨的細胞。
可藉由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括(但不限於)：乳房、前列腺、結腸、結腸直腸、肺、非小細胞肺、腦、睾丸、胃、胰腺、皮膚、小腸、大腸、咽喉、頭及頸、口腔、骨、肝、膀胱、腎、甲狀腺及血液。
可藉由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括：乳房、前列腺、結腸、卵巢、結腸直腸、肺及非小細胞肺。
可藉由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括：乳房、結腸(結腸直腸)及肺(非小細胞肺)。
可藉由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括：淋巴瘤及白血病。
本發明之化合物適用於治療乳癌。
本發明之化合物適用於治療前列腺癌。
Akt信號傳輸調節血管生成中之多個關鍵步驟。Shiojima及Walsh,Circ.Res .(2002)90：1243－1250。血管生成抑制劑在治療癌症中之實用性在文獻中為已知的，參見(例如)J.Rak等人Cancer Research ,55：4575－4580,1995及Dredge等人，Expert Opin.Biol.Ther .(2002)2(8)：953－966。血管生成在癌症中之作用已展示於許多類型之癌症及組織中：乳癌(G.Gasparini及A.L.Harris,J.Clin.Oncol .,1995,13：765－782；M.Toi等人，Japan.J.Cancer Res .,1994,85：1045－1049)；膀胱癌瘤(A.J.Dickinson等人，Br.J.Urol .,1994,74：762－766)；結腸癌瘤(L.M.Ellis等人，Surgery ,1996,120(5)：871－878)；及口腔腫瘤(J.K.Williams等人，Am.J.Surg .,1994,168：373－380)。其它癌症包括晚期腫瘤、毛細胞白血病、黑素瘤、晚期頭及頸、轉移性腎細胞、非霍奇金淋巴瘤、轉移性乳癌、乳房腺癌、晚期黑素瘤、胰腺癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌瘤、各種實性腫瘤、多發性骨髓瘤、轉移性前列腺癌、惡性神經膠質瘤、腎癌、淋巴瘤、難治轉移性疾病、難治多發性骨髓瘤、頸癌、Kaposi氏肉瘤、復發多形性神經膠質瘤及轉移性結腸癌(Dredge等人，Expert Opin.Biol.Ther .(2002)2(8)：953－966)。因此，本申請案中揭示之Akt抑制劑亦適用於治療該等與血管生成有關之癌症。
已經歷新血管生成之腫瘤展示增加之轉移可能性。事實上，血管生成對腫瘤生長及轉移而言為本質的。(S.P.Cunningham,等人，Can.Research ,61：3206－3211(2001))。本申請案中揭示之Akt抑制劑因此亦適用以預防或降低腫瘤細胞轉移。
另外，包括在本發明之範疇內的為治療或預防其中牽連血管生成之疾病之方法，其包含向需要該治療之哺乳動物投與治療有效量之本發明之化合物。眼睛新生血管性疾病為其中大部分所得組織損傷可歸於眼睛中之血管之異常浸潤的病狀之一實例(參見WO 00/30651，2000年6月2日公開)。不良浸潤可藉由諸如自糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、視網膜靜脈小管形成等等產生之缺血性視網膜病變觸發，或藉由諸如在年齡有關黃斑退化中觀察到之脈絡膜新血管生成之退化性疾病觸發。藉由本化合物之投藥抑制血管之生長將因此預防血管之浸潤且預防或治療其中牽連血管生成之疾病，諸如，如視網膜血管形成、糖尿病性視網膜病、年齡有關黃斑退化及其類似疾病之眼睛疾病。
另外，包括在本發明之範疇內的為，治療或預防包括(但不限於)以下者之其中牽連血管生成之非惡性疾病的方法：眼睛疾病(諸如視網膜血管形成、糖尿病性視網膜病及年齡有關黃斑退化)，動脈粥樣硬化，關節炎，牛皮癬，肥胖及阿茲海默氏疾病(Alzheimer's disease)(Dredge等人，Expert Opin.Biol.Ther .(2002)2(8)：953－966)。在另一實施例中，治療或預防其中牽連血管生成之疾病之方法包括：眼睛疾病(諸如，視網膜血管形成、糖尿病性視網膜病及年齡有關黃斑退化)，動脈粥樣硬化，關節炎及牛皮癬。
另外，包括在本發明之範疇內的為治療諸如再狹窄、發炎、自體免疫疾病及過敏/哮喘之過度增生病症之方法。
另外，包括在本發明之範疇內的為本化合物塗佈血管支架之用途及因此在經塗佈血管支架上之本化合物用於治療及/或預防再狹窄(WO03/032809)之用途。
另外，包括在本發明之範疇內的為本化合物用於治療及/或預防骨關節炎(WO03/035048)之用途。
另外，包括在本發明之範疇內的為治療胰島素過多症之方法。
本發明之化合物亦適用於製備藥劑，該藥劑適用於治療上文所述疾病，尤其為癌症。
在本發明之一實施例中，本化合物為選擇性抑制劑，其抑制功效視PH域而定。在該實施例中，相對於缺PH域之截斷Akt蛋白質，化合物顯示活體外抑制活性之降低或無活體外抑制活性。
在另一實施例中，本化合物係選自Akt1之選擇性抑制劑、Akt2之選擇性抑制劑及Akt1及Akt2之選擇性抑制劑之群。
在另一實施例中，本化合物係選自Akt1之選擇性抑制劑、Akt2之選擇性抑制劑、Akt3之選擇性抑制劑及3種Akt同功異型物之兩者之選擇性抑制劑的群。
在另一實施例中，本化合物為所有3種Akt同功異型物之選擇性抑制劑，但不為已經改質以缺失PH域、鉸鏈區或PH域及絞鏈區之該等Akt同功異型物之一、兩或所有者的抑制劑。
本發明另外針對抑制Akt活性之方法，其包含向需要其之哺乳動物投與醫藥學上有效量之本化合物。
本發明之化合物可根據標準醫藥實踐，單獨或以與醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑之組合，以醫藥組合物來投與至包括人類之哺乳動物。化合物可經口或非經腸地投與，包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下、直腸及局部投藥途徑。
含有活性成分之醫藥組合物可呈適於口服使用之形式，例如，作為錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含劑、水溶液或油性懸浮液、可分散性粉末或顆粒、乳液、硬或軟膠囊，或糖漿或酏劑。欲用於口服使用之組合物可根據用於製造醫藥組合物之技術中已知之任何方法來製備，且該等組合物可含有一或多種選自由甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑組成之群之藥劑，以提供醫藥學上精緻及可口之製劑。錠劑含有呈與適於製造錠劑之無毒醫藥學上可接受之賦形劑的混合物之活性成分。該等賦形劑可為(例如)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化及崩解劑，例如微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、玉米澱粉或褐藻酸；黏合劑，例如澱粉、明膠、聚乙烯－吡咯啶酮或阿拉伯膠，及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可為未經塗佈的或其可藉由已知技術塗佈，以遮蔽藥物之不良味道或延遲在胃腸道中之崩解及吸收，且進而提供在更長時期範圍之持續作用。舉例而言，可使用諸如羥基丙基甲基纖維素或羥基丙基纖維素之水溶性味道遮蔽物質，或諸如乙基纖維素、乙酸纖維素丁酸酯之時間延遲物質。
用於口服使用之調配物亦可作為硬明膠膠囊存在，其中活性成分與例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土之惰性固體稀釋劑混合，或作為軟明膠膠囊存在，其中活性成分與諸如聚乙二醇之水溶性載劑或例如花生油、液體石蠟或橄欖油之油性介質混合。
水性懸浮液含有呈與適於製造水性懸浮液之賦形劑之混合物的活性物質。該等賦形劑為懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯－吡咯啶酮、黃蓍樹膠及阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑可為天然存在磷脂，例如卵磷脂，或氧化烯與脂肪酸之縮合產物，例如聚氧化乙烯硬脂酸酯，或氧化乙烯與例如十七伸乙基氧基十六醇之長鏈脂族醇之縮合產物，或氧化乙烯與得自脂肪酸及己醣醇之偏酯之縮合產物，諸如聚氧化乙烯山梨糖醇單油酸酯，或氧化乙烯與得自脂肪酸及己醣醇酐之偏酯之縮合產物，例如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。水性懸浮液亦可含有一或多種例如對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸正丙酯之防腐劑、一或多種著色劑、一或多種調味劑及一或多種諸如蔗糖、糖精或阿斯巴甜糖(aspartame)之甜味劑。
油性懸浮液可藉由使活性成分懸浮於例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油之植物油中，或懸浮於諸如液體石蠟之礦物油中來調配。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可添加諸如上文陳述之甜味劑及調味劑以提供可口的口服製劑。該等組合物可藉由添加諸如丁基化羥基苯甲醚或α－生育酚之抗氧化劑來保存。
適於藉由添加水來製備水性懸浮液之可分散粉末及顆粒提供呈與分散或濕潤劑、懸浮劑及一或多種防腐劑之混合物之活性成分。適合分散或濕潤劑及懸浮劑已藉由上述彼等者來例示。亦可存在例如甜味劑、調味劑及著色劑之額外賦形劑。可藉由添加諸如抗壞血酸之抗氧化劑來保存該等組合物。
本發明之醫藥組合物亦可呈水包油乳液形式。油相可為植物油，例如橄欖油或花生油或例如液體石蠟之礦物油，或該等者之混合物。適合乳化劑可為天然存在磷脂，例如黃豆卵磷脂，及得自脂肪酸及己醣醇酐之酯或偏酯，例如脫水山梨糖醇單油酸酯，及該等偏酯與氧化乙烯之縮合產物，例如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。乳液亦可含有甜味劑、調味劑、防腐劑及抗氧化劑。
糖漿及酏劑可與例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖之甜味劑一起調配。該等調配物亦可含有緩和劑、防腐劑、調味劑及著色劑及抗氧化劑。
醫藥組合物可呈無菌可注射水溶液形式。其中，可使用之可接受之媒劑及溶劑為水、林格溶液(Ringer's solution)及等張氯化鈉溶液。
無菌可注射製劑亦可為其中活性成分溶於油相中之無菌可注射水包油微乳液。舉例而言，活性成分可先溶於黃豆油及卵磷脂之混合物中。隨後將油溶液引入水及甘油混合物中且加以處理以形成微乳液。
可注射溶液或微乳液可藉由局部快速注射引入患者之血流中。或者，可為有利的為，以諸如維持本化合物之恆定循環濃度之方式投與溶液或微乳液。為維持該恆定濃度，可利用連續靜脈內傳遞裝置。該裝置之一實例為Deltec CADD－PLUSTM 5400型靜脈內泵。
醫藥組合物可呈用於肌肉內及皮下的投藥之無菌可注射水溶液或油質懸浮液形式。該懸浮液可根據已知技術，使用已在上文所提及之彼等適合分散或濕潤劑及懸浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如作為於1,3－丁烷二醇中之溶液。另外，無菌、不揮發性油習知地用作溶劑或懸浮介質。為該目的，可使用任何溫和不揮發性油，包括合成單或二甘油酯。另外，諸如油酸之脂肪酸在製備可注射物中得到使用。
式C或E之化合物亦可以用於藥物之直腸投藥之栓劑形式來投與。該等組合物可藉由將藥物與適合的無刺激性賦形劑混合來製備，該賦形劑在常溫下為固體，但在直腸溫度下為液體且因此將在直腸中熔融以釋放藥物。該等物質包括可可脂、甘油明膠、氫化植物油、具有各種分子量之聚乙二醇之混合物及聚乙二醇之脂肪酸酯。
就局部用途而言，使用含有式C或E之化合物之乳膏、軟膏、凝膠物、溶液或懸浮液等等。(就本申請案之目的而言，局部應用應包括漱口水及漱口劑。)
本發明之化合物可以鼻內形式，經由局部使用適合的鼻內媒劑及傳遞裝置來投與，或經由經皮途徑，使用熟習此項技術者熟知之為經皮皮膚貼片之彼等形式來投與。為以經皮傳遞系統形式投與，劑量投藥當然將在貫穿給藥方案期間為連續的而不為間歇的。本發明之化合物亦可作為使用諸如以下者之基劑的栓劑來傳遞：可可脂、甘油明膠、氫化植物油、具有各種分子量之聚乙二醇之混合物及聚乙二醇之脂肪酸酯。
當將根據本發明之組合物投與至人類受檢者中時，日劑量將通常由開處方醫師來確定，劑量通常根據個別患者之年齡、體重及反應以及患者之症狀之嚴重性來變化。
利用本發明之化合物之給藥方案可根據包括以下者之各種因素來選擇：類型、物種、年齡、體重、性別及所治療之癌症之類型；欲治療之癌症之嚴重性(亦即，階段)；投藥途徑；患者之腎及肝功能；及所使用之特定化合物或其鹽。一般熟習技藝之醫師或獸醫可輕易確定且指定用以治療，例如，預防、抑制(完全或部分地)或停滯疾病之進程所需之藥物的有效量。舉例而言，本發明之化合物可以至多10,000 mg之總日劑量來投與。本發明之化合物可每日投與1次(QD)，或分成多次日劑量，諸如每日2次(BID)，及每日3次(TID)。本發明之化合物可以至多10,000 mg，例如2,000 mg、3,000 mg、4,000 mg、6,000 mg、8,000 mg或10,000 mg之總日劑量來投與，其可如上所述以1次日劑量來投與或可分成多次日劑量。
舉例而言，本發明之化合物可以至多1,000 mg之總日劑量來投與。本發明之化合物可每日投與1次(QD)，或分成多次日劑量，諸如每日2次(BID)，及每日3次(TID)。本發明之化合物可以至多1,000 mg，例如200 mg、300 mg、400 mg、600 mg、800 mg或1,000 mg之總日劑量來投與，其可如上所述以1次日劑量來投與或可分成多次日劑量。
另外，投藥可為連續的，亦即每天，或間歇的。如本文中所使用之術語"間歇的"或"間歇地"意謂以規則或不規則時間間隔停止及開始。舉例而言，本發明之化合物之間歇投藥可每週投藥1至6天或其可意謂循環投藥(例如，每日投藥歷時2至8個連續週，隨後歷時至多1週之不投藥之中止期)或其可意謂隔日投藥。
另外，本發明之化合物可根據上文所述之時程之任何者來連續投與歷時數週，再接續中止期。舉例而言，本發明之化合物可根據上文所述之時程之任一者來投與2至8週，接續1週之中止期，或以100－500 mg之劑量每日兩次投與歷時一週之3至5天。在另一特定實施例中，本發明之化合物可每日投與3次歷時連續2週，接著中止1週。
本發明之化合物之特定劑量及劑量時程的任何一或多者亦可適於用於組合治療中之治療劑(在下文稱為"第二治療劑")之任何一或多者。
此外，該第二治療劑之特定劑量及劑量時程可進一步變化，且最佳劑量、給藥時程及投藥途徑將基於所使用之特定第二治療劑來確定。
當然，本發明之化合物之投藥途徑不依賴於第二治療劑之投藥途徑。在一實施例中，本發明之化合物之投藥為口部投藥。在另一實施例中，本發明之化合物之投藥為靜脈內投藥。因此，根據該等實施例，本發明之化合物經口或靜脈內投與，且第二治療劑可經口、非經腸、腹膜內、靜脈內、動脈內、經皮、舌下、肌肉內、經直腸、經頰、鼻內、經脂質體、經由吸入、經陰道、眼內、經由藉由導管或血管支架之局部傳遞、皮下、脂肪內(intraadiposally)、關節內、鞘內來投與或以緩慢釋放劑型來投與。
另外，本發明之化合物及第二治療劑可藉由相同投藥模式來投與，亦即，(例如)兩種藥劑經口地，藉由IV來投與。然而，亦在本發明之範疇內的為，藉由例如口部之一種投藥模式來投與本發明之化合物，且藉由例如IV或上文所述之投藥模式之任何其他模式的另一投藥模式來投與第二治療劑。
第一治療程序，即本發明之化合物之投藥可在第二治療程序，亦即第二治療劑之前發生，在用第二治療劑治療之後發生，與用第二治療劑之治療同時發生，或其組合。舉例而言，可決定本發明之化合物之總治療時期。第二治療劑可在用本發明之化合物之治療開始之前或在用本發明之化合物之治療後投與。另外，抗癌症治療可在本發明之化合物之投藥期間投與，但不需要在本發明之化合物之整個治療時期範圍內發生。
本化合物亦適用於與治療劑、化學療劑及抗癌症藥劑組合。當前揭示之化合物與治療劑、化學療劑及抗癌症藥劑之組合在本發明之範疇內。該等藥劑之實例可見於由V.T.Devita及S.Hellman(編者)之Cancer Principles and Practice of Oncology 第6版(2001年2月15日)，Lippincott Williams & Wilkins Publishers中。熟習此項技術者將能基於所涉及之藥物及癌症之特定特徵而辨別藥劑之何組合將為有效的。該藥劑包括以下者：雌激素受體調節劑、雄性激素受體調節劑、類視色素受體調節劑、細胞毒素/細胞生長抑制劑、抗增生劑、異戊二烯基－蛋白質轉移酶抑制劑、HMG－CoA還原酶抑制劑及其他血管生成抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、細胞增殖及存活信號傳輸之抑制劑、雙膦酸鹽、芳香酶抑制劑、siRNA治療劑、γ－分泌酶抑制劑、干擾受體酪胺酸激酶(RTK)之藥劑及干擾細胞週期檢查點之藥劑。當與放射療法共投與時，本化合物為尤其有效的。
本發明之化合物亦可適用於與以下治療劑組合來治療癌症：阿巴瑞克(abarelix)(Plenaxis depot)；阿地白介素(aldesleukin)(Prokine)；阿地白介素(Proleukin)；阿來組單抗(Alemtuzumabb)(Campath)；亞利崔托寧(alitretinoin)(Panretin)；別嘌呤醇(allopurinol)(Zyloprim)；六甲蜜胺(altretamine)(Hexalen)；氨磷汀(amifostine)(Ethyol)；安美達錠(anastrozole)(Arimidex)；三氧化二砷(arsenic trioxide)(Trisenox)；天門冬醯胺酶(asparaginase)(Elspar)；阿紮胞苷(azacitidine)(Vidaza)；貝伐單抗(bevacuzimab)(Avastin)；貝瑟羅汀膠囊(bexarotene capsule)(Targretin)；貝瑟羅汀凝膠(Targretin)；博萊黴素(bleomycin)(Blenoxane)；硼替佐米(bortezomib)(Velcade)；靜脈內硫酸布他卡因(busulfan intravenous)(Busulfex)；口服硫酸布他卡因(Myleran)；卡魯睾酮(calusterone)(Methosarb)；卡西他賓(capecitabine)(Xeloda)；卡鉑(carboplatin)(Paraplatin)；卡莫斯丁(carmustine)(BCNU、BiCNU)；卡莫斯丁(Gliadel)；具有Polifeprosan 20植入物之卡莫斯丁(Gliadel Wafer)；賽利克西(celecoxib)(Celebrex)；西妥昔單抗(cetuximab)(Erbitux)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)(Leukeran)；順鉑(Platinol)；克拉屈濱(cladribine)(Leustatin、2－CdA)；氯法拉濱(clofarabine)(Clolar)；環磷醯胺(cyclophosphamide)(Cytoxan、Neosar)；環磷醯胺(Cytoxan Injection)；環磷醯胺(Cytoxan Tablet)；阿糖胞苷(cytarabine)(Cytosar－U)；阿糖胞苷脂質體(DepoCyt)；達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC－Dome)；放線菌素(dactinomycin)、放線菌素D(actinomycin D)(Cosmegen)；阿法達貝汀α(Darbepoetin alfa)(Aranesp)；道諾黴素脂質體(daunorubicin liposomal)(DanuoXome)；道諾黴素(daunorubicin)、道諾黴素(daunomycin)(Daunorubicin)；道諾黴素(daunorubicin)、道諾黴素(daunomycin)(Cerubidine)；地尼白介素(Denileukin diftitox)(Ontak)；右雷佐生(dexrazoxane)(Zinecard)；多西他賽(docetaxel)(Taxotere)；阿黴素(doxorubicin)(Adriamycin PFS)；阿黴素(Adriamycin、Rubex)；阿黴素(Adriamycin PFS Injection)；阿黴素脂質體(Doxil)；屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)(dromostanolone)；屈他雄酮丙酸酯(masterone injection)；艾略特氏B溶液(Elliott's B Solution)(Elliott's B Solution)；表柔比星(epirubicin)(Ellence)；依泊汀α(Epoetin alfa)(epogen)；埃羅替尼(erlotinib)(Tarceva)；雌莫司汀(estramustine)(Emcyt)；依託泊苷磷酸酯(etoposide phosphate)(Etopophos)；依託泊苷、VP－16(Vepesid)；依西美坦(exemestane)(Aromasin)；惠爾血添(Filgrastim)(Neupogen)；氟尿嘧啶(floxuridine)(動脈內)(FUDR)；氟達拉濱(fludarabine)(Fludara)；氟尿嘧啶，5－FU(Adrucil)；氟維司群(fulvestrant)(Faslodex)；吉非替尼(gefitinib)(Iressa)；吉西他濱(gemcitabine)(Gemzar)；吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg)；乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)(Zoladex Implant)；乙酸戈舍瑞林(Zoladex)；乙酸組氨瑞林(histrelin acetate)(Histrelin implant)；羥基脲(hydroxyurea)(Hydrea)；替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)(Zevalin)；黃膽素(idarubicin)(Idamycin)；異環磷醯胺(ifosfamide)(IFEX)；甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(Gleevec)；干擾素α 2a(Roferon A)；干擾素α－2b(Intron A)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar)；來那度胺(lenalidomide)(Revlimid)；來曲唑(letrozole)(Femara)；甲醯四氫葉酸(leucovorin)(Wellcovorin、Leucovorin)；乙酸柳培林(Leuprolide Acetate)(Eligard)；左旋咪唑衍生物(levamisole)(Ergamisol)；洛莫司汀(lomustine)，CCNU(CeeBU)；美羅塞滿(meclorethamine)、氮芥(Mustargen)；乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(Megace)；美法侖(melphalan)，L－PAM(Alkeran)；巰嘌呤(mercaptopurine)，6－MP(Purinethol)；美斯鈉(mesna)(Mesnex)；美斯鈉(Mesnex tabs)；甲胺喋呤(methotrexate)(Methotrexate)；甲氧沙林(methoxsalen)(Uvadex)；絲裂黴素C(mitomycin C)(Mutamycin)；米托坦(mitotane)(Lysodren)；米托蒽醌(mitoxantrone)(Novantrone)；苯丙酸去甲睾酮(nandrolone phenpropionate)(Durabolin－50)；奈拉濱(nelarabine)(Arranon)；諾非土莫單抗(Nofetumomab)(Verluma)；奧瑞維金(Oprelvekin)(Neumega)；奧賽力鉑(oxaliplatin)(Eloxatin)；太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Paxene)；太平洋紫杉醇(Taxol)；太平洋紫杉醇蛋白質結合粒子(Abraxane)；帕利非明(palifermin)(Kepivance)；帕米膦酸鹽(pamidronate)(Aredia)；培加酶(pegademase)(Adagen(Pegademase Bovine))；培門冬酶(pegaspargase)(Oncaspar)；培非司亭(Pegfilgrastim)(Neulasta)；培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium)(Alimta)；噴司他丁(pentostatin)(Nipent)；哌泊溴烷(pipobroman)(Vercyte)；普卡黴素(plicamycin)、光輝黴素(mithramycin)(Mithracin)；卟吩姆鈉(porfimer sodium)(Photofrin)；丙卡巴肼(procarbazine)(Matulane)；奎納克林(quinacrine)(Atabrine)；拉布立酶(Rasburicase)(Elitek)；利妥昔單抗(Rituximab)(Rituxan)；沙格司亭(sargramostim)(Leukine)；沙格司亭(Prokine)；索拉非尼(sorafenib)(Nexavar)；鏈脲黴素(streptozocin)(Zanosar)；順丁烯二酸舒尼替尼(sunitinib maleate)(Sutent)；滑石(Sclerosol)；他莫西芬(tamoxifen)(Nolvadex)；替莫唑胺(temozolomide)(Temodar)；替尼泊甙(teniposide)，VM－26(Vumon)；睾內酯(testolactone)(Teslac)；硫鳥嘌呤，6－TG(Thioguanine)；噻替派(thiotepa)(Thioplex)；拓朴替康(topotecan)(Hycamtin)；托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；托西莫單抗(Tositumomab)(Bexxar)；托西莫單抗/I－131托西莫單抗(Bexxar)；曲妥珠單抗(Trastuzumab)(Herceptin)；維甲酸(tretinoin)，ATRA(Vesanoid)；尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard)(Uracil Mustard Capsules)；戊柔比星(valrubicin)(Valstar)；長春鹼(vinblastine)(Velban)；長春新鹼(vincristine)(Oncovin)；長春瑞濱(vinorelbine)(Navelbine)；唑來膦酸鹽(zoledronate)(Zometa)及瑞諾斯塔(vorinostat)(Zolinza)。
本發明之化合物適用於與紫杉烷組合治療癌症。
本發明之化合物適用於與多西他賽(Taxotere)組合治療癌症。
本發明之化合物適用於與瑞諾斯塔(Zolinza)組合治療癌症。
本發明之化合物適用於與極光激酶抑制劑，MK－0457組合治療癌症。
本發明之化合物適用於與mTor抑制劑，AP 23573組合治療癌症。
本發明之化合物適用於與IGF1R抑制劑，MK－0646組合治療癌症。
本發明之化合物適用於與沙鉑組合治療癌症。
本發明之化合物適用於與拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb)組合治療癌症。
因此，本發明之範疇涵蓋當前主張之化合物與選自以下者之第二化合物組合的用途：雌激素受體調節劑、雄性激素受體調節劑、類視色素受體調節劑、細胞毒素/細胞生長抑制劑、抗增生劑、異戊二烯基－蛋白質轉移酶抑制劑、HMG－CoA還原酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、血管生成抑制劑、PPAR－γ促效劑、PPAR－δ促效劑、具有固有多藥物抵抗力之抑制劑、抗催吐劑、適用於治療貧血之藥劑、適用於治療嗜中性球減少症之藥劑、免疫增強藥物、細胞增殖及存活信號傳輸之抑制劑、雙膦酸鹽、芳香酶抑制劑、siRNA治療劑、γ－分泌酶抑制劑、干擾受體酪胺酸激酶(RTK)之藥劑、干擾細胞週期檢查點之藥劑及上文所列治療劑之任何者。
關於本發明之化合物之術語"投藥"及其變體(例如，"投與"化合物)意謂將化合物或化合物之前藥引入需要治療之動物之系統中。當本發明之化合物或其前藥以與一或多種其它活性劑(例如細胞毒素劑等等)之組合來提供時，"投藥"及其變體各自被理解為包括同時及連續引入化合物或其前藥及其他藥劑。
如本文中所使用，術語"組合物"欲涵蓋包含呈規定量之規定成分之產物，以及自呈規定量之規定成分之組合直接或間接產生之任何產物。
如本文中所使用之術語"治療有效量"意謂引出由研究人員、獸醫、醫藥醫生或其它臨床醫師所尋求之組織、系統、動物或人類之生物學或醫學反應的活性化合物或醫藥劑之量。
術語"治療癌症"或"癌症之治療"係指向受癌性病狀折磨之哺乳動物投藥且係指藉由殺死癌細胞而減輕癌性病狀之效應，而且係指導致對癌症之生長及/或轉移之抑制之效應。
在一實施例中，欲用作第二化合物之血管生成抑制劑係選自酪胺酸激酶抑制劑、表皮衍生生長因子之抑制劑、纖維母細胞衍生生長因子之抑制劑、血小板衍生生長因子之抑制劑、MMP(基質金屬蛋白酶)抑制劑、整合素阻斷劑、干擾素－α、介白素－12、聚戊醣聚硫酸酯、環加氧酶抑制劑、羧基醯胺基三唑、康貝他斯汀A－4(combretastatin A－4)、角鯊胺(squalamine)、6－O－氯乙醯基－羰基)－煙黴醇(fumagillol)、沙立度胺(thalidomide)、血管生長抑素(angiostatin)、肌鈣蛋白－1或VEGF之抗體。在一實施例中，雌激素受體調節劑為他莫西芬或雷諾昔酚(raloxifene)。
亦包括在申請專利範圍之範疇中的為，治療癌症之方法，其包含投與治療有效量之本發明之化合物與放射療法之組合及/或與選自以下者之第二化合物之組合：雌激素受體調節劑、雄性激素受體調節劑、類視色素受體調節劑、細胞毒素細胞生長抑制劑、抗增生劑、異戊二烯基－蛋白質轉移酶抑制劑、HMG－CoA還原酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、血管生成抑制劑、PPAR－γ促效劑、PPAR－δ促效劑、具有固有多藥物抵抗力之抑制劑、抗催吐劑、適用於治療貧血之藥劑、適用於治療嗜中性球減少症之藥劑、免疫增強藥物、細胞增殖及存活信號傳輸之抑制劑、雙膦酸鹽、芳香酶抑制劑、siRNA治療劑、γ－分泌酶抑制劑、干擾受體酪胺酸激酶(RTK)之藥劑、干擾細胞週期檢查點之藥劑及上文所列治療劑之任何者。
本發明亦包括適用於治療或預防癌症之醫藥組合物，其包含治療有效量之本發明之化合物及選自以下者之第二化合物：雌激素受體調節劑、雄性激素受體調節劑、類視色素受體調節劑、細胞毒素/細胞生長抑制劑、抗增生劑、異戊二烯基－蛋白質轉移酶抑制劑、HMG－CoA還原酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、血管生成抑制劑、PPAR－γ促效劑、PPAR－δ促效劑、細胞增殖及存活信號傳輸之抑制劑、雙膦酸鹽、芳香酶抑制劑、siRNA治療劑、γ－分泌酶抑制劑、干擾受體酪胺酸激酶(RTK)之藥劑、干擾細胞週期檢查點之藥劑及上文所列治療劑之任何者。
所識別之所有專利、公開案及申請中之專利申請案因此以引用之方式併入。
用於隨後之化學描述及實例中之縮寫為：AEBSF(對胺基乙基苯磺醯基氟化物)；BSA(牛血清白蛋白)；BuLi(正丁基鋰)；CDCl3 (氯仿－d)；CuI(碘化亞銅)；CuSO4 (硫酸銅)；DCE(二氯乙烷)；DCM(二氯甲烷)；DEAD(偶氮二羧酸二乙酯)；DMF(N,N－二甲基甲醯胺)；DMSO(二甲基亞碸)；DTT(二硫蘇糖醇)；EDTA(伸乙基－二胺－四乙酸)；EGTA(伸乙基－二醇－四乙酸)；EtOAc(乙酸乙酯)；EtOH(乙醇)；HOAc(乙酸)；HPLC(高效液相層析)；HRMS(高解析度質譜)；IPA(異丙醇)；LCMS(液相層析－質譜儀)；LHMDS(雙(三甲基矽烷基)醯胺鋰)；LRMS(低解析度質譜)；MeOH(甲醇)；MP－B(CN)H3 (巨孔氰基硼氫化物)；NaHCO3 (重碳酸鈉)；Na2 SO4 (硫酸鈉)；Na(OAc)3 BH(三乙醯氧基硼氫化鈉)；NH4 OAc(乙酸銨)；NBS(N－溴琥珀醯胺)；NMR(核磁共振)；PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)；PCR(聚合酶鏈反應)；Pd(dppf)([1,1'－雙(二苯基膦)二茂鐵]鈀)；Pd(Ph3 )4 (肆－三苯基膦鈀(0))；POCl3 (氧氯化磷)；PS－DIEA(聚苯乙烯二異丙基乙胺)；PS－PPh3 (聚苯乙烯－三苯膦)；TBAB(四丁基銨溴化物)；TBAF(四丁基銨氟化物)；THF(四氫呋喃)；TFA(三氟乙酸)；TMSCH2 N2 (三甲基矽烷基重氮甲烷)及Ac(乙醯基)；BOC(第三丁氧基羰基)；Bu(丁基)；Cal(經計算的)；Calc'd(經計算的)；DIEA(二異丙基乙胺)；DMAP(4－二甲基胺基吡啶)；EDC(N－乙基－N'－(3－二甲基胺基丙基)碳化二醯亞胺)；Eq(當量)；Et(乙基)；HOBT(羥基苯幷三唑)；IPA(異丙醇)；LC/MS(液相層析－質譜儀)；Me(甲基)；MeCN(乙腈)；NMP(N－甲基吡咯啶酮)；Pr(丙基)；Pyr(吡啶)；Sat(飽和)、Tosic(對甲苯磺酸)及Bn(苄基)；t－Bu(第三丁基)；dba(二亞苄基丙酮)；DIPEA(二異丙基乙胺)；IPAC(乙酸異丙酯)；MTBE(第三丁基甲基醚)；OAc(乙酸)；RT(室溫)；Wt(重量)；及XRPD(X射線粉末繞射)。
除在文獻中已知或在實驗程序中所例示之其它標準操作外，本發明之化合物可藉由使用如以下反應流程中所示之反應來製備。因此，下文之說明性反應流程不由所列化合物或不由用於說明性目的而使用之任何特定取代基來限制。如反應流程中所示之取代基編號不必與申請專利範圍中所使用的相關聯，且常常，為明確性，展示連接於化合物之單一取代基，其中在在上文式C或E之定義下，允許多個取代基。
反應流程之概要
以下反應流程，即反應流程I－III，提供製備本化合物之有用細節。必要中間物在一些狀況下為市售的或可根據文獻程序來製備。
如反應流程I中所說明，環烷基(苯基)乙酸衍生物(在該狀況下為環丁基)首先反應且在Curtius型條件下重排以得到胺基甲酸酯I－1 。在該狀況下藉由鈀催化之氰化法得到腈I－2 。去質子化I－2 ，接著與親核苄基格林納試劑(Grignard reagent)反應且水解處理得到酮I－3 。I－3 與醛I－4 在鹼性條件下之縮合得到氯啶I－5 。氯與肼之置換得到醯肼I－6 。醯化得到醯基醯肼I－7 ，在酸性條件下將其環化得到三唑幷啶I－8 。在該狀況下用HCl對胺之去保護產生I－9 。
稠合三唑可藉由用諸如羰二咪唑之活化羰基等價物將醯肼I－6 醯化或在碳化二醯亞胺存在下，用甲酸醯化來製備，而不需要環化步驟。或者，氯啶1－5 可在酸催化下與諸如烷基肼羧酸酯之衍生肼反應，以得到肼加合物，在鹼性條件下將其環化成三唑。
其中R1 為胺基烷基之本發明之化合物可根據反應流程II中概述之程序來製備。醯肼I－6 與碳化二醯亞胺反應以產生尿素，在酸性條件下將其就地環化以得到烷基胺基三唑II－1 。隨後去保護得到II－2 。
氯啶I－5 之一替代合成說明於反應流程III中。(4－鹵基苯基)乙腈衍生物III－1 (在該狀況下為溴基)首先在鹼性條件下烷基化以得到環丁烷III－2 ，其在鹼存在下與過氧化氫水合以得到醯胺III－3 。隨後，醯胺在第三丁醇存在下氧化性重排以得到胺基甲酸酯III－4 。在該狀況下藉由鈀催化之氰化法得到腈I－2 。I－2 與過量親核苄基格林納試劑之反應及水解處理得到酮I－3 。用諸如TFA之酸將醛I－4 去保護得到胺基吡啶III－5 。I－3 與醛III－5 在鹼性條件下之縮合得到氯啶I－5 。
反應流程I
反應流程II
反應流程III
實例
所提供之實例及流程欲幫助進一步理解本發明。所使用之特定物質、物種及條件欲進一步說明本發明且不限制其合理範疇。
流程1
[1－(4－氯苯基)環丁基]胺基甲酸第三丁酯(1－1) 向圓底燒瓶添加1－(4－氯苯基)環丁烷羧酸(40.4 g，192 mmol)、二碳酸二第三丁酯(46.0 g，211 mmol)、疊氮化鈉(43.6 g，671 mmol)、四丁基銨溴化物(9.27 g，28.7 mmol)、三氟甲烷磺酸鋅(2.30 g，6.32 mmol)及THF(1 L)。將反應混合物加熱至60℃同時在氮氣氛下，在連接水冷式回流冷凝器之熱油浴中攪拌18小時。向粗反應混合物添加重碳酸鈉飽和溶液，懸浮於乙酸乙酯中且用重碳酸鈉飽和溶液洗滌，接著用水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析法(0－3% IPA/DCM)純化所得殘餘物以得到呈白色固體之[1－(4－氯苯基)環丁基]胺基甲酸第三丁酯(1－1 )。HRMS(M＋Na)＋ ：觀察值＝304.1075，計算值＝304.1075。
[1－(4－氰基苯基)環丁基]胺基甲酸第三丁酯(1－2) 向[1－(4－氯苯基)環丁基]胺基甲酸第三丁酯(1－1 )(5.32 g，18.9 mmol)於無水1,4－二噁烷(70 mL)中之溶液添加氰化鋅(2.44 g，20.8 mmol)，接著添加雙(三第三丁基膦)鈀(0)(0.965 g，1.89 mmol)。將反應混合物加熱至100℃同時在氮氣氛下，在連接水冷式回流冷凝器之熱油浴中攪拌1.5小時。過濾反應混合物且真空濃縮。藉由矽膠層析法(0－5% IPA/DCM)純化所得殘餘物以得到呈蠟狀灰白色/黃色固體之[1－(4－氰基苯基)環丁基]胺基甲酸第三丁酯(1－2 )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝273.1598，計算值＝273.1597。
{1－[4－(苯基乙醯基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－3) 將[1－(4－氰基苯基)環丁基]胺基甲酸第三丁酯(1－2 )(16.6 g，61.0 mmol)於無水THF(300 mL)中之溶液冷卻至－78℃，同時在氮氣氛下攪拌。隨後，經5分鐘逐滴添加異丙基氯化鎂於THF(30.5 mL，61.0 mmol)中之2.0 M溶液。使反應混合物在－78℃下，在氮氣氛下攪拌10分鐘。隨後，經10分鐘逐滴添加苄基氯化鎂於THF(116 mL，232 mmol)中之2.0 M溶液。允許反應混合物溫至0℃。2小時後，在0℃下，藉由添加氯化銨飽和溶液來中止反應混合物。使反應溫至室溫，懸浮於乙酸乙酯中，用氯化銨飽和溶液、重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析法(1－40% EtOAc/5% DCM/己烷)純化所得殘餘物以得到呈蠟狀灰白色固體之{1－[4－(苯基乙醯基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－3 )。HRMS(M＋Na)＋ ：觀察值＝388.1892，計算值＝388.1883。
{1－[4－(5－氯－3－苯基－1,6－ 啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－5) 向圓底燒瓶添加{1－[4－(苯基乙醯基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－3 )(2.7 g，6.1 mmol)、(2－氯－3－甲醯基吡啶－4－基)胺基甲酸第三丁酯(1－4 )(1.6 g，6.1 mmol)、碳酸鉀(5.0 g，6.0 mmol)及DMF(20 mL)。將反應混合物加熱至80℃，同時在氮氣氛下，在熱油浴中攪拌15小時。隨後，將反應混合物溫至120℃歷時1小時。使反應混合物冷卻至室溫，添加水，懸浮於乙酸乙酯中，用重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析法(5－50% EtOAc/5% DCM/己烷)純化所得殘餘物以得到呈灰白色固體之{1－[4－(5－氯－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－5 )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝486.1954，計算值＝486.1943。
{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－ 啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6) 向微波小瓶添加{1－[4－(5－氯－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－5 )(4.05 g，8.34 mmol)、無水肼(5.24 mL，167 mmol)及1,4－二噁烷(15 mL)。隨後，在微波照射下，在100℃下(高吸收)，將反應混合物加熱5分鐘。使反應混合物冷卻至室溫，懸浮於乙酸乙酯中，用重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮以得到呈橙色固體/泡沫之{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6 )。MS(M＋H)＋ ：觀察值＝482.3，計算值＝482.59。
{1－[4－(5－{2－[(1－甲基－1H －咪唑－4－基)羰基]肼基}－3－苯基－1,6－ 啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－7) 向圓底燒瓶添加{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6 )(3.94 g，8.18 mmol)、EDC(1.34 g，10.6 mmol)、HOBt(1.44 g，10.6 mmol)、1－甲基－1H－咪唑－4－羧酸(1.34 g，10.6 mmol)及DMF(40 mL)。將反應混合物加熱至60℃，同時在氮氣氛下，在熱油浴中攪拌。45分鐘後，使反應混合物冷卻至室溫，懸浮於乙酸乙酯中，用重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮以得到呈紅色泡沫之{1－[4－(5－{2－[(1－甲基－1H－咪唑－4－基)羰基]肼基}－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－7 )。MS(M＋H)＋ ：觀察值＝590.3，計算值＝590.69。
(1－{4－[3－(1－甲基－1H －咪唑－4－基)－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶啶－8－基]苯基}環丁基)胺基甲酸第三丁酯(1－8) 向圓底燒瓶添加{1－[4－(5－{2－[(1－甲基－1H－咪唑－4－基)羰基]肼基}－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－7 )(2.73 g，4.63 mmol)、乙酸(5.30 mL，93 mmol)及1,4－二噁烷(20 mL)。將反應混合物加熱至80℃，同時開口至大氣壓(封蓋)，在熱油浴中攪拌。3小時後，使反應混合物冷卻至室溫，懸浮於乙酸乙酯中，用重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析法1－15% IPA/DCM純化所得殘餘物。組合適當溶離份且真空移除溶劑。藉由逆相管柱層析(Sunfire C18)，用5至95%乙腈/(0.1% TFA/水)梯度溶離，將所得殘餘物再純化。藉由懸浮於乙酸乙酯中將適當溶離份游離鹼化，用重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮以得到呈灰白色固體之(1－{4－[3－(1－甲基－1H－咪唑－4－基)－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基]苯基}環丁基)胺基甲酸第三丁酯(1－8 )。MS(M＋H)＋ ：觀察值＝572.3，計算值＝572.7。
1－{4－[3－(1－甲基－1H －咪唑－4－基)－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－8－基]苯基}環丁胺二鹽酸鹽(1－9) 向(1－{4－[3－(1－甲基－1H－咪唑－4－基)－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基]苯基}環丁基)胺基甲酸第三丁酯(1－8 )(2.52 g，4.41 mmol)於MeOH(5 mL)及DCM(15 mL)中之溶液添加HCl於EtOAc(22 mL，88 mmol)中之4 N溶液。在室溫下，使所密封之反應混合物攪拌。4小時後，真空濃縮反應混合物以得到呈黃色固體之1－{4－[3－(1－甲基－1H－咪唑－4－基)－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基]苯基}環丁胺二鹽酸鹽(1－9 )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝472.2249，計算值＝472.2244。
以與實例1－9 相似之方式製備以下化合物：
流程1A
8－[4－(1－胺基環丁基)苯基]－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－ 啶－3－醇(1－16) 向圓底燒瓶添加於1,4二噁烷(30 mL)中之{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6 )(2.77 g，5.75 mmol)及1,1'－羰基雙(1H－咪唑)(4.10 g，4.40 mmol)。隨後，在95℃下，在氮氣氛下，將經密封之反應混合物加熱。向粗反應混合物添加重碳酸鈉飽和溶液(100 mL)及乙酸乙酯。用重碳酸鈉飽和溶液，接著水，隨後鹽水洗滌有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。隨後，藉由矽膠層析法，以0－10% IPA/DCM溶離，將所得殘餘物純化。隨後組合適當溶離份且真空移除溶劑以得到呈棕褐色固體之{1－[4－(3－羥基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6a )。MS(M＋H)＋ ：觀察值＝508.1，計算值＝508.6。
在室溫下，向{1－[4－(3－羥基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6a )(1.14 g，2.25 mmol)於MeOH(5 mL)及DCM(15 mL)中之溶液添加HCl於EtOAc中之4N溶液(22 mL，88 mmol)。4小時後，真空濃縮反應混合物以得到呈黃色固體之8－[4－(1－胺基環丁基)苯基]－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－3－醇鹽酸鹽(1－16 )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝408.1803，計算值＝408.1819。
隨後，對黃色固體之X射線結晶學分析指示，固體化合物1－16 作為以下化學結構存在：8－[4－(1－胺基環丁基)苯基]－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－3(2H )－酮鹽酸鹽
流程1B
{1－[4－(9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－15) 向圓底燒瓶添加EDC(569 mg，2.97 mmol)、HOBt(401 mg，10.6 mmol)、甲酸(248 mg，5.40 mmol)、DCM(20 mL)& NMP(2.5 mL)。隨後，在室溫下，在氮氣氛下將反應混合物攪拌30分鐘。隨後，添加{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6 )(1.30 g，2.70 mmol)。隨後，在室溫下，在氮氣氛下使反應混合物攪拌隔夜。隨後使反應混合物懸浮於乙酸乙酯中，用重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析法50－90% EtOAc/DCM，隨後1－15% IPA/DCM純化所得殘餘物。組合適當溶離份且真空移除溶劑以得到呈棕褐色固體之{1－[4－(9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6b )。MS(M＋H)＋ ：觀察值＝492.2，計算值＝492.6。
1－[4－(9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－8－基)苯基]環丁胺鹽酸鹽(1－15) 向{1－[4－(9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6b )(1.07 g，2.177 mmol)於MeOH(5 mL)及DCM(15 mL)中之溶液添加HCl於EtOAc中之4 N溶液(5.44 mL，21.77 mmol)。在室溫下，使所密封之反應混合物攪拌。4小時後，過濾反應混合物以得到呈棕褐色固體之1－[4－(9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁胺鹽酸鹽(1－15 )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝392.1872，計算值＝392.1870。
流程1C
1－(4－溴苯基)環丁烷腈(1－2c) 將TBAB(1.61 g，0.5 mmol)、二溴丙烷(22.2 g，110 mmol)及腈1－1c(19.6 g，100 mmol)添加至KOH(31.17 g，500 mmol)於15 mL水及200 mL甲苯之混合物中之攪拌溶液中(溫度維持在72與79℃之間)。藉由蒸汽加熱混合物且在99－108℃下攪拌2.5 h。將混合物冷卻至80℃且添加200 mL之庚烷。所得混合物在攪拌下冷卻至RT後，過濾頂部澄清溶液，用水(3×30 mL)洗滌且真空濃縮以得到油性產物1－2c 。
1－(4－溴苯基)環丁烷羧醯胺(1－3c) 經3h，將H2 O2 (30% 11.3 mL，118 mmol)添加至40－87℃之腈1－2c (13.88 g，約58.9 mmol)及K2 CO3 (1.62 g，11.8 mol)於59 mL DMSO中之攪拌混合物中，用水浴冷卻。將所得混合物冷卻至27℃且經30 min添加水(100 mL)。形成結晶產物1－3c 。經1 h添加更多水(100 mL)。在RT下，使所得漿液老化16 h，之後過濾。用100 mL之水及隨後用100 mL之庚烷沖洗濾餅。在50℃下，在真空烘箱中乾燥後，獲得呈白色固體之產物1－3c 。
[1－(4－溴苯基)環丁基]胺基甲酸第三丁酯(1－4c) 將Pb(OAc)4 (25.7 g，25.7 mmol)添加至57℃至86℃之醯胺1－3c (12.7 g，50 mmol)於64 mL t－BuOH中之攪拌溶液中，用水浴冷卻。在65－86℃下，將所得混合物攪拌0.5 h。將混合物冷卻至26℃且添加12.7 g之Na2 CO3 ，接著加入65 mL MTBE。10 min後，過濾混合物。用10 L之 MTBE沖洗濾餅且用20 mL之水洗滌所組合之濾液且隨後用3×10 mL之10% KHCO3 洗滌有機層(注意：鼓泡)，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮。用8 mL之IPAc及8 mL之庚烷沖洗所得固體且在40℃下，在真空烘箱中乾燥以得到呈灰色固體之產物1－4c 。
[1－(4－氰基苯基)環丁基]胺基甲酸第三丁酯(1－2) 用氮將Pd2 dba3 (101 mg；1 mol%)及dppf(122 mg；2 mole%)於DMF(25 mL)中之攪拌漿液噴射5 min且隨後加溫至65℃且老化30 min。在該溫度下，添加芳基溴1－4c (3.6 g，11 mmol)、鋅粉(51 mg；6 mol%)及氰化鋅(777 mg；0.60當量)，用DMF(5 mL)沖洗。將溶液加熱至92－95℃且老化4 h。將溶液冷卻至RT隔夜，且經由Solka Floc墊過濾，用DMF(5 mL)沖洗濾餅。經3.5 h，在25－33℃下添加水(30 mL)連同晶種。在RT下老化隔夜後，過濾所得結晶溶液且用甲醇水溶液洗滌，且乾燥隔夜以產生呈黃色固體之1－2 。
{1－[4－苯基乙醯基]苯基}環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－3) 將苄基格林納(Benzyl Grignard)(19 mL，38.5 mmol)添加至腈1－2 (3 g，11 mmol)於THF(25 mL)中之攪拌、輕微渾濁溶液中，以一速率冷卻至大約－20℃，以便反應溫度不溫至－10℃以上。使溶液老化3－4小時，將反應溫度保持在－10℃與－20℃之間。將攪拌溶液冷卻至－30℃且添加至15 wt%檸檬酸水溶液(60 mL)中，該檸檬酸水溶液預先冷卻至5－10℃，維持溫度低於15℃。分離各層且用MTBE洗滌水性層。
組合有機層，用半飽和鹽水(60 mL)洗滌，且減壓濃縮。添加庚烷且將混合物濃縮成漿液，將其過濾，用庚烷(15 mL)洗滌且在氮下乾燥以得到1－3 。
4－胺基－2－氯煙鹼醛(1－5c) 將三氟乙酸(17.4 mL，234 mmol)小心添加至Boc醛1－4 (20 g，78.1 mmol)及二氯甲烷(60 mL)之攪拌混合物中，保持溫度低於25℃。將溶液溫至35℃，老化隔夜(劇烈排氣)且隨後冷卻至室溫。添加25 mL之MTBE且使所得白色漿液老化1小時，過濾且用MTBE(10 mL×2)沖洗濾餅。真空乾燥固體1－5c TFA鹽。
{1－[4－(5－氯－3－苯基－1,6－ 啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－5) 經20分鐘，將45 wt%氫氧化鉀溶液(18 mL，5當量)逐滴添加至氯吡啶TFA鹽1－5c (19.5 g)、環丁基胺基酮1－3 (26 g)及異丙醇(200 mL)之攪拌混合物中，保持溫度低於24℃。1 h後，添加水(100 mL)且又1 h後，過濾所得漿液，用2：1之IPA/水(30 mL，隨後24 mL)，隨後用水(80 mL，隨後2×60 mL)洗滌。在氮流下將固體乾燥以得到呈灰白色固體之1－5 。
{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－ 啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6) 在氮氣氛下，將無水肼(25 mL，797 mmol)添加至氯啶(1－5 )(25.12 g，51.7 mmol)於1,4－二噁烷(200 mL)中之攪拌溶液中，且將反應混合物加熱至95℃。30 min後，將溶液冷卻至室溫，添加乙酸乙酯(400 mL)且用重碳酸鈉飽和溶液，接著水及鹽水洗滌溶液，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮以得到呈橙色固體之(1－6 )。
流程1D
{1－[4－(9－苯基－3－嘧啶－2－基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6d) 向圓底燒瓶添加{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6 )(267 mg，0.554 mmol)、EDC(138 mg，0.721 mmol)、HOBt(97 mg，0.721 mmol)、嘧啶－2－羧酸(89 mg，0.721 mmol)、DIPEA(0.367 mL，2.218 mmol)及DMF(3 mL)。隨後將反應混合物封蓋並在100℃下，在微波照射下加熱5分鐘。將混合物冷卻，添加乙酸(0.476 mL，8.32 mmol)且隨後將反應封蓋並在80℃下，在微波照射下加熱5分鐘。使反應混合物冷卻至室溫，懸浮於乙酸乙酯中，用重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析法0－10% IPA/DCM純化所得殘餘物。組合適當溶離份且真空移除溶劑以得到呈橙色固體之{1－[4－(9－苯基－3－嘧啶－2－基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6d )。MS(M＋H)＋ ：觀察值＝570.2，計算值＝570.7。
1－[4－(9－苯基－3－嘧啶－2－基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁胺鹽酸鹽(1－10) 向{1－[4－(9－苯基－3－嘧啶－2－基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6d )(71 mg，0.125 mmol)於MeOH(2 mL)及DCM(3 mL)中之溶液添加HCl於EtOAc中之4 N溶液(3 mL，12 mmol)。在室溫下，使所密封之反應混合物攪拌。4小時後，濃縮反應混合物。4小時後，真空濃縮反應混合物。藉由逆相管柱層析(Sunfire C18)，用1至50%乙腈/(0.1% TFA/水)梯度溶離，將所得殘餘物純化。真空濃縮適當溶離份。隨後將所得殘餘物溶於DCM(5 mL)& MeOH(5 mL)中，隨後添加HCl於EtOAc中之4 N溶液(5 mL，20 mmol)，隨後真空濃縮以得到呈棕褐色固體之1－[4－(9－苯基－3－嘧啶－2－基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁胺鹽酸鹽(1－10 )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝470.2098，計算值＝470.2088。
流程1E(化合物1－16之替代合成)
中間物(1－5e) 將氯啶1－5 (1.8 g)、甲基肼羧酸酯(0.318 g)及異丙醇(20 L)之攪拌漿液溫至66℃，之後變成均質的。添加於IPA(0.05 ml)中之5－6 N HCl且溫度增加至70℃歷時16小時，且隨後冷卻至RT。冷卻至RT後，將45 wt%氫氧化鉀溶液(0.52 mL)與水(5.5 mL)混合且經15分鐘添加。30分鐘後，添加乙酸水溶液(0.7 mL於6 mL水中)，接著添加水(2 mL)。在RT下，將所得漿液老化3小時，過濾且用1：1 IPA/水(2×2.4 mL)洗滌。在氮流下將產物乾燥，隨後在20℃下，在二氯甲烷中調漿4小時，過濾且在氮流下乾燥以得到呈灰白色固體之1－5e 。
8－[4－(1－胺基環丁基)苯基]－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－3(2H )－酮(1－16) 經30 min，將濃HCl水溶液(12.1 M，1.64 mL)於乙醇(2.0 mL)中之溶液逐滴添加至50℃之1－5e (500 mg，0.985 mol)於乙醇(1.7 mL)及水(0.2 mL)中之攪拌漿液中。酸添加後之3小時後，將混合物播晶種且在50℃下老化隔夜，冷卻至室溫且過濾。經1 h，將乙醯氯(0.5 g，7 mmol)添加至0℃之乙醇(2 mL)中。隨後將溶液冷卻至室溫且老化30分鐘。用該溶液(1 mL×2)，隨後用乙酸乙酯(4 mL×2)洗滌濾餅，且最後在75.0℃下，在真空烘箱中，在氮吹掃(50托)下乾燥，直至藉由XRPD看見1－16 形式IV向形式II之完全轉化。
用於流程1A中之方法得到結晶雙HCl鹽1－16 ，表示形式I。流程1E中所述之程序產生雙HCl鹽1－16 之3種新多晶型物，表示形式II、III及IV。據發現，在氮吹掃下減壓條件下乾燥形式III或形式IV會將其完全轉化成形式II。將形式I及II於酸性乙醇中之混合物調漿會產生於漿液中之形式III。分離形式III且如上所述乾燥可產生形式II。
亦經由於水中之溶解產生1－16 之單HCl版本。6小時後，水性漿液轉變成淺黃色且將之過濾。該固體之氯化銀滴定顯示氯化物之一種等價物之存在。最後，用KOH水溶液(2當量)處理雙HCl鹽1－16 產生如由氯化物滴定所測定之中性1－16 。
流程1F
{1－[4－(3－甲基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6f) 向圓底燒瓶添加EDC(4.63 g，24.17 mmol)、HOBt(3.27 g，24.17 mmol)、無水DCM(50 mL)及乙酸(13.2 mL，13.86 mmol)。隨後，在室溫下，在氮氣氛下將反應混合物攪拌30分鐘。隨後，添加{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6 )(10.58 g，21.97 mmol)。隨後，在室溫下，在氮氣氛下，使反應混合物攪拌隔夜(18小時)，隨後加熱至80℃歷時2小時。隨後使反應混合物懸浮於乙酸乙酯中，緩慢傾倒至重碳酸鈉飽和溶液，接著水、鹽水中，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析法1－20% IPA/DCM純化所得殘餘物。組合適當溶離份且真空移除溶劑以得到呈棕褐色固體之{1－[4－(3－甲基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6f )。MS(M＋H)＋ ：觀察值＝506.2，計算值＝506.6。
1－[4－(3－甲基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－8－基)苯基]環丁胺鹽酸鹽(1－17) 向{1－[4－(3－甲基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6f )(9.23 g，18.26 mmol)於MeOH(20 mL)及DCM(100 mL)中之溶液添加HCl於EtOAc中之4 N溶液(91 mL，365 mmol)。在室溫下，使所密封之反應混合物攪拌。18小時後，過濾反應混合物以得到呈灰白色固體之1－[4－(3－甲基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁胺鹽酸鹽(1－17 )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝406.2047，計算值＝406.2026。
流程1G
{1－[4－(3－環丙基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6g) 向圓底燒瓶添加EDC(535 mg，2.79 mmol)、HOBt(377 mg，2.79 mmol)、無水DCM(17.5 mL)、無水NMP(.2.5 mL)及環丙烷羧酸(248 mg，5.40 mmol)。隨後，在室溫下，在氮氣氛下將反應混合物攪拌30分鐘。隨後，添加{1－[4－(5－肼基－3－苯基－1,6－啶－2－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6 )(1.221 g，2.54 mmol)。隨後，在室溫下，在氮氣氛下使反應混合物攪拌隔夜(18小時)。添加乙酸(2.178 mL，38.0 mmol)且在80℃下，在熱油浴中將反應混合物加熱2小時。使反應混合物冷卻至室溫，添加乙酸乙酯，且用重碳酸鈉飽和溶液、水、鹽水洗滌混合物，經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析法90% EtOAc/DCM(等度)純化所得殘餘物。組合適當溶離份且真空移除溶劑以得到呈粉紅色固體之{1－[4－(3－環丙基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(1－6g )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝532.2729，計算值＝532.2707。
1－[4－(3－環丙基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f ]－1,6－ 啶－8－基)苯基]環丁胺鹽酸鹽(1－23) 向{1－[4－(3－環丙基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯(MJK－9)(899.4 mg，18.26 mmol)於MeOH(5 mL)及DCM(15 mL)中之溶液添加HCl於EtOAc中之4 N溶液(4.23 mL，16.92 mmol)。在室溫下，使所密封之反應混合物攪拌。18小時後，過濾反應混合物以得到呈黃色固體之1－[4－(3－甲基－9－苯基[1,2,4]三唑幷[3,4－f]－1,6－啶－8－基)苯基]環丁胺鹽酸鹽(1－23 )。HRMS(M＋H)＋ ：觀察值＝432.2186，計算值＝432.2183。
實例1
選殖人類Akt同功異型物及△PH－Akt1 pS2neo載體(2001年4月3日作為ATCC PTA－3253寄存於ATCC)被如下製備：pRmHA3載體(如Nucl.Acid Res. 16：1043－1061(1988)中所述經製備)經BglII切割且分離2734 bp片段。pUChsneo載體(如EMBO J .4：167－171(1985)中所述經製備)亦經BglII切割且分離4029 bp帶。將該等兩個片段連接在一起以產生稱為pS2neo－1之載體。該質粒含有在金屬硫胺酸啟動子與乙醇脫氫酶多A添加位點之間的多酶切點接頭。其亦具有藉由熱休克啟動子(heat shock promoter)驅動之新抗性基因。pS2neo－1載體經Psp5II及BsiWI切割。合成兩個互補寡核苷酸且隨後黏接(CTGCGGCCGC(SEQ.ID.NO.：1)及GTACGCGGCCGCAG(SEQ.ID.NO.：2))。將經切割pS2neo－1及經黏接寡核苷酸連接在一起以產生第二載體pS2neo。將NotI位點添加於該轉化物中以輔助在轉染至S2細胞中之前之線性化。
人類Akt1基因藉由PCR(Clontech)，使用5'引子：5'CGCGAATTCAGATCTACCATGAGCGACGTGGCTATTGTG 3'(SEQ.ID.NO.：3)及3'引子：5'CGCTCTAGAGGATCCTCAGGCCGTGCTGCTGGC3'(SEQ.ID.NO.：4)自人類脾cDNA(Clontech)擴增出來。5'引子包括EcoRI及BglII位點。3'引子包括用於選殖目的之XbaI及BamHI位點。將所得PCR產物作為EcoRI/Xba I片段次選殖至pGEM3Z(Promega)中。為表現/純化目的，使用PCR引子：5'GTACGATGCTGAACGATATCTTCG 3'(SEQ.ID.NO.：5)將中間T標籤添加至全長Akt1基因之5'末端。所得PCR產物涵蓋5' KpnI位點及3' BamHI位點，其係用以次選殖在框架中具有含昆蟲細胞表現載體pS2neo之生物素標籤之片段。
為表現Akt1之pleckstrin同源域(PH)缺失(△aa 4－129，其包括Akt1鉸鏈區之部分之缺失)版本，使用於作為模板之pS2neo載體中之全長Akt1基因進行PCR缺失誘變。使用重疊內部引子(5'GAATACATGCCGATGGAAAGCGACGGGGCTGAAGAGATGGAGGTG 3'(SEQ.ID.NO.：6)及5'CCCCTCCATCT CTTCAGCCCCGTCGCTTTCCATCGGCATG TATTC 3'(SEQ.ID.NO.：7))(該引子涵蓋缺失)及涵蓋KpnI位點及5'末端上之中間T標籤之5'及3'側接引子，以2個步驟進行PCR。用KpnI及SmaI消化最終PCR產物且連接至pS2neo全長Akt1 KpnI/SmaI切割載體中，從而用缺失版本有效置換純系之5'末端。
人類Akt3基因藉由成熟腦cDNA(Clontech)之PCR，使用胺基末端寡聚引子：5' GAATTCAGATCTACCATGAGCGATGTTACCATTGTG 3'(SEQ.ID.NO.：8)；及羧基末端寡聚引子：5' TCTAGATCTTATTCTCGTCCACTTGCAGAG 3'(SEQ.ID.NO.：9)來擴增。
該等引子包括用於選殖目的之5' EcoRI/BglII位點及3' XbaI/BglII位點。將所得PCR產物選殖至pGEM4Z(Promega)之EcoRI及XbaI位點中。為表現/純化目的，使用PCR引子：5'GGTACCATGGAATACATGCCGATGGAAAGCGATGTTACCATTGTGAAG 3'(SEQ.ID.NO.：10)，將中間T標籤添加至全長Akt3純系之5'末端。所得PCR產物涵蓋5' KpnI位點，其允許在框架中用含昆蟲細胞表現載體pS2neo之生物素標籤來選殖。
人類Akt3基因藉由人類胸腺cDNA(Clontech)之PCR，使用胺基末端寡聚引子：5' AAGCTTAGATCTACCATGAATGAGGTGTCTGTC 3'(SEQ.ID.NO.：11)；及羧基末端寡聚引子：5'GAATTCGGATCCTCACTCGCGGATGCTGGC 3'(SEQ.ID.NO.：12)來擴增。該等引子包括用於選殖目的之5' HindIII/BglII位點及3' EcoRI/BamHI位點。將所得PCR產物次選殖至pGem3Z(Promega)之HindIII/EcoRI位點中。為表現/純化目的，使用PCR引子：5'GGTACCATGGAATACATGCCGATGGAAAATGAGGTGTCTGTCATCAAAG 3'(SEQ.ID.NO.：13)，將中間T標籤添加至全長Akt2之5'末端。將所得PCR產物次選殖至如上所述之pS2neo載體中。
實例2
表現人類Akt同功異型物及△PH－Akt1 將含有於pS2neo表現載體中之經選殖Akt1、Akt2、Akt3及△PH－Akt1基因之DNA純化且用以藉由磷酸鈣方法轉染果蠅(Drosophila )S2細胞(ATCC)。選擇抗生素(G418，500 μg/ml)抗性細胞之池。細胞膨脹至1.0 L體積(約7.0×106 /ml)，添加生物素及CuSO4 分別達到50 μM及50 mM之最終濃度。在27℃下，使細胞生長72 h且藉由離心收穫。在－70℃下冷凍細胞糊狀物直至需要。
實例3
純化人類Akt同功異型物及△PH－Akt1 藉由超聲波處理，用於緩衝液A：(pH 7.4之50 mM Tris、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0.2 mM AEBSF、10 μg/ml苯甲脒、各5 μg/ml之亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶及抑肽素、10%甘油及1 mM DTT)中之50 mls 1% CHAPS將來自實例2中所述之1公升S2細胞的細胞糊狀物溶解。在裝有9 mg/ml抗中間T單株抗體的蛋白質G瓊脂糖速流(Pharmacia)管柱上純化可溶性部分且用在含有25%甘油之緩衝液A中之75 μM EYMPME(SEQ.ID.NO.：14)肽來溶離。彙集含Akt/PKB部分且藉由SDS－PAGE評估蛋白質純度。使用標準Bradford協定對所純化之蛋白質定量。在液氮上急驟冷凍所純化之蛋白質且在－70℃下儲存。
自S2細胞純化之Akt及Akt pleckstrin同源域缺失需要活化。Akt及Akt pleckstrin同源域缺失係在含有10 nM PDK1(Upstate Biotechnology,Inc.)，脂質囊(10 μM磷脂醯肌醇－3,4,5－三磷酸酯－Metreya,Inc、100 μM磷脂醯膽鹼及100 μM磷脂醯絲胺酸－Avanti Polar lipids,Inc.)及活化緩衝液(pH 7.4之50 mM Tris、1.0 mM DTT、0.1 mM EGTA、1.0 μM微囊藻毒－LR、0.1 mM ATP、10 mM MgCl2 、333 μg/ml BSA及0.1 mM EDTA)之反應中活化(Alessi等人Current Biology 7：261－269)。在22℃下，將反應培養4小時。在液氮中急驟冷凍等分試樣。
實例4
Akt激酶檢定 利用GSK－衍生生物素標記肽受質來檢定活化Akt同功異型物及pleckstrin同源域缺失構築體。藉由均質時間分辨螢光(HTRF)，使用鑭系元素螯合劑(Lance)－與將結合於肽上之生物素部分之經抗生蛋白鏈菌素連接的別藻藍蛋白(SA－APC)螢光團組合之對磷酸肽特異之偶合單株抗體，測定肽磷酸化作用之程度。當Lance及APC接近(亦即結合於同一磷酸肽分子)時，自Lance向APC發生非輻射能量轉移，接著在665 nm下，自APC發射光。
檢定所需之材料：A.活化Akt同功酶或pleckstrin同源域缺失構築體
B. Akt肽受質：GSK3α(S21)肽#3928生物素－GGRARTSSF AEPG(SEQ.ID.NO.：15)，Macromolecular Resources。
C. Lance標記抗磷酸GSK3α單株抗體(Cell Signaling Technology，純系# 27)。
D. SA－APC(Prozyme目錄號PJ25S lot # 896067)。
E. MicrofluorB U底部微量滴定盤(Dynex Technologies，目錄號7205)。
F. DiscoveryHTRF微盤式分析器(Microplate Analyzer)，Packard Instrument Company。
G. 100 X蛋白酶抑制劑混合物(PIC)：1 mg/ml苯甲脒、0.5 mg/ml抑肽素、0.5 mg/ml亮抑蛋白酶肽、0.5 mg/ml抗蛋白酶。
H. 10X檢定緩衝液：pH 7.5之500 mM HEPES、1% PEG、mM EDTA、1 mM EGTA、1% BSA、20 mM－磷酸甘油。
I.中止緩衝液：pH 7.3之50 mM HEPES、16.6 mM EDTA、0.1% BSA、0.1% Triton X－100、0.17 nM Lance標記單株抗體純系#27、0.0067 mg/ml SA－APC
J. ATP/MgCl2 工作溶液：1X檢定緩衝液、1 mM DTT、1X PIC、125 mM KCl、5%甘油、25 mM MgCl2 、375 TM ATP
K.酶工作溶液：1X檢定緩衝液、1 mM DTT、1X PIC、5%甘油、活性Akt。選擇最終酶濃度以便檢定處於線性響應範圍中。
L.肽工作溶液：1X檢定緩衝液、1 mM DTT、1X PIC、5%甘油、2 TM GSK3生物素標記肽#3928
藉由將16 TL之ATP/MgCl2 工作溶液添加至96孔微量滴定盤之適當孔中來組合反應。添加抑制劑或媒劑(1.0 T1)，接著添加10 T1之肽工作溶液。藉由添加13 T1之酶工作溶液及混合來開始反應。使反應進行50 min且隨後藉由添加60 T1 HTRF中止緩衝液來停止。在室溫下將停止之反應培養至少30 min且隨後在Discovery器具上讀取。
用於抗生蛋白鏈菌素急驟培養盤檢定(Streptavidin Flash Plate Assay)之程序：步驟1： 將測試化合物於100% DMSO中之1 μl溶液添加至20 μl之2X受質溶液(20 μM GSK3肽、300 μM ATP、20 mM MgCl2 、20 μCi/ml[γ33 P]ATP、1X檢定緩衝液、5%甘油、1 mM DTT、1X PIC、0.1% BSA及100 mM KCl)中。藉由添加19 μl之2X酶溶液(6.4 nM活性Akt/PKB、1X檢定緩衝液、5%甘油、1 mM DTT、1X PIC及0.1% BSA)來引發磷酸化反應。隨後在室溫下，將反應培養45分鐘。
步驟2： 藉由添加170 μl之125 mM EDTA來停止反應。將200 μl之停止之反應轉移至抗生蛋白鏈菌素FlashplatePLUS(NEN Life Sciences，目錄號SMP103)中。在室溫下，在培養盤搖動器上將培養盤培養10分鐘。吸出各孔之內含物，且以每孔200 μl TBS將孔沖洗2次。隨後，以每孔200 μl TBS將孔洗滌3次歷時5分鐘，在洗滌步驟期間，在室溫下，在平臺搖動器上將培養盤培養。
用密封帶覆蓋培養盤且使用Packard TopCount，以用於在急驟培養盤中計數[33 P]之適當設定來計數。
用於抗生蛋白鏈菌素過濾盤檢定之程序：步驟1： 執行如上文抗生蛋白鏈菌素急驟培養盤檢定之步驟1中所述之酶促反應。
步驟2： 藉由添加20 μl之7.5M鹽酸胍停止反應。將50 μl之停止之反應轉移至抗生蛋白鏈菌素過濾盤(SAM2TM 生物素俘獲培養盤(Biotin Capture Plate)，Promega，目錄號V7542)且在施加真空之前，在過濾器上將反應培養1－2分鐘。
隨後使用真空歧管如下洗滌培養盤：1)4×200 μl/孔之2 M NaCl；2)具有1% H3 PO4 之6×200 μl/孔之2 M NaCl；3)2×200 μl/孔之diH2 O；及4)2×100 μl/孔之95%乙醇。隨後，使膜完全風乾，之後添加閃爍體。
用白色襯帶密封培養盤之底部，添加30 μl/孔之Microscint 20(Packard Instruments，目錄號6013621)。用澄清密封帶密封培養盤之頂部，且隨後使用Packard TopCount，以用於具有液體閃爍體之[33 P]之適當設定將培養盤計數。
用於磷纖維素過濾盤檢定(Phosphocellulose Filter Plate Assay)之程序：步驟1： 酶促反應係如抗生蛋白鏈菌素急驟培養盤檢定(上文)之步驟1中所述，利用KKGGRARTSSFAEPG(SEQ.ID.NO.：16)作為受質替代生物素－GGRARTSSFAEPG來執行。
步驟2： 藉由添加20 μl之0.75% H3 PO4 停止反應。將50 μl之停止之反應轉移至過濾盤(UNIFILTERTM ，Whatman P81強陽離子交換劑，白色聚苯乙烯96孔盤，Polyfiltronics，目錄號7700－3312)且在施加真空之前，在過濾器上將反應培養1－－2分鐘。
隨後使用真空歧管如下洗滌培養盤：1)9×200 μl/孔之0.75% H3 PO4 ；及2)2×200 μl/孔之diH2 O。用白色襯帶密封培養盤之底部，隨後添加30 μl/孔之Microscint 20。用澄清密封帶密封培養盤之頂部，且使用Packard TopCount，以用於[33 P]及液體閃爍體之適當設定對培養盤計數。
PKA檢定： 各個別PKA檢定由以下組分組成：A.5X PKA檢定緩衝液(pH 7.5之200 mM Tris、100 mM MgCl2 、5 mM β－巰基乙醇、0.5 mM EDTA)
B.稀釋於水中之Kemptide(Sigma)之50 μM原料
C.藉由將1.0 μl33 P－ATP[10 mCi/ml]稀釋於200 Tl之50 μM未標記ATP原料中製備之33 P－ATP
D. 10 μl的稀釋於0.5 mg/ml BSA中之PKA催化子單元(UBI目錄# 14－114)之70 nM原料
E. PKA/Kemptide工作溶液：相等體積之5X PKA檢定緩衝液、Kemptide溶液及PKA催化子單元。
在96深孔檢定培養盤中組合反應。將抑制劑或媒劑(10 Tl)添加至10 Tl之33 P－ATP溶液。藉由將30 Tl之PKA/Kemptide工作溶液添加至各孔來引發反應。將反應混合且在室溫下培養20 min。藉由添加50 Tl之100 mM EDTA及100 mM焦磷酸鈉且混合來停止反應。
在p81磷纖維素96孔過濾盤(Millipore)上收集酶反應產物(磷酸化Kemptide)。為預備培養盤，用75 mM磷酸填充p81過濾盤之各個孔。經由過濾器，藉由施加真空至培養盤之底部將孔抽空。將磷酸(75 mM，170 μl)添加至各孔。將來自各經停止PKA反應之30 μl等分試樣添加至含有磷酸之過濾盤上之相應孔中。在施加真空後，在過濾器上俘獲肽，且用75 mM磷酸將過濾器洗滌5次。最終洗滌後，使過濾器風乾。將閃爍液體(30 μl)添加至各孔中且在TopCount(Packard)上對過濾器計數。
PKC檢定： 各PKC檢定由以下組分組成：A. 10X PKC共活化緩衝液：2.5 mM EGTA、4 mM CaCl2
B. 5X PKC活化緩衝液：1.6 mg/ml磷脂醯絲胺酸、0.16 mg/ml二醯基甘油、pH 7.5之100 mM Tris、50 mM MgCl2 、5 mM β－巰基乙醇
C.藉由將1.0 μl33 P－ATP[10 mCi/ml]稀釋於100 μl之100 μM未標記ATP原料中製備之33 P－ATP
D.稀釋於水中之髓鞘鹼性蛋白(350 μg/ml，UBI)
E.稀釋於0.5 mg/ml BSA中之PKC(50 ng/ml，UBI目錄#14－115)
F.PKC/髓鞘鹼性蛋白工作溶液：藉由將分別5體積之PKC共活化緩衝液及髓鞘鹼性蛋白與分別10體積之PKC活化緩衝液及PKC混合來製備。
在96深孔檢定培養盤中組合檢定。將抑制劑或媒劑(10 Tl)添加至5.0 μl之33 P－ATP。以添加PKC/髓鞘鹼性蛋白工作溶液且混合來引發反應。在30℃下，將反應培養20 min。藉由添加50 Tl之100 mM EDTA及100 mM焦磷酸鈉且混合來停止反應。在96孔過濾盤中之PVDF膜上收集磷酸化髓鞘鹼性蛋白且藉由閃爍計數來定量。
在上文所述之檢定中測試了流程及表中所述之本發明之化合物，且發現其具有抵抗Akt1、Akt2及Akt3之一或多者之為50 μM之IC50 。
實例5
測定Akt/PKB之抑制之基於細胞的檢定 將細胞(例如，具有活化Akt/PKB之LnCaP或PTEN(－/－) 腫瘤細胞株)塗於100 mM培養皿中。當細胞為大致70至80%長滿時，用5 mls之新鮮培養基對細胞再進料，且將測試化合物添加於溶液中。對照物包括未經處理之細胞、經媒劑處理之細胞及用LY294002(Sigma)或渥曼青黴素(wortmanin)(Sigma)，分別以20 μM或200 nM處理之細胞。將細胞培養2、4或6小時，移除培養基，用PBS洗滌細胞，刮取且轉移至離心管中。使其成小球狀且再次用PBS洗滌。最後，使細胞小球再懸浮於溶解緩衝液(pH 8之20 mM Tris、140 mM NaCl、2 mM EDTA、1% Triton、1 mM焦磷酸鈉、10 mM β－磷酸甘油、10 mM NaF、0.5 mm NaVO4 、1 μM Microsystine及1×蛋白酶抑制劑混合物)中，置放於冰上15分鐘且輕輕渦旋以溶解細胞。在Beckman台式超離心機中，在4℃下，以100,000 x g旋轉溶胞物20 min。藉由標準Bradford協定(BioRad)對上清液蛋白質定量且在－70℃下儲存直至需要。
如下，自澄清溶胞物將蛋白質免疫沈澱(IP)：就Akt1/PKBα而言，將溶胞物與Santa Cruz sc－7126(D－17)混合於NETN(100 mM NaCl、pH 8.0之20 mM Tris、1 mM EDTA、0.5% NP－40)中且添加蛋白質A/G瓊脂糖(Santa Cruz sc－2003)。就Akt2/PKBβ而言，將溶胞物與抗Akt2瓊脂糖(Upstate Biotechnology #16－174)混合於NETN中，且就Akt3/PKBγ而言，將溶胞物與抗Akt3瓊脂糖(Upstate Biotechnology #16－175)混合於NETN中。在4℃下，將IP培養隔夜，洗滌且藉由SDS－PAGE分離。
使用特異抗體(Cell Signaling Technology)：抗總Akt(目錄號9272)、抗磷酸Akt絲胺酸473(目錄號9271)及抗磷酸Akt蘇胺酸308(目錄號9275)，使用西方墨點來分析總Akt、pThr308 Akt1、pSer473 Akt1以及Akt2及Akt3上之相應磷酸化位點，及Akt之下游標靶。在4℃下，用稀釋於PBS＋0.5%脫脂乳粉(NFDM)中之適當第一抗體培養隔夜後，洗滌墨點，在室溫下，用在PBS＋0.5% NFDM中之經辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase)(HRP)標記之第二抗體培養1小時。用ECL試劑(Amersham/Pharmacia Biotech RPN2134)偵測蛋白質。
實例6
Heregulin刺激之Akt活化 以每100 mM培養盤1×106 個細胞塗佈MCF7細胞(人類乳癌細胞株，亦即PTEN＋/＋ )。當細胞為70－80%長滿時，用5 ml之不含血清培養基對其再進料且培養隔夜。第二日早晨，添加化合物且將細胞培養1－2小時，該時間後添加heregulin(以誘導Akt之活化)歷時30分鐘且如上所述分析細胞。
實例7
抑制腫瘤生長 可藉由此項技術中熟知之若干協定來確認癌細胞症生長。在第0天，將顯示PI3K路徑(諸如LnCaP、PC3、C33a、OVCAR－3、MDA－MB－468、A2780或其類似物)之反常之人類腫瘤細胞株皮下注射至6－10週大的雌性裸(又，雄性小鼠[年齡10－14週]係用於前列腺腫瘤異種移植物[LnCaP及PC3])小鼠(Harlan)之左側腹中。將小鼠隨機分配至媒劑、化合物或組合治療群。第1天開始每日皮下投藥且持續歷時實驗之整個時期。或者，可藉由連續輸液泵投與抑制劑測試化合物。化合物、化合物組合或媒劑以0.2 ml之總體積來傳遞。當所有經媒劑治療動物顯示直徑0.5－1.0 cm之病灶時(通常為注射細胞後4至5.5週)，切除腫瘤且稱重。計算就各細胞株而言，各治療群中之腫瘤之平均重量。
實例8
點多路檢定 該程序描述用以偵測96孔格式培養盤之相同孔中之多個磷酸化蛋白的夾心免疫檢定。在96孔培養盤中培養細胞溶胞物，在該96孔培養盤上，不同俘獲抗體置放於相同孔中的空間相異點上。添加磷酸化特異兔多株抗體，且藉由經電化學發光標籤標記之抗兔抗體來偵測複合物。
96孔LNCaP培養盤＋/－化合物： 在Beckman J6中，以1200 rpm旋轉10 min，吸出培養基。添加50 μl/孔：TBS(pH 7.5之Pierce #28376－20 mM Tris、150 mM NaCl)＋1% Triton X－100＋蛋白酶及磷酸酶抑制劑。包裝於塑膠包裝中，置放於－70℃冷凍器中直至完全冷凍。用在1X Tris洗滌緩衝液中之3%阻斷劑150 μl/孔地阻斷多路培養盤(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)。用盤密封劑覆蓋，在Micromix搖動器上，室溫下培養2 h(最小)。用1X RCM 51(TTBS)洗滌。在冰上解凍細胞溶胞物培養盤，每孔40 μl溶胞物地將溶胞物添加至阻斷培養盤中。用盤密封劑覆蓋，在Micromix搖動器上，在4℃ O/N下培養，用1X RCM 51洗滌。在於1X Tris洗滌緩衝液中之1%阻斷劑A中稀釋第二抗體：單獨或呈組合之抗磷酸AKT(T308)、抗磷酸馬鈴薯球蛋白(Tuberin)(T1462)。25 μl/孔地添加，用盤密封劑覆蓋，在Micromix搖動器上，室溫下培養3 h。用1X RCM 51洗滌。在於1X Tris洗滌緩衝液中之1%阻斷劑A中稀釋Ru－GAR。25 μl/孔地添加，用盤密封劑覆蓋，在Micromix搖動器上，室溫下培養1 h。用1X RCM 51洗滌。用水將4X讀取緩衝液T稀釋至1X，每孔添加200 μl經稀釋讀取緩衝液。
在Sector 6000成像器上讀取。
蛋白酶及磷酸酶抑制劑： 微囊藻毒－LR，Calbiochem # 475815達到1 μM最終濃度(原料＝500 μM)Calbiochem # 524624，100X第I組Calbiochem # 524625，100X第II組Calbiochem # 539134，100X第III組
抗磷酸AKT(T308)： Cell Signaling Technologies # 9275
抗磷酸馬鈴薯球蛋白(T1462)： Covance親和力純化(兔MS 2731/2732)
Ru－GAR＝Ruthenylated山羊抗兔
10X Tris洗滌緩衝液、阻斷劑A及4X讀取緩衝液T
10X RCM 51(10X TTBS,RCM 51)
1X＝pH 7.5之20 mM Tris、140 mM NaCl、0.1% Tween－20
實例9
基於細胞之(活體內)檢定 該程序描述用於Akt絲胺酸/蘇胺酸激酶之基於細胞之(活體內)活性檢定。經活化的內源Akt能夠磷酸化經生物素標記之特異Akt受質(GSK3β)肽。藉由均質時間解析螢光(HTRF)，使用對磷酸肽及結合於肽上之生物素部分之抗生蛋白鏈菌素連接XL665螢光團為特異性之穴合銪[Eu(K)]偶合抗體，執行偵測。當[Eu(K)]及XL665接近(亦即結合於同一磷酸肽分子)時，自Eu(K)向XL665發生非輻射能量轉移，接著自XL665發射665 nm的光。
若各自之特異抗體存在，則檢定可用以偵測來自多種不同物種的所有3種Akt同功酶(Akt1、Akt2及Akt3)之抑制劑。
材料及試劑 A.細胞培養微量滴定平底96孔培養盤，Corning Costar，目錄號3598。
B.反應－結合蛋白質A塗佈之96孔培養盤，Pierce，目錄號15130。
C.反應－結合蛋白質G塗佈之96孔培養盤，Pierce，目錄號15131。
D.微混合5搖動器。
E. MicrofluorB U底部微量滴定盤，Dynex Technologies，目錄號7205。
F. 96孔培養盤洗滌器，Bio－Tek Instruments，目錄號EL 404。
G.DiscoveryHTRF微盤式分析器，Packard Instrument Company。
緩衝溶液 A.IP激酶細胞溶解緩衝液：1X TBS；0.2% Tween 20；1X蛋白酶抑制劑混合物III(原料為100X，Calbiochem,539134)；1X磷酸酶抑制劑混合物I(原料為100X，Calbiochem,524624)；及1X磷酸酶抑制劑混合物II(原料為100X，Calbiochem,524625)。
B.10X檢定緩衝液：pH 7.5之500 mM Hepes；1% PEG；1 mM EDTA；1 mM EGTA；及20 mM β－甘油磷酸酯。
C.IP激酶檢定緩衝液：1X檢定緩衝液；50 mM KCl；150 μM ATP；10 mM MgCl2 ；5%甘油；1 mM DTT；每50 ml檢定緩衝液1錠劑蛋白酶抑制劑混合物；及0.1% BSA。
D.GSK3β受質溶液：IP激酶檢定緩衝液；及500 nM生物素標記GSK3β肽。
E.Lance緩衝液：pH 7.5之50 mM Hepes；0.1% BsA；及0.1% Triton X－100。
F.Lance終止緩衝液：Lance緩衝液；及33.3 mM EDTA。
G.Lance偵測緩衝液：Lance緩衝液；13.3 μg/ml SA－APC；及0.665 nM EuK Ab a－磷酸(Ser－21)GSK3。
多步免疫沈澱Akt激酶檢定第1天 A.接種C33a細胞步驟：在96孔微量滴定盤中每孔塗佈60,000個C33a細胞。
B.在37℃將細胞培養隔夜。
第2天 D.化合物添加步驟：將於新鮮培養基(α－MEM/10% FBS，室溫)中之化合物添加至來自上述之96孔培養盤中，且在組織培養恆溫箱中培養5小時。
E.細胞溶解步驟：吸出培養基且添加100 μl之IP激酶細胞溶解緩衝液。
F.在－70℃下冷凍96孔微量滴定盤(注意：該步驟可進行最少1小時或隔夜。)
第3天 G.塗佈蛋白質A/G 96孔培養盤步驟：將適當濃度之於100 μl之PBS中的α－Akt抗體(Akt1、Akt2或Akt3)添加至以下孔中：α－Akt 1(20 ng/孔/100 ul) B2>>>>>>B10/列B－G/Akt1培養盤α－Akt 2(50 ng/孔/100ul) B2>>>>>>B10/列B－G/Akt2培養盤兔－IgG(150 ng/孔/100ul)：B11－G11於每一培養盤上(Akt1及Akt2)
H.在Micromix 5(20型；狀態2)上，在冷室(＋4℃)中培養4小時(注意：狀態視Micromix 5機器而定)。
I.吸出α－Akt抗體溶液且將100 μl之PBS添加至各孔。
J. Akt免疫沈澱步驟：向來自步驟(I)之100 μl之PBS添加5 μl之解凍細胞溶胞物用於Akt1培養盤，及添加10 μl之解凍細胞溶胞物用於Akt2培養盤。注意：在冰上解凍細胞溶胞物。藉由用節流吸管向上吸&向下吸10X來混合解凍溶胞物，之後轉移至抗體培養盤。將細胞溶胞物培養盤保持於冰上。將細胞溶胞物轉移至抗體培養盤後，在－70℃下將細胞溶胞物培養盤再冷凍。
K.在Micromix 5搖動器(20型，狀態3)上，在冷室(＋4℃)中培養隔夜。
第4天 L.免疫沈澱培養盤洗滌步驟：使用96孔培養盤洗滌器，用TTBS(RCM 51，1X＝2次循環)將96孔培養盤洗滌1X。用TTBS填充孔且培養10分鐘。用TTBS將96孔培養盤洗滌2X。(注意：使用前預先準備培養盤洗滌器：1.檢查緩衝液儲集器，確保其填滿，且2.排空廢料容器。)
M.手動培養盤洗滌步驟：添加180 μl之IP激酶檢定緩衝液。
N.開始Akt酶反應：吸出上清液。添加60 μl之GSK3β受質溶液。
O.在Micromix 5搖動器上，在室溫下培養2.5小時。注意：培養時間應經調整以便管柱10/管柱11之比率不為>10。
P.將30 μl之Lance偵測緩衝液與30 μl之Lance終止緩衝液組合(60 μl總體/孔)且添加至Microfluor U底96孔黑色培養盤中。
Q.停止Akt酶反應：將來自步驟(O)之蛋白質A/G 96孔培養盤之40 μl之Akt酶反應混合物轉移至來自步驟(P)之Microfluor U底96孔黑色培養盤中。
U.在室溫下，在Micromix 5搖動器(20型，狀態3)上培養1－2小時，隨後用使用Akt程式之Discovery HTRF微盤式分析器讀取。
IP激酶細胞溶解緩衝液 每孔100 μl
IP激酶檢定緩衝液 每孔100 μl
GSK3 受質溶液 每孔60 μl
Lance終止緩衝液 每孔30 μl
Lance偵測緩衝液 每孔30 μl
<110> 美國默克大藥廠 <120>AKT活性抑制劑 <130> 22304YS<140> 096145487 <141> 2007－11－29 <150> 60/873,198 <151> 2006－12－06 <150> 60/880,661 <151> 2007－01－16 <150> 60/967,872 <151> 2007－09－06 <160> 16 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 1<210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 2<210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 3<210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 4<210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 5<210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 6<210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 7<210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 8<210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 9<210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 10<210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 11<210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 12<210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 完全合成DNA序列<400> 13<210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 完全合成胺基酸序列<400> 14<210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 完全合成胺基酸序列<400> 15<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 完全合成胺基酸序列<400> 16

Claims (10)

  1. 一種根據式C之化合物： 其中：a為0或1；b為0或1；m為0、1或2；p為0、1或2；虛線代表視需要之雙鍵；R2 係獨立地選自：(C1 -C6 )烷基，(C1 -C6 )烷氧基、CO2 H、鹵基、OH及NH2 ；環Y為(C4 -C7 )環烷基；R1 係選自：H、側氧基、(C=O)a Ob (C1 -C10 )烷基，(C=O)a Ob -芳基、(C=O)a Ob (C2 -C10 )烯基、(C=O)a Ob (C2 -C10 )炔基、CO2 H、鹵基、OH、Ob (C1 -C6 )全氟烷基、(C=O)a NR7 R8 、CN、(C=O)a Ob (C3 -C8 )環烷基、S(O)m NR7 R8 、SH、S(O)m -(C1 -C10 )烷基及(C=O)a Ob -雜環基，該烷基、芳基、烯基、炔基、環烷基及雜環基經一或多個選自R6 之取代基取代或未經取代；R6 為：(C=O)a Ob C1 -C10 烷基，(C=O)a Ob 芳基、C2 -C10 烯基、C2 -C10 炔基、(C=O)a Ob 雜環基、CO2 H、鹵基、CN、OH、Ob C1 -C6 全氟烷基、Oa (C=O)b NR7 R8 、側氧基、CHO、(N=O)R7 R8 、S(O)m NR7 R8 、SH、S(O)m -(C1 -C10 )烷 基或(C=O)a Ob C3 -C8 環烷基，該烷基、芳基、烯基、炔基、雜環基及環烷基經一或多個選自R6a 之取代基取代或未經取代；R6a 係選自：(C=O)a Ob (C1 -C10 )烷基，Oa (C1 -C3 )全氟烷基、(C0 -C6 )伸烷基-S(O)m Ra 、SH、側氧基、OH、鹵基、CN、(C2 -C10 )烯基、(C2 -C10 )炔基、(C3 -C6 )環烷基、(C0 -C6 )伸烷基-芳基、(C0 -C6 )伸烷基-雜環基、(C0 -C6 )伸烷基-N(Rb )2 、C(O)Ra 、(C0 -C6 )伸烷基-CO2 Ra 、C(O)H及(C0 -C6 )伸烷基-CO2 H，該烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基及雜環基經至多3個選自以下者之取代基取代或未經取代：Rb 、OH、(C1 -C6 )烷氧基、鹵素、CO2 H、CN、Oa (C=O)b (C1 -C6 )烷基、側氧基及N(Rb )2 ；R7 及R8 係獨立地選自：H、(C=O)a Ob (C1 -C10 )烷基、(C=O)a Ob (C3 -C8 )環烷基、(C=O)a Ob -芳基、(C=O)a Ob -雜環基、(C2 -C10 )烯基、(C2 -C10 )炔基、SH、SO2 Ra 及(C=O)a NRb 2 ，該烷基、環烷基、芳基、雜環基、烯基及炔基經一或多個選自R6a 之取代基取代或未經取代：或R7 及R8 可連同其所連接之該氮一起形成單環或雙環雜環，其在各環中具有3-7個成員且視需要含有除該氮外之一或兩個選自N、O及S之額外雜原子，該單環或雙環雜環經一或多個選自R6a 之取代基取代或未經取代；Ra 為(C1 -C6 )烷基，(C3 -C6 )環烷基、芳基或雜環基；且Rb 獨立地為：H或(C1 -C6 )烷基；芳基為在各環中具有至多7個原子之單環或雙環碳 環，其中至少一個環為芳族；雜環基為含有1至4個選自由O、N及S組成之群之雜原子且包括雙環基團的3至10員芳族或非芳族雜環；或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 一種根據式E之化合物： 其中： 為 環Y為環丁基；R1 為H、嘧啶基、甲基咪唑、OH、甲基或環丙基；或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 一種化合物，其為：1-{4-[3-(1-甲基-1H -咪唑-4-基)-9-苯基[1,2,4]三唑幷[3,4-f ]-1,6-啶-8-基]苯基}環丁胺二鹽酸鹽； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  4. 一種化合物，其為：{1-[4-(9-苯基[1,2,4]三唑幷[3,4-f ]-1,6-啶-8-基)苯基]環丁基}胺基甲酸第三丁酯；或其醫藥學上可接受之鹽。
  5. 一種化合物，其為：1-[4-(9-苯基-3-嘧啶-2-基[1,2,4]三唑幷[3,4-f ]-1,6-啶-8-基)苯基]環丁胺；或其醫藥學上可接受之鹽。
  6. 一種化合物，其為：8-[4-(1-胺基環丁基)苯基]-9-苯基[1,2,4]三唑幷[3,4-f ]-1,6-啶-3(2H )-酮；或其醫藥學上可接受之鹽。
  7. 一種化合物，其為：1-[4-(3-甲基-9-苯基[1,2,4]三唑幷[3,4-f ]-1,6-啶-8-基)苯基]環丁胺；或其醫藥學上可接受之鹽。
  8. 一種化合物，其為：1-[4-(3-環丙基-9-苯基[1,2,4]三唑幷[3,4-f ]-1,6-啶-8-基)苯基]環丁胺；或其醫藥學上可接受之鹽。
  9. 一種醫藥組合物，其包含醫藥載劑及分散於其中之治療有效量之如請求項1的化合物。
  10. 一種如請求項1之化合物用於製備適用於治療或預防需要該治療之哺乳動物中的癌症之藥劑之用途。
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