CN101115479A

CN101115479A - Akt活性抑制剂

Info

Publication number: CN101115479A
Application number: CNA2006800044643A
Authority: CN
Inventors: N·D·P·科斯福德; M·E·莱顿; J·梁; C·W·林兹利; P·E·桑德森; Z·赵
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2005-02-14
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2008-01-30
Also published as: WO2006091395A3; EP1850843A2; AU2006216998A1; EP1850843A4; CA2597456A1; AU2006216998B2; JP2008530111A; US7589068B2; US20080009507A1; WO2006091395A2

Abstract

本发明提供抑制Akt活性的化合物。特别是，本发明公开的化合物选择性地抑制一种或者两种Akt同工酶。本发明还提供了包含所述抑制性化合物的组合物和通过将所述化合物给药至需要治疗癌症的患者而抑制Akt活性的方法。

Description

AKT活性抑制剂

背景技术

本发明涉及是一种或者多种丝氨酸/苏氨酸激酶同工酶Akt(亦称PKB；以下称为“Akt”)活性的抑制剂的化合物。本发明还涉及含有所述化合物的药物组合物以及在癌症治疗中使用本发明化合物的方法。

细胞凋亡(细胞程序死亡)在胚胎发育和在多种疾病(比如退化神经元疾病、心血管疾病和癌症等)的发病机理中都起着至关重要的作用。近期的研究已经使得参与程序性细胞死亡调节或执行的多种促凋亡基因产物和抗凋亡基因产物得到了确认。抗凋亡基因的表达，例如Bc12或Bc1-x_L的表达，抑制多种刺激诱导的凋亡性细胞死亡。另一方面，促凋亡基因的表达，例如Bax或Bad的表达会导致程序性细胞死亡(Aams等人，Science，281：1322-1326(1998))。程序性细胞死亡的执行是由与胱天蛋白酶(caspase)-1相关蛋白酶介导的，包括胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-9等(Thornberry等人，Science，281：1312-1316(1998))。

磷脂酰肌醇3′-OH激酶(PI3K)/Akt途径对调节细胞存活/细胞死亡显得很重要(Kulik等人，Mol.Cell.Biol.17：1595-1606(1997)；Franke等人，Cell，88：435-437(1997)；Kauffmann-Zeh等人，Nature 385：544-548(1997)；Hemmings Science，275：628-630(1997)；Dudek等人，Science，275：661-665(1997))。存活因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，通过诱导PI3K的活性，促进细胞在各种条件下的存活(Kulik等人，1997，Hemmings 1997)。活化PI3K导致磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸(PtdIns(3，4，5)-P3)产生，磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸继而与含有血小板白细胞C激酶底物同源(PH)结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶Akt结合，并促进其活化(Franke等人，Cell，81：727-736(1995)；HemmingsScience，277：534(1997)；Downward，Curr.Opin.Cell Biol.10：262-267(1998)；Alessi等，EMBO J.15：6541-6551(1996))。PI3K特异性抑制剂或显性失活Akt突变体破坏了这些生长因子或细胞因子促进存活的活性。先前已经公开，PI3K抑制剂(LY294002或渥曼青霉素)通过上游激酶阻断Akt的活化。另外，在细胞正常经历凋亡性细胞死亡的条件下，结构活性PI3K或Akt突变体的导入促进细胞存活(Kulik等人，1997，Dudek等人，1997)。

第二信使调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt亚家族的3个成员已经得到了鉴定，并分别称之为Akt1/PKα、Akt2/PKBβ和Akt3/PKBγ(在下文分别称为“Akt1”、“Akt2”和“Akt3”)。同工酶是同源的，特别是在编码催化结构域的区域是同源的。通过响应PI3K信号发生的磷酸化作用，Akt得到激活。PI3K使膜肌醇磷脂磷酸化，产生已经表明会结合到Akt的PH域上的第二信使磷脂酰-肌醇3，4，5-三磷酸和磷脂酰肌醇3，4-二磷酸。Akt激活的当前模型提出，通过3′-磷酸化磷酸肌醇将酶补充到膜上，并在膜上通过上游激酶，产生Akt调节位点的磷酸化作用(B.A.Hemmings，Science 275：628-630(1997)；B.A.Hemmings，Science 276：534(1997)；J.Downward，Science 279：673-674(1998))。

Akt1磷酸化发生在两个调节位点，催化结构域活化环上的Thr³⁰⁸和靠近羧基端的Ser⁴⁷³(D.R.Alessi等人，EMBO J.15：6541-6551(1996)和R.Meier等人，J.Biol.Chem.272：30491-30497(1997))。在Akt2和Akt3中存在同等的调节磷酸化位点。在活化环位点使Akt磷酸化的上游激酶被克隆，称为3′-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)。PDK1不仅使Akt磷酸化，而且可使p70核糖体S6激酶、p90RSK、血清及糖皮质素调节激酶(SGK)和蛋白激酶C磷酸化。对近羧基端的Akt调节位点磷酸化的上游激酶尚未得到鉴定，但近期的报告提示该酶对于整联蛋白偶联性激酶(ILK-1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或自身磷酸化的作用。

对人类肿瘤中Akt水平的分析表明，在为数众多的卵巢癌(J.Q.Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：9267-9271(1992))和胰腺癌(J.Q.Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：3636-3641(1996))中，Akt2都过量表达。类似地，还发现在乳腺癌细胞系和前列腺癌细胞系中，Akt3过量表达(Nakatani等人，J.Biol.Chem.274：21528-21532(1999))。

肿瘤抑制剂PTEN，一种特异性去除PtdIns(3，4，5)-P3中3′磷酸的蛋白质和脂质磷酸酶，是PI3K/Akt途径的负调节剂(Li等人，Science275：1943-1947(1997)，Stambolic等人，Cell 95：29-39(1998)，Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.96：6199-6204(1999))。PTEN的种系突变是造成人类癌症综合征的原因，例如Cowden病(Liaw等人，NatureGenetics 16：64-67(1997))。很大比例的人类肿瘤中的PTEN缺失，且无功能性PTEN的肿瘤细胞系显示活化Akt的水平升高(Li等人，出处同上，Guldberg等人，Cancer Research 57：3660-3663(1997)，Risinger等人，Cancer Research 57：4736-4738(1997))。

这些观察结果表明，在肿瘤发生中，PI3K/Akt途径在调节细胞存活或细胞凋亡中起着重要作用。

通过使用例如LY294002和渥曼青霉素等抑制剂抑制PI3K，可以实现对Akt活化和Akt活性的抑制。但是，PI3K抑制可能不加区别地影响不仅所有3个Akt同工酶，而且影响依赖于PdtIns(3，4，5)-P3的含有PH结构域的其它信号分子，例如酪氨酸激酶的Tec家族。另外，已经公开，Akt可被与PI3K无关的生长信号激活。

另外，可通过阻断上游激酶PDK1的活性抑制Akt活性。尚无特异性PDK1抑制剂的报道。再者，抑制PDK1可能导致抑制其活性依赖于PDK1的许多蛋白激酶，例如，非典型PKC同工酶、SGK和S6激酶(Williams等，Curr.Biol.10：439-448(2000))。

本发明的目标是提供新颖的Akt抑制剂化合物。

本发明的另一个目标是提供包含新颖的Akt抑制剂化合物的药物组合物。

本发明的目标还在于提供治疗癌症的方法，包括给药所述Akt活性抑制剂。

发明概述

发明详述

本发明化合物可以用于抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Akt的活性。在本发明第一实施方案中，Akt活性抑制剂表示为式A：

其中：

a为0或者1；b为0或者1；m为0、1或者2；n为0、1、2、3或者4；p为0、1、2、3、4或者5；和t为2、3、4、5或者6；

u、v、w和x独立地选自：CH和N；

y和z独立地选自：CH和N，条件是y和z中至少一个是N；

环K选自：(C₃-C₈)环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，条件是环K不是苯基；

R¹独立地选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、(C＝O)_aO_b-芳基、(C＝O)_aO_b(C₂-C₁₀)烯基、(C＝O)_aO_b(C₂-C₁₀)炔基、CO₂H、卤素、OH、O_b(C₁-C₆)全氟烷基、(C＝O)_aNR⁷R⁸、CN、(C＝O)_aO_b(C₃-C₈)环烷基、S(O)₂NR⁷R⁸、S(O)₂-(C₁-C₁₀)烷基和(C＝O)_aO_b-杂环基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、环烷基和杂环基任选被一个或者多个选自R⁶的取代基取代；

R²独立地选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、(C＝O)_aO_b-芳基、(C＝O)_aO_b(C₂-C₁₀)烯基、(C＝O)_aO_b(C₂-C₁₀)炔基、CO₂H、卤素、OH、O_b(C₁-C₆)全氟烷基、(C＝O)_aNR⁷R⁸、CN、(C＝O)_aO_b(C₃-C₈)环烷基、S(O)₂NR⁷R⁸、S(O)₂-(C₁-C₁₀)烷基和(C＝O)_aO_b-杂环基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、环烷基和杂环基任选被一个或者多个选自R⁶的取代基取代；

R³和R⁴独立地选自：H、(C₁-C₆)烷基和(C₁-C₆)全氟烷基，或者R³和R⁴可以合起来形成-(CH₂)_t-其中一个碳原子任选被选自O、S(O)_m、-N(R^b)C(O)-和-N(COR^a)-的部分替换；

R⁵选自：NR⁷R⁸；

R⁶为：(C＝O)_aO_bC₁-C₁₀烷基、(C＝O)_aO_b芳基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、(C＝O)_aO_b杂环基、CO₂H、卤素、CN、OH、O_bC₁-C₆全氟烷基、O_a(C＝O)_bNR⁷R⁸、氧代、CHO、(N＝O)R⁷R⁸、S(O)₂NR⁷R⁸、S(O)₂-(C₁-C₁₀)烷基或者(C＝O)_aO_bC₃-C₈环烷基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、杂环基和环烷基任选被一个或者多个选自R^6a的取代基取代；

R^6a选自：(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、O_a(C₁-C₃)全氟烷基、(C₀-C₆)亚烷基-S(O)_mR^a、氧代、OH、卤素、CN、(C₂-C₁₀)烯基、(C₂-C₁₀)炔基、(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₆)亚烷基-芳基、(C₀-C₆)亚烷基-杂环基、(C₀-C₆)亚烷基-N(R^b)₂、C(O)R^a、(C₀-C₆)亚烷基-CO₂R^a、C(O)H和(C₀-C₆)亚烷基-CO₂H，所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选被最高达三个选自R^6a的取代基取代；

R^6b选自：(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、O_a(C₁-C₃)全氟烷基、(C₀-C₆)亚烷基-S(O)_mR^a、氧代、OH、卤素、CN、(C₂-C₁₀)烯基、(C₂-C₁₀)炔基、(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₆)亚烷基-芳基、(C₀-C₆)亚烷基-杂环基、(C₀-C₆)亚烷基-N(R^b)₂、C(O)R^a、(C₀-C₆)亚烷基-CO₂R^a、C(O)H和(C₀-C₆)亚烷基-CO₂H，所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选被最高达三个选自R^b、OH、(C₁-C₆)烷氧基、卤素、CO₂H、CN、O_a(C＝O)_b(C₁-C₆)烷基、氧代和N(R^b)₂的取代基取代；

R⁷和R⁸独立地选自：H、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、(C＝O)_aO_b(C₃-C₈)环烷基、(C＝O)_aO_b-芳基、(C＝O)_aO_b-杂环基、(C₂-C₁₀)烯基、(C₂-C₁₀)炔基、SO₂R^a和(C＝O)_aNR^b ₂，所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选被一个或多个选自R^6a的取代基取代，或者R⁷和R⁸可以与它们连接的氮原子合起来形成在各个环中具有3-7个环原子和除了氮之外任选另外含有一个或者两个选自N、O和S的杂原子的单环或者二环杂环，所述单环或者二环杂环任选被一个或者多个选自R^6a的取代基取代；

R^a为(C₁-C₆)烷基、(C₃-C₆)环烷基、芳基或者杂环基；和

R^b为H、(C₁-C₆)烷基、芳基、杂环基、(C₃-C₆)环烷基、(C＝O)_aO_b(C₁-C₆)烷基或者S(O)₂R^a；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

在本发明第二实施方案中，Akt活性抑制剂表示为式B：

其中：

q为0、1、2、3或者4；

Q独立地选自：杂环基，所述杂环基任选被1～3个选自R^6a的取代基取代；

和所有其它取代基和变量如第一实施方案中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

在第三实施方案中，本发明的抑制剂表示为式C：

其中：

所有其它取代基和变量如第二实施方案中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

在第四实施方案中，本发明的抑制剂表示为式D：

其中：

所有其它取代基和变量如第二实施方案中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

在第五实施方案中，本发明的抑制剂表示为式E：

其中：

所有其它取代基和变量如第二实施方案中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

在第六实施方案中，本发明的抑制剂表示为式F：

其中：

所有其它取代基和变量如第一实施方案中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

在第七实施方案中，本发明的抑制剂表示为式G：

其中：

R³和R⁴独立地为：H和(C₁-C₆)烷基，其中所述烷基任选被最高达三个选自以下的取代基取代：OH和卤素；和其中R³和R⁴可以连接在一起形成(C₃-C₇)环烷基；和

所有其它取代基和变量如第一实施方案中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

在第八实施方案中，本发明的抑制剂表示为式G：

其中：

R³和R⁴独立地为：H和(C₁-C₆)烷基；和

所有其它取代基和变量如第一实施方案中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

本发明的具体化合物包括：

5-甲氧基-2-(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘(1-7)；

2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮(1-8)；

1-{4-[4-(3-嘧啶-5-基喹喔啉-2-基)苄基]环己基}-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(1-9)；

3-[3-(4-{[4-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-1-基)环己基]甲基}苯基)喹喔啉-2-基]噻吩-2-甲醛(1-10)；

1-4-{4-[3-(1H-吡唑-5-基)喹喔啉-2-基]苄基}环己基)-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(1-11)；和

2-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮(2-7)；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

本发明化合物的实例包括以下化合物的TFA盐：

5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘(1-7)；

3-[3-(4-{[4-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-1-基)环己基]甲基}苯基)喹喔啉-2-基]噻吩-2-甲醛(1-10)；和

1-(4-{4-[3-(1H-吡唑-5-基)喹喔啉-2-基]苄基}环己基)-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(1-11)；

或者其立体异构体。

本发明化合物可以具有不对称中心、手性轴和手性面(如E.L.Eliel和S.H.Wilen，Stereochemistry of Carbon Compounds，John Wiley&Sons，New York，1994，pages 1119-1190中所述)，并且可以存在为外消旋物、外消旋混合物和作为单一非对映异构体，与所有可能的异构体及其混合物，包括旋光异构体，所有这些立体异构体都包括在本发明范围内。

此外，在此公开的化合物可以作为互变异构体存在，并且其两种互变异构形式都意图包括在本发明范围内，即便仅仅对一种互变结构进行了说明。例如，以下任何涉及化合物A的权利要求都应当理解为包括互变结构B，反之亦然，及其混合物。苯并咪唑酮基部分的两种互变异构形式同样包括在本发明范围内。

四唑作为1H/2H互变异构体的混合物存在。四唑部分的互变异构形式同样包括在本发明范围内。

当任何变量(例如R¹、R²、R^6b等等)在任何结构中出现多于一次时，它在各次出现时的定义独立于下一次出现时的定义。并且，只有当组合能够产生稳定的化合物时，取代基和变量的组合才是允许的。从取代基画入环系统中的线表示所示键可以连接在任何可取代环原子上。如果所述环系统为二环系统，那么该键意图连接在二环部分的任一环的任何适宜原子上。

应当理解，本领域普通技术人员可以对本发明化合物上的取代基和取代方式进行选择，从而提供化学性质稳定并且可以由可以轻易获得的原料通过本领域已知工艺以及以下所述方法轻易合成的化合物。如果取代基自身被多于一个基团取代，那么应当理解，所述多个基团可以在相同碳原子或者不同碳原子上，只要得到稳定结构即可。短语“任选被一个或者多个取代基取代”应当理解为等价于短语“任选被至少一个取代基取代”，并且在这种情形下，优选实施方案将具有0～4个取代基，并且更优选的实施方案将具有0～3个取代基。

在此使用的“烷基”意指包括具有指定碳原子数目的支链和直链的饱和脂族烃基。例如，C₁-C₁₀，如在“C₁-C₁₀烷基”中定义，为包括在直链或者支链结构中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个碳原子的基团。例如，“(C₁-C₁₀)烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基等等。

术语“环烷基”是指具有指定数目碳原子的单环饱和脂族烃基。例如，“环烷基”包括环丙基、甲基-环丙基、2，2-二甲基-环丁基、2-乙基-环戊基和环己基等等。

“烷氧基”表示通过氧桥连接的具有所述碳原子数目的环状或者非环状烷基。由此，“烷氧基”包含以上烷基和环烷基的定义。

如果碳原子数目没有明确说明，那么术语“烯基”是指含有2～10个碳原子和至少一个碳碳双键的直链、支链或者环状非芳香烃基。优选存在一个碳碳双键，并且可以存在最高达四个非芳香碳碳双键。由此，“(C₂-C₁₀)烯基”是指具有2～10个碳原子的烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、2-甲基丁烯基和环己烯基。烯基的直链、支链或者环部分可以含有双键，并且如果表明为取代烯基，那么可以被取代。

术语“炔基”是指含有2～10个碳原子和至少一个碳碳三键的直链、支链或者环状烃基。其中可以存在最高达三个碳碳三键。由此，“(C₂-C₁₀)炔基”是指具有2～10个碳原子的炔基。所述炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基和3-甲基丁炔基等等。炔基的直链、支链或者环部分可以含有三键，并且如果表明为取代炔基，那么其可以被取代。

在某些情况下，取代基可以用包括0的碳原子范围来限定，比如(C₀-C₆)亚烷基-芳基。如果芳基取值为苯基，那么该定义将包括苯基自身以及-CH₂Ph、-CH₂CH₂Ph和-CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)Ph等等。

在此使用的“芳基”是指任何稳定的在各环中有最高达7个原子的单环或者双环碳环，其中至少一个环是芳香环。所述芳基的实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和联苯基。可以理解，在芳基取代基是二环取代基以及一个环是非芳香环的情况中，连接是通过芳环进行的。

在此使用的术语“杂芳基”表示各环中有最高达7个原子的稳定单环或者二环，其中至少一个环是芳香环并且含有1～4个选自O、N、和S的杂原子。在此定义范围内的杂芳基包括但不限于：吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、唑基、异唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉。正如以下杂环的定义一样，“杂芳基”还应当理解为包括任何含氮杂芳基的N-氧化物衍生物。在其中杂芳基取代基是二环取代基并且一个环是非芳香环或者不包含杂原子的情况下，可以理解，连接分别通过芳环或者通过包含杂原子的环进行。取代基Q的所述杂芳基部分包括但不限于：2-苯并咪唑基、2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、1-异喹啉基、3-异喹啉基和4-异喹啉基。

在此使用的术语“杂环”或者“杂环基”表示含有1～4个选自O、N和S的杂原子的3～10元芳香或者非芳香杂环，并且包括二环基团。因此，“杂环基”包括上述杂芳基以及其二氢或者四氢类似物。“杂环基”的其它实例包括但不限于以下：苯并咪唑基、苯并咪唑酮基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、indolazinyl、吲唑基、异苯并呋喃基、异氮杂茚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、萘吡啶基、二唑基、唑基、唑啉、异唑啉、氧杂环丁基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、1，4-二氧杂环己基、六氢氮杂基、哌嗪基、哌啶基、吡啶-2-酮基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异唑基、二氢异噻唑基、二氢二唑基、二氢唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基及其N-氧化物。杂环基取代基可以经碳原子或者杂原子进行连接。

如熟练的技术人员所理解，本文中使用的“卤”或者“卤素”意指包括氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)和碘(I)。

在一种实施方案中，下式表示的部分：

包括以下结构，这些结构仅仅是例证性而非限制性结构；此外，所述二环结构中所含的任何适宜的碳和/或氮原子可以任选被1、2或者3个选自R¹的取代基取代：

和

在另一实施方案中，下式表示的部分：

选自：

和

其中在所述二环结构中，任何适宜的碳和/或氮原子可以任选被1～3个选自R¹的取代基取代。

在另一实施方案中，下式表示的部分：

选自：

在一种实施方案中，环K选自杂环基。

在一种实施方案中，环K选自：

在一种实施方案中，n为0、1、2或者3。

在进一步实施方案中，n为0、1或者2。

在另一实施方案中，n为1。

在一种实施方案中，p为0、1、2或者3。

在进一步实施方案中，p为0、1或者2。

在另一实施方案中，p为1。

在一种实施方案中，y和z为N。

在另一实施方案中，y为N和z为CH。

在另一实施方案中，y为CH和z为N。

在一种实施方案中，Q选自：苯并咪唑基、苯并咪唑酮基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、indolazinyl、吲唑基、异苯并呋喃基、异氮杂茚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、萘吡啶基、二唑基、唑基、唑啉、异唑啉、氧杂环丁基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、1，4-二氧杂环己基、六氢氮杂基、哌嗪基、哌啶基、吡啶-2-酮基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异唑基、二氢异噻唑基、二氢二唑基、二氢唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基及其N-氧化物，其任选被1～3个选自R^6b的取代基取代。杂环基取代基可以经碳原子或者杂原子进行连接。

在进一步施方案中，Q选自：2-azepinone、苯并咪唑基、苯并咪唑酮基、2-diazapinone、咪唑基、2-咪唑烷酮、吲哚基、异喹啉基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡咯烷基、2-哌啶酮、2-嘧啶酮、2-吡咯烷酮、喹啉基、四唑基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基和噻吩基，其任选被1～3个选自R^6b的取代基取代。杂环基取代基可以经碳原子或者杂原子进行连接。

在再进一步实施方案中，当Q为杂环基时，Q选自：

其任选被1～3个选自R^6b的取代基取代。

在还进一步实施方案中，当Q为杂环基时，Q选自：

和其任选被一个选自R^6b的取代基取代。

在一种实施方案中，R¹选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、(C＝O)_aO_b-芳基、(C＝O)_aO_b(C₂-C₁₀)烯基、(C＝O)_aO_b(C₂-C₁₀)炔基、CO₂H、卤素、OH、O_b(C₁-C₆)全氟烷基、(C＝O)_aNR⁷R⁸、CN、(C＝O)_aO_b(C₃-C₈)环烷基、S(O)₂NR⁷R⁸、S(O)₂-(C₁-C₁₀)烷基和(C＝O)_aO_b-杂环基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、环烷基和杂环基任选被R^b、OH、(C₁-C₆)烷氧基、卤素、CO₂H、CN、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基、氧代和N(R^b)₂取代。

在另一实施方案中，R¹选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、CO₂H、卤素、OH、CN、(C₁-C₆)烷氧基、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基和N(R^b)₂。

在另一实施方案中，R¹选自：氧代和O(C₁-C₆)烷基。

在一种实施方案中，R²选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、(C＝O)_aO_b-芳基、(C＝O)_aO_b(C₂-C₁₀)烯基、(C＝O)_aO_b(C₂-C₁₀)炔基、CO₂H、卤素、OH、O_b(C₁-C₆)全氟烷基、(C＝O)_aNR⁷R⁸、CN、(C＝O)_aO_b(C₃-C₈)环烷基、S(O)₂NR⁷R⁸、S(O)₂-(C₁-C₁₀)烷基和(C＝O)_aO_b-杂环基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、环烷基和杂环基任选被R^b、OH、(C₁-C₆)烷氧基、卤素、CO₂H、CN、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基、氧代和N(R^b)₂取代。

在另一实施方案中，R²选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、CO₂H、卤素、OH、CN、(C₁-C₆)烷氧基、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基、(C₂-C₁₀)烯基和N(R^b)₂，所述烯基任选被氧代取代。

在一种实施方案中，R³和R⁴选自H和(C₁-C₆)烷基。

在另一实施方案中，R³和R⁴为H。

在一种实施方案中，当Q被R^6b取代时，所述R^6b为任选被最高达三个选自以下的取代基取代的杂环基：R^b、OH、(C₁-C₆)烷氧基、卤素、CO₂H、CN、O_a(C＝O)_b(C₁-C₆)烷基、氧代和N(R^b)₂。

在另一实施方案中，当Q被R^6b取代时，所述R^6b选自：任选被1～3个选自氧代、OH、N(R^b)₂、卤素和O_a(C₁-C₆)烷基的取代基取代的

在一种实施方案中，R^b独立地选自H和(C₁-C₆)烷基。

在式A的一种实施方案中，环K为杂环基；R¹选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、CO₂H、卤素、OH、CN、(C₁-C₆)烷氧基、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基和N(R^b)₂；R²选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、CO₂H、卤素、OH、CN、(C₁-C₆)烷氧基、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基、(C₂-C₁₀)烯基和N(R^b)₂，所述烯基任选被氧代取代；R³和R⁴为H；Q独立地选自：杂环基，所述杂环基任选被1～3个选自R^6b的取代基取代；R^6b为任选被最高达三个选自R^b、OH、(C₁-C₆)烷氧基、卤素、CO₂H、CN、O_a(C＝O)_b(C₁-C₆)烷基、氧代，和N(R^b)₂的取代基取代的杂环基；R^b独立地选自H和(C₁-C₆)烷基；所有其它取代基和变量如上式A中所定义。

在式D的一种实施方案中，环K为杂环基；R¹选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、CO₂H、卤素、OH、CN、(C₁-C₆)烷氧基、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基和N(R^b)₂；R²选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、CO₂H、卤素、OH、CN、(C₁-C₆)烷氧基、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基、(C₂-C₁₀)烯基和N(R^b)₂，所述烯基任选被氧代取代；R³和R⁴为H；Q独立地选自：杂环基，所述杂环基任选被1～3个选自R^6b的取代基取代；R^6b为任选被最高达三个选自R^b、OH、(C₁-C₆)烷氧基、卤素、CO₂H、CN、O_a(C＝O)_b(C₁-C₆)烷基、氧代和N(R^b)₂的取代基取代的杂环基；R^b独立地选自H和(C₁-C₆)烷基；所有其它取代基和变量如上式D中所定义。

在式E的一种实施方案中，环K为杂环基；R¹选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、CO₂H、卤素、OH、CN、(C₁-C₆)烷氧基、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基和N(R^b)₂；R²选自：氧代、(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、CO₂H、卤素、OH、CN、(C₁-C₆)烷氧基、O(C＝O)(C₁-C₆)烷基、(C₂-C₁₀)烯基和N(R^b)₂，所述烯基任选被氧代取代；R³和R⁴为H；Q独立地选自：杂环基，所述杂环基任选被1～3个选自R^6b的取代基取代；R^6b为任选被最高达三个选自R^b、OH、(C₁-C₆)烷氧基、卤素、CO₂H、CN、O_a(C＝O)_b(C₁-C₆)烷基、氧代和N(R^b)₂的取代基取代的杂环基；R^b独立地选自H和(C₁-C₆)烷基；所有其它取代基和变量如上式E中所定义。

在式G的一种实施方案中，环K选自杂环基。

在式G的一种实施方案中，p为0和环K选自：

在式G的一种实施方案中，p为0和环K为

本发明包括式A化合物的游离形式以及其药学上可接受的盐和立体异构体。在此例证说明的一些分离的具体化合物为胺化合物的质子化盐。术语“游离形式”是指为非盐形式的胺化合物。本发明所包含的药学上可接受的盐不仅包括对于在此所述具体化合物而例证说明的分离盐，而且包括游离形式的式A化合物的所有一般药学上可接受的盐。所述化合物具体盐的游离形式可以应用本领域已知的工艺进行分离。例如，上述游离形式可以通过用适宜的稀碱水溶液处理所述盐重新得到，所述稀碱水溶液比如稀NaOH、碳酸钾、氨水和碳酸氢钠水溶液。所述游离形式在某些物理性能上可以与其相应的盐形式存在某些不同，比如在极性溶剂中的溶解度，但是基于本发明目的，其酸和碱盐是其它与其相应的游离形式药学上等同的盐。

本发明化合物药学上可接受的盐，可以由含有碱性或者酸性部分的本发明化合物利用常规化学方法进行合成。通常，碱性化合物的盐通过离子交换色谱法进行制备，或者通过在适当溶剂或者溶剂的多种组合中，使游离碱与化学计量或者与过量的形成期望盐的无机酸或有机酸反应进行制备。类似地，酸性化合物的盐通过与适当的无机或者有机碱反应而得到形成。

由此，本发明化合物药学上可接受的盐包括通过使本发明碱性化合物与无机或者有机酸反应而形成的本发明化合物的常规无毒盐。例如，常规的无毒盐包括由无机酸得到的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、胺磺酸盐、磷酸盐和硝酸盐等等，以及由有机酸制备的盐，例如醋酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、乙醇酸盐、硬脂酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、扑酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、苯基马来酸盐、谷氨酸盐、安息香酸盐、水杨酸盐、磺胺酸盐、2-乙酰氧基-安息香酸盐、富马酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙基二磺酸盐、草酸盐、羟乙磺酸盐和三氟乙酸盐(TFA)等等。

当本发明化合物为酸性化合物时，适宜的“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱(包括无机碱和有机碱)制备得到的盐。由无机碱衍生得到的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、三价铁盐、二价铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等等。特别优选铵、钙、镁、钾和钠盐。由药学上可接受的有机无毒碱衍生得到的盐包括伯胺盐、仲胺盐、叔胺盐、取代胺盐(包括天然存在的取代胺盐)、环胺盐和阳离子离子交换树脂盐，比如精氨酸、甜菜碱咖啡因、胆碱、N，N¹-二苄基乙二胺、二乙基胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、哈胺、异丙胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺和氨基丁三醇等等。

如上所述药学上可接受的盐以及其它一般药学上可接受的盐的制备由Berg等人，″Pharmaceutical Salts″，J.Pharm.Sci.，1977，66：1-19进行了更全面的描述。

还应当指出，本发明化合物潜在地是内盐或者两性离子化合物，因为在生理条件下，化合物中的去质子酸性部分(比如羧基)可以成为阴离子，随后此电荷可以与质子化或者烷基化碱性部分(比如季氮原子)的阳离子电荷得到内部平衡。

应用

本发明化合物是Akt活性抑制剂，因此可以用于治疗癌症，特别是与Akt活性异常及Akt下游细胞靶相关的癌症。所述癌症包括但不限于卵巢癌、胰腺癌、乳癌和前列腺癌，以及肿瘤抑制剂PTEN在其中发生突变的癌症(包括恶性胶质瘤)(Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89：9267-9271；Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93：3636-3641；Bellacosa等人，Int.J.Cancer(1995)64：280-285；Nakatani等人，J.Biol.Chem.(1999)274：21528-21532；Graff，Expert.Opin.Ther.Targets(2002)6(1)：103-113；和Yamada和Araki，J.Cell Science.(2001)114：2375-2382；Mischel和Cloughesy，Brain Pathol.(2003)13(1)：52-61)。

认为在此提供的化合物、组合物和方法特别可以用于治疗癌症。可以通过本发明化合物、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：心脏：(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸态瘤；肺：支气管癌(鳞状上皮细胞、未异化小细胞、未异化大细胞、恶性腺瘤)、肺泡(bronchiolar)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤错构瘤、间皮瘤；胃肠：食道(鳞状细胞癌、恶性腺瘤、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺胰腺(ductal ductal ductal恶性腺瘤、胰岛瘤、胰升血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、vipoma)、小肠(恶性腺瘤、淋巴瘤、类癌瘤、Karposi′s sarcoma、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤纤维神经瘤、纤维瘤)、大肠(恶性腺瘤、管腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道：肾(恶性腺瘤、韦母氏瘤[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、血癌)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、转移细胞癌、恶性腺瘤)、前列腺(恶性腺瘤、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸态瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝：肝癌(肝细胞癌)、胆管细胞癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨骼：骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索癌、osteochronfroma(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、chondromyxofibroma、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统：头骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、佩吉特氏病)、脑膜(脑膜瘤、meningiosarcoma、神经胶质瘤)、大脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、胚组织瘤[松果状瘤]、恶性胶质瘤多型、少枝胶质瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓纤维神经瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、宫颈(宫颈癌、预肿瘤子宫颈非典型增生)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、一般性癌症]、肉芽瘤-膜细胞肿瘤、卵巢塞-莱二氏细胞瘤、无性细胞瘤、卵巢未成熟畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、恶性腺瘤、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄样肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤))、输卵管(癌)；血液：血液(骨髓性白血病[急性和慢性]、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓及外骨髓增殖病、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征)淋巴肉芽肿病、非何杰金氏淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤：恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、Karposi′s sarcoma、moles dysplastic nevi、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣；和肾上腺：成神经细胞瘤。由此，如上所给出的术语“癌细胞”包括受任何上述等同症状折磨的细胞。

可以通过本发明化合物、组合物和方法进行治疗的癌症包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、脑癌、睾丸癌、胃癌、pancrease、皮肤癌、小肠癌、大肠癌、喉癌、头部和颈癌、口腔癌、骨癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌和血癌。

Akt信号调节血管形成中的多个关键步骤。Shiojima和Walsh，Circ.Res.(2002)90：1243-1250。血管形成抑制剂在癌症治疗中的应用在文献中已知，例如，参见J.Rak等人，Cancer Research，55：4575-4580，1995和Dredge等人，Expert Opin.Biol.Ther.(2002)2(8)：953-966。血管形成在癌症中的作用在多种癌肿和组织中得到了表明：乳腺癌(G.Gasparini和A.L.Harris，J.Clin.Oncol.，1995，13：765-782；M.Toi等人，Japan.J.Cancer Res.，1994，85：1045-1049)；膀胱癌(A.J.Dickinson等人，Br.J.Urol.，1994，74：762-766)；结肠癌(L.M.Ellis等人，Surgery，1996，120(5)：871-878)；和口腔肿瘤(J.K.Williams等人，Am.J.Surg.，1994，168：373-380)。其它癌症包括晚期肿瘤、毛细胞白血病、黑素瘤、晚期头颈部癌、转移性肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、转移性乳癌、乳腺癌，晚期黑素瘤、胰腺癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、各种实体瘤、多发性骨髓瘤、转移性前列腺癌、恶性神经胶质瘤、肾癌、淋巴瘤、顽固性转移性疾病、顽固性多发性骨髓瘤、宫颈癌、卡波西肉瘤、复发性间变神经胶质瘤和转移性结肠癌(Dredge等，Expert Opin.Biol.Ther.(2002)2(8)：953-966)。由此，本申请所公开的Akt抑制剂也可以用于治疗这些血管生成相关的癌症。

已经历新血管形成的肿瘤显示升高的转移可能性。事实上，血管生成对肿瘤生长和转移是至关重要的(S.P Cunningham等人，Can.Research，61：3206-3211(2001))。因此，在本申请中公开的Akt抑制剂也可以用于预防或降低肿瘤细胞的转移。

还包含在本发明范围的是治疗或预防涉及血管生成的疾病的方法，该方法包括向需要所述治疗的哺乳动物给药治疗有效量的本发明化合物。眼部新血管形成病是其中大部分组织损害可以归咎于眼内血管的异常浸润的症状的一个实例(参见WO 00/30651，2000年6月2日公布)。不期望的浸润可以由局部缺血性视网膜病(比如由糖尿病性视网膜病、早熟儿视网膜病、视网膜静脉闭塞等)或变性疾病(比如在老龄化相关性黄斑变性中观察到的脉胳膜新血管形成)引起。因此，通过给予本发明化合物对血管生长的抑制作用可以预防血管浸润，和可以预防或治疗涉及血管生成的疾病，例如视网膜血管化、糖尿病性视网膜病、老年黄斑变性等。

还包含在本发明范围的是治疗或预防涉及血管生成的非恶性疾病的方法，所述疾病包括但不限于：眼疾(例如视网膜血管化、糖尿病性视网膜病和老龄化相关性黄斑变性)、动脉粥样硬化、关节炎、牛皮癣、肥胖症和阿尔茨海默病(Dredge等人，Expert Opin.Biol.Ther.(2002)2(8)：953-966)。在另一实施方案中，治疗或预防涉及血管生成的疾病的方法包括：眼疾(例如视网膜血管化、糖尿病性视网膜病和老龄化相关性黄斑变性)、动脉粥样硬化、关节炎和牛皮癣。

还包含在本发明范围的是治疗过度增殖性病症的方法，例如再狭窄、炎症、自身免疫病和变态反应/哮喘。

还包括在本发明范围内的是本发明化合物涂覆支架(stent)的用途，以及由此本发明化合物在涂覆支架上用于治疗和/或预防再狭窄的用途(WO03/032809)。

还包括在本发明范围内的是本发明化合物用于治疗和/或预防骨关节炎的用途(WO03/035048)。

还包含在本发明范围的是治疗高胰岛素血症的方法。

本发明化合物还可以用于制备用于治疗上述疾病(特别是癌症)的药物。

在本发明的一种实施方案中，本发明化合物为选择性抑制剂，其抑制效力取决于PH结构域。在该实施方案中，所述化合物对缺乏PH结构域的截短Akt蛋白表现为体外抑制活性降低或无体外抑制活性。

在另一实施方案中，本发明化合物选自Akt1选择性抑制剂、Akt2选择性抑制剂及Akt1和Akt2二者的选择性抑制剂。

在另一实施方案中，本发明化合物选自Akt1选择性抑制剂、Akt2选择性抑制剂、Akt3选择性抑制剂及上述三种Akt同工酶中两种Akt的选择性抑制剂。

在另一实施方案中，本发明化合物为所有三种Akt同工酶的选择性抑制剂，但不是经改造而删除PH结构域、删除铰链区或删除PH结构域和铰链区二者后的1种、2种或所有这些Akt同工酶的抑制剂。

本发明还涉及抑制Akt活性的方法，包括给药需要其的哺乳动物药用有效量的本发明化合物。

根据标准药物实践，本发明化合物可以单独或者以药物组合物的形式联用药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂一起给药至哺乳动物，包括人类。所述化合物可以口服给药或胃肠外给药，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、直肠内和局部等给药途径。

含有活性成分的药物组合物可为适于口服应用的形式，例如，片剂、糖锭剂、锭剂、水性混悬剂或油性混悬剂、分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬质胶囊剂或软质胶囊剂、糖浆剂或酏剂。用于口服的组合物可以根据本领域已知的任何制备药物组合物的方法进行制备，并且为了提供美观适口的药物制剂，所述组合物可以包含一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的成分。片剂包含与适用于片剂制备的无毒可药用赋形剂混合的活性成分。所述赋形剂可以是，例如惰性稀释剂，比如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯树胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。可以不对片剂进行包衣，或者可以用已知技术对其进行包衣以掩盖药物的不适味道，或延迟其在胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长时间内提供持续作用。例如，可以使用水溶性味道掩蔽材料，例如羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素，或者，可以使用延时材料例如乙基纤维素、醋酸丁酸纤维素。

用于口服应用的制剂还可为硬明胶胶囊剂，其中活性成分与碳酸钙、磷酸钙或高岭土等惰性固体稀释剂进行混合；或者为软明胶胶囊剂，其中活性成分与聚乙二醇等水可溶性载体进行混合，或与花生油、液体石蜡或橄榄油等油性介质进行混合。

水性混悬剂含有与适于制备水性混悬剂的赋形剂混合的活性材料。所述赋形剂为悬浮剂、分散剂或湿润剂，悬浮剂例如羧甲基纤维素纳、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂可为天然磷脂，例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七碳乙烯氧基十六醇，或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水性混悬剂还可以包含一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂及一种或多种甜味剂(例如蔗糖、糖精或天冬甜素)。

油性混悬剂可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中得到制备。所述油性混悬剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。还可以向其中加入比如如上所述的甜味剂和矫味剂以提供适口的口服制剂。这些组合物可通过加入抗氧化剂(例如丁羟茴醚或α-生育酚)予以保存。

通过向适于制备水性混悬剂的分散粉剂和颗粒剂中加入水，提供活性成分与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂如上述例证说明。其中还可存在另外的赋形剂，例如甜味剂、矫味剂和着色剂。这些组合物可通过加入抗氧化剂(例如抗坏血酸)予以保存。

本发明的药物组合物还可以是水包油乳剂的形式。所述油相可以为植物油(例如橄榄油或花生油)、矿物油(例如液体石蜡)或其混合物。合适的乳化剂可为天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，也可为从脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。所述乳剂还可包含甜味剂、矫味剂、防腐剂和抗氧化剂。

糖浆剂和酏剂可以利用甜味剂进行制备，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。所述制剂还可包含缓和剂、防腐剂、矫味剂和着色剂，以及抗氧化剂。

所述药物组合物可以是无菌注射水溶液剂的形式。可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。

所述无菌注射制剂还可是无菌注射水包油微乳剂，其中活性成分溶解在油相中。例如，可以首先将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后，将油性溶液掺入水和甘油的混合物中，从而制备形成微乳剂。

所述注射液或注射微乳剂可以通过局部快速浓注引入到患者血管中。另外，还可以有利地以保持本发明化合物处于恒定的循环浓度的方式给药所述溶液剂或微乳剂。为了保持这种恒定浓度，可以使用恒定静脉递药装置。所述装置的实例为Deltec CADD-PLUSTM 5400型静脉泵。

所述药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水性混悬剂或油性混悬剂。所述混悬剂可以根据本领域已知技术，使用上述适宜的分散剂或湿润剂及悬浮剂进行配制。所述无菌注射制剂还可以是无菌注射溶液剂或混悬剂，其中含有无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂，例如1，3-丁二醇的溶液剂。另外，通常将无菌固定油用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何品牌的固定油，包括合成甘油单酯或合成甘油二酯。另外，在注射剂制备中还可以使用脂肪酸(比如油酸)。

式A化合物还可以用于直肠内给药的栓剂形式进行给药。这些组合物可以通过将药物与合适的无刺激赋形剂混合得到制备，其中所述赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此可在直肠中熔化释放药物。这类材料包括可可脂、甘油化明胶、氢化植物油、多种分子量的聚乙二醇混合物和聚乙二醇脂肪酸酯。

对于局部使用，可以使用含有式A化合物的乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、溶液剂或混悬剂等(对于本申请，局部使用应当包括漱口水和含漱剂)。

本发明化合物可以通过局部应用合适的鼻内载体和递药装置以鼻内形式给药，或可以通过应用本领域普通技术人员熟知的经皮皮肤贴剂形式经皮途径进行给药。在以经皮递药系统的形式给药时，剂量给药在整个给药方案中当然将是连续的而不是间歇性的。本发明化合物还可以栓剂给药，所述栓剂使用比如脂、甘油化明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇的混合物和聚乙二醇脂肪酸酯的基料。

当将根据本发明的组合物给药至人类对象时，其日剂量通常将由处方医师进行确定，并且所述剂量通常将随着年龄、体重和具个体患者的反应以及患者症状的严重程度而变化。

在一种实施方案中，将适宜量的Akt抑制剂给药至正在接受癌症治疗的哺乳动物。抑制剂给药量的范围每目约0.1mg/kg体重～约60mg/kg体重，或每日约0.5mg/kg体重～约40mg/kg体重。另一个含有本发明组合物的治疗方案含有约0.01mg～约1000mg的Akt抑制剂。在另一实施方案中，所述剂量含有约1mg～约1000mg的Akt抑制剂。

本发明化合物也可以与已知的治疗药物和抗癌药联合使用。例如，本发明化合物可以与已知的抗癌药联合使用。因此本发明公开的化合物与其它抗癌药或化疗药物的联合使用也在本发明的范围内。所述试剂的实例可参见Cancer Principles and Practice of Oncology，V.T.Devita和S.Hellman编著，第6版(2001年2月15日)，Lippincott Williams&WilkinsPublishers。本领域普通技术人员应当能够理解，试剂的联用应当基于药物的特定性质和所涉及癌症的具体性质进行。所述抗癌药包括：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视黄醇受体调节剂、细胞毒剂/细胞抑制剂、抗增殖药、异戊烯基蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂和其它血管生成抑制剂、细胞增殖和存活信号抑制剂以及干扰细胞周期关卡的药剂。当进行放射治疗的同时给药时，本发明化合物尤为有益。

“雌激素受体调节剂”是指干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物，与机制无关。雌激素受体调节剂的实例包括但不限于，他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、2，2-二甲基丙酸4-[7-(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯酯、4，4’-二羟基二苯甲酮-2，4-二硝基苯腙和SH646。

“雄激素受体调节剂”是指干扰或抑制雄激素与受体结合的化合物，与机制无关。雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和醋酸阿比特龙。

“类视黄醇受体调节剂”是指干扰或抑制类视黄醇与受体结合的化合物，与机制无关。这些类视黄醇受体调节剂的实例包括贝沙罗汀、维A酸、13-顺-视黄酸、9-顺-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反-N-(4’-羟基苯基)视黄酰胺和N-4-羧基苯基视黄酰胺。

“细胞毒剂/细胞抑制剂”是指主要通过直接干扰细胞功能引起细胞死亡或抑制细胞增殖、或者抑制或干扰细胞减数分裂的化合物，包括烷基化试剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、低氧可激活化合物、微管抑制剂/微管稳定剂、有丝分裂驱动蛋白抑制剂、参与有丝分裂进程的激酶抑制剂、参与生长因子和细胞因子信号转导途径的激酶抑制剂、抗代谢药、生物反应调节剂、激素/抗激素治疗药物、造血生长因子、单克隆抗体定向治疗药、拓扑异构酶抑制剂、蛋白体抑制剂、泛肽接合酶抑制剂和遍在蛋白连接酶(aurora kinase)抑制剂。

细胞毒剂/细胞抑制剂的实例包括但不限于sertenef、恶液质素(cachectin)、异环磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲蜜胺、泼尼莫司汀、二溴卫矛醇、雷莫司汀、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、庚铂、雌莫司汀、托西酸英丙舒凡、曲磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯铵、嘌嘧替派、洛铂、沙铂、泊非霉素(profiromycin)、顺铂、依罗夫文、右异环磷酰胺、顺-胺二氯(2-甲基-吡啶)合铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、四氯化(反式，反式，反式)-双-μ-(己烷-1，6-二胺)-μ-[二胺-铂(II)]双[二胺(氯)铂(II)]、二吖丙啶基精氨、三氧化二砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基)-3，7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、比生群、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3’-脱氨基-3’-吗啉代-13-脱氧代-10-羟基洋红霉素、脂质体蒽环霉素(annamycin)、加柔比星、依利奈法德、MEN10755、4-脱甲氧基-3-脱氨基-3-吖丙啶基-4-甲基磺酰基-柔红霉素(参见WO00/50032)、Raf激酶抑制剂(例如Bay43-9006)和mTOR抑制剂(例如Wyeth公司的CCI-779)。

可低氧激活化合物的一个实例为替拉扎明。

蛋白体抑制剂的实例包括但不限于乳胞素和MLN-341(Velcade)。

微管抑制剂/微管稳定剂的实例包括紫杉醇、硫酸长春地辛、3’，4’-二脱氢-4’-脱氧-8’-去甲长春碱、多西他赛、根霉素、多拉司他汀、依西酸米伏布林、auristatin、西马多丁、RPR109881、BMS184476、长春氟宁、缩酚酸肽类抗肿瘤药(cryptophycin)、2，3，4，5，6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、脱水长春碱、N，N-二甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酸-叔丁酰胺、TDX258、埃博霉素(参见例如美国专利号6,284,781和6,288,237)和BMS188797。在一个实施方案中，微管抑制剂/微管稳定剂不包括大环内酯类抗肿瘤药。

拓扑异构酶抑制剂的一些实例为托泊替康、hycaptamine、伊立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3’，4’-O-外-亚苄基-教酒菌素、9-甲氧基-N，N-二甲基-5-硝基吡唑并[3，4，5-kl]吖啶-2-(6H)丙酰胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]呋喃并[3’，4’：b，7]-吲嗪并[1，2b]喹啉-10，13(9H，15H)二酮、勒托替康、7-[2-(N-异丙氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2’-二甲氨基-2’-脱氧-依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲氨基)乙基]-9-羟基-5，6-二甲基-6H-吡啶并[4，3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、(5a，5aB，8aa，9b)-9-[2-[N-[2-(二甲氨基)乙基]-N-甲氨基]乙基]-5-[4-羟基-3，5-二甲氧基苯基]-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并(3’，4’：6，7)萘并(2，3-d)-1，3-二氧杂环戊烯-6-酮、2，3-(亚甲二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶、6，9-双[(2-氨乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5，10-二酮、5-(3-氨基丙氨基)-7，10-二羟基-2-(2-羟乙基氨甲基)-6H-吡唑并[4，5，1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2(二乙氨基)乙氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮和地美司钠。

有丝分裂驱动蛋白抑制剂的实例，特别是人类有丝分裂驱动蛋白KSP的实例描述于以下PCT公布文本中：WO 01/30768，WO 01/98278，WO 03/049527，WO 03/049679，WO 03/050064，WO 03/050122，WO 03/049678和WO 03/039460。在一种实施方案中，有丝分裂驱动蛋白的抑制剂包括但不限于KSP抑制剂、MKLP1抑制剂、CENP-E抑制剂、MCAK抑制剂和Rab6-KIFL抑制剂。

“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”的实例包括但不限于SAHA、TSA、oxamflatin、PXDlOl、MG98和scriptaid。进一步涉及的其它组蛋白脱乙酰基酶抑制剂可以发现于以下文献中：Miller，T.A.等人J.Med.Chem.46(24)：5097-5116(2003)。

“参与有丝分裂进程的激酶抑制剂”包括但不限于aurora激酶抑制剂、Polo样激酶抑制剂(PLK；特别是PLK-1抑制剂)、bub-1抑制剂和bub-R1抑制剂。

“抗增殖药”包括反义RNA寡核苷酸和反义DNA寡核苷酸，比如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231和INX3001，还包括抗代谢药，比如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、三甲曲沙、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷ocfosfate、fosteabine钠水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋啉、地西他滨、诺拉曲塞、培美曲塞、nelzarabine、2’-脱氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞苷、N-[5-(2，3-二氢-苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3，4-二氯苯基)脲、N⁶-[4-脱氧-4-[N²-[2(E)，4(E)-十四烷二烯酰]甘氨酰氨基]-L-甘油基-B-L-甘露糖基-吡喃庚糖基]腺嘌呤、aplidine、海鞘素(ecteinascidin)、曲沙他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-b][1，4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2，5-噻吩甲酰基-L-谷氨酸、氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、乙酸11-乙酰基-8-(氨甲酰基氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-1 4-氧杂-1，11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四烷-2，4，6-三烯-9-基酯、八氢吲嗪三醇、洛美曲索、右雷佐生、甲硫氨酸酶(methioninase)、2’-氰基-2’-脱氧-N4-棕榈酰-1-B-D-阿糖呋喃糖基胞嘧啶、3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲和曲妥单抗。

单克隆抗体靶向治疗药物的实例包括那些具有连接癌细胞特异性单克隆抗体或靶细胞特异性单克隆抗体的细胞毒剂或放射性同位素的治疗药物。其实例包括托西莫单抗(Bexxar)。

“HMG-CoA还原酶抑制剂”是指3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂。可以使用的HMG-CoA还原酶抑制剂的实例包括但不限于洛伐他汀(MEVACOR，参见美国专利号4,231,938、4,294,926和4,319,039)、辛伐他汀(ZOCOR，参见美国专利号4,444,784、4,820,850和4,916,239)、普伐他汀(PRAVACHOL，参见美国专利号4,346,227、4,537,859、4,410,629、5,030,447和5,180,589)、氟伐他汀(LESCOL，参见美国专利号5,354,772、4,911,165、4,929,437、5,189,164、5,118,853、5,290,946和5,356,896)、阿托伐他汀(LIPITOR，参见美国专利号5,273,995、4,681,893、5,489,691和5,342,952)以及西立伐他汀(亦称雷伐它汀和BAYCHOL，参见美国专利号5,177,080)。M.Yalpani，”Cholesterol Lowering Drugs”，Chemistry&Industry，第85-89页(1996年2月5日)中的第87页，以及美国专利号4,782,084和4,885,314中描述了这些HMG-CoA还原酶抑制剂和其它可用于本发明使用方法的HMG-CoA还原酶抑制剂的结构式。本文所用的术语HMG-CoA还原酶抑制剂包括所有可药用内酯和开链酸(即其内酯环打开形成游离酸)的形式，还包括具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物的盐和酯的形式，因而此类盐、酯、开链酸和内酯形式的用途都包括在本发明的范围内。

“异戊烯基蛋白转移酶抑制剂”是指抑制异戊烯基蛋白转移酶中任何一种或任何组合的化合物，包括法尼基蛋白转移酶(FPTase)、香叶基香叶基蛋白转移酶I型(GGPTase-I)和香叶基香叶基蛋白转移酶II型(GGPTaseII，亦称Rab GGPTase)。

异戊烯基蛋白转移酶抑制剂的实例可发现于以下公开文本和专利中：WO 96/30343、WO 97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、WO97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美国专利号5,420,245、美国专利号5,523,430、美国专利号5,532,359、美国专利号5,510,510、美国专利号5,589,485、美国专利号5,602,098、欧洲专利公布号0618221、欧洲专利公布号0 675 112、欧洲专利公布号0 604 181、欧洲专利公布号0 696 593、WO 94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美国专利号5,661,152、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、WO 95/34535、WO95/25086、WO 96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、WO 96/24611、WO96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美国专利号5,571,792、WO 96/17861、WO 96/33159、WO 96/34850、WO 96/34851、WO 96/30017、WO 96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO96/31111、WO 96/31477、WO 96/31478、WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、WO 97/30053、WO 97/443 50、WO 98/02436和美国专利号5,532,359。异戊烯基蛋白转移酶抑制剂对血管生成的作用的实例参见European J.of Caner，第35卷，第9期，第1394-1401页(1999年)。

“血管生成抑制剂”是指抑制新血管形成的化合物，与机制无关。血管生成抑制剂的实例包括但不限于：酪氨酸激酶抑制剂(例如酪氨酸激酶受体Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)抑制剂)、表皮衍生生长因子抑制剂、成纤维细胞衍生生长因子抑制剂或血小板衍生生长因子抑制剂、MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、整联蛋白阻滞剂、干扰素-α、白介素-12、聚硫酸戊聚糖、环加氧酶抑制剂(包括非甾族抗炎剂(NSAIDs)，比如阿斯匹林和布洛芬，以及选择性环氧加酶-2抑制剂，比如西利考昔和罗非考昔)(PNAS，第89卷，第7384页(1992年)；JNCI，第69卷，第475页(1982年)；Arch.Opthalmol.，第108卷，第573页(1990年)；Anat.Rec.，第238卷，第68页(1994年)；FEBS Letters，第372卷，第83页(1995年)；Clin，Orthop.第313卷，第76页(1995年)；J.Mol.Endocrinol.，第16卷，第107页(1996年)；Jpn.J.Pharmacol.，第75卷，第105页(1997年)；Cancer Res.，第57卷，第1625页(1997年)；Cell，第93卷，第705页(1998年)；Intl.J.Mol.Med.，第2卷，第715页(1998页)；J.Biol..Chem.，第274，第9116页(1999年))、甾族抗炎药(例如皮质甾类、盐皮质甾类固醇、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、培他米松)、羧基酰胺基三唑、考布他汀A-4、角鲨胺、6-O-氯乙酰-羰基-烟曲霉醇、沙利度胺、血管生长抑素、肌原蛋白-1、血管紧张素II拮抗剂(参见Fernandez等人，J.Lab.Clin.Med.105：141-145(1985))和抗VEGF抗体(参见Nature Biotechnology，第17卷，第963-968页(1999年10月)；Kim等，Nature，362，841-844(1993)；WO 00/44777和WO 00/61186)。

其它调节或抑制血管生成的并且可以与本发明化合物联合使用的治疗剂，包括调节或抑制凝固系统和纤维蛋白溶解系统的试剂(参见Clin.Chem.La.Med.38：679-692(2000)中的综述)。所述调节或抑制凝固途径和纤维蛋白溶解途径的试剂的实例包括但不限于：肝素(参见Thromb.Haemost.80：10-23(1998))、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂(亦称活性凝血酶激活的纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa]抑制剂)(参见Thrombosis Res.101：329-354(2001))。TAFIa抑制剂已经在WO 03/13526中进行了描述。

“干扰细胞周期关卡的药物”是指抑制转导细胞周期关卡信号的蛋白激酶，因而致敏癌细胞成为DNA损伤剂的化合物。所述试剂包括ATR抑制剂、ATM抑制剂、Chk1和Chk2激酶抑制剂、及cdk和cdc激酶抑制剂，其中的具体实例为7-羟基星孢素、黄酮类抗肿瘤药(flavopiridol)、CYC202(Cyclacel)和BMS-387032。

“细胞增殖和生存信号转导途径抑制剂”是指抑制细胞表面受体信号转导级联系统下游的化合物。此类抑制剂包括丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(包括但不限于例如在WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140和WO 02/083138中描述的Akt抑制剂)、Raf激酶抑制剂(例如BAY-43-9006)、MEK抑制剂(例如CI-1040和PD-098059)、mTOR抑制剂(例如Wyeth CCI-779)和PI3K抑制剂(例如LY294002)。

如上所述，与NSAID的组合涉及为有效的COX-2抑制剂的NSAID的应用。对于本说明书，如果通过细胞或微粒体测定，测得NSAID对COX-2抑制的IC₅₀为1μM或更低，则是有效的。

本发明还包括与是选择性COX-2抑制剂的NSAID的组合。对于本说明书，当NSAID具有抑制COX-2比抑制COX-1超过至少100倍的特异性时，该NSAID被定义为选择性COX-2抑制剂，该特异性可通过细胞或微粒体测定，测出COX-2的IC₅₀与COX-1的IC₅₀之比来评价。此类化合物包括但不限于以下文献所公开的化合物：美国专利5,474,995、美国专利5,861,419、美国专利6,001,843、美国专利6,020,343、美国专利5,409,944、美国专利5,436,265、美国专利5,536,752、美国专利5,550,142、美国专利5,604,260、美国专利5,698,584、美国专利5,710,140、WO 94/15932、美国专利5,344,991、美国专利5,134,142、美国专利5,380,738、美国专利5,393,790、美国专利5,466,823、美国专利5,633,272和美国专利5,932,598,它们都在此引入作为参考。

具体可用于本发明治疗方法中的COX-2抑制剂为：3-苯基-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-2-(5H)-呋喃酮；和5-氯-3-(4-甲磺酰)苯基-2-(2-甲基-5-吡啶基)吡啶；或者其药学上可接受的盐。

被描述为COX-2特异性抑制剂并因而用于本发明中的化合物包括但不限于：帕瑞考昔、BEXTRA和CELEBREX或者其药学上可接受的盐。

血管生成抑制剂的其它实例包括但不限于：内皮生长抑素、ukrain、豹蛙酶、IM862、(氯乙酰基)氨基甲酸5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷基]-1-氧杂螺[2，5]辛-6-基酯、acetyldinanaline、5-氨基-1-[[3，5-二氯-4-(4-氯苯甲酰基)苯基]甲基]-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺、CM101、角鲨胺、考布他汀、RPI4610、NX31838、硫酸化磷酸甘露戊糖、7，7-(羰基-二[亚氨基-N-甲基-4，2-吡咯并羰基亚氨基[N-甲基-4，2-吡咯]-羰基亚氨基]-双-(1，3-萘二磺酸酯)和3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮(SU5416)。

以上所应用的“整联蛋白抑制剂”是指选择性拮抗、抑制或对抗生理配体与α_νβ₃整联蛋白结合的化合物；选择性拮抗、抑制或对抗生理配体与α_νβ₅整联蛋白结合的化合物；拮抗、抑制或对抗生理配体与α_νβ₃整联蛋白和α_νβ₅整联蛋白两者结合的化合物；以及拮抗、抑制或对抗毛细血管内皮细胞表达的特殊整联蛋白活性的化合物。该术语还指α_νβ₆、α_νβ₈、α₁β₁、α₂β₁、α₅β₁、α₆β₁和α₆β₄整联蛋白的拮抗剂。该术语还指α_νβ₃、α_νβ₅、α_νβ₆、α_νβ₈、α₁β₁、α₂β₁、α₅β₁、α₆β₁和α₆β₄整联蛋白中任何组合的拮抗剂。

酪氨酸激酶抑制剂的一些具体实例包括：N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异唑-4-甲酰胺、3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)甲基茚基]二氢吲哚-2-酮、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧格尔德霉素、4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2，3，9，10，11，12-六氢-10-(羟甲基)-10-羟基-9-甲基-9，12-环氧-1H-二吲哚并[1，2，3-fg：3’，2’，1’-kl]吡咯并[3，4-i][1，6]苯并二吖辛因-1-酮、SH268、金雀异黄素、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5，6-二甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶基甲磺酸酯、4-(3-溴-4-羟苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉、4-(4’-羟苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-二氮杂萘胺和EMD121974。

与除抗癌化合物外的其它化合物的组合也包括在本发明的方法内。例如，本申请要求保护的化合物与PPAR-γ激动剂和PPAR-δ激动剂的组合可用于治疗某些恶性肿瘤。PPAR-γ和PPAR-δ是核过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核过氧化物酶体增殖物激活受体δ。PPAR-γ在内皮细胞上的表达及其参与血管生成已经在文献中得到了报道(参见J.Cardiovasc.Pharmacol.1998；31：909-913；J.Biol.Chem.1999；274：9116-9121；Invest.Ophthalmol Vis.Sci.2000；41：2309-2317)。最近，有报告说明PPAR-γ激动剂在体外抑制血管生成对VEGF的反应；在小鼠中，马来酸曲格列酮和马来酸罗西格列酮两者都抑制视网膜新血管形成的发育(Arch.Ophthamol.2001；119：709-717)。PPAR-γ激动剂和PPAR-γ/α激动剂的实例包括但不限于噻唑烷二酮(例如DRF2725、CS-011、曲格列酮、罗西格列酮和吡格列酮)、非诺贝特、吉非贝剂、氯贝丁酯、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[(5，7-二丙基-3-三氟甲基-1，2-苯基异唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸(公开于WO 01/60807中)和2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基)苯氧基)丙氧基)-2-乙基苯并二氢吡喃-2-甲酸(公开于WO 02/026729中)。

本发明的另一个实施方案为目前公开的化合物与用于治疗癌症的基因治疗的联合应用。有关治疗癌症的基因策略的概况参见Hall等人(Am.J.Hum.Genet.61：785-789，1997)和Kufe等人(Cancer Medicine，第五版，第876-889页，BC Decker，Hamilton 2000)。基因治疗可用于传递任何肿瘤抑制基因。此类基因的实例包括但不限于p53，p53可通过重组病毒介导的基因转移进行传递(参见，例如美国专利号6,069,134)、uPA/uPAR拮抗剂(“Adenovirus-Mediated Delivery of a uPA/uPARAntagonist Suppresses Angiogenesis-Dependent Tumor Growth andDissemination in Mice”，Gene Therapy，1998年8月5(8)：1105-13)和干扰素γ(J.Immunol.2000；164：217-222)。

本发明化合物还可以与固有多药耐药性(MDR)抑制剂，特别是与转运蛋白高水平表达有关的MDR抑制剂联合用药。此类MDR抑制剂包括p-糖蛋白(P-gp)的抑制剂，例如LY335979、XR9576、OC144-093、R101922、VX853和PSC833(伐司朴达)。

本发明化合物可与止吐药联合使用从而治疗恶心或呕吐，包括急性呕吐、延迟呕吐、晚期呕吐和先期呕吐，所述恶心或者呕吐可能是因单独使用本发明化合物或与放疗一起使用而引起。为了预防或治疗呕吐，本发明化合物可与其它止吐药联合使用，特别是与下述止吐药联合使用：神经激肽-1受体拮抗剂；5HT3受体拮抗剂，例如昂丹司琼、格拉司琼、托烷司琼和zatisetron；GABAB受体激动剂，例如巴氯芬；皮质甾类，例如地塞米松(Decadron)、Kenalog、曲安西龙(Aristocort)、鼻松(Nasalide)、布地奈德(Preferid)、Benecorten或其它公开于美国专利号2,789,118、2,990,401、3,048,581、3,126,375、3,929,768、3,996,359、3,928,326和3,749,712中的皮质甾类，例如吩噻嗪(如丙氯拉嗪、氟奋乃静、硫利达嗪和美索达嗪)、甲氧氯普胺或屈大麻酚等抗多巴胺能药。在另一实施方案中，与选自神经激肽-1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂和皮质甾类等止吐药的联合疗法得到了公开，其用于治疗或预防由于给予本发明化合物而引起的呕吐。

与本发明化合物联用的神经激肽-1受体拮抗剂的用途在以下专利得到了全面描述，例如，美国专利号5,162,339、5,232,929、5,242,930、5,373,003、5,387,595、5,459,270、5,494,926、5,496,833、5,637,699、5,719,147；欧洲专利公布号EP 0 360 390、0 394 989、0 428 434、0 429366、0 430 771、0 436 334、0 443 132、0 482 539、0 498 069、0 499 313、0 512 901、0 512 902、0 514 273、0 514 274、0 514 275、0 514 276、0 515681、0 517 589、0 520 555、0 522 808、0 528 495、0 532 456、0 533 280、0 536 817、0 545 478、0 558 156、0 577 394、0 585 913、0 590 152、0 59953 8、0 610 793、0 634 402、0 686 629、0 693 489、0 694 535、0 699 655、0 699 674、0 707 006、0 708 101、0 709 375、0 709 376、0 714 891、0 723959、0 733 632和0 776 893；PCT国际专利公布号WO 90/05525、90/05729、91/09844、91/18899、92/01688、92/06079、92/12151、92/155 85、92/17449、92/20661、92/20676、92/21677、92/22569、93/00330、93/00331、93/01159、93/01165、93/01169、93/01170、93/06099、93/09116、93/10073、93/14084、93/14113、93/18023、93/19064、93/21155、93/21181、93/23380、93/24465、94/00440、94/01402、94/02461、94/02595、94/03429、94/03445、94/04494、94/04496、94/05625、94/07843、94/08997、94/10165、94/10167、94/10168、94/10170、94/11368、94/13639、94/13663、94/14767、94/15903、94/19320、94/19323、94/20500、94/26735、94/26740、94/29309、95/02595、95/04040、95/04042、95/06645、95/07886、95/07908、95/08549、95/11880、95/14017、95/15311、95/16679、95/17382、95/18124、95/18129、95/19344、95/20575、95/21819、95/22525、95/23798、95/26338、95/28418、95/30674、95/30687、95/33744、96/05181、96/05193、96/05203、96/06094、96/07649、96/10562、96/16939、96/18643、96/20197、96/21661、96/29304、96/29317、96/29326、96/29328、96/31214、96/32385、96/37489、97/01553、97/01554、97/03066、97/08144、97/14671、97/17362、97/18206、97/19084、97/19942和97/21702；以及英国专利公布号2 266 529、2 268 931、2 269 170、2 269590、2 271 774、2 292 144、2 293 168、2 293 169和2 302 689。所述化合物的制备完全描述在上述专利和公布说明书中，它们都在此引入作为参考。

在一种实施方案中，用于与本发明化合物联用的神经激肽-1受体拮抗剂选自：2-(R)-(1-(R)-(3，5-双(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(S)-(4-氟苯基)-4-(3-(5-氧代-1H，4H-1，2，4-三唑并)甲基)吗啉，或者其药学上可接受的盐，有关内容描述于美国专利号5,719,147中。

本发明化合物也可与用于治疗贫血的试剂一起给药。所述贫血治疗剂为，例如，连续红血球生成受体激活剂(例如阿法依泊汀)。

本发明化合物还可与用于治疗中性粒细胞减少症的试剂一起给药。所述中性粒细胞减少症的治疗剂为，例如，调节嗜中性粒细胞的形成和功能的造血生长因子(比如，人类粒细胞集落刺激因子(G-CSF))。G-CSF的实例包括非格司亭。

本发明化合物还可与例如左旋咪唑、异丙肌苷和日达仙(Zadaxin)的免疫增强药一起给药。

本发明的化合物还可以与双膦酸盐(理解为包括双膦酸盐、二膦酸盐、双膦酸和二膦酸)联合用于治疗或预防癌症，包括骨癌。双膦酸盐的实例包括但不限于：依替膦酸钠(Didronel)、氨羟二膦酸二钠(Aredia)、阿伦膦酸钠(Fosamax)、利塞膦酸钠(Actonel)、唑来磷酸(Zometa)、伊本膦酸钠(Boniva)、因卡瞵酸二钠或英卡膦酸钠、氯屈膦酸二钠、EB-1053、米诺膦酸二钠、奈立膦酸钠、piridronate和替鲁膦酸钠，包括其所有药学上可接受的盐、衍生物、水合物及其混合物。

由此，本发明的范围包括本申请要求保护的化合物与选自以下的第二化合物的联合应用：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视黄醇受体调节剂、细胞毒剂/细胞抑制剂、抗增殖药、异戊烯基蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、反转录酶抑制剂、血管生成抑制剂、PPAR-γ激动剂、PPAR-δ激动剂、固有多药耐药性抑制剂、止吐药、用于治疗贫血的药物、用于治疗中性粒细胞减少症的药物、免疫增强药、细胞增殖和存活信号抑制剂、双膦酸盐和干扰细胞周期关卡的试剂

与本发明化合物相关的术语“给药”及其变形(例如，“给药”一种化合物)，意指将化合物或者化合物的前体药物引入到需要治疗的动物系统中。当本发明化合物或者其前药与一种或多种其它活性剂(例如细胞毒素剂等等)组合提供时，应当将“给药”及其变形理解为包含所述化合物或者其前药和其它试剂同时和顺序引入。

在本文中使用的术语“组合物”意图包括含有指定量的指定成分的产品，以及任何由指定量的指定成分的组合物直接或者间接得到的产品。

在此使用的术语“治疗有效量”是指能够在组织、系统、动物或者人类中引起生物反应或者药物反应的活性物质或者药物制剂的量，该量由研究人员、兽医、医疗医生或者其他临床医生进行探索。

术语“治疗癌症”或者“癌症的治疗”是指给药遭受癌症症状折磨的哺乳动物和指通过杀死癌细胞从而减轻癌症症状的效果，并且指导致癌症生长和/或转移受到抑制的效果。

在一种实施方案中，意欲用作第二化合物的血管形成抑制剂选自酪氨酸激酶抑制剂、表皮源生长因子抑制剂、成纤维细胞源生长因子抑制剂、血小板源生长因子抑制剂、MMP(基体金属蛋白酶)抑制剂、整联蛋白阻断剂、干扰素-α、白细胞间介素-12、戊聚糖多硫酸盐、环加氧酶抑制剂、羧酰胺基三唑、考布他汀A-4、角鲨胺、6-O-氯乙酰基-羰基-烟曲霉醇、沙立度胺、血管生长抑素、肌钙蛋白-1或者VEGF抗体。在一种实施方案中，雌激素受体调节剂为他莫昔芬或者雷洛昔芬。

权利要求的范围还包括治疗癌症的方法，该方法包括联合放射治疗和/或第二化合物给药治疗有效量的式A化合物，所述第二化合物选自：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视黄醇受体调节剂、细胞毒剂/细胞抑制剂、抗增殖药、异戊烯基蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、血管生成抑制剂、PPAR-γ激动剂、PPAR-δ激动剂、固有多药耐药性抑制剂、止吐药、用于治疗贫血的药物、用于治疗中性粒细胞减少症的药物、免疫增强药、细胞增殖和存活信号抑制剂、双膦酸酯和干扰细胞周期关卡的药物。

本发明的另一实施方案是治疗癌症的方法，包括给药与紫杉醇或曲妥珠单抗联用的治疗有效量的式A化合物。

本发明还包括治疗或者预防癌症的方法，包括协同COX-2抑制剂给药治疗有效量的式A化合物。

本发明还包括用于治疗或者预防癌症的药物组合物，其中包含治疗有效量的式A化合物和选自以下的第二化合物：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视黄醇受体调节剂、细胞毒素/细胞生长抑制剂、抗增殖剂、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、血管形成抑制剂、PPAR-γ激动剂、PPAR-δ激动剂、细胞增殖和存活信号抑制剂、双膦酸酯和干扰细胞检验点的试剂。

所有标出的专利、出版物和未决专利申请都在此引入作为参考。

在以下化学过程说明和实施例中使用的缩略语如下：AEBSF(对氨基乙基苯磺酰氟)；Atm(大气压)；BSA(牛血清蛋白)；Boc(叔丁氧羰基)；BuLi(正丁基锂)；CDCl₃(氯仿-d)；CuI(碘化亚铜)；CuSO₄(硫酸铜)；DCE(二氯乙烷)；DCM(二氯甲烷)；DEAD(偶氮二羧酸二乙酯)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺)；DMSO(二甲亚砜)；DTT(二硫苏糖醇)；EDTA(乙二胺四乙酸)；EGTA(乙二醇-四乙酸)；EtOAc(乙酸乙酯)；EtOH(乙醇)；HOAc(乙酸)；HPLC(高效液相色谱)；HRMS(高分辨率质谱)；LCMS(液相色谱仪-质谱仪)；LHMDS(双(三甲基甲硅烷)氨基锂)；LRMS(低分辨率质谱)；Me(甲基)；MeOH(甲醇)；MP-B(CN)H₃(大孔氰基硼氢化物)；NaHCO₃(碳酸氢钠)；Na₂SO₄(硫酸钠)；Na(OAc)₃BH(三乙酰氧基硼氢化钠)；NH₄OAc(乙酸铵)；NBS(N-溴丁二酰胺)；NMR(核磁共振)；PBS(磷酸盐缓冲盐水)；PCR(聚合酶链反应)；Pd(dppf)([1，1′-二(二苯膦基)二茂铁]钯)；Pd(Ph₃)₄(钯(0)四-三苯基膦)；POCl₃(三氯氧磷)；PS-DIEA(聚苯乙烯二异丙基乙胺)；PS-PPh₃(聚苯乙烯-三苯膦)；TBAF(四丁基氟化铵)；THF(四氢呋喃)；TFA(三氟乙酸)；和TMSCH₂N₂(三甲基甲硅烷基重氮甲烷)。

除了其它文献中已知或者在试验方法中例证说明的标准操作之外，本发明化合物还可以通过利用以下方案中所示反应进行制备。由此，以下例证性反应方案并不受所列举化合物或者任何基于例证说明目的而使用的具体取代基的限制。如反应方案所示的取代基编号并不必然与权利要求中所用编号相关，通常为了清楚起见，在上文式A定义中允许有多个取代基的化合物上显示连接一个取代基。

除了其它可以在文献中已知或者例证说明于试验方法中的标准操作，比如酯水解、保护基裂解等等之外，可以用于形成本发明化合物的反应通过应用如反应方案I-X所示的反应进行制备。

这些反应可以以线性顺序使用，从而提供本发明化合物，或者它们可以用于合成片断，随后通过反应方案中所述的烷基化反应进行连接。

反应方案概要

以下反应方案，反应方案I-VII提供了制备本发明化合物二环部分的有用细节。按照反应方案VIII-IX，芳基可以被杂环基部分取代。

反应必需的中间体在一些情形中可以市场购买到或者可以根据文献方法进行制备。如反应方案1中所示，适当取代的苯基乙炔化合物可以与碘化亚铜反应，从而形成相应的乙炔铜I-1(参见，例如，Sonogashira，K.；Toda，Y.；Hagihara，N.Tetrahedron Lett.1975，4467)。然后，中间体I可以与适当取代的亲电部分反应，从而提供不对称取代的I-2。与NBS反应之后进行水解，得到I-3(参见，例如，Yusybov，M.S.；Filimonov，VD.；Synthesis 1991，2，131)。多种取代或者未取代的芳基和杂环基同样可以市场购买到。

反应方案II图解说明了由适当取代的II-1开始进行的化合物的制备。该中间体可以与适当取代的胺反应，从而提供中间体II-2，该化合物可以与适宜的芳基或者杂芳基二胺反应，从而提供本发明化合物的区域异构体混合物，通常可以对该混合物进行色谱分离。

反应方案III图解说明了其中“y”为CH和“z”为N的化合物的合成。

反应方案IV图解说明了由适当取代的4-氨基-3-硝基苯甲腈IV-I开始进行的化合物的制备。然后，使该中间体进行微波促进的[3+2]环化加成反应，从而得到四唑IV-II。用亲电试剂(比如碘代甲烷)对该酸性四唑进行烷基化，得到烷基化四唑的2-甲基(IV-III)/1-甲基(IV-IV)混合物，该混合物可以通过柱色谱进行分离。对IV-III进行Ra-Ni氢化，得到二胺IV-V。进一步的合成如以上反应方案所述。

反应方案V是本发明化合物的合成的例证说明。用适当取代的酮与适当取代的芳基或者杂芳基氨基醛进行Friedlander环化缩合，从而得到式V-1中间体。将羧酸官能团转化为醛官能团，得到中间体V-2，该过程可以通过本领域熟练技术人员熟知的方法进行。用适当取代的胺进行还原性烷基化作用，从而得到式V-3化合物。

反应方案VI图解说明了中间体V-2的另一种合成方法。

反应方案VII图解说明了由酮VII-1开始的化合物的合成，其中酮VII-1根据文献方法进行制备(Renault，O.；Dallemagne，P；和Rault，S.，Org.Prep.Proced.Int.，1999，31，324)。使VII-1与N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛缩合，得到酮基-烯胺VII-2，其与2-氰基乙酰胺发生环化反应，从而得到吡啶酮VII-3。用三氯氧磷处理VII-3，得到氯代吡啶VII-4。进行自由基溴化之后，用适当取代的胺进行取代，从而得到胺VII-5。随后使氯代烟酰腈VII-5与多种双亲核化合物反应，得到环化结构VII-6。

反应方案I

反应方案II

反应方案III

反应方案IV

反应方案V

反应方案VI

反应方案VII

除了其它可以在文献中已知或者例证说明于试验方法中的标准操作，比如酯水解、保护基裂解等等之外，用于形成本发明化合物的反应通过应用如反应方案VIII和IX所示的反应进行制备。

进一步的反应方案概要

反应方案VIII图解说明了1，6-二氮杂萘-6(5H)-酮化合物的制备。所述合成从市售羧酸(VIII-1)开始，将其转化为Weinreb酰胺(VIII-2)。使该酰胺与芳基锂试剂(通过芳基溴与正丁基锂进行锂-卤素交换反应得到)反应，得到酮(VIII-3)。在碱(例如氢氧化钠或者甲醇钠)存在下，使上述取代酮与4-氨基烟碱醛进行缩合，得到1，6-二氮杂萘(VIII-4)。苯基上的R取代基可以是比如(甲硅烷基)保护的羟甲基、掩蔽的醛(即缩醛)或者羧酸的官能团。该物质可以转化成必需的醛VIII-4。当R基团为羟甲基时，用比如活化二氧化锰的试剂对其进行氧化，得到醛VIII-4。当R为缩醛时，进行弱酸水解即可得到醛。通过用硼氢化物还原混合酸酐对羧基进行还原，同样得到醛VIII-4。然后，用不同系列的胺(例如，4-取代哌啶)和硼氢化物对该醛进行还原氨基化，得到1，6-二氮杂萘-5(H)-酮(VIII-5)。在150℃时用吡啶盐酸盐处理(VIII-5)，得到最终产品(VIII-6)。

反应方案IX图解说明了在C3-位置上引入杂环的另一策略。从市售二氯苯并吡嗪开始，在钯催化剂存在下使其与芳基硼酸偶联(Suzuki反应)。然后，在相同的反应条件下，与另一杂环硼酸重复上述反应，从而得到最终产品。

反应方案X图解说明了1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮化合物的另一种制备方法。在该方案中，使Weinreb酰胺VIII-2与由芳基溴X-1得到的芳基锂试剂反应，其中R为保护或者掩蔽的氨基甲基衍生物(比如1-(1-叠氮基-1-甲基乙基))，从而得到酮X-2。在甲醇钠存在下，使该酮与(2-氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯进行缩合，从而得到1，6-二氮杂萘X-3。在这种情形中，通过用氢气进行钯催化还原对胺进行去保护或者去屏蔽，得到胺X-4。用盐酸处理X-4，得到1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮X-5。

反应方案VIII

反应方案IX

反应方案X

实施例

以下提供的实施例和方案用于辅助对本发明的进一步了解。使用的具体物质、种类和条件确定为是对本发明的进一步说明，并不是对其合理范围的限制。

方案1

5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)- 3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘(1-7)和2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮 (1-8)

N-甲氧基-N-甲基-2-(2-噻吩基)乙酰胺(1-1)

向具有搅拌棒的25mL RB(圆底)烧瓶中加入2-噻吩乙酸(2.84g，2mmol)，随后向其中加入无水DMF(10mL)。将1，1’-羰基二咪唑(3.24g，2mmol)一次加入其中，产生显著的气体逸出。将上述混合物的温度升高至40℃。30分钟之后，将N，O-二甲基羟胺盐酸盐(2.14g，2.2mmol)一次加入其中。在23℃下将上述混合物搅拌30分钟，之后用饱和氯化铵溶液(100mL)进行稀释并且用1∶1乙酸乙酯/己烷(100mL)进行提取两次。在硅胶上(0-25％乙酸乙酯/己烷)通过柱色谱法对所得粗混合物进行纯化，从而得到N-甲氧基-N-甲基-2-(2-噻吩基)乙酰胺(1-1)。¹H NMR(CDCl₃，ppm)δ7.20(m，1H)，6.96(m，2H)，3.91(s，2H)，3.70(s，3H)，3.25(s，3H).

1-[4-(1，3-二氧戊环-2-基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(1-2)

向具有搅拌棒的25ml RB烧瓶中加入1-溴-4-1，3-二氧戊环-2-基)苯(243mg，1.0mmol)，随后向其中加入无水THF(5mL)。将上述混合物冷却至-78℃，并且在2分钟时间内将正丁基锂(687μ L1.6M己烷溶液)滴加加入其中。在-78℃下搅拌15分钟之后，将N-甲氧基-N-甲基-2-(2-噻吩基)乙酰胺(1-1)(185mg，1mmol)一次加入其中。在-78℃下再搅拌30分钟之后，用饱和氯化铵(20mL)将上述混合物猝灭，并且用乙酸乙酯(10mL)提取两次。合并的有机提取物用硫酸钠干燥、进行浓缩并且经柱色谱在硅胶上(0-50％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，从而得到1-[4-(1，3-二氧戊环-2-基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(1-2)。¹HNMR(CDCl₃，ppm)δ：7.98(d，J＝8.25Hz，2H)，7.45(d，J＝8.25Hz，2H)，7.15(d，J＝5.15Hz，1H)，6.86(m，1H)，6.83(m，1H)，5.77(s，1H)，4.38(s，2H)，4.01(m，4H).

(2-氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3)

向4-氨基-2-氯吡啶(30.0g，243mmol)的CH₂Cl₂(500mL)溶液中加入三乙胺(38mL)、二碳酸二叔丁酯(58.0g)和DMAP(10.0g)。将上述反应混合物搅拌过夜，在真空中对其进行浓缩，并且在硅胶上对其进行色谱分离，用1∶1己烷/EtOAc洗脱。将所得固体与CH₂Cl₂/EtOAc(1∶1)一起进行研磨，从而得到N-BOC-4-氨基-2-氯吡啶。¹HNMR：(500MHz，CDCl₃)δ8.19(d，1H)，7.53(d，1H)，7.25(br s，1H)，7.20(dd，1H)，5.80(s，1H)，1.52(s，9H).

在10分钟时间内，向-78℃的N-Boc-4-氨基-2-氯吡啶(14.4g，63mmol)的THF(200mL)中滴加加入1.7M叔丁基锂溶液(100mL)，并且将所得溶液搅拌2小时。然后将DMF(15mL)加入其中，并且使该反应升温至环境温度3小时。用饱和NH₄Cl小心地将该反应猝灭，用EtOAc进行提取，所得有机层用H₂O和盐水洗涤、用MgSO₄干燥、过滤、在真空中进行浓缩和通过硅胶色谱法(10-25％EtOAc/己烷)进行纯化，从而得到为白色固体的(2-氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3)。¹H NMR：(500MHz，CDCl₃)δ10.98(br s，1H)，10.49(s，1H)，8.35(d，1H)，8.28(d，1H)，1.52(s，9H).

4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-2-基]苯甲醛(1-5)

向具有搅拌棒的25ml RB烧瓶中加入1-[4-(1，3-二氧戊环-2-基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(1-2)(80mg，0.29mmol)、(2-氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3)(90mg，0.35mmol)和无水甲醇(2mL)。然后将甲醇钠(25％w/w甲醇溶液)一次加入其中，并且在65℃下将上述混合物加热4小时，从而产生暗橙色悬浮液。经旋转蒸发将溶剂除去，所得混合物用1M盐酸(10mL)进行酸化并且用乙酸乙酯(10mL)提取两次。在硅胶上(0-50％乙酸乙酯/己烷)通过柱色谱对所得粗混合物进行纯化，从而得到2-[4-(1，3-二氧戊环-2-基)苯基]-5-甲氧基-3-苯基-1，6-二氮杂萘(1-4)。

将2-[4-(1，3-二氧戊环-2-基)苯基]-5-甲氧基-3-苯基-1，6-二氮杂萘(1-4)溶于THF(4mL)和1M HCl(4mL)溶液的混合物中，并且在23℃下将其搅拌2小时，直至通过TLC确定没有原料存在为止。上述反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)进行稀释并且用乙酸乙酯(10mL)提取两次。对合并的有机提取物进行浓缩，从而得到4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-2-基]苯甲醛(1-5)。¹H NMR(CDCl₃，ppm)δ：9.93(s，1H)，8.54(s，1H)，8.12(d，J＝6.0Hz，1H)，7.75(d，J＝8.2Hz，2H)，7.40(d，J＝8.2Hz，2H)，7.19(d，J＝5.0Hz，1H)，7.03(d，J＝3.5Hz，1H)，6.82(d，J＝3.6Hz，1H)，6.69(s，1H)，4.13(s，3H).

5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-

3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘(1-7)

向具有搅拌棒的25ml RB烧瓶中加入4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-2-基]苯甲醛(1-5)(62mg，0.18mmol)，随后向其中加入2-(3-哌啶-4-基-1H-1，2，4-三唑-5-基)吡啶二盐酸盐(1-6)(82mg，0.36mmol)、无水DMF(1.0mL)、三乙胺(72mg，0.716mmol)和乙酸(107mg，1.79mmol)。然后将三乙酰氧基硼氢化钠(76g，0.36mmol)一次加入其中，并且在23℃下将所得浅黄色溶液搅拌过夜。上述反应混合物用饱和氯化铵溶液(10mL)进行稀释并且用乙酸乙酯(10mL)提取两次。在硅胶上(0-30％甲醇/二氯甲烷)通过柱色谱对所得粗混合物进行纯化，从而得到5-甲氧基-2-(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘(1-7)。¹H NMR(CDCl₃，ppm)δ：8.54(bs，1H)，8.51(s，1H)，8.10(d，J＝6.0Hz，1H)，8.01(d，J＝7.8Hz，1H)，7.68(t，J＝7.7Hz，1H)，7.42(d，J＝8.0Hz，2H)，7.37(d，J＝6.9Hz，1H)，7.29(d，J＝8.0Hz，2H)，7.25(t，J＝3.4Hz，1H)，7.19(d，J＝5.1Hz，1H)，7.15(s，1H)，6.81(t，J＝3.6Hz，1H)，6.68(d，J＝3.1Hz，1H)，4.05(s，3H)，3.98(s，2H)，3.35(s，1H)，3.25(bs，2H)，3.02(bs，2H)，2.75(bs，2H)，2.19(bs，2H).

2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1 2 4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-

(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮(1-8)

向具有搅拌棒的10ml RB烧瓶中加入5-甲氧基-2-(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘(1-7)(40mg，0.7mmol)和吡啶盐酸盐(738mg，6.4mmol)。在150℃下将上述混合物加热10分钟，直至混合物熔化为黄色溶液为止。通过冷却上述混合物再次固化，用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)进行中和并且用乙酸乙酯(10mL)提取两次。对合并的有机提取物进行浓缩并且在硅胶上(0-30％甲醇/二氯甲烷)通过柱色谱对其进行纯化，从而得到2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮(1-8)。¹H NMR(CDCl₃，ppm)δ：8.69(s，1H)，8.51(s，1H)，8.40(d，J＝6.0Hz，1H)，8.03(d，J＝7.8Hz，1H)，7.76(t，J＝7.7Hz，1H)，7.39(d，J＝8.0Hz，2H)，7.27(m，4H)，7.22(d，J＝4.4Hz，1H)，6.78(d，J＝5.1Hz，2H)，3.55(s，2H)，2.95(d，J＝11.6Hz，2H)，2.83(bs，1H)，2.14(m，2H)，1.97(m，2H)，1.87(m，2H).

以下表1中的化合物按照类似于方案1所示和反应方案中所示的方式进行制备：

表1

方案2

2-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮 (2-7)

2-(4-溴苯基)丙-2-醇(2-2)

在-30℃下，将甲基溴化镁溶液(1.4M 75：25甲苯：THF溶液，20mL，28mmol)缓缓加入到4-溴苯甲酸乙酯(2-1，2.52g，11.0mmol)的THF(10mL)溶液中。2小时之后，用氯化铵将上述混合物猝灭并且用醚进行提取。所得有机层用1∶1盐水∶水洗涤、用硫酸镁干燥、进行过滤并且对其进行浓缩，从而得到为浅黄色油的标题化合物(J.Am.Chem.Soc.1971，93，6877)。

1-(1-叠氮基-1-甲基乙基)-4-溴苯(2-3)

将TFA(4.4mL，45.0mmol)的氯仿(10mL)溶液缓缓加入到冷却至-5℃的2-(4-溴苯基)丙-2-醇(2-2，2.33g，10.8mmol)和叠氮化钠(1.42g，21.8mmol)的氯仿(10mL)混合物中，保持温度低于0℃。将冷却浴除去并且在室温下将上述混合物搅拌过夜。将浓氨水加入其中，直至溶液成为碱性(湿润的pH试纸)。所得有机层用1∶1盐水∶水洗涤、用硫酸镁干燥、进行过滤并且对其进行浓缩，从而得到为浅黄色油的标题化合物(2.51g)。

LRMS m/z(M-N₂)计算值：197.0，发现值197.1

1-[4-(1-叠氮基-1-甲基乙基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(2-4)

在-78℃下，将nBuLi(1.6M己烷溶液，2.88mL，4.60mmol)滴加加入至1-(1-叠氮基-1-甲基乙基)-4-溴苯(2-3，1.03g，4.28mmol)的THF(20mL)溶液中。15分钟之后，将N-甲氧基-N-甲基-2-噻吩-2-基乙酰胺(1-1，0.78g，4.18mmol)的THF(1mL)溶液加入其中。在-78℃下再保持30分钟之后，用饱和氯化铵溶液将反应猝灭，用乙酸乙酯提取、用硫酸镁干燥、进行过滤并且对其进行浓缩，从而得到油。在硅胶上(在30分钟时间内，5％CH₂Cl₂，0-10％EtOAc/己烷)经自动快速柱色谱法对所得粗产品进行纯化，从而得到为黄色油的标题化合物。

LRMS m/z(M+1)计算值：286.1，发现值286.2

2-[4-(1-叠氮基-1-甲基乙基)苯基]-5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮

杂萘(2-5)

将甲醇钠(在甲醇中为25重量％，0.23mL)加入到搅拌的1-[4-(1-叠氮基-1-甲基乙基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(2-4，95mg，0.33mmol)和(2-氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3，100mg，0.39mmol)的甲醇(2mL)混合物中，然后在65℃下将其加热2小时。将上述混合物冷却至室温、用EtOAc稀释并且用1N HCl进行酸化。用乙酸乙酯对所得水相进行提取，合并的有机物用1∶1盐水∶水洗涤、用硫酸镁干燥、进行过滤和浓缩，从而得到黑色半固体。在硅胶上(在30分钟时间内，0-45％EtOAc的己烷溶液，含有5％CH₂Cl₂)经自动快速柱色谱法对所得粗产品进行纯化，从而得到为琥珀油的标题化合物。LRMS m/z(M+1)计算值：402.2，发现值402.2

2-{4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-2-基]苯基}丙-2-胺(2-6)

在1atm氢气下，在EtOH(5mL)中，将2-[4-(1-叠氮基-1-甲基乙基)苯基]-5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘(2-5，78mg，0.194mmol)和10％Pd/C(9mg)搅拌2小时。将反应混合物滤过硅藻土并且对其进行浓缩，从而得到为透明油的标题化合物。LRMS m/z(M+1)计算值：376.1，发现值376.2

向2-{4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-2-基]苯基}丙-2-胺(2-6，66mg，0.176mmol)的THF(10mL)溶液中加入浓HCl(1mL)，并且在室温下将其搅拌5小时。在真空中将挥发物蒸发，并且将所得残余物分配在饱和碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯之间。所得有机层用硫酸镁干燥、进行过滤并且对其进行浓缩，从而得到为灰白色固体的标题化合物。LRMS m/z(M+1)计算值：362.1，发现值362.2

实施例1

人Akt同工酶和ΔPH-Akt1的克隆

pS2neo载体(于2001年4月3日保藏于ATCC，保藏号为ATCCPTA-3253)按下述方法制备：用BglII切割pRmHA3载体(按照Nucl.Acid Res.16：1043-1061(1988)中所述的方法制备)，分离出2734bp片段。还用BglII切割pUChsneo载体(按照EMBO J.4：167-171(1985)中所述的方法制备)，分离出4029bp片段。将这两个分离出的片段连接在一起从而形成载体，被称为pS2neo-1。该质粒在金属硫蛋白启动子和醇脱氢酶聚腺苷酸(poly A)添加位点间含有多接头。它还有一个受热激启动子驱动的neo抗性基因。用Psp5II和BsiWI切割pS2neo-1载体。合成两个互补寡核苷酸，然后退火(CTGCGGCCGC(SEQ.ID.NO.：1)和GTACGCGGCCGCAG(SEQ.ID.NO.：2))。将经切割的pS2neo-1与经退火的寡核苷酸连接起来从而形成第二载体，即pS2neo。这一基因转变加入了NotI位点，有助于在转染到S2细胞前线性化。

用以下引物将人脾cDNA(Clontech)通过PCR(Clontech)扩增人Akt1基因：5’引物：5’CGCGAATTCAGATCTACCATGAGCGACGTGGCTATTGTG3’(SEQ.ID.NO.：3)和3’引物：5’CGCTCTAGAGGATCCTCAGGCCGTGCTGCTGGC3’(SEQ.ID.NO.：4)。5’引物包括EcoRI和BglII位点。3’引物包括用于克隆目的的XbaI和BamHI位点。所得的PCR产物作为EcoRI/XbaI片段亚克隆到pGEM3Z(Promega)中。为了表达/纯化目的，用PCR引物：5’GTACGATGCTGAACGATATCTTCG 3’(SEQ.ID.NO.：5)，在全长Akt1基因的5’末端加上中间T标记。所得的PCR产物包含5’KpnI位点和3’BamHI位点，用于与含有昆虫细胞表达载体pS2neo的生物素标记一起符合读框地亚克隆所述片段。

为了表达Akt1的血小板白细胞C激酶底物同源结构域(PH)缺失模型(Δaa 4-129，其中包括Akt1铰链区部分的缺失)，用pS2neo载体中的全长Akt1基因作为模板，进行PCR缺失诱变。用重叠内部引物(5’GAATACATGCCGATGGAAAGCGACGGGGCTGAAGAGATGGAGGTG3’(SEQ.ID.NO.：6)，和5’CCCCTCCATCTCTTCAGCCCCGTCGCTTTCCATCGGCATGTATTC 3’(SEQ.ID.NO.：7))分两步进行PCR，该重叠内部引物包含缺失和5’侧翼引物和3’侧翼引物，该5’侧翼引物和3’侧翼引物在5’端具有KpnI位点和中间T标记。最终的PCR产物用KpnI和SmaI消化，并连接成为pS2neo全长Akt1 KpnI/SmaI切割载体，用缺失形式有效地替换克隆的5’端。

用氨基端寡聚引物：5’GAATTCAGATCTACCATGAGCGATGTTACCATTGTG 3’(SEQ.ID.NO.：8)和羧基端寡聚引物：5’TCTAGATCTTATTCTCGTCCACTTGCAGAG3’(SEQ.ID.NO.：9)，通过成体脑cDNA(Clontech)的PCR，扩增人Akt3基因。这些引物包括用于克隆目的的5’EcoRI/BglII位点和3’XbaI/BglII位点。将所得的PCR产物克隆到pGEM4Z(Promega)的EcoRI和XbaI位点。为了表达/纯化目的，用PCR引物将中间T标记加到全长Akt3克隆的5’端，该PCR引物为：5’GGTACCATGGAATACATGCCGATGGAAAGCGATGTTACCATTGTGAAG 3’(SEQ.ID.NO.：10)。所得的PCR产物包含5’KpnI位点，允许用含有昆虫细胞表达载体pS2neo的生物素标记进行符合读框地克隆。

用以下引物，通过从人胸腺cDNA(Clontech)的PCR扩增人Akt2基因：氨基端寡聚引物 5’AAGCTTAGATCTACCATGAATGAGGTGTCTGTC 3’(SE Q.ID.NO.：11)和羧基端寡聚引物：5’GAATTCGGATCCTCACTCGCGGATGCTGGC 3’(SEQ.ID.NO.：12)。这些引物包括用于克隆目的的5’HindIII/BglII位点和3’EcoRI/BamHI位点。所得的PCR产物可亚克隆到pGem3Z(Promega)的HindIII/EcoRI位点。为了表达/纯化目的，用PCR引物5’GGTACCATGGAATACATGCCGATGGAAAATGAGGTGTCTGTCATCAAAG 3’(SEQ.ID.NO.：13)将中间T标记加到全长Akt2的5’端。所得的PCR产物亚克隆到上述的pS2neo载体内。

实施例2

人Akt同工酶和ΔPH-Akt1的表达

用磷酸钙方法，将pS2neo表达载体中含有经克隆的Akt1、Akt2、Akt3和ΔPH-Akt1基因的DNA纯化，并用于转染果蝇(Drosophila)S2细胞(ATCC)。选出抗生素(G418，500μg/ml)抗性细胞集合体。将细胞稀释至1.0L体积(～7.0×10⁶/ml)，加入生物素和CuSO₄，使之终浓度分别为50μM和50mM。细胞在27℃下生长72小时，通过离心收获。细胞沉淀物置于-70℃冷藏待用。

实施例3

人Akt同工酶和ΔPH-Akt1的纯化

将实施例2中描述的由1L S2细胞中得到的细胞沉淀物，在50ml 1％CHAPS的缓冲液A(50mM Tris pH7.4、1mM EDTA、1mM EGTA、0.2mMAEBSF、10μg/ml苯甲脒、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽和抑胃酶肽各5μg/ml、10％甘油和1mM DTT)中，用超声处理进行裂解。可溶性部分用装有9mg/ml抗中间T单克隆抗体的G蛋白琼脂糖凝胶(Sepharose)快流(Pharmacia)柱纯化，用75μM EYMPME(SEQ.ID.NO.：14)肽的含25％甘油的缓冲液A洗脱。合并含有Akt/PKB的流分，通过SDS-PAGE对蛋白质纯度进行评价。使用标准Bradford方案定量测定纯化蛋白质。用液氮快速冷冻纯化蛋白质，并贮藏于-70℃。

从S2细胞中纯化的Akt和Akt血小板白细胞C激酶底物同源结构域缺失需要进行活化。在含有下述成分的反应物中对Akt和Akt血小板白细胞C激酶底物同源结构域缺失进行激活(Alessi等，Current Biology7：261-269)：10nM PDK1(Upstate Biotechnology，Inc.)、脂囊泡(10μM磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(Metreya，Inc.)、100μM磷脂酰胆碱和100μM磷脂酰丝氨酸(Avanti Polar lipids，Inc.))以及激活缓冲液(50mM Tris pH7.4、1.0mM DTT、0.1mM EGTA、1.0μM微囊藻素-LR、0.1mM ATP、10mMMgCl₂、333μg/ml BSA和0.1mM EDTA)。反应物在22℃下孵育4小时。在液氮中对等分试样进行快速冷冻。

实旋例4

Akt激酶测定

利用GSK衍生生物素化肽底物，对活化Akt同工酶和血小板白细胞C激酶底物同源结构域缺失构建体进行测定。使用对磷酸肽特异性的镧螯合物(Lance)偶联的单克隆抗体，以及可在肽上与生物素部分结合的链霉抗生物素蛋白连接的别藻蓝蛋白(SA-APC)荧光团，通过均相时间分辨荧光(HTRF)测定肽磷酸化的程度。当镧螯合物和APC接近时(即与同一磷酸肽分子结合)，从镧螯合物到APC产生无辐射能量转移，随后在665nm从APC发出发射光。

测定所需的材料：

A.活化Akt同工酶或血小板白细胞C激酶底物同源结构域缺失构建体；

B.Akt肽底物：GSK3α(S21)肽No.3928生物素-

GGRARTSSFAEPG(SEQ.ID.NO.：15)，MacromolecularResources；

C.镧螯合物标记的抗磷酸GSK3α单克隆抗体(Cell SignalingTechnology，克隆#27)；

D.SA-APC(Prozyme目录号PJ25S批号896067)；

E.MicrofluorB U形底微量滴定板(Dynex Technologies，目录号7205)；

F.DiscoveryHTRF微型板分析仪，Packard InstrumentCompany；

G.100X蛋白酶抑制剂混合物(PIC)：1mg/ml苯甲脒，0.5mg/ml抑胃酶肽，0.5mg/ml亮抑酶肽，0.5mg/ml抑蛋白酶肽；

H.10X测定缓冲液：500mM HEPES，pH7.5，1％PEG，mM EDTA，1mM EGTA，1％BSA，20mMθ-磷酸甘油；

I.猝灭缓冲液：50mM HEPES pH7.3，16.6mM EDTA，0.1％BSA，0.1％Triton X-100，0.17nM镧螯合物标记的单克隆抗体克隆#27，0.006mg/ml SA-APC；

J.ATP/MgCl₂工作液：1X测定缓冲液，1mM DTT，1X PIC，125mMKCl，5％甘油，25mM MgCl₂，375 TM ATP；

K.酶工作液：1X测定缓冲液，1mM DTT，1X PIC，5％甘油，活性Akt。选择最终的酶浓度，使得测定在线性反应范围内；

L.肽工作液：1X测定缓冲液，1mM DTT，1X PIC，5％甘油，2TMGSK3生物素化肽#3928。

通过在96孔微量滴定板适当的孔中加入16TL ATP/MgCl₂使用液，反应开始。将抑制剂或载体(1.0Tl)加入其中，随后将10Tl肽使用液加入其中。通过加入13Tl酶使用液并混合，反应开始。使反应进行50分钟，然后加入60Tl HTRF猝灭缓冲液终止反应。在室温下，将终止的反应至少孵育30分钟，然后在Discovery仪器上读数。

抗生物素蛋白链菌素闪现板测定的方法：

步骤1：

将1μl测试化合物的100％DMSO溶液加入到20μ1 2X基质溶液(20uM GSK3肽，300μ MATP，20mM MgCl₂，20μ Ci/ml[γ³³P]ATP，IX测定缓冲液，5％甘油，1mMDTT，IX PIC，0.1％BSA和100mMKCl)中。通过加入19μl 2X酶溶液(6.4nM活性Akt/PKB，IX测定缓冲液，5％甘油，1mM DTT，IX PIC和0.1％BSA)，磷酸化反应得到引发。然后，在室温下将上述反应孵化45分钟。

步骤2：

通过加入170μl125mM EDTA，反应得到终止。将200μl终止的反应转移入抗生物素蛋白链菌素FlashplatePLUS(NEN LifeSciences，目录号SMP103)中。在平板振荡器上，在室温下将上述反应孵化≥10分钟。将孔中物质从各孔中吸出，并且用200μl TBS/孔清洗各孔两次。然后，用200μl TBS/孔将各孔洗涤5分钟，洗涤三次，在洗涤步骤的同时，在平台振荡器上在室温下对板进行孵化。

用密封带盖上板并且利用适当设定的Packard TopCount对Flashplates中的[³³P]进行计数。

抗生物素蛋白链菌素滤板测定的方法：

步骤1：

如以上步骤1中所述的抗生物素蛋白链菌素闪现板测定进行酶促反应。

步骤2：

通过加入20μl 7.5M的盐酸胍终止反应。将50μl终止的反应转移入抗生物素蛋白链菌素滤板(SAM^2TM Biotin Capture Plate，Promega，目录号V7542)中，并且在施加真空之前，在过滤器上将反应孵化1～2分钟。

然后，利用如下所述的真空歧管对板进行洗涤：1)4×200μl/孔的2M NaCl；2)6×200μl/孔的2M NaCl与1％H₃PO₄；3)2×200μl/孔的双蒸水；和4)2×100μl/孔的95％乙醇。然后，在加入闪烁体之前，使得膜得到完全风干。

用白色带基将板的底部密封，将30μl/孔的Microscint 20(PackardInstruments，目录号6013621)加入其中。用透明密封带密封板的顶部，然后利用[³³P]与液体闪烁体适当设定的Packard TopCount对板进行计数。

磷酸纤维素滤板测定的方法：

步骤1：

如步骤1(以上)的抗生物素蛋白链菌素闪现板测定进行酶促反应，使用KKGGRARTSSFAEPG(SEQ.ID.NO.：16)作为基质代替生物素-GGRARTSSFAEPG。

步骤2：

通过加入20μl 0.75％H₃PO₄终止反应。将50μl终止的反应转移入滤板(UNMLTERTM，Whatman P81强阳离子交换剂，白色聚苯乙烯96孔板，Polyfiltronics，目录号7700-3312)中，并且在施加真空之前，在过滤器上将反应孵化1～2分钟。

然后，利用如下所述的真空歧管对板进行洗涤：1)9×200μl/孔的0.75％H₃PO₄；2)2×200μl/孔的双蒸水。用白色带基将板的底部密封，将30μl/孔的Microscint 20加入其中。用透明密封带密封板的顶部，然后利用[³³P]与液体闪烁体适当设定的Packard TopCount对板进行计数。

PKA测定：

每个单独的PKA测定由下列成分组成：

A.5X PKA测定缓冲液(200mM Tris pH7.5，100mM MgCl₂，5mMθ-巯基乙醇，0.5mM EDTA)；

B.50μM用水稀释的肯普肽(Kemptide)(Sigma)贮液；

C.通过将1.0μl³³P-ATP[10mCi/ml]稀释成200Tl 50μM未标记ATP贮液制备的³³P-ATP；

D.10μl稀释至0.5mg/ml BSA的70nM PKA催化亚基(UBI目录#14-114)贮液；

E.PKA/肯普肽使用液：等体积的5X PKA测定缓冲液，肯普肽溶液和PKA催化亚基。

在96深孔测定板中进行反应。向10Tl³³P-ATP溶液中加入抑制剂或载体(10Tl)。向各孔中加入30Tl PKA/肯普肽使用液，反应即开始。反应物经混合，在室温下孵育20分钟。加入50Tl 100mM EDTA和100mM焦磷酸钠，混合，终止反应。

用p81磷酸纤维素96孔滤板(Millipore)收集酶反应产物(磷酸化肯普肽)。向p81滤板各孔中加入75mM磷酸以制板。通过板底抽真空，经过滤，排空各孔。向各孔中加入磷酸(75mM，170μl)。在含磷酸滤板的相应孔中，加入30μl等分的各已停止反应的PKA反应物。抽真空后，肽被截留在滤板上，用75mM磷酸洗涤滤板5次。最后一次洗涤后，将滤板风干。向各孔中加入闪烁液(30μl)，在TopCount(Packard)上对滤板进行计数。

PKC测定：

每个PKC测定都由下列成分组成：

A.10X PKC辅激活缓冲液：2.5mM EGTA、4mM CaCl₂；

B.5X PKC激活缓冲液：1.6mg/ml磷脂酰丝氨酸，0.16mg/ml二酰甘油，100mM Tris pH7.5，50mM MgCl₂，5mMθ-巯基乙醇；

C.在将1.0μl 33P-ATP[10mCi/ml]稀释成100μl 100μM未标记的ATP贮液制备的³³P-ATP；

D.用水稀释的髓鞘碱性蛋白(350μg/ml，UBI)；

E.稀释至0.5mg/ml BSA的PKC(50ng/ml，UBI目录#14-115)；

F.PKC/髓鞘碱性蛋白使用液：将各5倍体积的PKC辅激活缓冲液和髓鞘碱性蛋白与各10倍体积的PKC激活缓冲液和PKC混合而制得。

在96深孔测定板中进行测定。在5.0μl ³³P-ATP中加入抑制剂或载体(10Tl)。加入PKC/髓鞘碱性蛋白使用液，混合，即开始反应。反应物在30℃下孵育20分钟。加入50Tl 100mM EDTA和100mM焦磷酸钠，混合后，停止反应。在96孔滤板的PVDF膜上收集磷酸化髓鞘碱性蛋白，用闪烁计数进行定量测定。

用上述测定法，对上述方案1和表1中所述的本发明化合物进行测定，发现所述化合物对一种或多种Akt1、Akt2和Akt3的IC₅₀≤50μM。

实施例5

基于细胞的测定确定Akt/PKB的抑制

将细胞(例如具活化Akt的LnCaP或PTEN^(-/-)肿瘤细胞系)接种到100mM培养皿中。当细胞生长至约70-80％汇合时，再补加5ml新培养基和试验化合物溶液并继续培养细胞。对照包括未处理细胞、经载体处理的细胞和分别用20μM或者200nM LY294002(Sigma)或渥曼青霉素(Sigma)处理的细胞。细胞孵育2、4或6小时，弃培养基。细胞用PBS洗涤，刮出，并转移到离心管中。使细胞沉淀，再次用PBS洗涤。最后，将细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH8、140mM NaCl、2mMEDTA、1％Triton、1mM焦磷酸钠、10mMθ-磷酸甘油、10mM NaF、0.5mM NaVO₄、1μM Microsystine和1x蛋白酶抑制剂混合物)中，在冰上放置15分钟，温和涡旋使细胞裂解。将裂解液放入Beckman台式超速离心机中，在4℃以100,000×g离心20分钟。通过标准Bradford方案(BioRad)对上清液中的蛋白质进行定量分析，贮藏于-70℃待用。

按下述方法，对澄清裂解液中的蛋白质进行免疫沉淀(IP)：对于Akt1，将裂解液与NETN(100mM NaCl、20mM Tris pH8.0、1mM EDTA、0.5％NP-40)中的Santa Cruz sc-7126(D-17)混合，加入A/G蛋白琼脂糖凝胶(Santa Cruz sc-2003)。对于Akt2，将裂解液与NETN中的抗Akt-2琼脂糖(Upstate Biotechnology#16-174)混合，至于Akt3，将裂解液与NETN中的抗Akt3琼脂糖(Upstate Biotechnology#16-175)混合。免疫沉淀物(IP)在4℃下孵育过夜，洗涤，用SDS-PAGE进行分离。

使用蛋白质印迹分析总Akt、pThr308 Akt1、pSer473 Akt1以及Akt2和Akt3上相应的磷酸化位点，并用特异性抗体(Cell Signaling Technology)分析Akt下游目标：抗总Akt(目录号9272)、抗磷酸Akt丝氨酸473(目录号9271)和抗磷酸Akt苏氨酸308(目录号9275)。在4℃下，与用PBS+0.5％脱脂奶粉(NFDM)稀释的合适第一抗体孵育过夜后，洗涤印迹，在室温下，与PBS+0.5％NFDM中的辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体孵育1小时。用ECL试剂(Amersham/Pharmacia Biotech RPN2134)检测蛋白质。

实施例6

调蛋白刺激的Akt活化

将MCF7细胞(为PTEN+/+的一种人乳癌系)以1×10⁶细胞/100mM板接种到培养板中。当细胞为70-80％汇合时，再补加5ml无血清培养基并孵育过夜。次日上午，加入化合物，孵育细胞1-2小时，然后加入调蛋白(诱导Akt的活化)30分钟，用上述方法对细胞进行分析。

实施例7

肿瘤生长的抑制

癌细胞生长抑制剂的体内功效，可通过几种本领域众所周知的方案加以确定。

第0天，在6-10周龄的雌性无胸腺小鼠(Harlan)左胁处，皮下注射人肿瘤细胞系，该细胞系具有PI3K途径(例如LnCaP、PC3、C33a、OVCAR-3、MDA-MB-468等)失调。随机将小鼠分为载体组、化合物组或联合治疗组。从第一天起，每天经皮下给药，并在实验过程中连续给药。或者，可选用连续输注泵，给予抑制剂试验化合物。化合物、化合物联合药物或载体以总体积为0.2ml给药。通常注射细胞后4-5.5周，当所有载体治疗的动物的损害直径为0.5-1.0cm时，切除肿瘤并称重。计算每一治疗组每一细胞系肿瘤的平均重量。

序列表

<110>默克公司&Co.，Inc.

N.D.P.科斯福德

M.E.莱顿

J.梁

C.W.林兹利

P.E.桑德森

Z.赵

<120>AKT活性抑制剂

<130>MS0064Y

<150>60/652,737

<151>2005-02-14

<160>16

<170>FastSEQ，Windows文本4.0

<210>1

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>1

ctgcggccgc 10

<210>2

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>2

gtacgcggcc gcag 14

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>3

cgcgaattca gatctaccat gagcgacgtg gctattgtg 39

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>4

cgctctagag gatcctcagg ccgtgctgct ggc 33

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>5

gtacgatgct gaacgatatc ttcg 24

<210>6

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>6

gaatacatgc cgatggaaag cgacggggct gaagagatgg aggtg 45

<210>7

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>7

cccctccatc tcttcagccc cgtcgctttc catcggcatg tattc 45

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>8

gaattcagat ctaccatgag cgatgttacc attgtg 36

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>9

tctagatctt attctcgtcc acttgcagag 30

<210>10

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>10

ggtaccatgg aatacatgcc gatggaaagc gatgttacca ttgtgaag 48

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>11

aagcttagat ctaccatgaa tgaggtgtct gtc 33

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>12

gaattcggat cctcactcgc ggatgctggc 30

<210>13

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>全合成DNA序列

<400>13

ggtaccatgg aatacatgcc gatggaaaat gaggtgtctg tcatcaaag 49

<210>14

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>全合成氨基酸序列

<400>14

Glu Tyr Met Pro Met Glu

1 5

<210>15

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>全合成氨基酸序列

<400>15

Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly

1 5 10

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>全合成氨基酸序列

<400>16

Lys Lys Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly

1 5 10 15

Claims

1.式A化合物：

其中：

u、v、w和x独立地选自：CH和N；

y和z独立地选自：CH和N，条件是y和z中至少一个是N；

R³和R⁴独立地选自：H、(C₁-C₆)烷基和(C₁-C₆)全氟烷基，或者R³和R⁴合起来形成-(CH₂)_t-，其中一个碳原子任选被选自O、S(O)_m、-N(R^b)C(O)-和-N(COR^a)-的部分替换；

R⁵选自：NR⁷R⁸；

R^6a选自：(C＝O)_aO_b(C₁-C₁₀)烷基、O_a(C₁-C₃)全氟烷基、(C₀-C₆)亚烷基-S(O)_mR^a、氧代、OH、卤素、CN、(C₂-C₁₀)烯基、(C₂-C₁₀)炔基、(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₆)亚烷基-芳基、(C₀-C₆)亚烷基-杂环基、(C₀-C₆)亚烷基-N(R^b)₂、C(O)R^a、(C₀-C₆)亚烷基-CO₂R^a、C(O)H和(C₀-C₆)亚烷基-CO₂H，所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选被最高达三个选自R^6b的取代基取代；

R^a为(C₁-C₆)烷基、(C₃-C₆)环烷基、芳基、或者杂环基；和

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

2.根据权利要求1的式B所示化合物：

其中：

q为0、1、2、3或者4；

Q独立地选自：杂环基，所述杂环基任选被1～3个选自R^6b的取代基取代；

和所有其它取代基和变量如权利要求1中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

3.根据权利要求2的式C所示化合物：

其中：

所有其它取代基和变量如权利要求2中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

4.根据权利要求3的式D所示化合物：

其中：

所有其它取代基和变量如权利要求2中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

5.根据权利要求4的式E所示化合物：

其中：

所有其它取代基和变量如权利要求2中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

6.根据权利要求1的式F所示化合物：

其中：

所有其它取代基和变量如权利要求1中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

7.根据权利要求6的式G所示化合物：

其中：

R³和R⁴独立地为：H和(C₀-C₆)烷基，其中所述烷基任选被最高达三个选自以下的取代基取代：OH和卤素；和其中R³和R⁴可以连接在一起形成(C₃-C₇)环烷基；和

所有其它取代基和变量如权利要求1中所定义；

或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

8.根据权利要求1的化合物，选自：

5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘；

2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮；

1-{4-[4-(3-嘧啶-5-基喹喔啉-2-基)苄基]环己基}-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮；

3-[3-(4-{[4-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-1-基)环己基]甲基}苯基)喹喔啉-2-基]噻吩-2-甲醛；

1-(4-{4-[3-(1H-吡唑-5-基)喹喔啉-2-基]苄基}环己基)-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮；和

2-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮；或者其药学上可接受的盐或者立体异构体。

9.根据权利要求1的化合物的TFA盐，所述化合物选自：

3-[3-(4-{[4-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-1-基)环己基]甲基}苯基)喹喔啉-2-基]噻吩-2-甲醛；和

1-(4-{4-[3-(1H-吡唑-5-基)喹喔啉-2-基]苄基}环己基)-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮；

或者其立体异构体。

10.一种药物组合物，含有药物载体和分散于其中的治疗有效量的权利要求1的化合物。

11.根据权利要求1的化合物的用途，用于制备在需要所述治疗的哺乳动物中治疗或者预防癌症的药物。