KR101101920B1 - 플랙스단백질분리물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
플랙스단백질분리물들은 플랙스기름종자들이 기름을 회수하고 밀을 생산하기 위해 분쇄되는 것에 앞서 그로부터 점액질을 제거하도록 초기 추출되는 방법을 통해 얻을 수 있다. 그런 다음, 플랙스단백질밀은 플랙스단백질분리물을 회수하도록 처리된다.
플랙스단백질분리물, 밀, 플랙스기름종자, 점액질
Description
본 발명은 플랙스기름종자밀로부터 플랙스단백질분리물들을 회수하는 것에 관한 것이다.
이 출원의 양수인에게 양도되며 그것의 개시 내용이 참조로 통합되는 2002년 10월 9일 출원된 미국특허출원 제10/266,677호(WO 03/030652)에서, 플랙스단백질분리물의 제조방법에 관해 개시하고 있다. 여기서 기술된 바와 같이, 건량기준으로 켈달(Kjeldahl) 질소 x 6.25(N x 6.25)에 의해 측정될 경우, 적어도 약 90 중량%, 바람직하게는 적어도 약 100 중량%의 단백질함량을 가진 플랙스기름종자단백질분리물을 제공한다.
이 공정에서, 수용성 점액질의 존재로 단백질용액을 높은 단백질함량을 가지도록 농축할 수 없기 때문에, 플랙스단백질분리물의 수율은 제한되었다. 플랙스종자 점액질은 대체로 다당류들로 구성된 점착성 물질이다. 다른 가공들에 의해 플랙스기름종자밀로부터 분리된 단백질산물에 있어서 점액질의 존재로, 분리물들로서 분류되기에 충분한 정도의 높은 단백질함량을 가진 산물들을 생산하기 어렵다.
플랙스종자는 약 34 내지 약 37 중량%의 단백질들을 함유하는 것으로 알려져 있고, 다른 침전지수(S)로 구별되는 다수의 다른 단백질성분들이 식별되어졌다. 이러한 단백질들은 리닌으로 알려져 있는 12S 글로불린, 콜리닌으로 알려져 있는 2S 알부민을 포함한다.
어그리코어 유나이티드(Agricore United)사에 의해 공급되는 리놀라®기름종자는 전통적인 육종방법들을 통해, 지방산조성이 변화되고 리놀렌산(C18:3)이 종래의 플랙스기름종자의 약 50% 내지 약 2%로 실질적으로 감소된 플랙스기름종자의 변이종이다. 이러한 변화들은 결과적인 리놀라기름종자로부터, 지방산조성에 있어서 해바라기기름과 실질적으로 유사한 식용 다불포화기름을 제공하도록 하였다.
점액질을 제거하도록 중탄산나트륨의 미알칼리성 용액을 이용하여 상승된 온도에서 플랙스종자의 초기 추출이 수행된다면, 농축된 수성 단백질용액의 훨씬 더 높은 농도를 생산할 수 있고, 얻어지는 플랙스단백질분리물의 수율을 향상시킬 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 또한, 플랙스단백질분리물은 등전침전이나 미셀루트(micellar route)에 의해 플랙스단백질밀로부터 생산될 수 있다.
또한, 본 발명의 플랙스단백질분리물의 현저한 단백질성분은, 리닌으로 알려져 있는 12S 글로불린의 절반으로 보이고, 바이오래드(BioRad)사 동물단백질 기준들에 비교하여 HPLC 정체시간에 의해 측정될 경우 대략 162,000 내지 169,000 달톤의 분자량을 가진 7S단백질이라는 것이 발견되었다. 본 발명의 플랙스단백질분리물들의 다른 단백질성분들은 바이오래드사 동물단백질 기준들에 비교하여 HPLC 정체시간에 의해 측정될 경우 대략 415,000 내지 440,000 달톤의 분자량을 가진 리닌, 및 바이오래드사 동물단백질 기준들에 비교하여 HPLC 정체시간에 의해 측정될 경우 대략 16,000 내지 17,000 달톤의 분자량을 가진 콜리닌을 포함한다.
또한, 단백질성분들의 상대적 비율들은 본 발명의 단백질미셀덩어리(PMM)-유도 플랙스단백질분리물 및 상청액-유도 플랙스단백질분리물 사이에서 유사하는 것을 발견하였다.
특히, 적어도 약 90 중량%(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100 중량%의 단백질함량을 가진 PMM-유도 플랙스단백질분리물은 약 65 내지 95 중량%의 7S 플랙스단백질(리닌의 절반), 약 0 내지 20 중량%의 리닌 및 약 0 내지 20 중량%의 콜리닌의 단백질성분 함량을 가진다는 것을 발견하였다. 적어도 약 90 중량%(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100 중량%의 단백질함량을 가진 상청액-유도 플랙스단백질분리물은 약 65 내지 95 중량%의 7S 플랙스단백질(리닌의 절반), 약 0 내지 20 중량%의 리닌 및 약 0 내지 20 중량%의 콜리닌의 단백질성분 함량을 가진다는 것을 발견하였다.
PMM-유도 및 상청액-유도 플랙스단백질분리물들에 대한 단백질성분 프로파일들에 있어서의 유사성은 플랙스단백질분리물들이 사용되는 환경들에서 유사한 작용을 야기한다. 유사한 단백질함량 프로파일들은 조성의 변화없이 어떤 소망된 비로 PMM-유도 및 상청액-유도 플랙스단백질분리물들의 결합을 가능하게 하고, 따라서 가공에 있어서의 수율을 증가시킬 수 있다.
PMM-유도, 상청액-유도 및 등전침전(IEP)-유도 플랙스단백질분리물들은 매우 유사한 아미노산 프로파일을 가진다. 얻어진 아미노산 프로파일들은 이하 실시예에서 기술한다.
본 발명은 특정 단백질 프로파일을 가진 플랙스단백질분리물 및 기름종자의 초기 추출을 포함하는 상기 플랙스단백질분리물의 제조방법을 제공한다. 단백질분리물은 켈달 질소 전환비 N x 6.25로 적어도 약 90 중량% 단백질을 함유하는 단백질로 정의된다. 여기서 언급되는 "단백질함량"은 건량기준으로 표현된 단백질분리물의 단백질 양을 나타낸다.
본 발명에 따른 가공에 의해 생산된 플랙스단백질분리물은 가령, 가공식품들의 단백질강화, 기름들의 유화, 구운 음식들의 바디포머들(body formers) 및 가스를 포획하는 제품들의 발포제들과 같은 단백질분리물들의 종래 적용분야에도 이용될 수 있다. 또한, 단백질분리물은 고기류들에 유용한 단백질섬유들로 형성될 수 있고, 달걀 흰자위가 결합제로 이용되는 음식제품들의 달걀 흰자위 대치품 또는 증량제로서 이용될 수 있다. 플랙스단백질분리물은 영양첨가제들로 이용될 수 있다. 플랙스단백질분리물의 다른 용도들로는 애완동물 먹이들, 동물사료분야가 있고, 산업용 및 미용 적용분야가 있으며, 퍼스널캐어(personal care) 제품들의 분야가 있다.
플랙스종자의 초기 추출은, 약 30°내지 약 70℃의 상승된 온도, 바람직하게는 약 50℃에서 일반적으로 약 7.5 내지 약 9의 pH를 가지는, 바람직하게는 알칼리성 물질 수용액의 본래 pH에서, 수용액을 이용하여 수행될 수 있다. 플랙스기름종자의 추출은 약 1:1 내지 약 1:20, 바람직하게는 약 1:5 내지 약 1:10의 용액에 대한 종자비로, 약 0.2 내지 약 0.7 M 미알칼리성 물질을 함유하는 수용액을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 약 0.5 M의 농도를 가진 중탄산나트륨의 수용액이 약 1:8의 용액에 대한 플랙스종자비로 약 50℃에서 이용될 수 있다.
일반적으로 약 15 내지 60분, 바람직하게는 약 30 내지 60분 동안, 수성 알칼리성 용액에서 기름종자를 교반하여 혼합하는 것에 의해 기름종자의 첫 번째 추출 후에, 기름종자들로부터 더 이상의 점액질이 추출되지 않을 때까지, 추출은 신선한 수성 알칼리성 용액으로 반복되는 것이 바람직하다.
그런 다음, 추출된 기름종자들은 기름을 회수하고 플랙스단백질분리물이 생산될 수 있는 기름종자밀을 제공하도록 처리된다.
플랙스단백질분리물이 플랙스기름종자밀로부터 형성될 수 있는 일방법은 등전침전에 의한 것이다. 여기 제공된 바와 같이 점액질의 초기 제거를 수행함에 앞서, 출원인들은 플랙스기름종자밀의 등전침전 처리에 의해 플랙스단백질분리물을 생산할 수 없었다. 등전침전은 일반적으로 가령, 콩단백질분리물과 같은 다른 단백질분리물을 제조하는데 이용된다.
이런 등전침전에 있어서, 플랙스기름종자밀 또는 리놀라기름종자밀은 일반적으로 약 8 내지 약 12, 바람직하게는 약 9 내지 약 11의 pH를 갖는 수산화나트륨인 수성 알칼리성 용액으로, 약 0°내지 약 40℃, 바람직하게는 약 15°내지 약 25℃의 온도에서, 약 10% w/v, 바람직하게는 약 2.5 내지 약 5% w/v의 밀농도로 추출된다.
밀의 추출 후에, 잔여의 밀은 가령, 진공여과(vacuum filtration)를 사용한 다음, 잔여의 밀을 제거하도록 원심분리 및/또는 여과되는 것과 같은 어떤 편리한 방법으로 수성 단백질용액으로부터 분리된다. 분리된 잔여의 밀은 처리를 위해 건조될 수 있다.
그런 다음, 플랙스단백질용액은, 플랙스 또는 리놀라단백질분리물의 침전을 형성하도록 가령, 염산과 같은 어떤 편리한 산을 이용하여, 약 3 내지 약 5, 바람직하게는 약 4의 pH로 산성화된다. 침전물은 상청액으로부터 제거되고 건조된다. 건조된 등전침전(IEP)-유도 플랙스단백질분리물은 약 90 중량%(N x 6.25)을 초과하는, 바람직하게는 적어도 약 100 중량%의 높은 단백질함량을 가진다.
선택적으로 그리고 바람직하게는, 플랙스단백질분리물은 전술한 미국의 동시계속출원 제10/266,677호에 개시된 방법을 따라 제조된다. 가공은 일련의 회분식공정들(batch operations)에서 수행되거나 연속 또는 반연속적공정으로 수행될 수 있다.
전술한 출원의 방법에 따른 플랙스단백질분리물을 생산하는 공정의 초기단계는, 플랙스기름종자밀로부터 단백질성 물질을 가용화하는 것을 포함한다. 플랙스종자밀로부터 회수된 단백질성 물질은 플랙스종자에서 자연적으로 발생하는 단백질이거나 또는 단백질성 물질은 유전조작에 의해 변형되었으나 천연 단백질의 특징적인 소수성 및 극성특성을 가진 단백질일 수 있다. 플랙스밀은 다양한 수준의 비변성단백질을 가지고 가령, 뜨거운 헥산추출(hot hexane extraction)법이나 차가운 기름 압출(cold oil extrusion)법으로부터 얻은, 플랙스기름종자로부터 플랙스기름을 제거한 어떤 플랙스밀일 수 있다. 플랙스기름종자로부터 플랙스기름의 제거는 통상적으로 여기에 기술된 단백질분리물 회수방법으로부터 분리공정으로 수행된다.
단백질 가용화는, 염의 존재가 기름종자밀로부터 가용성 단백질의 제거를 향상시키므로 염용액을 이용하여 보다 효과적으로 수행된다. 염은 가령, 염화칼륨과 같은 다른 염들도 이용될 수 있지만, 통상적으로 염화나트륨이다. 염용액은 적어도 약 0.10 M, 바람직하게는 적어도 약 0.15 M의 이온강도를 가지며, 일반적으로 수행되는 단백질의 현저한 양의 가용화를 가능하게 하도록 약 2.0 M까지 이를 수 있다. 염용액의 이온강도가 증가됨에 따라, 기름종자밀에서 단백질의 가용화 정도는 최대값에 도달할 때까지 초기에 증가된다. 이온강도에 있어서 차후의 증가는 가용화된 전체 단백질을 증가시키지 않는다. 최대 단백질 가용화를 야기하는 염용액의 이온강도는 관계된 염 및 선택된 기름종자밀에 따라 다르다.
이온강도를 증가시키면서 단백질침전을 위해 요구되는 보다 나은 희석의 정도를 고려하여, 통상 바람직하게는 약 1.0 미만, 보다 바람직하게는 약 0.15 내지 약 0.6의 이온강도값을 이용한다.
회분식공정에서, 단백질의 염 가용화는 약 0℃ 이상의 온도, 바람직하게는 약 35℃의 온도에서, 통상적으로 약 10 내지 약 90분인 가용화 시간을 감소시키도록 바람직하게는 교반을 수반하여 수행된다. 산출수율을 향상시키기 위해, 기름종자밀로부터 실질적으로 단백질의 최대량을 추출하도록 가용화를 수행하는 것이 바람직하다. 더 높은 온도는 회분식모드에서 공정이 비경제적이 되므로 바람직한 상부 온도 제한이 35℃로 선택된다.
연속공정에서, 플랙스기름종자밀로부터의 단백질 추출은, 플랙스기름종자밀로부터 단백질의 연속추출을 수행하는 것으로 구성된 어떤 방법으로 실시될 수 있다. 일실시형태에서, 플랙스기름종자밀은 연속적으로 염용액과 혼합되고 혼합물은 여기에 기술된 파라미터들에 따라 소망된 추출을 수행하기에 충분한 잔류시간을 위한 길이 및 유량을 가진 파이프 또는 도관을 통해 운반된다. 이러한 연속적인 과정에서, 염 가용화 단계는 약 10분에 이르는 시간, 바람직하게는 플랙스기름종자밀로부터 단백질의 최대량을 실질적으로 추출하도록 가용성을 수행하는데 이르는 시간에 신속하게 수행된다. 연속공정에서 가용화는 상승된 온도들, 일반적으로 약 60℃ 또는 그 이상에 이르는 온도에서 수행되는 것이 바람직하다.
수성 염용액 및 플랙스기름종자밀은 이하에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 단백질분리물을 미셀루트에 의해 형성되도록 하는 약 5 내지 약 7의 본래의 pH를 가진다. 플랙스 또는 리놀라단백질분리물의 최대수율을 위한 최적의 pH 값은 선택된 플랙스기름종자밀에 따라 다르다.
pH 범위의 한계 및 그 근방에서, 단백질분리물 형성은 미셀루트를 통해, pH 범위에서 도달할 수 있는 어디에서 보다도 낮은 수율로 오직 부분적으로 일어난다. 이러한 이유들로, 약 5.3 내지 약 6.2의 pH 값들이 바람직하다.
염용액의 pH는 통상적으로 필요에 따라 염산 또는 알칼리, 보통 수산화나트륨과 같은 어떤 편리한 산의 이용으로 추출단계에서 이용하기 위해 약 4 내지 약 7의 범위 내에서 어떤 소망된 값으로 조절될 수 있다.
가용화 단계 동안 염용액에서 기름종자밀의 농도는 광범위하게 변할 수 있다. 전형적인 농도값은 약 5 내지 약 15% w/v이다.
수성 염용액으로의 단백질 추출단계는 플랙스종자밀에 존재하는 지방질들을 가용화하는 부가적인 효과를 가지고 이는 수성상에서 존재하는 지방질들을 야기한다.
추출단계로부터의 단백질용액은 일반적으로 약 5 내지 약 40 g/L, 바람직하게는 약 10 내지 약 30 g/L의 단백질농도를 가진다.
그런 다음, 추출단계로부터의 수성상은 가령, 진공여과를 사용한 다음, 잔여의 밀을 제거하도록 원심분리 및/또는 여과되는 것과 같은 어떤 편리한 방법으로 잔여의 플랙스기름종자밀로부터 분리될 수 있다. 분리된 잔여의 밀은 처리를 위해 건조될 수 있다.
플랙스종자밀이 현저한 양의 지방을 함유하는 경우, 이 출원의 양수인에게 양도되며 그것의 개시 내용이 참조로 통합되는 미국특허 제5,844,086호 및 제6,005,076호에 개시된 캐놀라에 관한 탈지단계들이 이하에 기술되는 농축된 수성 단백질용액 및 분리된 수성 단백질용액에서 수행될 수 있다.
수성 염용액으로 플랙스기름종자를 추출하는 것에 대안으로서, 이런 추출은, 물만을 이용하는 것은 수성 염용액보다 플랙스오일종자밀로부터 더 적은 단백질을 추출하는 경향이 있지만, 물만을 이용하여 수행될 수 있다. 이런 대안이 사용되는 경우, 염은, 상기 언급된 농도들에서, 이하에 기술되는 농축단계 동안 용액에서 단백질을 유지하기 위해 잔여의 플랙스기름종자밀로부터의 분리 후에 단백질용액을 첨가할 수 있다.
그런 다음, 수성 단백질용액은 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하면서 단백질농도를 증가시키도록 농축된다. 이런 농축은 일반적으로 적어도 약 150 g/L, 바람직하게는 적어도 약 250 g/L의 단백질농도를 가진 농축된 단백질용액을 얻도록 수행된다.
농축단계는 연속적인 공정 동안, 수성 단백질용액이 막들을 통과할 수 있을 정도의 소망된 농축정도를 허용할 수 있도록 치수화된 다른 막물질들 및 형상들을 고려하여, 약 3,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 5,000 내지 10,000 달톤과 같은 적절한 분자량 차단으로, 한외여과(ultrafiltration) 또는 여과작용(diafiltration)과 같은 어떤 편리한 선택적 막 기술을 사용하는 것, 할로우-피버막들(hollow-fibre membranes) 또는 스피럴운드막들(spiral-wound membranes)과 같은 막들을 이용하는 것과 같은 회분식공정 또는 연속적인 공정과 일치하는 어떤 편리한 방식으로 수행되어 질 수 있다.
그런 다음, 농축된 단백질용액은 추출용액과 동일한 몰농도 및 pH의 수성 염용액, 통상적으로 염화나트륨 용액을 이용하는 여과작용 단계가 가해진다. 이 여과작용은 약 2 내지 20, 바람직하게는 약 5 내지 10의 여과작용 용액 볼륨(volumes)을 이용하여 수행될 수 있다. 여과작용에서, 더 많은 양의 오염이 투과성을 가진 막을 통과하는 것에 의해 수성 단백질용액으로부터 제거된다. 여과작용은 현저하게 더 많은 오염이 투과 중에 존재하지 않을 때까지 수행되어 질 수 있다. 이 여과작용은 약 3,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 5,000 내지 10,000 달톤의 범위 내의 분자량 차단을 가지고, 다른 막물질들 및 형상들을 고려한 막을 이용하여 수행될 수 있다.
항산화제는 적어도 여과작용 단계의 부분 동안 여과작용 매질에 존재할 수 있다. 항산화제는 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 어떤 편리한 항산화제일 수 있다. 여과작용 매질에 사용된 항산화제 양은 사용된 물질들에 의존하고 약 0.01 내지 약 1 중량%, 바람직하게는 약 0.05 중량%로 변할 수 있다.
농축단계 및 최적의 여과작용 단계는 어떤 편리한 온도, 일반적으로 약 15°내지 약 60℃의 온도에서 소망된 농축의 정도를 이룰 수 있는 시간 동안 수행되어 질 수 있다. 온도 및 약간의 정도로 사용된 다른 조건들은 농축을 수행하도록 이용된 막장비 및 용액의 소망된 단백질 농도에 의존한다.
공지된 바와 같이, 한외여과 및 유사한 선택적인 막 기술들은 더 높은 분자량 종이 통과하는 것을 막으면서 낮은 분자량 종을 통과할 수 있도록 허용한다. 저분자량 종들은 단백질의 어떤 저분자량 형태들은 물론, 식품첨가용 염의 이온 종 뿐만 아니라 탄수화물들, 색소들 및 비영양 인자들과 같은 근원 물질로부터 추출된 저분자량 물질들도 포함한다. 막의 분자량 차단은 통상적으로 다른 막물질들 및 형상들을 고려하여, 오염원들은 통과되도록 허용하면서, 용액에서 단백질의 현저한 잔류 비율을 확보하도록 선택되어 진다.
농축되고 선택적으로 여과작용된 단백질용액은 저장 또는 다른 방법의 결과로 본래의 밀에 존재할 수 있고 추출단계에서 밀로부터 플랙스단백질분리물 용액 내로 추출된 어떤 박테리아를 죽이기 위해 저온살균이 가해진다. 이러한 저온살균은 어떤 소망된 저온살균 조건 하에 수행되어 질 수 있다. 일반적으로, 농축되고 선택적으로 여과작용된 단백질용액은 약 55°내지 약 70℃, 바람직하게는 약 60°내지 약 65℃의 온도로, 약 10 내지 15분, 바람직하게는 약 10분 동안 가열된다. 그런 다음, 저온살균된 농축된 단백질용액은 이하에서 기술하는 바와 같은 차후 공정 동안, 바람직하게는 약 25°내지 약 40℃로 냉각될 수 있다.
농축단계에서 사용된 온도에 의존하여, 농축된 단백질용액은 연이은 희석단계의 수행 및 미셀 형성을 용이하게 하기 위해 농축된 단백질용액의 점도를 감소시키도록 적어도 약 20°내지 약 60℃ 까지, 바람직하게는 약 25°내지 약 40℃까지의 온도로 데워질 수 있다. 농축된 단백질용액은 농축된 단백질용액의 온도가 냉각수에 의해 희석시 미셀을 형성하는 것을 허용하지 않는 온도 이상으로 가열되지 않는다. 농축된 단백질용액은 필요하다면, 미국특허 제5,844,086호 및 제6,005,076호에 개시한 바와 같이, 더욱 탈지하는 작용이 가해진다.
그런 다음, 농축단계 및 선택적 탈지단계로부터의 결과적인 농축된 단백질용액은 소망된 희석 정도를 실현하기 위해 요구되는 부피를 가진 냉각수와 농축된 단백질용액을 혼합하여 미셀형성을 수행하도록 희석된다. 농축된 단백질용액은 약 15배 이하, 바람직하게는 약 10배 이하로 희석된다.
농축된 단백질용액과 혼합되는 냉각수는 약 15℃ 이하, 일반적으로 약 3°내지 약 15℃, 바람직하게는 약 10℃ 이하의 온도를 가지는데, 이는 단백질 미셀 덩어리의 형태로 단백질분리물의 향상된 수율은 이용된 희석 인자들에서 이렇게 더 낮은 온도로 얻어지기 때문이다.
회분식공정에서, 농축된 단백질용액의 배치(batch)는 상기 언급한 바와 같이, 소망된 부피를 가진 냉각수의 정적보디(static body)에 첨가된다. 농축된 단백질용액의 희석 및 이에 대한 결과로서 일어나는 이온강도의 감소는 미셀형태의 분리된 단백질 소적(droplet)들의 형태로 매우 응집된 단백질분자들의 구름형 덩어리의 형성을 야기한다. 회분식공정에서, 단백질 미셀들은 냉각수의 보디에 침전되어, 응집되고 유착되고 밀집되고 무정형의 끈적거리는 글루텐과 같은 단백질 미셀 덩어리(PMM)를 형성한다. 침전은 원심분리와 같은 것에 의해 보조될 수 있다. 이렇게 된 침전은 단백질 미셀 덩어리의 액체함량을 감소시켜, 일반적으로 약 70 중량% 내지 약 95 중량%의 수분함량을 일반적으로 전체 미셀 덩어리의 약 50 중량% 내지 약 80 중량%의 값으로 감소시킨다. 또한, 이런 방법으로 미셀 덩어리의 수분함량 감소는 미셀 덩어리의 흡장된(occluded) 염 함량을 감소시키고 따라서 건조분리물의 염함량을 감소시킨다.
선택적으로, 희석작용은 희석수가 T-형 파이프의 다른 한 입구로 공급되는 동안 파이프에 혼합되게 T-형 파이프의 한 입구로 농축된 단백질용액을 계속적으로 통과시키는 것에 의해 계속적으로 실행될 수 있다. 희석수는 농축된 단백질용액의 소망된 희석정도를 실현하기에 충분한 정도의 비율로 T-형 파이프 내로 공급된다.
파이프에서 농축된 단백질용액 및 희석수의 혼합은 단백질 미셀들의 형성을 개시하고 혼합물은 계속적으로 T-형 파이프로부터의 출구로부터, 가득찰 경우 상청액이 넘쳐 흐르도록 하는 침전용기 내로 공급된다. 바람직하게는, 혼합물은 액체의 보디 내의 난류를 최소화하는 방법으로 침전용기에 액체의 보디 내로 공급된다.
연속공정에서, 단백질 미셀들은 침전용기에 침전되어, 응집되고 유착되고 밀집되고 무정형의 끈적거리는 글루텐과 같은 단백질 미셀 덩어리(PMM)를 형성하고 공정은 소망된 PMM의 양이 침전용기의 바닥에 쌓일 때까지 계속되고, 그 결과 축적된 PMM은 침전용기로부터 제거된다.
침전된 분리물은 가령, 침전된 덩어리로부터 잔여의 수성상을 따라내는 것(decantation)에 의해 또는 원심분리에 의해 잔여의 수성상 또는 상청액으로부터 분리된다. PMM은 젖은 형태로 이용되거나 어떤 편리한 기술, 가령 분무건조, 동결건조 또는 진공드럼건조에 의해 건조형태로 건조된 상태로 건조될 수 있다. 건조 플랙스단백질분리물은 약 90 중량%를 초과하는, 바람직하게는 적어도 약 100 중량% 단백질(N x 6.25) 높은 단백질함량을 가지고, 실질적으로 변성되지 않았다<시차 주사 열계량법(differential scanning calorimetry)으로 측정시>. 또한, 지방 기름종자밀로부터 분리된 건조 플랙스단백질분리물은 미국특허 제5,844,086호 및 제6,005,076호의 방법이 사용될 경우, 약 1 중량% 미만의 낮은 잔여 지방함량을 가진다.
PMM 형성 및 침전단계로부터의 상청액은 희석단계에서 침전되지 않은, 현저한 양의 플랙스단백질을 함유하고, 상청액은 그로부터 부가적인 양의 단백질을 회수하도록 처리될 수 있다.
이런 공정에서, PMM의 제거 후에 희석단계로부터의 상청액은 단백질 농도를 증가시키도록 농축된다. 이런 농축은 어떤 편리한 선택적 막 기술, 가령 용액에 플랙스단백질을 유지하면서, 원 물질로부터 추출된 여타의 비단백질성 저분자량 물질들 및 식품첨가용 염을 포함하는 저분자량 종들을 막을 통과하도록 하는 적절한 분자량 차단을 가진 막들을 이용하는 한외여과를 이용하여 수행된다. 다른 막물질들 및 형상들을 고려하여, 약 3,000 내지 100,000 달톤의 분자량 차단을 가진 한외여과 막들이 이용될 수 있다. 또한, 이 방법에서 상청액의 농축은 단백질을 회수하도록 건조되는데 요구되는 액체의 부피와 그 결과 건조에 요구되는 에너지를 감소시킨다. 상청액은 일반적으로 건조하기에 앞서 약 50 내지 약 300 g/L, 바람직하게는 약 100 내지 약 200 g/L의 단백질 농도로 농축된다.
농축된 상청액은 플랙스단백질분리물을 더욱 제공하기 위해 어떤 편리한 기술, 가령, 분무건조, 동결건조 또는 진공드럼건조에 의해 건조형태로 건조될 수 있다. 이렇게 더욱 얻어진 플랙스단백질분리물은 약 90 중량% 단백질(N x 6.25)을 초과하는, 바람직하게는 적어도 약 100 중량%의 높은 단백질함량을 가지고, 실질적으로 변성되지 않았다(시차 주사 열계량법으로 측정시). 소망된다면, 젖은 PMM은 결합된 플랙스단백질분리물을 제공하도록 어떤 편리한 기술에 의해 결합된 단백질 흐름들(streams)을 건조하기에 앞서 농축된 상청액과 결합될 수 있다. 결합된 플랙스단백질분리물은 약 90 중량%(N x 6.25)를 초과하는, 바람직하게는 적어도 약 100 중량% 높은 단백질함량을 가지고, 실질적으로 변성되지 않았다(시차 주사 열계량법으로 측정시).
또 다른 대안적 공정에서, 농축된 상청액의 오직 일부분만이 PMM의 적어도 일부분과 결합하고 결과적인 혼합물들은 건조된다. 농축된 상청액의 잔류물은 PMM의 잔류물의 일부와 같이 건조될 수 있다. 또한, 건조된 PMM 및 건조된 상청액은 어떤 소망된 상대적 비율로 건조 혼합된다.
이런 방법의 공정에 의해, 다수의 플랙스단백질분리물들은 건조된 PMM, 건조된 상청액, 및 다른 기능적이고 영양적인 특성들을 얻을 수 있기 위해 소망되어질 수 있는 일반적으로 약 5:95 내지 약 95:5의 중량으로, 다양한 중량비율의 PMM 및 상청액의 건조된 혼합물들의 형태로 회수될 수 있다.
선택적으로, 이 출원의 양수인에게 양도되며 그것의 개시 내용이 참조로 통합되는 2004년 2월 17일 출원된 미국의 동시계속출원 제60/544,346호에 개시된 캐놀라단백질분리물의 회수에 관한 방법이 플랙스단백질분리물을 회수하는데 이용될 수 있다. 여기에 기술된 방법에 따르면, 단백질용액 농축단계로부터의 결과적인 농축된 단백질용액은 PMM을 생산하도록 처리되고 분리하여 상청액을 처리하는 것보다 직접 건조된다. 상기 기술한 바와 같이, 선택적으로 여과작용되고 탈지될 수 있는 농축된 단백질용액의 건조는 어떤 편리한 방식으로, 가령 분무건조, 동결건조 또는 진공드럼건조로 수행될 수 있다.
직접 건조 과정에 의해 형성된 단백질분리물들은 일반적으로 상기 기술된 방법에 의해 얻어진 것보다 더 낮은 순도, 특히 더 높은 염함량을 가지므로, 단백질분리물들이 투석과 같은 어떤 편리한 방법에 의해 그들의 염함량을 감소시키도록 처리될 수 있지만, 그것들은 비인체의 적용들에 이용되는 것이 바람직하다.
어떤 주어진 단백질분리물에 있어서 각 단백질들의 상대적인 양들은 가령, 분석분리기술(analytical separation techique)과 같은 어떤 편리한 분석기술에 의해 측정될 수 있다. 이러한 기술들의 가장 일반적인 점은 사이즈에 기초하여 분리될 수 있는 컬럼에 선택적인 매질들을 이용하는 것이다. 젤 투과 크로마토그래피(GPC) 적용에 있어서는, 구형의 겔 같은 물질들을 이용한다. 압력이 이용되는 경우, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 있어서는, 강성한(rigid) 매질들을 이용한다. 또한, 후자의 기술은 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)로 알려져 있다. 여기 기술된 바와 같이 제조된 플랙스단백질의 샘플들에 이런 기술들을 이용하여 얻어진 결과들은 이하의 실시예들에 포함된다.
PMM-유도 플랙스단백질분리물 및 상청액-유도 플랙스단백질분리물은 주로 대략 162,000 내지 169,000 달톤의 분자량을 가진 7S 플랙스단백질(리닌의 절반), 대략 415,000 내지 440,000 달톤의 분자량을 가진 적은 양의 리닌, 및 대략 16,000 내지 17,000 달톤의 분자량을 가진 콜리닌으로 구성되어 있다. 일반적으로, PMM-유도 단백질은 이하를 함유한다:
약 65 내지 95 중량%의 7S 플랙스단백질(리닌의 절반);
약 0 내지 20 중량%의 리닌; 및
약 0 내지 20 중량%의 콜리닌.
일반적으로, 상청액-유도 단백질은 이하를 함유한다:
약 65 내지 95 중량%의 7S 플랙스단백질(리닌의 절반);
약 0 내지 20 중량%의 리닌; 및
약 0 내지 20 중량%의 콜리닌.
도 1 및 도 2는 리놀라분리물들의 HPLC 크로마토그램으로서, 도 1은 PMM-유도 리놀라단백질분리물에 관한 크로마토그램, 도 2는 상청액-유도 리놀라단백질분리물에 관한 크로마토그램; 및
도 3, 4 및 5는 리놀라분리물들의 시차 주사 열계량법 온도기록도(Differential Scanning Calorimetry thermogram)로서, 도 3은 PMM-유도 리놀라단백질분리물에 관한 것이고, 도 4는 상청액-유도 리놀라단백질분리물에 관한 것이며, 도 5는 IEP-유도 리놀라단백질분리물에 관한 것이다.
제1실시예
본 실시예는 리놀라기름종자밀로부터 점액질의 제거를 예시한다.
리놀라기름종자는 다양한 농도수준의 중탄산나트륨을 이용하여 수성 중탄산나트륨을 종자:용매 비를 1:8로 하여 리놀라기름종자와 50℃에서 한 시간동안 고속에서 오버헤드 믹서세트(overhead mixer set)를 이용하여 혼합하는 것에 의해 세척되었다.
세척은, 종자들로부터 회수된 점액질의 양을 비교하기 위해 테스트된 수성 중탄산나트륨 용액의 각 농도에서 행해졌다. 총 500g의 리놀라는 각 농도에서 4L의 중탄산나트륨에 세척되었다.
각 세척으로부터의 상청액은 따라내어지고 각 상청액으로부터 100 ml는 어떤 가용화된 점액질을 침전시키도록 88% 에탄올로 1:1 희석되었다. 그런 다음, 점액질은 종자들로부터 제거된 점액질의 총량을 계산하기 위해 수집되고 건조되었다.
다양한 농도의 중탄산나트륨에서 추출된 양은 표 1에 기재하였다.
| 중탄산나트륨의 농도 | 점액질의 중량(g) |
| 0.1 M | 16.0 g |
| 0.3 M | 16.4 g |
| 0.5 M | 32.0 g |
표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 0.5 M 중탄산나트륨의 농도가 더 낮은 농도들에 비해 점액질 제거에 있어서 훨씬 더 효과적이다. 또한, 0.5 M 농도에서, 종자는 여전히 점액질에 기인하는 끈적거리는 느낌을 가졌다. 동일한 제2세척이 행해졌고 또 다른 34g의 점액질이 제거되었다. 이런 제2세척이 행해진 후, 제3세척이 행해졌고 또 다른 36.4g의 점액질이 제거되었다. 제4세척은 매우 적은 양의 점액질을 산출하였고, 이는 500g의 리놀라종자로부터 점액질이 완전하게 제거되었음을 나타낸다. 총 102.8g의 점액질이 제거되었다.
이러한 세척들 후에, 종자는 점액질에 기인하는 "끈적거리는" 느낌을 가지지 않았고, 이는 대부분의 점액질이 제거되었음을 나타내는 또 다른 좋은 표시이다.
제2실시예
본 실시예는 본 발명의 제1실시예에 따른 플랙스밀의 제조방법을 예시한다.
품종 2047, 25kg의 리놀라기름종자가 400L 혼합탱크에 50℃에서 0.5M의 중탄산나트륨 200L에 첨가되었다. 슬러리(slurry)는 1시간 동안 활발하게 교반되었다. 침전 후에, 수성상은 따라내어졌고 폐기물은 버려졌다. 따라내어진 수성상의 1리터 부분은 동일한 부피의 에탄올로 희석되었고, 회수된 점액질의 양을 대략적으로 추정할 수 있도록 점액질이 침전되었다.
수성상을 따라낸 후에, 종자는 일부 잔류하는 세척용액을 제거하도록 뜨거운 수도물로 2회 행궈졌다. 중탄산나트륨 추출, 분리 및 세척의 공정은 5회 반복되었다. 그런 다음, 종자는 일부 잔류하는 세척 용액 및 점액질을 제거하도록 뜨거운 수도물로 4회 세척되었다. 종자는 그것의 끈적거리는 느낌이 없어지게 되었고, 이는 점액질이 제거되었다는 좋은 표시이다.
각각의 연속적인 수성 중탄산나트륨 세척은 이전보다 적은 점액질이 제거되고, 에탄올로 희석되는 경우 제5세척에서 1리터의 세척액으로부터 훨씬 적은 점액질이 침전되는 것을 알게 되었고, 이는 종자로부터 점액질의 대부분이 제거되었음을 나타내는 좋은 표시이다.
그런 다음, 종자는 종자로부터 기름을 제거하도록 건조되고, 세척되며 탈지되었다.
제3실시예
본 실시예는 점액질-감소 밀로부터 등전침전에 의해 리놀라단백질분리물의 침전을 예시한다.
제2실시예에 기술된 바와 같이 제조된 10 kg의 탈지된 리놀라기름종자밀은 실온에서 0.15M NaCl 용액의 200L에 첨가되었고, 혼합물의 pH는 50 중량% 수산화나트륨 용액으로 11.0으로 조절되었다. 슬러리는 1시간 동안 교반되었고 그 후 추출된 밀은 1시간 동안 결과적인 단백질용액으로부터 침전되도록 하였다.
그런 다음, 13 g/L의 단백질함량을 가진 100L의 단백질용액은 따라내어지고, 용액을 정화하기 위해 20 및 0.2 μm 필터들을 통해 압착식여과기(filter press)에서 여과되었다. 그런 다음, 정화된 용액은 일부 존재하는 기름을 표면으로 상승시키도록 16시간 동안 4℃에서 냉각기에 방치되었고 표면의 기름은 제거되었다. 매우 적은 양의 기름이 남게 되었고, 이것은 매우 효과적인 탈지단계임을 나타낸다.
그런 다음, 대기온도에서 단백질용액의 pH는 3N NaCl을 이용하여 4.0으로 조절되었고 단백질은, 즉시 금빛 노란색으로부터 우유빛 하얀색으로 용액의 색깔이 변하면서 침전되기 시작하였다. 혼합이 정지될 경우, 단백질은 용액으로부터 신속하게 침전되었다. 2 시간의 침전기 후에, 상청액은 따라내어지고 단백질함량이 분석되었다.
상청액의 제거 후에, 10 L의 침전물질은 침전된 단백질의 잔여 상청액 함량을 감소시키도록 5분 동안 10,000 xg에서 원심분리되었다. 결과적인 침전물은 4L의 물로 녹여졌고(reconstituted) 건조 293 g의 IEP-유도 리놀라단백질분리물을 얻도록 분무건조되었다. 분무건조된 단백질의 단백질함량은 101 중량%(N x 6.25) d.b였다.
제4실시예
본 실시예는 제3실시예에서 생산된 리놀라단백질분리물의 기능적 특성들을 예시한다.
제3실시예의 방법에 따라 생산된 IEP-유도 리놀라단백질분리물은(IEP 리놀라), 이 출원의 양수인에게 양도되며 그것의 개시 내용이 참조로 통합되는 2002년 5월 3일 출원된 미국특허출원 제10/137,391호(WO 02/089597)에 개시된 공정을 따라 생산된 PMM-유도 및 상청액-유도 캐놀라단백질분리물들의 전형적인 샘플들과 비교하여 거품 형성(foaming) 및 기름흡착능력(oil holding capacity)의 기능적 특성들에 대해 테스트되었다.
사용된 테스트 방법은, 이 출원의 양수인에게 양도되며 그것의 개시 내용이 참조로 통합되는 2002년 5월 3일 출원된 미국특허 동시계속출원 제10/137,306호(WO 02/089597)에 개시된 바와 같다.
거품 형성에 있어서, 이용된 방법은 필립스 등(Phillips et al)에 의한 식품과학회지(J. Food Sci.) 55:1441, 1990에 기술된 바와 같다. 3.75 g의 단백질분리물들은 150 ml 비이커들에 각각 배치되었다. 0.075 M NaCl 용액의 60 ml는, 수 ml의 액체로 단백질을 용해하도록 초기에 페이스트를 만드는 것에 의해 단백질에 첨가되었다. 혼합물은 10분 동안 자력교반기로 혼합되었다. 용액의 pH는 0.1 M NaOH로 7.00으로 조절되었고, 용액은 또다시 10분 동안 교반되었다. pH는 7.00으로 다시 조절되었고 용액의 부피는, 5 % w/v 단백질용액을 얻도록 0.075 M NaCl의 필요한 양으로 75 ml까지 올렸다. 75 ml의 용액은 호바트믹서 사발(Horbart Mixer bowl)로 따라내어졌고 용액, 사발 및 휘스크부착물(whisk attachment)의 결합된 중량이 기록되었다. 단백질용액은 5분 동안 스피드 3으로 세게 휘저어 거품이 일게하였다.
충분한 거품이 고무주걱을 이용하여 두 개의 테어드(tared) 125 ml 계량컵들을 가득채우도록 하여 천천히 떠내어졌다. 초과된 거품은, 계량컵의 윗부분에 거품 수준을 고르게 하도록 큰 나이프의 평평한 끝부분을 이용하여 긁어냈고 거품의 중량이 기록되었다.거품은 천천히 혼합 사발로 되돌려졌고 또 다시 5분 동안 세게 휘저어 거품이 일게 하였다. 그런 다음, 이런 방법이 반복되었다. 거품은 천천히 혼합 사발로 되돌려졌고, 또 다른 5분 동안 전체 15분 동안 세게 휘저어 거품이 일게 하였다. 다시 이 방법은 반복되었다.
초과생산량(overrun)은 다음의 방정식으로 계산되었다:
또한 거품의 안정도가 측정되었다. 단백질용액은, 단백질용액이 수준 3으로 15분 동안 세게 휘저어 거품이 일게하는 것을 제외하고는 % 초과생산량에 대해 기술된 바와 같은 동일한 방법으로 제조되었다. 고무주걱을 사용하여, 거품은 조심스럽게 250 ml의 눈금실린더의 윗부분에 위치된 1L의 긴목 깔때기 내로 옮겨진다. 적은 양의 석영울(quartz wool)은, 액체의 배출은 가능하게 하는 동시에 배출시 거품이 생기는 것을 방지하도록 깔때기 주둥이의 윗부분에 배치되었다.
5, 10 및 15 분에 눈금실린더에 수집된 액체의 부피가 측정되었다. 울에 흡착된 부피는 최종부피에 더해졌다.
기름흡착능력에 있어서, 본 실시예에서 이용된 방법은 스위프트 등(Swift et al)에 의한 식품공학지(Food Technol) 15, 436-72(1961)에 기술된 바와 같다.
표 2에 기술된 성분은 유탁액을 제조하는데 이용되었다.
| 성분 | 부가 중량(g) |
| 단백질분리물 | 0.5 |
| 식초(이름없는 5% 아세트산) | 55.2 |
| 캐놀라기름(CSP 식품들) | N/D |
| 설탕<로저스 미세과립(Rogers fine granulated)> | 4.1 |
| 염<시프토(Sifto)> | 1.2 |
| 증류수 | 52.4 |
N/D = 측정되지 않음
설탕, 염 및 단백질분리물은 600 ml 비이커에서 건조 혼합되었다. 물 및 식초가 수 ml의 액체로 단백질을 용해하도록 초기에 페이스트를 만드는 것에 의해 혼합되었다. 혼합물은 5분 동안 자력교반기로 혼합되었다. 2000 ml 비이커는 캐놀라기름으로 가득채워졌고 중량이 기록되었다. 흡입호스나 기름에 배치되었다.
호스의 투여말단(dispensing end)은 균질화기에 부착되고 펌프는 대략 40 내지 50 ml/분을 투여하도록 세팅 #1을 이용하여 기름으로 주입되었다. 동시에, 균질화기(실버슨사 LHRT)는 5,000 rpm으로 회전되고 펌프는 기름을 주입하도록 스위치-온 되었다. 유탁액이 많은 점성을 띤 지점이 시각적으로 관찰되었다. 역전(inversion) 지점에서, 펌프 및 균질화기는 즉시 스위치-오프되었다. 흡입호스의 말단은 기름이 그 안에 유지되도록 클립으로 조여지고 200 ml 비이커에 남겨진 기름의 중량이 측정되었다.
얻어진 결과들은 이하의 표 3 및 4에 기재되었다.
| 배치 | %초과생산 (거품부피) |
거품안정도 (15분에 Ml 배수) |
기름흡착능력 ( Ml 기름/100 mg 단백질) |
구상 사이즈 (μM) |
| CPI-1 | 1471.8 | 17.5 | 147.7 | 18.9 |
| CPI-2 | 1030.4 | 32.7 | 190.5 | 29.1 |
| CPI-3 | 1216.5 | 24.0 | 119.8 | 24.3 |
| CPI-4 | 1051.2 | 45.3 | 115.4 | 21.6 |
| CPI-5 | 1091.6 | 35.3 | 124.5 | 28.0 |
| CPI-6 | 1196.1 | 34.0 | 166.9 | 24.6 |
| IEP-유도 리놀라 | 1770.9 | 0.67 | 118.9 | 59.0 |
| 배치 | %초과생산 (거품부피) |
거품안정도 (15분에 Ml 배수) |
기름흡착능력 ( Ml 기름/100 mg 단백질) |
구상 사이즈 (μM) |
| CPI-7 | 2603.6 | 22.7 | 67.2 | 72.6 |
| CPI-8 | 1984.8 | 21.3 | 53.6 | 151.7 |
| CPI-9 | 1924.4 | 22.0 | 43.3 | 151.7 |
| CPI-10 | 1889.2 | 17.3 | 41.3 | 192.4 |
| IEP-유도 리놀라 | 1170.9 | 0.67 | 118.9 | 59.0 |
표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, IEP 리놀라단백질분리물은 보다 큰 부피의 거품과 적은 배수성(보다 나은 안정도)을 가져 PMM-유도 캐놀라단백질분리물에 비해 거품특성이 우수하였다. IEP 리놀라단백질분리물의 기름흡착능력은 PMM-유도 캐놀라단백질분리물과 거의 유사하였지만 보다 큰 구상(globular) 사이즈를 가졌다.
표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, IEP 리놀라단백질분리물에 의해 생산된 거품부피는 상청액-유도 캐놀라단백질분리물에 의해 생산된 것보다 작았지만, 거품은 훨씬 더 안정적이었다. 리놀라단백질분리물은 상청액-유도 캐놀라단백질분리물보다 에멀젼화 특성이 우수하였다. 리놀라단백질분리물의 기름흡착능력은 상청액-유도 캐놀라단백질분리물의 거의 두 배였고, 보다 작은 구상 사이즈를 가졌다.
제5실시예
본 실시예는 미셀루트에 의해 점액질-감소 밀로부터 리놀라단백질분리물을 제조하는 것을 예시한다.
제2실시예에 기술된 바와 같이 제조된 4 kg의 탈지된 리놀라기름종자밀은 실온에서 0.5 M NaCl 용액의 80 L에 첨가되었다(5% w/v). 슬러리는 한 시간 동안 혼합되었고, 그 후 슬러리는 30분 동안 침전되도록 하였으며 수성단백질용액은 따라내어졌다. 따라내어진 수성단백질용액은 7.1 g/L의 단백질함량과 55 L의 부피를 가졌다. 용액은, 부유된 고형물질을 제거하도록 압착식여과기에서 20 μM 여과패드를 통해 여과되었다. 압착기는, 5.28 g/L의 단백질함량을 가진 75 L의 여과액을 얻도록 20 L의 물로 씻겨졌다.
여과액은, 174 g/L의 단백질함량을 가진 1.3 L의 농축된 수성 단백질용액(보전물<retentate>)으로 용액을 농축하도록 300 달톤의 분자량 차단 한외여과 막들을 이용하여 한외여과처리 하였다. 그런 다음, 보전물은 4℃의 9 볼륨으로 희석되었고 하얀 구름모양의 단백질 미셀들을 생산하였다.
16시간의 침전기가 있은 후에, 1.11 g/L의 단백질함량을 가진 11 L의 상청액을 얻기 위해 가능할 만큼의 침전물질을 회수하도록 상청액은 따라내어지고 원심분리되었다. 또한, 침전단계로부터 얻어진 리놀라단백질분리물 침전물은 최소 수준으로 그것의 부피를 감소시키도록 원심분리되었다.
리놀라단백질분리물 침전물은 리놀라종자밀로부터 추출된 단백질의 20 중량% 수율을 나타내는 81 g의 건조된 단백질을 생산하도록 건조되었다. 건조된 리놀라단백질분리물은 112 중량%(N x 6.25)d.b의 단백질함량을 가졌다.
정화된 상청액은, 300 달톤 분자량 차단막들을 이용하여 63.3 g/L의 단백질을 함유하는 1.25 L의 농축된 상청액으로 농축되었다. 농축된 상청액은 건조되었고 106 중량%(N x 6.25)d.b의 단백질함량을 가진 77g의 리놀라단백질분리물(20% 수율)을 생산하였다.
고압 액체 크로마토그래피(HPLC)분석은, 이 출원의 양수인에게 양도되며 그것의 개시 내용이 참조로 통합되는 2003년 4월 15일 출원된 미국의 동시계속출원 제10/413,371호(WO 03/088760)에 개시된 바와 같이, 두 개의 리놀라 부분들에 대해 실시되었다.
제6실시예
본 실시예는 제5실시예에서 생산된 PMM-유도 및 상청액-유도 리놀라단백질분리물들의 기능적 특성들을 예시한다.
제5실시예의 방법에 따라 제조된 PMM-유도 및 상청액-유도 리놀라단백질분리물은, 전술한 미국특허출원 제10/137,391호(WO 02/089597)에 개시된 공정을 따라 생산된 PMM-유도 및 상청액-유도 캐놀라단백질분리물들의 전형적인 샘플들(CPI)과 비교하여, 제4실시예에 기술된 방법에 따라, 거품 형성 및 기름흡착능력의 기능적 특성들에 대해 테스트되었다.
얻어진 결과들은 이하의 표 5 및 6에 기술되었다.
| 배치 | %초과생산 (거품부피) |
거품안정도 (15분에 Ml 배수) |
기름흡착능력 ( Ml 기름/100 mg 단백질) |
구상 사이즈 (μM) |
| CPI-1 | 1471.8 | 17.5 | 147.7 | 18.9 |
| CPI-2 | 1030.4 | 32.7 | 190.5 | 29.1 |
| CPI-3 | 1216.5 | 24.0 | 119.8 | 24.3 |
| CPI-4 | 1051.2 | 45.3 | 115.4 | 21.6 |
| CPI-5 | 1091.6 | 35.3 | 124.5 | 28.0 |
| CPI-6 | 1196.1 | 34.0 | 166.9 | 24.6 |
| PMM-유도 리놀라 | 1464.0 | 2.0 | 139.5 | 19.8 |
| 상청액-유도 리놀라 | 1470.0 | 0 | 81.4 | 11.8 |
| 배치 | %초과생산 (거품부피) |
거품안정도 (15분에 Ml 배수) |
기름흡착능력 ( Ml 기름/100 mg 단백질) |
구상 사이즈 (μM) |
| CPI-7 | 2603.6 | 22.7 | 67.2 | 72.6 |
| CPI-8 | 1984.8 | 21.3 | 53.6 | 151.7 |
| CPI-9 | 1924.4 | 22.0 | 43.3 | 151.7 |
| CPI-10 | 1889.2 | 17.3 | 41.3 | 192.4 |
| CPI-11 | 2776.8 | 4.0 | 47.1 | 118.9 |
| PMM-유도 리놀라 | 1464.0 | 2.0 | 139.5 | 19.8 |
| 상청액-유도 리놀라 | 1470.0 | 0 | 81.4 | 11.8 |
표 5 및 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, PMM-유도 및 상청액-유도 리놀라단백질분리물의 기능적 특성들은 그들의 유사한 HPLC 특성들로부터 예상할 수 있는 바와 같이, 매우 유사하며, 주요 차이점들은 유탁액 특성들에 있고, 차이점들은 두 개의 부분들 사이에 기름흡착능력 및 구상 사이즈에 있어서 존재한다.
대부분의 카테고리들에 있어서, PMM-유도 및 상청액-유도 리놀라단백질분리물들의 기능성은 PMM-유도 및 상청액-유도 캐놀라단백질분리물과 같거나 또는 보다 우수하다. PMM-유도 및 상청액-유도 리놀라단백질분리물은, 거품 부피면에 있어서 캐놀라상청액-유도 분리물보다 취약하지만, 리놀라 거품의 안정도는 보다 우수하다.
제7실시예
본 실시예는 제5실시예에서 생산된 PMM-유도 및 상청액-유도 리놀라단백질분리물들의 분석을 예시한다.
이 출원의 양수인에게 양도되며 그것의 개시 내용이 참조로 통합되는 2003년 4월 15일 출원된 미국의 동시계속출원 제10/413,371호(WO 03/088760)에 개시된 바와 같이 실시된 두 개의 리놀라분리물들의 HPLC 분석은, 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, 각 분리물이 주로 동일한 성분들로 구성되었음을 보여준다. 양 리놀라단백질분리물들에 있어서, 주 단백질성분은 대략 162,000 내지 169,000 달톤의 분자량을 가지며, 적은 성분들로는 16,000 내지 17,000 달톤의 범위 내의 분자량을 가진 것과 415,000 내지 440,000 달톤의 분자량을 가진 것이 있다. 이러한 결과들은 이하의 표 7 및 8에 요약되었다.
| 단백질 부분 | 12S-리닌 | 7S-리닌 절반 | 2S-콜리닌 | 기타 |
| 단백질 피크 % | 11.9 | 78.0 | 9.2 | 0.9 |
| 분자량(kDa) | 415-440 | 162-169 | 16-17 |
| 단백질 부분 | 12S-리닌 | 7S-리닌 절반 | 2S-콜리닌 | 기타 |
| 단백질 피크 % | 6.4 | 76.9 | 12.6 | 4.1 |
| 분자량(kDa) | 415-440 | 162-169 | 16-17 |
제8실시예
본 실시예는 아미노산 분석을 예시한다.
제3 및 제5실시예에 기재된 바와 같이 제조된 리놀라단백질분리물들은 아미노산 함량에 대해 분석되었다.
아미노산 분석은 이하의 표 9에 기술되었다.
| g/100g 건조물질 | ||||
| 아미노산 분자량(1) |
아미노산 | PMM-유도 분리물 | 상청액-유도 분리물 | IEP-유도 분리물 |
| 133.1 | 아스파르트산 (Aspartic) |
11.50 | 11.40 | 11.90 |
| 119.1 | 트레오닌 (Threonine) |
3.97 | 3.80 | 3.77 |
| 105.1 | 세린 (Serine) |
4.74 | 4.87 | 4.88 |
| 204.2 | 트립토판 (Tryptophan) |
1.84 | 1.81 | 1.75 |
| 146.1 | 글루탐산 (Glutamic) |
21.10 | 21.00 | 19.10 |
| 75.1 | 글리신 (Glycine) |
5.61 | 5.62 | 5.26 |
| 89.1 | 알라닌 (Alanine) |
4.67 | 4.78 | 4.90 |
| 121.1 | 시스틴 (Cystine) |
1.30 | 1.28 | 0.96 |
| 117.1 | 발린 (Valine) |
5.30 | 5.70 | 5.92 |
| 149.2 | 메티오닌 (Methionine) |
1.47 | 1.42 | 1.48 |
| 131.2 | 이소류신 (Isoleucine) |
4.33 | 4.49 | 4.93 |
| 131.2 | 류신 (Leucine) |
5.33 | 5.36 | 5.76 |
| 181.2 | 티로신 (Tyrosine) |
2.29 | 2.36 | 2.25 |
| 165.2 | 페닐알라닌 (Phenylalanine) |
4.85 | 4.86 | 5.86 |
| 155.2 | 히스티딘 (Histidine) |
2.03 | 2.02 | 2.09 |
| 146.2 | 리신 (Lysine) |
2.73 | 2.34 | 2.69 |
| 174.2 | 아르기닌 (Arginine) |
11.80 | 12.10 | 12.20 |
| 115.1 | 프롤린 (Proline) |
3.71 | 3.87 | 4.05 |
| 합계: | 98.57 | 99.08 | 99.75 | |
| 평균 아미노산 분자량(1) | 134.75 | 135.33 | 136.43 | |
| 무수의 분자량(2) | 116.74 | 117.32 | 118.41 | |
참고: (1): "자유"아미노산들의 분자량
(2): 고분자 아미노산들의 중량평균분자량. 참고: 글루탐산(Glutamic) 및 아스파르트산(Aspartic) 각각에 포함되는, 글루타민 또는 아스파라긴에 대한 조절 없음.
표 9에 나타난 값들은 100 그램 건량당 그램들을 기준으로 아미노산들을 나타내었다. 데이터는 아미노산 100 그램을 기준으로 조정되었고, 변경된 데이터는 이하의 표 10에 나타내었다:
| 아미노산 서머리(Summary):g/100g 아미노산 | |||
| 아미노산 | PMM-유도 분리물 | 상청액-유도 분리물 | IEP-유도 분리물 |
| 아스파르트산* | 11.7 | 11.5 | 11.9 |
| 트레오닌e | 4.0 | 3.8 | 3.8 |
| 세린 | 4.8 | 4.9 | 4.9 |
| 트립토판e | 1.9 | 1.8 | 1.8 |
| 글루탐산* | 21.4 | 21.2 | 19.1 |
| 글리신 | 5.7 | 5.7 | 5.3 |
| 알라닌 | 4.7 | 4.8 | 4.9 |
| 시스틴e | 1.3 | 1.3 | 1.0 |
| 발린e | 5.4 | 5.8 | 5.9 |
| 메티오닌e | 1.5 | 1.4 | 1.5 |
| 이소류신e | 4.4 | 4.5 | 4.9 |
| 류신e | 5.4 | 5.4 | 5.8 |
| 티로신 | 2.3 | 2.4 | 2.3 |
| 페닐알라닌e | 4.9 | 4.9 | 5.9 |
| 히스티딘e | 2.1 | 2.0 | 2.1 |
| 리신e | 2.8 | 2.4 | 2.7 |
| 아르기닌e | 12.0 | 12.2 | 12.2 |
| 프롤린 | 3.8 | 3.9 | 4.1 |
| 합계: | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 필수 aa 합계: | 45.6 | 45.6 | 47.5 |
e = 11개의 필수 아미노산 aa = 아미노산
* 글루탐산 및 아스파르트산은 각각 글루타민 및 아스파라긴을 포함함
표 9 및 표 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, PMM-유도, 상청액-유도 및 IEP-유도 리놀라단백질분리물들에 대한 아미노산 프로파일들은 매우 유사하다.
표 9는 각 아미노산들에 대한 분자량들을 포함한다. 각각의 양들과 결합된 경우, 3개의 단백질분리물에 있어서 "자유"아미노산들에 대한 평균분자량들을 알 수 있고, 모두 약 135 달톤이다. 단백질들이 무수의 아미노산들의 생체고분자물질들이기 때문에 무수의 중량평균분자량(Weight averaged Molecular Weights)을 알 수 있다(폴리펩티드당 하나의 말단 아미노산을 배제하고 물분자를 뺌).
평균 고분자 아미노산 분자량들(average polymeric amino acid molecular weights)은 모두 약 117 내지 118 달톤이다. 또한, 표 10은 인체에서 합성될 수 없는 필수 아미노산들을 나타낸다. 11개의 필수 아미노산의 전체 함량은 3개의 단백질분리물들에 있어서 매우 유사하다.
제9실시예
본 실시예는 리놀라단백질분리물들의 시차 주사 열계량법 분석을 예시한다.
제3 및 제5실시예에 기재된 바와 같이 제조된 리놀라단백질분리물들은 시차 주사 열계량법 처리된다. 시차 주사 열계량법은 생체분자들에서 일어나는 위상전이를 측정하는 기기분석법이다. 샘플은 약간의 물 또는 완충된 용액을 가진 밀봉된 팬으로 도입되고, 가령 20℃ 내지 150℃와 같은 특정 온도범위에 걸쳐서, 예를 들면, 10℃/분과 같은 일정한 비율로 가열된다. 물 또는 완충용액을 함유하는 제2팬은 동시에 참조로 작용하도록 가열된다. 흡열 열류량(endothermic heat flow)라고 부르는 에너지 흡수의 온도기록도가 온도가 상승하는 동안 기록된다. 단백질과 같은 생물학적 복합체들은 에너지를 흡수하고 이 에너지는 변성 또는 접힘풀림(unfolding)과 같은 분자의 입체형태를 변화시킨다. 변성작용은 각 단백질들, 또는 다른 생체분자들에 특이적이고, 분석은 변성온도(TD) 및 샘플의 줄(Joules)/그램(gram)으로 엔탈피변화(ΔH)를 제공한다. 온도기록도는 본래의 단백질로부터 변성단백질까지 위상전이를 나타내는 에너지"우물(well)"을 나타낸다. "우물"의 바닥은 TD 값을 나타낸다. 어떤 에너지"우물"도 없는 경우는 완전한 변성이 이뤄졌음을 나타낸다.
도 3, 4 및 5에 나타난 바와 같이, PMM-유도 및 상청액-유도 리놀라단백질분리물들은 그들의 유사한 HPLC 특성들로부터 예상할 수 있는 바와 같이, 열안정성의 측면에서 유사하고, 상청액-유도 리놀라단백질분리물이 약간 더 높은 안정성을 가진다. IEP-유도 리놀라단백질분리물에 대한 시차 주사 열계량법 온도기록도는, 실질적으로 변성되지 않은 PMM-유도 및 상청액-유도 리놀라단백질분리물들과 대조적으로 실질적으로 변성되었음을 나타낸다.
본 발명은, 플랙스기름제거에 앞서 플랙스기름종자로부터 점액질을 우선 추출하여 플랙스단백질분리물을 생산하는 향상된 방법 및 얻어지는 단백질분리물들의 우수한 수율 및 실시되는 분리방법에 있어서 우수한 유연성을 가능하게 하는 플랙스기름종자밀 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 특정 단백질분리물을 가진 신규한 플랙스단백질분리물을 제공한다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변화와 변경이 가능하다.
Claims (25)
- 플랙스단백질분리물의 제조방법에 있어서,7.5 내지 9의 pH를 가지고, 0.2 내지 0.7 M 농도의 미알칼리성 물질을 가지는 알칼리성 물질의 미알칼리성 수용액을 이용하여 플랙스기름종자들을 초기 추출하여 점액질을 제거하는 단계,상기 추출된 기름종자들을 분쇄하여 기름을 회수하고 밀을 남겨두는 단계, 및상기 밀을 처리하여 플랙스단백질분리물을 회수하는 단계를 포함하고,여기서 상기 밀을 처리하여 플랙스단백질분리물을 회수하는 단계는알칼리성 수용액을 사용한 상기 밀의 추출에 의해 생산된 플랙스단백질의 알칼리성 용액으로부터 플랙스단백질용액을 등전 침전시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수행되는, 플랙스단백질분리물의 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,30°내지 70℃에서, 1:1 내지 1:20의 용액에 대한 종자비로 수행되는 것을 특징으로 하는 플랙스단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서,상기 수용액 내에서 상기 기름종자를 15 내지 60분 동안 교반하여 수행되는 것을 특징으로 하는 플랙스단백질분리물의 제조방법.
- 제1항, 3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,기름종자들로부터 더이상의 점액질이 추출되지 않을 때까지 기름종자를 추출하는 단계를 다수 행하는 것을 특징으로 하는 플랙스단백질분리물의 제조방법.
- 제1항, 3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,상기 미알칼리성 물질은 자신의 본래 pH에서 중탄산나트륨의 수용액으로서 사용되는 중탄산 나트륨인 것을 특징으로 하는 플랙스단백질분리물의 제조방법.
- 삭제
- 플랙스단백질분리물의 제조방법에 있어서,7.5 내지 9의 pH를 가지고, 0.2 내지 0.7 M 농도의 미알칼리성 물질을 가지는 알칼리성 물질의 미알칼리성 수용액을 이용하여 플랙스기름종자들을 초기 추출하여 점액질을 제거하는 단계,상기 추출된 기름종자들을 분쇄하여 기름을 회수하고 밀을 남겨두는 단계, 및상기 밀을 처리하여 플랙스단백질분리물을 회수하는 단계를 포함하고,여기서 상기 밀을 처리하여 플랙스단백질분리물을 회수하는 단계는5 내지 7의 pH에서 적어도 0.10 M의 이온강도를 가진 염화나트륨 수용액을 이용하여 상기 플랙스기름종자밀을 추출함으로써 상기 플랙스기름종자밀에 단백질을 가용화하여 5 내지 40 g/L의 농도를 가진 수성 단백질 용액을 제공하는 단계,상기 수성 단백질 용액을 선택막기술에 의해 적어도 150 g/L의 농도로 농축하는 단계,15℃보다 낮은 온도의 물로 상기 농축된 단백질 용액을 희석하여 단백질미셀을 형성하는 단계, 및상기 단백질미셀을 플랙스단백질분리물의 단백질미셀덩어리로서 수집하고 회수하는 단계에 의해 수행되는, 플랙스단백질분리물의 제조방법.
- 제8항에 있어서,상기 단백질미셀덩어리는 건조되는 것을 특징으로 하는 플랙스단백질분리물의 제조방법.
- 제8항에 있어서,단백질미셀덩어리로부터의 잔여 액체에 대해 상기 회수 공정을 반복하여 부가적인 양의 플랙스단백질분리물을 회수하는 것을 특징으로 하는 플랙스단백질분리물의 제조방법.
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